Name: Preklinik antikanser Coumarin OT48 pulcuklarının, koloni oluşumu deneyleri ve zebra balığı Xenografts Bioactivity değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Keşfedin, antikanser kumarinlerin preklinik etkinliğini 3D kültür ve zebra balığı modelleriyle değerlendirin. A549 hücreleriyle koloni oluşumu ve xenograft deneyleri, ilaç keşfi için mekanizmalı bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SNU Araştırma Kore MEST tümör Microenvironment küresel çekirdek Araştırma Merkezi (GCRC) Bursu, [grant numarası 2011-0030001]; tarafından Ulusal Araştırma Vakfı (NMG) tarafından desteklenmektedir Seul Ulusal Üniversitesi Araştırma Bursu ve beyin Kore (BK21) tarafından program artı.

1. koloni oluşumu deneyleri
<ol><li>Kültür A549 hücreleri 20.000 hücre/cm2 RPMI1640 15 ml bir konsantrasyon, hücre kültürü 10 ile desteklenmiş orta % FBS (Fetal sığır Serum) ve CO2 kuluçka CO237 ° C ve % 5, 75 cm2 şişeye %1 antibiyotik.</li>
	<li>Deneme günü, bir hemasitometre kullanarak hücre konsantrasyonu belirlemek. Santrifüjü 400 x g 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde 7 min için de tarafından 50.000 hücreleri toplamak ve 1 x steril PBS (fosfat tamponlu tuz) 1,5 mL tüpler 100 µL hücrelerde yeniden askıya alma.</li>
	<li>15 mL tüpler bir multipipette ile yarı katı methylcellulose tabanlı Orta (MCBM) 1.1 mL dağıtmak. Bir tüp her koşul için hazırlayın.</li>
	<li>FBS 110 µL P200 micropipette kullanarak MCBM için 1.1 mL ekleyin.</li>
	<li>1000 hücre/mL, Tohum hücreleri. Hisse senedi çözüm (1 x PBS 100 µL 50.000 hücreleri) hücre süspansiyon, 2.4 µL toplamak bir P2 micropipette kullanarak ve MCBM % 10 ile desteklenmiş 1.1 mL için eklemek FBS.</li>
	<li>Hücreleri, ekledikten sonra girdap tüpler için 1dk onları tutan dikey olarak en yüksek hızda MCBM ve hücreler iyice karıştırın.</li>
	<li>Test bileşikler (OT48 tek başına veya birlikte A1210477 ile) ekleyin. Bir denetim olarak ayrı bir tüp hazırlamak için kullanılan çözücü (burada dimetil sülfoksit (DMSO)). Bileşikleri ve her koşul için eklenen hacim konsantrasyonu bağlı olarak, solvent denetim solvent testi bileşik, dilutions için çözücü tarafından kaynaklanan olumsuz etkileri için değerlendirmek için kullanılan en yüksek konsantrasyonu içerir.</li>
	<li>Girdap tüpler 1 dakika.</li>
	<li>Her tahlil için karışımı P1000 micropipette ile 1 mL merkezine de 12-şey hücre kültür plaka ekleyin.</li>
	<li>Boş wells ile 1 mL steril su veya nem stabilize etmek için 1 x PBS doldurun.</li>
	<li>Kültür plakaları bir kuluçka 37 ° C ve % 5 CO210 gün kuluçkaya.</li>
	<li>Kuluçka, 10 gün sonra 200 µL MTT (methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromür) hisse senedi çözümünün (5 mg/mL) 1 mg/mL nihai bir konsantrasyon ulaşmak için her şey için ekleyin.</li>
	<li>Kuluçka 37 ° C ve % 5 CO210 min kuluçkaya. Kalıcı koloniler dönecek violet.</li>
	<li>Beyaz arka plan plaka (LAS beyaz dia tepsi) kullanarak bir dijital kamera ile çekim. Kullanma ertesi gün koyma: Yöntem, dijital ortama; Pozlama türü, hassas; Çekim hızı, el kitabı, 1 saniye; Hassasiyet/çözünürlük, yüksek çözünürlüklü. Resmi TIFF formatında kaydedin.</li>
	<li>Kalıcı koloniler ImageJ yazılım kullanarak ölçmek. Seç menüsünü "görüntü | Türü | 8 bit". Seç menüsünü "ayarlama | Eşik". Eşik denetimine ayarlayın ve tüm koşulları için sabit tutmak; Seç menüsünü "Analyze | «««Analiz"parçacıkları. Verileri kaydetmek ve grafik olarak gösterilmesi için bir istatistik yazılım ile analiz.</li>
</ol>2. küresel oluşumu tahlil
<ol><li>Kültür A549 hücreleri 20.000 hücre/cm2 ' 75 cm2 şişeler bir konsantrasyon ile 15 mL RPMI 1640 orta % 10 FBS ve % 1 antibiyotik ile desteklenmiştir.</li>
	<li>Deneme günü, 96 hazırlamak de U-alt plaka.</li>
	<li>Bileşik faiz (OT48, burada 50 µM) ve/veya A1210477 20 µM içeren bir kuyuya plaka 10.000 hücre. Hücre kültür ortamının 100 µL için son ses düzeyini ayarlayın. Sağlam bir dış kenarlığı ile Tekdüzen pulcuklarının oluşturan hücreleri formu pulcuklarının için yeterli kabul edilir.</li>
	<li>Bir kuluçka 37 ° C'de ve % 5 CO23 gün kuluçkaya.</li>
	<li>Kuluçka 3 gün sonra 4 x büyütme ile hafif bir mikroskop kullanarak pulcuklarının görüntülerini yakalamak.</li>
</ol>3. zebra balığı Xenograft tahlil
Not: Bu teknik yaklaşım bir şematik (Şekil 1) görüntülenir.
