Name: Yüksek işlem hacmi üç boyutlu tümör pulcuklarının nesil uyuşturucu taraması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-05T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Keşfedin, 1536-kuyucuklu plakalarda yüksek işlem hacimli üç boyutlu tümör pulcukları yetiştirme yöntemini. Bu teknik, onkolojide yeni ilaç adaylarının hızla taranmasına ve daha fizyolojik olarak uygun sonuçlar elde edilmesine olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar Marc Ferrer Ulusal Merkezi translasyonel Bilimler ilerleyen, Ulusal Sağlık Enstitüleri için onun destek ve rehberlik bu deneyleri ilk geliştirme için kabul etmek istiyorum. Buna ek olarak, Alyson Freeman, Mariela Jaskelioff, Michael Acker, Jacob Haling ve Vesselina Cooke onların bilimsel girdi ve ekip üyeleri proje olarak tartışma için teşekkür etmek istiyorum.

1. kültür 1536-şey 3D tümör pulcuklarının
<ol><li>Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM/F12) 500 mL aşağıdaki ayıraçlar ekleyerek bir taze 3D tümör küresel orta kök (hücre orta + nakavt serumu değiştirme + insülin-transferrin-selenyum) hazırlamak: 1 x penisilin/streptomisin, insan 10 ng/mL temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF), 20 ng/mL insan epidermal büyüme faktörü (EGF), %0,4 Sığır serum albumin (BSA) (Kesir V), 1 x insülin-transferrin-selenyum ve % 1'nakavt (KO) serum değiştirme (değil donma-çözülme).</li>
	<li>Filtre-0.4 µm şişe-ilk filtre sistemi aracılığıyla takviyeleri ile tüm Orta sterilize.</li>
	<li>Önerilen rutin kültür şartlarından yıkama tarafından geleneksel hücre kültürü şişeler göre büyüyen kanser hücre satırları ayırmak 3 x 1 x fosfat ile arabelleğe alınmış serum (PBS) ve % 0.25 tripsin (1 mL uygun bir miktar ekleniyor 5 cm2) başına hücrenin üzerine ince bir tabaka oluşturmak 5 min için. 5 x serum içeren orta miktarda tripsin etkisiz hale getirmek ve hücreleri saymak için devam edin. Örneğin, orta 25 mL 5 mL tripsin için kullanın.</li>
	<li>Toplam 8 µL küresel orta bir kuyu başına 500 hücre doku kültürü tedavi 1536-şey kalıplara tohum için hücre çözümü için 62,5 x 104 hücre/mL konsantrasyonu ayarlayın.</li>
	<li>Bir biyolojik emanet dolabı, steril, küçük çelik uçlu Paslanmaz kaset peristaltik pompa-tabanlı bir sistem ile kullanarak hücreleri tohum. Kaset 1 x PBS ve % 70 ile tüp farklı hücre aralarını temizlemek için 10 etanol s.</li>
	<li>Alternatif olarak, steril, küçük çelik uçlu Paslanmaz kaset ve peristaltik pompa veya tabak gerekli hücre satır başına sayısına bağlı olarak bir ekli şırınga pompa kullanarak bir HEPA filtre oda içinde bulunan sıvı bir işleyici kullanarak hücreleri tohum.</li>
	<li>Bir nefes alabilir yapışkan plaka mühür de el ile veya bir tabak mühürleyen kullanarak plakalarının.</li>
	<li>10 rpm ve 37 ° C % 5 karbondioksit (CO2) ve %95 bağıl nem ile ayarlamak bir iplik kuluçka tabak koyun. 3 d formuna pulcuklarının izin.</li>
</ol>2. kültür 1536-şey 2D kanser satırları
Not: 1536-şey 2D kanser satırları ek bahçedeki 3D plakaları önce 24 h kültürlü.
<ol><li>Seçili satırlar için bir uygun büyüme ortamının 500 ml aşağıdaki ayıraçlar ekleyerek bir 2D kanser hücre ortamı hazırlamak: 1 x penisilin/streptomisin ve % 10 fetal Sığır serum (FBS).</li>
	<li>Filtre-0.4 µm şişe-ilk filtre sistemi aracılığıyla takviyeleri ile tüm Orta sterilize.</li>
