Yüksek işlem hacmi üç boyutlu tümör pulcuklarının nesil uyuşturucu taraması
5 Eylül 2018
Hastalık göstergeler çok çeşitli, daha fizyolojik ilgili modelleri gelişmiş ve içine uygulanan ilaç bulma programları davranıyorsun. Burada açıklanan yeni modeli sistemi pulcuklarının kültürlü ve yeni Onkoloji uyuşturucu aramak için bir yüksek üretilen iş 1536-şey plaka tabanlı sistem festivalde nasıl üç boyutlu tümör göstermektedir.
Bu yöntem, ilaç keşfi alanında, isabetten kurşuna tanımlama için en uygun doku kültürü ayarının ne olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, 1536 kuyu plakası kullanılarak hücrelerin üç boyutlu, yüksek verimli bir şekilde kültürlenmesine izin vermesidir. Bu protokolü gösteren, laboratuvarımdan kıdemli bir bilim adamı olan Kalyani Gampa olacak.
Bir 3D tümör sferoid kültürü oluşturmak için, ilgilenilen kanser hücre hatlarını üç yıkama BBS ile ayırın. Bunu takiben, kültür şişesinin beş santimetre karelik alanı başına bir mililitre tripsin ilavesi. Beş dakika sonra, tripsini her bir şişede serum takviyeli ortamın hacminin beş katı ile nötralize edin ve hücreleri sayın.
1.536 kuyucuklu doku kültürü ile muamele edilmiş bir plakanın her bir oyuğuna sekiz mikrolitre küresel ortamda toplam 500 hücre tohumlamak için peristaltik pompa tabanlı bir sisteme sahip sterilize edilmiş, küçük paslanmaz çelik uçlu bir kaset kullanın. Ardından, plakayı kaplamak için nefes alabilen bir yapışkan plaka contası kullanın. Ve plakayı üç gün boyunca %5 karbondioksit ve %95 bağıl nem ile 37 santigrat derece ve 10 rpm'ye ayarlanmış bir eğirme inkübatörüne yerleştirin.
En kritik adım, plakaların inkübatöre yerleştirilmeden önce iyi bir şekilde kapatılmasını sağlamaktır. Sferoidlerin oluşması için üç güne ihtiyaç duyulacaktır ve bu adım orta buharlaşmayı önler. İnkübasyonun sonunda, herhangi bir yoğuşmayı toplamak için kanser kaplı kültür plakalarını yerçekiminin 100 katı sıcaklıkta hızlı bir şekilde döndürün ve yapışkan contaları çıkarın.
İşlenecek her bir plakayı, her bir bileşiğin toplam sekiz nanolitresini verecek şekilde ayarlanmış bir akustik dağıtıcıya koyun. Kuyu başına% 0.1 DMSO'luk bir nihai konsantrasyona seyreltme ve 10 mikromolar üst bileşik dozu. Bileşik uygun plakalara eklendiğinde, buharlaşmayı önlemek için her bir plakaya özel yapım, paslanmaz çelik bir hücre kültürü kapağı yerleştirin ve plakaları beş gün daha eğirme inkübatörüne geri koyun.
İnkübasyonun sonunda, her bir hücre kültürü plakasının her bir oyuğuna lusiferin ile takviye edilmiş üç mikrolitre önceden ısıtılmış hücre lizis reaktifi ekleyin. Ve plakaları oda sıcaklığında en az 15 dakika inkübe edin. Ardından ATP lüminesansını bir plaka luminometresinde yakalayın.
Tüm plakalar analiz edildiğinde, ham verileri cihazdan çıkarın ve test bileşiklerini içeren tüm alanları, nötr kontrol olarak tek başına DMSO içeren tüm kuyucukların ortalamasına normalleştirin. Her bir bileşiğin büyüme inhibisyonu yüzdesi daha sonra formüle göre hesaplanabilir ve doz yanıt eğrileri ve inhibitör IC50'ler üretilebilir. 2D kültür koşulları altında iyi büyüdüğü bilinen çeşitli yerleşik kanser hücreleri, morfolojik farklılıklarına rağmen, az önce gösterildiği gibi kültürlendiğinde 3D yapılar oluşturdu.