<ol><li>
Hisse senedi reaktifler hazırlanması
	<ol>
<li>30 Danieau'nın çözüm x 1 L hazırlamak: 1740 mM NaCl, 21 mM KCl, 12 mM MgSO4∙7H2O, 18 mM Ca (NO3)2ve 150 mM HEPES. PH metre kullanarak 7,6 arabelleğe pH için ayarlayın.</li>
		<li>%1 (50 x) tricaine çözüm hazırlamak: 20 mg 2 mL distile su içinde etil 3-aminobenzoate methanesulfonate (tricaine) geçiyoruz.</li>
		<li>%1 fenol Red-PBS çözeltisi hazırlamak: fenol Red sodyum tuz solüsyonu 1,5 µL tüp içinde sterilize PBS çözümün 198 µL için Ekle 2 µL.</li>
		<li>%3 methylcellulose hazırlamak: 1 Danieau'nın çözüm x 100 ml methylcellulose 3 g ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zebra balığı yumurta üretimi ve kuluçka
	<ol>
<li>Ayrı bir kadın ve bir erkek zebra balığı bir bölüm tank karanlıkta 28.5 ° C'de UV sterilize ve filtre uygulanmış musluk suyu ile dolu. Ayrılık 24 saat sonra balık çiftleşme başlatmak için her iki cinsiyette karıştırın. Döllenmiş yumurta çiftleşme tankından 5 mL taze Danieau'nın çözeltisi içeren bir Petri kabına aktarın.</li>
		<li>Yumurta 3 kez 5 mL Danieau'nın çözeltisi ile yıkayın. Yıkama için dikkatle yumurta bir pipet ve 5 mL taze çözüm de aktarmak ile Aspire edin. 28.5 ° C'de 8 h için kuluçkaya<ol>
<li>Kuluçka Danieau'nın çözüm içinde 8 h sonra %0,03 1-fenil-2-Tioüre (pigmentasyon inhibe PTU) içeren Danieau'nın eriyik-e doğru değiştirmek. Kontaminasyonu önlemek için opak yumurta (döllenmemiş veya içeren gelişmemiş embriyo) sıralamak.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Embriyo dechorionation
	<ol>
<li>24 saat sonrası döllenme (hpf), keskin forseps kullanarak dechorionate zebra balığı embriyo. Damızlık embriyo % 0.03 ile Danieau'nın çözümde kuluçkaya PTU 48 kadar 28.5 ° C'de hpf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bileşik tedavi hücre hazırlık
	<ol>
<li>Tohum A549 hücreleri 20.000 hücre/cm2 25 cm2 kültür şişeler'de. Tohum 24 saat sonra bileşikler ekleyin (50 µM, burada OT48 ve ve/veya A1210477, 20 µM) bir kuluçka 37 ° C ve % 5 CO224 h için. Tedavi süresi her bileşik için hücrelerin canlılık korumak için ama onları hücre ölüme doğru işlemek için ayarlayın. Bu sefer noktası ihtiyaçlarını tek tek ayarlamak için hücre canlılığı, Morfoloji ve moleküler işaretleyiciler dayalı.</li>
		<li>2 h tedavi sonundan önce leke hücreleri floresan hücre izci 4 µM ile 37 ° C ve % 5 CO2CM-Dil boya. 2 h, kuluçka sonra % 0.05 tripsin-EDTA içeren hücreleri trypsinize ve fenol Red-PBS çözüm enjeksiyon önce 50 µL 106 hücrelerde sulandırmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mikro-enjeksiyon xenograft oluşumu için kanser hücrelerinin
	<ol>
<li>Onlar bir agar plaka üzerinde sakinleşene kadar zebra balığı 5 min için %0,02 tricaine çözümünde anestezi.</li>
		<li>1.0 mm (dış çapı (OD) cam kapiller) tarafından bir micropipette çektirmenin çekin (Program ayarları: P: 300, ısı: 260, çekin: 60, VEL: 50 ve Saat: 200). Microcapillary bir keskin kenar üretmek için bir şırınga ile kesti. Yük microcapillaries hücre/fenol Red 20 µL ile-PBS çözüm. Ayarla enjeksiyon basıncı ve 2 dağıtmak için zaman nL enjeksiyon başına.</li>
		<li>100-200 hücreleri sarısı kesesi içine enjekte ederek 6 ila 10 tarafından enjekte nL 3-5 enjeksiyon yoluyla. Enjeksiyon sonra balık 10-30 dk için 5 mL taze Danieau'nın çözüm PTU solüsyon içeren kurtarmak izin. 1 mL PTU solüsyon içeren Danieau'nın çözeltisi ile 24-şey plakalar Merkez balık vardır ve 28.5 ° C'de 72 h için kuluçkaya</li>
		<li>72 h, kuluçka sonra balık %0.02 tricaine çözümünde anestezi ve % 3 methylcellulose bir damla ile bir cam slayt üzerinde hareketsiz. Bir dalga boyu 620-750, floresans mikroskobu tarafından 5 x fotoğraf çekmek nm.</li>
		<li>ImageJ yazılım tarafından floresan tümör boyutunu ölçmek. Seç menüsünü "Analyze | Ölçü birimi". Floresan sinyal karşılık gelen değerleri kaydetmek ve grafik olarak gösterilmesi için bir istatistik yazılım ile analiz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulation+of+cell+signaling+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Deregulation of cell signaling in cancer.</a> FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).</li>
