Hızlı ve güvenilir yöntem LEISHMANIA parazit virülans değerlendirmek için hücre içi büyüme makrofajlar içinde miktar olduğunu

Bu deneyin genel amacı, murin kemik iliği türevi makrofajların in vitro enfeksiyonu ve ardından parazit hücre içi büyüme kinetiğinin nicelleştirilmesi yoluyla çeşitli Leishmania suşlarının virülansını değerlendirmektir. Bu yöntem, hem konakçının makrofajından hem de enfektif Leishmania parazitlerinin virülansını belirleyen patojenden gelen faktörler hakkındaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, in vivo çalışmalara kıyasla önemli ölçüde daha az hayvan gerektiren hızlı, ekonomik ve güvenilir bir yöntem olmasıdır.

Bu tekniğin etkileri, mutasyona uğramış Leishmania suşlarının enfektivitesini veya terapötik bileşiklerin etkinliğini değerlendirmek için kullanılabileceği için Leishmaniasis tedavisine kadar uzanır. Kemik iliği kaynaklı makrofaj izolasyonu ve hücre içi parazit kantifikasyon adımlarının tek başına yazılı protokollerden öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Dört ila altı haftalık bir dişi fareyi bir diseksiyon tahtasına sabitleyerek ve hayvanı% 70 etanol ile dezenfekte ederek başlayın.

Bir kalça ekleminin yakınında bir santimetrelik bir kesi yapmak için makas kullanın ve cildi eklemin etrafından tamamen kesin. Uzvu dikkatlice ayırmak için cildi bacaktan ayak bileğine doğru çekin ve kaval kemiğini sağlam bırakmak için ayağı ayak bileği ekleminden veya altından kesin. Kalça eklemini bulmak için, dönme noktasını belirlemek için uyluk kemiğini manipüle edin ve kalça ekleminin üzerindeki bacağı kesmek için makası kullanın ve uyluk kemiğinin proksimal başını dokunulmaz halde bırakın.

Bacaktan mümkün olduğunca fazla kas ve bağ dokusu çıkarın ve temizlenmiş kemikleri buz üzerinde antibiyotik takviyesi yapılmış steril RPMI içeren Petri kabına yerleştirin. İkinci bacak kemiği setini topladıktan sonra, kalan kas ve bağ dokusunu çıkarmak için sterilize edilmiş forseps ve on numara bıçak kullanın. Temizlenmiş kemikleri boş bir Petri kabı kapağına aktarın ve iliğe erişmek için her bir kaval kemiğinin her iki ucunu çıkarmak için neşteri kullanın.

Forseps kullanarak, bir tibiayı buz üzerine 50 mililitrelik konik bir tüpün ağzına yerleştirin ve antibiyotiklerle takviye edilmiş ortamlarla dolu 10 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 25 gauge bir iğnenin ucunu tibianın bir ucuna yerleştirin. Tüm kırmızı kemik iliği dokusu toplanana ve kemik beyaz görünene kadar kemikten yaklaşık beş ila 10 mililitre ortamı konik tüpe akıtın. Tüm kemik iliği toplandığında, havuzlanmış kemik iliğini santrifüjleyin ve kemik iliği hücre paletini beş mililitre kemik iliği türevi makrofaj ortamında yeniden askıya alın.

Kemik iliği hücre süspansiyonunu, 60 mililitre steril kemik iliği türevi makrofaj ortamı içeren 175 santimetre karelik bir hücre kültürü şişesine aktarın ve maksimum hücre geri kazanımını sağlamak için tüpü kültür şişesinden gelen ortamla iki kez durulayın. İkinci yıkamadan sonra, 30 mililitrelik bir hücre alikotunu ikinci bir 175 santimetre karelik hücre kültürü şişesine aktarın ve her şişeyi bir filtre kapağı ile kapatın. Daha sonra, yerleşik makrofajların herhangi bir kontamine fibroblasttan veya diğer yapışkan hücrelerden ayrılmasına izin vermek için her iki kültürü de gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Ertesi sabah, her bir şişeden 10 mililitre farklılaşmamış kemik iliği hücresi içeren süpernatanı, 100 x 15 milimetrelik doku kültürü olmayan polistiren Petri kaplarına aktarın ve hücreleri iki ila üç gün daha hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Daha sonra, kültürleri tabak başına beş mililitre taze 37 santigrat derece kemik iliği türevi makrofaj ortamı ile besleyin ve plakaları inkübatöre geri koyun. Kültürden sonraki yedi veya sekizinci günde, dört otoklavla sterilize edilmiş 12 milimetre cam kapak kızağını üst üste binmeden altı kuyulu bir kültür plakasının her bir oyuğunun dibine aktarmak için bir vakum hattına takılan bir aspirasyon ucu kullanın.

Deneyin her zaman noktası için aynı plakaları hazırlayın. Daha sonra, kemik iliği kaynaklı makrofaj kültürlerini iki kez taze 37 santigrat derece PBS ve her plakaya bir milimolar EDTA ile desteklenmiş kalsiyum ve magnezyum içermeyen beş mililitre PBS ile yıkayın. 37 santigrat derecede beş dakika sonra, ayrılan hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpte toplayın, her plakayı iki kez kalsiyum ve magnezyum içermeyen beş mililitre PBS ile durulayın.