	<li>Önerilen rutin kültür şartlarından yıkama tarafından geleneksel hücre kültürü şişeler göre büyüyen kanser hücre satırları ayırmak 3 x 1 x PBS ve 5 min için % 0.25 tripsin (5 cm2başına 1 mL) uygun bir miktar ekleniyor hücrenin üzerine ince bir tabaka oluşturmak. 5 x serum içeren orta miktarda tripsin etkisiz hale getirmek ve hücreleri saymak için devam edin. Örneğin, orta 25 mL 5 mL tripsin için kullanın.</li>
	<li>Hücre çözümü için 62,5 x 104 hücre/mL konsantrasyonu tam orta 8 µL kuyuda başına 500 hücre Toplam 1536-iyi doku kültürü tedavi kalıplara tohum için ayarlayın.</li>
	<li>Bir biyolojik emanet dolabı, steril, küçük çelik uçlu Paslanmaz kaset peristaltik pompa-tabanlı bir sistem ile kullanarak hücreleri tohum. Kaset 1 x steril PBS ve % 70 ile tüp farklı hücre aralarını temizlemek için 10 etanol s.</li>
	<li>Alternatif olarak, steril, küçük çelik uçlu Paslanmaz kaset ve peristaltik pompa veya hücre başına plakaların hacmine bağlı olarak ekli şırınga pompa kullanarak bir HEPA filtre robotik oda içinde bulunan sıvı bir işleyici kullanarak hücreleri tohum gerekli satır.</li>
	<li>Bir nefes alabilir yapışkan plaka mühür de el ile veya bir tabak mühürleyen kullanarak plakalarının.</li>
	<li>10 rpm ve 37 ° C % 5 CO2 ve % 95 bağıl nem ile bileşik toplama önce 24 h için ayarlamak bir iplik kuluçka tabak koyun.</li>
</ol>3. Bileşik toplama
<ol><li>Sıvı işleme robot 10 mM en iyi bir konsantrasyon ile % 100 dimetil sülfoksit (DMSO) MAPK inhibitörleri, 8-point, 3-fold seri dilutions hazırlayın. Proteasome inhibitörü Bortezomib olumlu bir denetim olarak tam bir hücre tahlil dinamik aralığını belirlemek için öldürmek için kullanılır.</li>
	<li>Hızlı-spin all tahlil plakaları ve herhangi bir yoğunlaşma toplamak için 100 x g de bileşik plakaları. Yapışkanlı mühür her tabaktan kaldırmak ve bir tabak 8 toplam eklemek için bir akustik dağıtıcı set-up üzerinde yer her bileşik/seyreltme % 0,1 DMSO iyi başına son bir konsantrasyon ve 10 µM üst bileşik dozu temsil eden nL.</li>
	<li>Bileşik ilavesi tamamlandıktan sonra buharlaşma plaka üzerinde engeller ve bir iplik Kuluçka Gelişim makinesi 37 ° C'de % 5 CO2 ve % 95 bağıl nem ile 5 d için plaka yerleştirin bir ısmarlama, paslanmaz çelik hücre kültür kapak koyun.</li>
</ol>4. algılama reaktif toplama ve ham veri Acquirement
<ol><li>Yeterli bir hücre çoğalması, oda sıcaklığında veya 37 ° C su banyosu adenin trifosfat (ATP) değişiklikler ve böylece, değişiklikleri algılamak için biyoluminesans içeren bir hücre lizis reaktif hacmi önceden ısıtmak. Algılama reaktif 3 µL toplam peristaltik pompa kullanarak her şey ekleyin ve en az 15 dakika oda sıcaklığında plaka kuluçkaya.</li>
	<li>Bir tabak luminometer üzerinde ışıldama yakalamak.</li>
</ol>5. veri işleme
<ol><li>Araç ham veri ayıklamak ve bütün wells DMSO tarafsız denetim olarak yalnız içeren ortalama test bileşikler içeren tüm alanlar normalleştirmek. Bu değeri, her bileşik yüzde büyüme inhibisyonu hesaplayın. Bu Microsoft Excel'de formül işlevini kullanarak tamamlanır nerede f (x) = {(örnek değer göreli ışık birimleri (RLUs) / (DMSO değeri RLUs Ortalama) * 100)}.</li>
	<li>Doz-yanıt eğrileri ve inhibitör IC50s değerleri normalleştirilmiş veri--dan adım 5.1 bir grafik programı kullanarak bileşik toplama karşı grafiklerini çizerek oluşturmak. Not: Helios, bir iç NIBR yazılım aracı kullanarak verileri analiz ettik. Bu işlevi tamamlamak için parametrik olmayan eğri çözümleme aracı seçili.</li>
</ol>