<li>Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bioprinting for cancer research.</a> Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).</li>
<li>Santo, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+3D+in+vitro+tumor+models%3A+overcoming+current+pitfalls+of+efficacy+read-outs%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs.</a> Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).</li>
<li>Tanner, K., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+3D+culture+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Beyond 3D culture models of cancer.</a> Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289(2015).</li>
<li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture%3A+a+review+of+current+approaches+and+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).</li>
<li>Talhi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bis%284-hydroxy-2H-chromen-2-one%29%3A+synthesis+and+effects+on+leukemic+cell+lines+proliferation+and+NF-kappaB+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).</li>
<li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17406473">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li>
<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Tumor+Models%3A+Advantages%2C+Disadvantages%2C+Variables%2C+and+Selecting+the+Right+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytostatic+hydroxycoumarin+OT52+induces+ER%2FGolgi+stress+and+STAT3+inhibition+triggering+non-canonical+cell+death+and+synergy+with+BH3+mimetics+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer.</a> Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+to+the+soft-agar+assay+that+permits+high-throughput+drug+and+genetic+screens+for+cellular+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).</li>
<li>Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Cell+Cycle+Imaging+in+a+3D+Cell+Culture+Model+of+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).</li>
<li>Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging-+and+Flow+Cytometry-based+Analysis+of+Cell+Position+and+the+Cell+Cycle+in+3D+Melanoma+Spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53486(2015).</li>
<li>Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+cell+culture+techniques+for+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery.</a> Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).</li>
<li>Ji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dialkyl+resorcinol+stemphol+disrupts+calcium+homeostasis+to+trigger+programmed+immunogenic+necrosis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer.</a> Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Koloni oluşumu MCBM ile elde edilen oranda hücre türüne bağlıdır. Genellikle, yapışık olmayan hücreler için koloni sayısı çok daha yüksek yapisan hücrelere karşılaştırılır. A549 hücreleri 10 gün sonra 30-40 kolonileri oluşturduğu görülmektedir. Daha önce farklı lösemi hücreleri için kolonileri sayısının 200-2509arasında olduğunu bildirdin. Sonuçlarımız OT48 yalnız kolonileri yalnız sayısı önemli bir azalma getirmedi gösterdi. Ancak, BH3 ile birlikte mimetic A1210477 koloni şekillendirme yeteneği A...

Kanser tarafından hücresel mutasyonlar neden olur ve sonuç olarak biyokimyasal sinyal yolları kontrolsüz hücre bölünmesi ve hücre ölümü direnç tetikleyen bozdu. Tümörleri sindirim, sinir, dolaşım sistemi ve daha sonra komşu dokulara1fizyolojik fonksiyonları müdahale. Kapsamlı bir araştırma, kanser dünya2' deki en yaygın hayatı tehdit eden hastalık imlere rağmen. Hassas tıp gelecekteki kanser tedavi temel olarak kabul edilmiştir. Yeni moleküler varlıklar klinik sonuç geliştirmek için mevcut uyuşturucu ile birlikte düzenli olarak test edilir.