Santrifüjlemeden sonra, makrofajları buz üzerinde beş ila 10 mililitre taze kemik iliği türevi makrofaj ortamında yeniden süspanse edin. Saydıktan sonra, hücreleri taze kemik iliği türevi makrofaj ortamında mililitre konsantrasyonunda beş kez 10 ila beşte bir oranında seyreltin ve altı oyuklu plakaya oyuk başına iki mililitre hücre ekleyin. Daha sonra, hücreleri gece boyunca hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.

Hücreleri L.amazonesis ile enfekte etmek için, parazit süspansiyonunu uygun deneysel enfeksiyon çokluğuna seyreltin ve deneyin tüm zaman noktaları da dahil olmak üzere altı kuyucuk plakasının her birine 50 ila 100 mikrolitre parazit ekleyin. Kemik iliği kaynaklı makrofajları uygun enfeksiyon süresi ve sıcaklığı için inkübe edin. Daha sonra, kuyucukları kuyucuk başına kalsiyum veya magnezyum içermeyen iki mililitre taze 37 santigrat derece PBS ile üç kez yıkayın ve ilk zaman noktası örneklerini 10 dakika boyunca 1.5 ila 2 mililitre% 2 paraformaldehit ile sabitleyin.

Daha sonraki zaman noktalarına karşılık gelen plakalar için, her oyuğa iki mililitre taze kemik iliği türevi makrofaj ortamı ekleyin ve plakaları uygun inkübatöre geri koyun. Ardından, az önce gösterildiği gibi, kalan zaman noktalarının her biri için hücreleri sabitleyin ve yıkayın ve örnekleri taze PBS'de dört santigrat derecede saklayın. Hücreleri DAPI ile boyamak için, süpernatanı kalsiyum ve magnezyum içermeyen 1,5 mililitre taze PBS ile değiştirin, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 0,1 iyonik olmayan deterjan ile takviye edin, ardından kalsiyum veya magnezyum içermeyen PBS ile üç iki mililitre yıkama yapın.

Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında bir saat boyunca bir mililitre PBS'de mililitre DAPI başına iki mikrogram ile boyayın. Üç yıkamadan sonra, kapak kızaklarını hücre tarafı aşağı bakacak şekilde, ticari olarak solmaya karşı dayanıklı bir montaj reaktifi ile monte edilmiş ayrı bir cam mikroskop lamına yerleştirin. Daha sonra, enfekte olmuş hücrelerin sayısını ölçmek için, bir floresan mikroskobunun 100x emersiyon yağı objektifini ve her büyük DAPI lekeli çekirdeğin etrafında kümelenmiş daha küçük amastigot çekirdeklerinin sayısını belirlemek için manuel bir sayaç kullanın.

Leishmania'nın iki enfektif formu vardır, kültürün durağan fazında prosiklik promastigotlardan farklılaşan metasiklik promastigotlar ve omurgalı konakçıda bulunan hücre içi enfektif form olan amastigot. Burada, aksenik olarak farklılaşmış amastigotlar, ilk enfeksiyondan bir saat sonra ve fagolizozomal füzyon yoluyla parazitoforöz vakuollerin oluşumundan önce kemik iliği kaynaklı bir makrofaj içinde görüntülenebilir. 48. saatte, virülan bir Leishmania enfeksiyonunun karakteristiği olan birden fazla paraziti barındıran belirgin büyük parazitoforöz vakuoller gözlenebilir.

Buna karşılık, virülan olmayan log faz promastigotları, parazitoforöz vakuol gelişimini başlatamaz, çoğalamaz ve sonunda konakçı makrofajlar içinde öldürülür. Bu deneyde, enfeksiyondan 72 saat sonrasına kadar hücre içi vahşi tip metasiklik Leishmania parazitlerinin sayısında sabit bir artış gözlenirken, bozulmuş mitokondriyal demir ithalatı olan mutant parazitler için hücre içi büyüme çok az veya hiç ölçülmedi, bu da mitokondriyal aktivitenin makrofajlar içinde parazit büyümesi için gerekli olduğunu düşündürmektedir. Yabani tip ve mutant aksenik amastigotlarla gerçekleştirilen makrofaj enfeksiyonları, metasiklik promastigotlarda gözlenene benzer bir hücre içi büyüme paterni gösterdi, ancak metasiklik promastigotlardan görülenden daha yüksek bir vahşi tip parazit enfektivitesi gösterdi.

Metasiklik promastigot enfeksiyonları için ilk 24 saatlik bir gecikme olduğuna dikkat etmek önemlidir, bu da içselleştirilmiş metasiklik promastigotların çoğalmaya başlamadan önce amastigotlara farklılaşması için gereken süreyi temsil eder. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa 15 gün içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, tüm deneylerde tutarlı MOI'leri sağlamak için uygun fare suşlarını kullanmak ve hem makrofaj hem de parazit hücrelerinin dikkatli bir şekilde ölçülmesini sağlamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, kemik iliği kaynaklı makrofajların nasıl kültürleneceğini ve DAPI ile nükleer boyamayı takiben hücre içi parazit büyümelerinin nicelleştirilmesi için Leishmania ile enfekte edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Leismania ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken biyolojik güvenlik kabini ve kişisel koruyucu ekipman kullanmak ve keskin aletlerden kaçınmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.