<ol><li>Lee, M., Vasioukhin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+polarity+and+cancer--cell+and+tissue+polarity+as+a+non-canonical+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Cell polarity and cancer--cell and tissue polarity as a non-canonical tumor suppressor.</a> Journal of Cell Science. 121 (Pt 8), 1141-1150 (2008).</li>
<li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research%3A+Focus+on+tumor+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).</li>
<li>Weigelt, B., Ghajar, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+need+for+complex+3D+culture+models+to+unravel+novel+pathways+and+identify+accurate+biomarkers+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 69, 42-51 (2014).</li>
<li>Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 332 (3), 821-828 (2010).</li>
<li>Li, L., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+a+3D+Culture+System+to+Study+the+Interaction+between+Epithelial+Breast+Cancer+and+Its+Surrounding+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Optimizing a 3D Culture System to Study the Interaction between Epithelial Breast Cancer and Its Surrounding Fibroblasts.</a> Journal of Cancer. 2, 458-466 (2011).</li>
<li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+HER2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li>
<li>Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumour+models%3A+novel+in+vitro+approaches+to+cancer+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">3D tumour models: novel in vitro approaches to cancer studies.</a> Journal of Cell Communication and Signaling. 5 (3), 239-248 (2011).</li>
<li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three-dimensional+%283D%29+models+in+cancer+research%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update.</a> Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).</li>
<li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+pharmacological+profiling+of+3D+tumor+models+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Large-scale pharmacological profiling of 3D tumor models of cancer cells.</a> Cell Death & Disease. 7 (12), e2492(2016).</li>
<li>Polo, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+to+PI3K+and+MEK+inhibitors+in+breast+cancer.+Use+of+a+3D+culture+system+to+study+pathways+related+to+hormone+independence+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Responsiveness to PI3K and MEK inhibitors in breast cancer. Use of a 3D culture system to study pathways related to hormone independence in mice.</a> PLoS One. 5 (5), e10786(2010).</li>
<li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).</li>
<li>Bhargava, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Registered+report%3A+RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Registered report: RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Elife. 5, e09976(2016).</li>
<li>Mathews, L. A., Hurt, E. M., Zhang, X., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+CpG+promoter+methylation+in+invasive+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of CpG promoter methylation in invasive prostate cancer cells.</a> Molecular Cancer. 9, 267(2010).</li>
<li>Mathews, L. A., Crea, F., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+gene+regulation+in+stem+cells+and+correlation+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Epigenetic gene regulation in stem cells and correlation to cancer.</a> Differentiation. 78 (1), 1-17 (2009).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+DNA+repair+genes+in+invasive+human+pancreatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreas%22%5BJournal%5D)">Increased expression of DNA repair genes in invasive human pancreatic cancer cells.</a> Pancreas. 40 (5), 730-739 (2011).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+1536-well+quantitative+high-throughput+screen+to+identify+compounds+targeting+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).</li>
<li>Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+culture+of+murine+primordial+germ+cells+and+embryonic+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells.</a> Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+SOX9+by+the+NF-kappaB+signaling+pathway+in+pancreatic+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of SOX9 by the NF-kappaB signaling pathway in pancreatic cancer stem cells.</a> Stem Cells. 31 (8), 1454-1466 (2013).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+1536-well+quantitative+high-throughput+screen+to+identify+compounds+targeting+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).</li>
<li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+combinatorial+screening+identifies+drugs+that+cooperate+with+ibrutinib+to+kill+activated+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).</li>
<li>Herter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+three-dimensional+heterotypic+spheroid+model+for+the+assessment+of+the+activity+of+cancer+immunotherapy+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">A novel three-dimensional heterotypic spheroid model for the assessment of the activity of cancer immunotherapy agents.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (1), 129-140 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar Novartis çalışanlarının, ve bazı çalışanlar da hissedarları vardır.