Büyük ölçekli tarama için kullanıldığında, 2D'de yetiştirilen kültürler ile 3D'de yetiştirilen kültürler arasındaki diferansiyel bileşik duyarlılığı gözlemlenebilir. Her nokta, her iki kültür ortamında da %50'lik bir hücre öldürme tepkisinin gözlendiği tek bir bileşiğin inhibitör konsantrasyonunu temsil eder. Bu temsili deneyde, test edilen her iki RAF kinaz inhibitör bileşiği, KRAS proteininde aktive edici bir mutasyon barındıran küçük hücreli olmayan bir akciğer kanseri hattı kültüründe 3D koşullarda daha güçlüydü.
Bununla birlikte, bileşikler, KRAS'ta bir G13D aktive edici mutasyon içeren hem 3D sferoid hem de 2D kolon kanseri çizgi kültürlerinde benzer bir potens göstermektedir. 3D tahlil ayrıca, ilacın düşük konsantrasyonlarında hücre büyümesi ile kanıtlandığı gibi, yüksek konsantrasyonlarda bastırıldığı gibi, yüksek derecede aktive edilmiş RAF mutant hatlarında RAF dimerlerinin eksik bir inhibisyonu olduğunda ortaya çıkan paradoksal büyüme aktivasyon fenomeninin gözlemlenmesine de izin verir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, kanser ilacı keşfi alanındaki araştırmacıların, bilinen hedeflere karşı yeni, etkili kimyasal maddeleri tanımlamak için alternatif kültür koşullarını keşfetmelerinin yolunu açtı.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, yüksek kapasiteli 1536 kuyucuklu plaka sisteminde kültüre edilmiş üç boyutlu tümör sferoidlerini kullanarak ilaç keşfi için yeni bir yöntem sunmaktadır. Bu yaklaşım, potansiyel onkoloji ilaçlarının belirlenmesinde doku kültürü ortamlarının uygunluğunu artırmayı amaçlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Onkoloji
- İlaç Keşfi
- Hücre Kültürü Teknikleri
Arka Plan
- Geleneksel iki boyutlu hücre kültürleri genellikle tümör mikroçevresini taklit etmede yetersiz kalır.
- Üç boyutlu kültürler, kanser çalışmalarında fizyolojik olarak daha uygun bir model sunar.
- Yüksek kapasiteli tarama, verimli ilaç keşfi için temel öneme sahiptir.
- Bu çalışma, tümör sferoitlerinin kültürlenmesinin optimize edilmesine odaklanmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Tümör sferoidlerini kültüre almak için yüksek kapasiteli bir yöntem geliştirmek.
- Bu modelin ilaç keşfindeki uygunluğunu değerlendirmek.
- Yeni onkoloji ilaçlarının tanımlanmasını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- BBS yıkamaları kullanarak kanser hücre hatlarının ayrıştırılması.
- Hücre ayrıştırma için tripsin kullanımı ve serum destekli besiyeri ile nötralizasyon.
- Hücrelerin 1536 kuyucuklu plaka formatında kültüre edilmesi.
- Potansiyel ilaç adaylarının yüksek kapasiteli bir yöntemle taranması.
Ana Sonuçlar
- Bu yöntem, 3D tümör sferoidlerinin verimli bir şekilde kültüre edilmesine olanak tanır.
- Yüksek kapasiteli tarama yetenekleri, ilaç adaylarının hızla taranmasını sağlar.
- 3D kültür modelinin ilaç keşfindeki geçerliliği kanıtlanmıştır.
- Hit-to-lead (başarıdan öncü bileşiğe) tanımlama sürecini iyileştirme potansiyeline sahiptir.
Sonuçlar
- Bu 3D tümör sferoid kültürü yöntemi, ilaç keşfi çalışmalarını geliştirmektedir.
- Tümör biyolojisinin daha doğru bir temsilini sunar.
- Bu yaklaşım, yeni onkoloji tedavilerinin belirlenmesine yol açabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektörel Uygunluğu
Bu yöntem, fizyolojik olarak ilgili bir 3D tümör sferoid modelinde yüksek kapasiteli tarama sağlayarak onkoloji ilaç keşfindeki translasyonel boşluğu gidermektedir. 2D ve 3D kültür koşulları arasındaki farklı ilaç yanıtlarını ortaya çıkararak hedef doğrulamada öngörülebilir güveni destekler. Bu yaklaşım, genetik olarak tanımlanmış kanser modellerinde MAPK yolak inhibitörleri için hit-to-lead tanımlamasını geliştirmektedir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: 3D hücresel etkileşimleri ve uzamsal organizasyonu yakalayan, hastalıkla ilişkili bir sistemde terapötik hipotezlerin sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: Bağlama bağlı aktiviteyi belirlemek için bileşik etkinliğini 2D ile 3D kültürler arasında karşılaştırarak mekanistik risk azaltmayı destekler.