Burada sunulan yöntemleri 1536-şey tabak büyük ölçekli bileşik izlemek için tümör pulcuklarının üretmek nasıl ayrıntılı bir protokol göstermektedir. Bu yöntemler başlangıçta nerede tümör pulcuklarının düşük işlem hacmi deneyleri genetik bağımlılıkları ve bileşik duyarlılık13, hakkında soru sormak için 6-şey ve 96-iyi tabak içinde yetiştirilen Ulusal Kanser Enstitüsü'nde işten adapte 14 , 15. bir kritik ve benzersiz bu protokolü ...

Son on yılda daha fazla çalışmalar tam olarak 2D hücrelerde plastik üzerinde büyüyerek recapitulated değil kavramları anlamak için 3D hücre kültür modellerinin kullanımı hayata geçirdik. Bu kavramlar değişiklikler hücrelerinin apikal ve bazal katmanları kayma yönünü nerede kayıp normal epitel hücre polarite1 , hem de hücre dışı matriks hayatta kalma ve hücre kader düzenlenmesinde rol örnekleridir. Onkoloji araştırma, özellikle, 3D modelleri temel biyoloji kanser hücreleri ve 2D ve 3D hücre kültür sistemleri3,4arasındaki farkları anlamak için kullandı. Daha gelişmiş hücre kültürü teknikleri ve onların daha fazla uyum çok iyi biçimleri için 3D ayarları'nda yeni ilaçlar için arama sağlamıştır. Karmaşık çok cell tipi küreler6,7için, koşullarda 2D, 3D modelleri tek hücre tipi alanlara farklı boyutlarda, katmanlı hücresel sistemleri5 karmaşıklık tümörler aralığının hücre aksine yetiştirilen 8. yeni bileşikler veya kuvvetli bu 3D modeli sistemlerinde hücre ölümüne neden destekte keşfi, bu nedenle, ilaç geliştirme kampanyalarının yüksek ilgi olduğunu. Bitiş noktaları bu deneyleri kez hücre çoğalması değişimler değerlendirmek için 2D kültürlerde geçekleştirilen aynıdır, ancak daha fizyolojik ilgili bir ortamda yürütülen zaman bağımlılık hedef gen veya yolu olma gerçek düzeyini ortaya çıkarabilir sorguya.
Yukarıda tanıtılan gibi çeşitli model sistemleri geliştirilmiştir 3D kültür sistemlerinde uyuşturucu yanıt çalışmaya, ama çoğunluk ya 96 veya 384-de microtiter plakaları kullanın ve sık sık kullanılan yüksek üretilen iş (HTS) eleme oluşum kolayca adapte değildir ilaç keşif tarama kampanyalar. Bu tür sistemleri damlacık teknolojileri, küresel kültürler, havaya yükselme ve kollajen, Matrigel veya Polietilen glikol (PEG)2 gibi doğal veya sentetik jelleri birleşmeyle kültürleri ikna etmek için manyetik parçacıklar hücrelerle zonklayan asılı kullanımını içerir . Burada, 3D küresel kültürler 1536-şey plaka biçiminde kurulan kanser hücre satırlarından üretmek için daha önce gelişmiş bir teknik detaylı yöntemleri mevcut. Bu protokol için yüksek tanımlı bir orta normalde yapisan hücre hatları9eki önleyen kullanılır. Bu sistem sınırlamaları vardır (yani, tam olarak karmaşık bir modeli sistem kanseri özetlemek olamaz), ama yine de, bu deneyleri bir yüksek-den geçerek tarama küçük moleküller büyük koleksiyonları ve uyuşturucu yanıtının Çapraz karşılaştırma etkinleştirin çeşitli hücre satırları ve bileşikleri karşı 2D ve 3D kültürler arasında.
Hücre hatları bu makaledeki yöntemlerden yolu, kanser, dysregulated son derece olan bir yol sinyal MAPK ilgili genlerin tüm liman mutasyonların göstermek için seçilen ve hangi birçok tedavi için kullanılabilir. Satırları da KRAS, Nöroblastom RAS veya NRAS, Harvey sıçan sarkomu virüs onkogen veya HRAS ve ilişkili kinaz hızla hızlandırılmış Fibrosarcomas da bilinir Kirsten sıçan sarkomu virüs oncogenic mutasyonların aktive var RAFs. Son edebiyat bu yolun farklı düğümlerin inhibitörleri 3D koşulları9,10altında yetiştirilen hücre satırları alt kümesinde benzersiz olarak daha etkili olduğunu göstermektedir. Bir çalışmada kanser hücrelerinin etkin RAS ile 3D kültürlü ne zaman, onlar MAPK inhibitörleri için artan bir hassasiyet gösterdi ve ayrıca, bu yaklaşım yolları tanımlayabilir ve geleneksel 2D cevapsız inhibitörleri hedef bulundu ayarı. Bu çalışmanın amacı bu hücre satırları kültür için kullanılan yöntemleri sunmaktır ve ayrıca, kültür sistemleri sadece 3D kullanırken gözlenen bu inhibitörleri yanıtlarını diferansiyel göstermek için hücre.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) / F12</td><td>ATCC</td><td>30-2006</td><td>Hazırlanmış bir çözüm olarak satın alındı. Bu reçetenin diğer satıcılara göre tercih edildiği tespit edildi.</td></tr><tr><td>DMEM Dulbecco'nun Modifiye Eagle Media (DMEM)/F12</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td>Hazırlanmış bir çözüm olarak satın alındı.</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)</td><td>Lonza</td><td>12-115Q</td><td>Hazırlanmış bir çözüm olarak satın alındı.</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td>Hazırlanmış bir çözelti olarak satın alınır.</td></tr><tr><td>1x Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile %0.25 Tripsin:</td> <td>Hidroksilon</td><td>SH30042.01</td><td>Hazırlanmış bir çözelti olarak satın alınır.</td></tr><tr><td>1x Penisilin / Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>Hazırlanmış bir çözelti olarak satın alındı.</td></tr><tr><td>10 ng/mL İnsan temel Fibrobast Büyüme Faktörü (bFGF)</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>Steril suda tekrar süspansiyon halindedir.</td></tr><tr><td>20 ng/mL İnsan Epidermal Büyüme Faktörü (EGF)</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>Steril suda yeniden süspansiyon halindedir.</td></tr><tr><td>% 0.4 Sığır Serum Albümini (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A9418</td><td>Steril PBS ve filtrede yeniden süspansiyon.</td></tr><tr><td>1x İnsülin Transferrin Selenyum (ITS)</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>%1 Nakavt (KO) Serum Değiştirme</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td>Kullanmadan hemen önce taze ekleyin.</td></tr><tr><td>% 100 Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G7573</td><td>Hazırlanmış bir çözelti olarak satın alınır.</td></tr><tr><td><güçlü>Sarf Malzemeleri</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Küçük Kombi Kaset</td><td>ThermoFisher</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Küçük Çok Akışlı Kaset</td><td>BioTek</td><td>294085</td><td></td></tr><tr><td>1536 kuyulu steril TC plakaları (beyaz)</td><td>Corning</td><td>3727</td><td></td></tr><tr><td>1536 kuyucuklu steril TC plakaları (siyah)</td><td>Corning</td><td>3893</td><td></td></tr><tr><td>Scivax Plakaları</td><td>MBL International</td><td>NCP-LH384-10</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Ekipman</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yapıştırıcılar contalar</td><td>ThermoFisher</td><td>AB0718</td><td></td></tr><tr><td>İplik İnkübatörü</td><td>LiCONiC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz Çelik Kapaklar</td><td>Novartis Araştırma Vakfı Genomik Enstitüsü (GNF)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATS Akustik Dağıtıcı</td><td>EDS Biyosistemler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yankı Akustik Dağıtıcı</td><td>Labsit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luminometre</td><td>Envision-Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peristaltik Pompa - Multidrop Combi</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıvı İşleyici-Multiflow FX</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