- Öngörücü Değer: 3D koşullar altında KRAS mutant küçük hücreli dışı akciğer kanseri modellerinde farklı duyarlılıkları tespit ederek öncü bileşik tanımlamayı kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Büyük ölçekli bileşik taramaları için 1536 kuyucuklu formatlarla uyumlu, standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir 3D kültür sistemi sağlar.
- Operasyonel Değer: Büyüme inhibisyonunu ölçmek, doz-yanıt eğrilerini ve IC50 değerlerini oluşturmak için kantitatif ATP tabanlı lüminesans okumalarına olanak tanır.
- Deney Hazırlığı: Hassas nanolitre düzeyinde bileşik aktarımı için akustik dağıtma yöntemini ve evaporasyonu önlemek için mühürlü inkübasyonu kullanarak deney bütünlüğünü sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Tümör-stroma etkileşimlerini ve hücre dışı matris benzeri koşulları ölçeklenebilir bir formatta modelleyerek, keşif ve preklinik iş akışları arasında köprü kurar.
- Riskten Arındırılmış Gelişim: RAF dimer mutantlarında paradoksal büyüme aktivasyonunun gözlemlenmesine izin vererek kombinasyon tedavisi stratejilerine bilgi sağlar ve klinik adayların riskini azaltır.
- Biyobelirteç Uyumluluğu: Genotip ile ilaç yanıtını ilişkilendirmek için, genetik olarak tanımlanmış arka planlarda yola özgü inhibitörlerin (örneğin MAPK) değerlendirilmesini destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlamaya kadar olan keşif sürecine entegre edilerek, preklinik yatırımlardan önce bileşik etkinliğinin fizyolojik olarak daha ilgili bir bağlamda erken değerlendirilmesine olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: KRAS-mutant NSCLC gibi onkogen kaynaklı modellerde 3D kültürün ilaç hassasiyetini nasıl değiştirdiğini ortaya çıkararak hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Kontrollü inkübasyon ve mühürleme protokolleri ile 1536 kuyucuklu plakalarda standartlaştırılmış sferoid oluşumu sayesinde analiz hazırlığı ve tekrarlanabilirlik sağlar.
- Analitikler: ATP lüminesansının DMSO kontrollerine normalizasyonu yoluyla kantitatif bağımlı değişken ölçümüne olanak tanıyarak IC50 hesaplamasını ve karşılaştırmalı potens analizini kolaylaştırır.
- Translasyonel Araştırma: 2D sistemlerde bulunmayan uzamsal tümör mimarisini ve klonal etkileşimleri modelleyerek preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: MAPK gibi korunan yolakları hedefleyen çeşitli kanser hücre hatlarının ve bileşik kütüphanelerinin taranması için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: 2D ve 3D ilaç yanıtlarının doğrudan karşılaştırılması yoluyla mekanistik belirsizliği azaltarak öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Robotik uyumlu 1536 kuyucuklu plaka iş akışları ve sızdırmaz inkübasyon aracılığıyla standardizasyon, tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik sağlar.
- Stratejik Değer: Bağlama özgü aktiviteye sahip bileşikleri tanımlayarak geç evre biyolojik riskini azaltır ve go/no-go kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Fizyolojik olarak ilgili modellerdeki farklı etkinliğe dayalı olarak, risk ayarlı öncü madde önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Trypsin nötralizasyonu, hücre sayımı ve steril ekim dahil olmak üzere 3D hücre kültürü tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Peristaltik pompa tabanlı kaset sistemleri, akustik dispenserler, döner inkübatörler ve plaka lüminometreleri gibi cihazlara bağlıdır.
- Sızdırmazlık protokollerinin, inkübasyon parametrelerinin (37°C, 10rpm, 5% CO2, 95% nem) ve veri normalizasyon prosedürlerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Sferoid oluşum verimliliği, yerleşmiş hatlarda başarılı oluşuma rağmen farklı kanser hücre hatlarında değişkenlik gösterebileceği için adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Uzun süreli inkübasyonlar sırasında buharlaşmanın önlenmesi gerekliliği ve nanolitre hacimlerdeki bileşik dozajının optimizasyonu gibi pratik kısıtlamaları kapsar.