yüksek işlem hacmi üç boyutlu tümör pulcuklarının nesil uyuşturucu taraması

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Kanser hücrelerinin rutin bir plastik yüzey üzerinde iki boyutta (2D) kültürlü. Bu teknik, ancak, gerçek ortamı bir tümör yoksun kitle içinde vivoiçin maruz. Solid tümör değil bir levha plastik için bağlı olarak büyümek, ama onun yerine bir üç boyutlu (3D) klonal hücre koleksiyonu gibi onların komşuları ile ve normal hücresel polarite bozulma gibi farklı mekansal özellikleri ile etkileşim alanı. Bu etkileşimler 3D kültürlü hücre içinde vivo tümörü daha alakalı olan morfolojik ve hücresel özellikleri elde etmek neden. Ayrıca, bir tümör kitle stromal ve bağışıklık hücreleri yanı sıra--dan diğer hücre tip hücre dışı matriks gibi diğer hücre türleri ile doğrudan temas halinde olduğunu. Kollajen ve fibronektin oluştururlar, yatırılır matris oluşur.
Bir girişim başucu için tezgah gelen Onkoloji araştırma bulguları ve çeviri artırmak için birçok grup kendi ilaç geliştirme stratejileri 3D modeli sistemlerinin kullanımı araştırmaya başladı. Bu sistemler bir tümör karmaşık ve türdeş olmayan ortam özetlemek girişimi çünkü daha fizyolojik ilgili olduğu düşünülür. Bu sistemler, ancak, oldukça karmaşık olabilir ve 96-şey biçimleri ve bazı şimdi bile 384 büyüme mükellef olmasına rağmen onlar büyük ölçekli büyüme ve tarama için birkaç seçenek sunar. Bu boşluğu yöntem tanımlamak burada ayrıntılı olarak kültür tümör pulcuklarının 1536-şey tabak içinde yüksek-den geçerek kapasite geliştirme yol açmıştır görülmektedir. Bu yöntemler bir uzlaşma son derece karmaşık matris tabanlı sistemler, ekran ve geleneksel 2D deneyleri için zor olan temsil etmektedir. Kanser hücre hatları farklı genetik mutasyonlar yataklık çeşitli başarıyla tarandı, Mitogen-Activated Protein Kinaz veya MAPK yolu hedefleme bileşiklerin küratörlüğünde bir kütüphane kullanarak bileşik etkinlik İnceleme. Küresel kültür yanıt-e doğru o zaman yanıt 2D olarak yetiştirilen hücrelerin karşılaştırılır ve fark faaliyetleri bildirdi. Bu yöntemler bir yüksek-den geçerek 3D ortamda bileşik etkinliğini test etmek için benzersiz bir protokol sağlar.

Çeşitli kurulan kanser hücre hatları de 2D kültür koşullar altında büyümeye bilinir burada açıklanan yöntemleri kullanarak test edildi. Temsilcisi imge--dan a değişiklik-in MAPK mutant kanser hücre hatları (Calu-6:KRAS, ncı-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS ve KNS-62:HRAS) Şekil 1' de görülmektedir. Bu görüntüler hücre hatları çeşitli türleri morfoloji olmasına rağmen her 1536-iyi tahlil levhalar yaylıdır 3D yapılar oluşan göstermektedir. Şekil ...

Hastalık göstergeler çok çeşitli, daha fizyolojik ilgili modelleri gelişmiş ve içine uygulanan ilaç bulma programları davranıyorsun. Burada açıklanan yeni modeli sistemi pulcuklarının kültürlü ve yeni Onkoloji uyuşturucu aramak için bir yüksek üretilen iş 1536-şey plaka tabanlı sistem festivalde nasıl üç boyutlu tümör göstermektedir.

Yüksek işlem hacmi üç boyutlu tümör pulcuklarının nesil uyuşturucu taraması

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Bu yöntem, ilaç keşfi alanında, isabetten kurşuna tanımlama için en uygun doku kültürü ayarının ne olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, 1536 kuyu plakası kullanılarak hücrelerin üç boyutlu, yüksek verimli bir şekilde kültürlenmesine izin vermesidir. Bu protokolü gösteren, laboratuvarımdan kıdemli bir bilim adamı olan Kalyani Gampa olacak.Bir 3D tümör sferoid kültürü oluşturmak için, ilgilenilen kanser hücre hatlarını üç yıkama BBS ile ayırın. Bunu takiben, kültür şişesinin beş santimetre karelik alanı başına bir mililitre tripsin ilavesi. Beş dakika sonra, tripsini her bir şişede serum takviyeli ortamın hacminin beş katı ile nötralize edin ve hücreleri sayın.1.536 kuyucuklu doku kültürü ile muamele edilmiş bir plakanın her bir oyuğuna sekiz mikrolitre küresel ortamda toplam 500 hücre tohumlamak için peristaltik pompa tabanlı bir sisteme sahip sterilize edilmiş, küçük paslanmaz çelik uçlu bir kaset kullanın. Ardından, plakayı kaplamak için nefes alabilen bir yapışkan plaka contası kullanın. Ve plakayı üç gün boyunca %5 karbondioksit ve %95 bağıl nem ile 37 santigrat derece ve 10 rpm'ye ayarlanmış bir eğirme inkübatörüne yerleştiri

generation-high-throughput-three-dimensional-tumor-spheroids-for-drug

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu ticari olarak temin edilebilen mikro plakalar kullanılarak, üniform bir boyut ve bileşimin kontrollü tümör küremsi (bin yüz binlerce) büyük sayılar üretmek için bir protokol getirmektedir.

Microwell Tabaklar kullanma büyüklüğü kontrollü Tümör küremsi Büyük Sayılar üretimi

Çevredeki normal dokuların invazyonu, malign tümörlerin tanımlayıcı bir özelliğidir. Burada, bir dizi ileri insan kanseri modeliyle örneklenmiş doğal bir 3D biyomatrise basit, yarı otomatik bir mikro plaka istila testi sunuyoruz.

Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki

Sulu iki fazlı bir sistem kullanılarak yüksek verimli 96 oyuklu plaka formatında kanser hücresi sferoidlerinin robotik baskısı için bir protokol sunulmaktadır.

İlaç test için bir sulu iki-fazlı bir sistem ile Cancer Celi sferoitlerin Robotik üretimi

Glioblastoma multiforme'nin hasta kaynaklı ksenogreftleri, 3D insan biyojel kültür sistemi kullanılarak canlı mikrotümörlere minyatürleştirilebilir. Bu in vivo benzeri 3D tümör testi, kinom analizi de dahil olmak üzere ilaç yanıt testi ve moleküler profilleme için uygundur.

Kinomic Profil Yöntemi ve İlaç Tepki Testi için 3D İnsan BIOGEL Kültür Sisteminin Kullanılması Microtumors ve Hasta kaynaklı Glioblastom Hücreleri Üretimi

Optik koherens tomografi (OCT), üç boyutlu görüntüleme teknolojisi, izlemek ve çok hücreli tümör pulcuklarının büyüme kinetik karakterize etmek için kullanıldı. Tümör pulcuklarının yaklaşım ve içsel optik zayıflama Karşıtlık'dayalı pulcuklarının etiket içermeyen ölü dokuyu algılama sayma Voksel kullanarak hassas hacimsel miktar gösterdi.

Boyuna morfolojik ve fizyolojik izleme optik koherens tomografi kullanarak üç boyutlu tümör pulcuklarının

Bu protokol, ilacın belirlenmesi için, hastanın türetildiği kürlerin oluşumunu, proliferasyonun ölçülmesi, sitotoksisite testi, akış sitometri, immünofluoresesans boyama ve konfoksel görüntüleme gibi aşağı akış analizini açıklar. anti-neoplastik terapötik olarak adayların potansiyeli. Bu protokol her hasta ve hastalığın aşaması için spesifik ilaçların tanımlanması ile hassas ilacı destekler.

Fizyolojik hasta, kanser kök hücrelerini hedef alan anti-neoplastik Ilaç taraması için 3B kürler türetilmiştir

Bu protokol, üç farklı sferoid tipinin üretimi için bir yöntemi, onları büyük ölçekli yüksek içerikli tarama ve analiz için uygun hale getirecek şekilde detaylandırmaktadır. Ek olarak, küresel ve bireysel hücre seviyelerinde nasıl analiz edilebileceğini gösteren örnekler sunulmaktadır.

Yüksek İçerikli Tarama ve Analiz Uygulamaları için Büyük Ölçekli Sferoid Üretimi için Sağlam Bir Yöntem

Tümör sferoidleri, tümör hücresi-mikroçevre etkileşimlerini ve tedavi yanıtını değerlendirmek için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Mevcut protokol, hızlı optik temizleme kullanarak 3D tümör sferoidlerinin yarı yüksek verimli görüntülenmesi için sağlam ama basit bir yöntemi tanımlamaktadır.

Tümör Sferoidlerinin Yarı Yüksek Verimli Analizi için Hızlı Optik Temizleme

Bu protokol, primer kanser hücrelerinden 3D tümör kültürü modelleri oluşturmayı ve hücre canlılık testleri ve mikroskobik incelemeler kullanarak ilaçlara duyarlılıklarını değerlendirmeyi açıklamaktadır.

Hasta Kaynaklı Tümör Örneklerinden 3 Boyutlu Sferoidlerin Oluşturulması ve İlaçlara Duyarlılıklarının Değerlendirilmesi

Bu makalede, üç boyutlu tümör sferoidlerinin oluşturulması için standartlaştırılmış bir yöntem gösterilmektedir. Otomatik bir görüntüleme sistemi kullanarak küresel gözlem ve görüntü tabanlı derin öğrenme analizi için bir strateji de açıklanmaktadır.

İlaç Değerlendirme Çalışmaları için 3D Tümör Sferoidlerinin Üretimi

Burada, üç boyutlu (3D) glioma sferoidlerini ve hücre dışı akı analizi yoluyla görüntülemeye dayalı normalizasyonu entegre eden bir metabolik profilleme platformu oluşturuyoruz. Bu yaklaşım, ilaç tedavilerine tümör metabolik yanıtlarının daha doğru değerlendirilmesini sağlar ve potansiyel direnç mekanizmaları hakkında bilgi sağlar.

İlaç Taraması için Üç Boyutlu Beyin Tümörü Sferoidlerinin Metabolik Profillemesindeki Gelişmeler

Keşfedin, 1536-kuyucuklu plakalarda yüksek işlem hacimli üç boyutlu tümör pulcukları yetiştirme yöntemini. Bu teknik, onkolojide yeni ilaç adaylarının hızla taranmasına ve daha fizyolojik olarak uygun sonuçlar elde edilmesine olanak tanır.

Yüksek işlem hacmi üç boyutlu tümör pulcuklarının nesil uyuşturucu taraması

Daha fazla video keşfet