Ancak, yeni verimli hedefli tedaviler gelişimi ile ilişkili önemli kısıtlamalar uyuşturucu pozlama3tam biyolojik sonucu benzetimini yapmak için yaygın olarak kullanılan deneyleri başarısızlığın biridir. Kanser ilaç keşif hala çoğunlukla terapötik ajanlar etkinliğinin klinik4' te doğrulamak zor olan 2D monolayer kültürde kültürlü kanser hücre hatlarında test dayanır. Bu nedenle, daha iyi taklit tümörler vivo içinde5yerel özelliklerini daha iyi kanser modelleri geliştirmek için büyüyen bir ilgi vardır. Son yıllarda, 3D kültür modelleri artan bir ilgi 3D tümör modelleri5üretmek için geliştirilmiş yöntemleri geliştirmede sonuçlandı.
Burada, bir yaklaşım içinde derinlik vivo deneyleri daha önce BH3 mimetics ile birlikte OT486 Hidroksikumarin potens anlayış geliştirmek için izin üç farklı 3D hücre kültürü teknikleri ile mevcut. Daha fazla akciğer kanser hücrelerini OT48 ve BH3 mimetics arada etkinliğini doğrulamak ve kanser bir yaşam ilerlemesinde izlemek için bir zebra balığı modelini temel bir vivo içinde tümör oluşumu testi ile koloni ve SFAs birleştirerek bizim Yöntem oluşur organizma.
Koloni oluşumu deneyleri düzenli olarak hem katı hem de hematopoetik kanserler için antikanser ajanların etkinliğini değerlendirmek için kullanılır. Tahlil süresiz olarak çoğalırlar ve koloniler7oluşturmak için hücre yeteneğini belirler. Antikanser Ajan etkisi yetenek hücre oluşturan colony sayısı azalması ve/veya koloniler boyutunu tarafından belirlenir.
Pulcuklarının vitro tümör modelleri temsil ve antikanser maddeleri için bir düşük maliyetli tarama platform olarak hizmet. Pulcuklarının süspansiyon büyüyen hücresi ya da 3D dizey içinde gömülü. Bu yaklaşım yaygın uyuşturucu tarama ve tümör büyüme, yayılmasını önleme ve bağışıklık etkileşim8çalışmalar için kullanılır.
Tamamen yeni bir ilaç özelliklerini anlamak için in vivo deneyler kemirgenler üzerinde esastır. Ancak, geleneksel bu yöntem pahalı ve zaman alıcı. Son yıllarda, zebra balığı (Danio rerio) daha ucuz ve daha hızlı yükseltmek için yaygın olarak okudu laboratuvar organizma oldu. Tümör zebra balığı temsil bir 3D hücre kültür yaklaşımda ama içinde vivo ayarındaki omurgalı9geliştirdi.
Tamamen, biz burada Hidroksikumarin OT48 BH3 mimetics ile birlikte bir akciğer kanseri A549 hücre modelindeki antikanser kapasitesini göstermek için CFAs, SFAs ve zebra balığı vivo içinde tümör oluşumu da dahil olmak üzere üç farklı 3D kültür yaklaşımları kullanın.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Koloni oluşumu deneyleri için gerekli malzemeler< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C & derece;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Londra</td><td>30096</td><td>4 C & derece;</td></tr><tr><td>FBS</td><td></td><td>Biyobatı S1520-500-20</td> <td>C & deg;</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Lonza</td><td>17-602E-20</td> <td>C & deg;</td></tr><tr><td>Hücre kültürü şişesi T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS çözeltisi</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>1.5ml tüp</td><td>Extragene</td><td>Tüpü-170-C</td><td>RT</td></tr><tr><td>15 ml tüp</td><td>Hyundai Micro</td><td>H20015</td><td>RT</td></tr><tr><td>12 kuyulu plaka</td><td>SPL</td><td>30012</td><td>RT</td></tr><tr><td>MethoCult</td><td>StemCell teknolojileri</td><td>4230-20</td> <td>C & deg;</td></tr><tr><td>Tiyazolil Mavi Tetrazolyum Bromür (MTT tozu)</td> <td>Sigma</td><td>M5622</td><td>4 C & deg;</td></tr><tr><td>LAS4000</td><td>GE Sağlık Teknolojileri</td><td></td><td>RT</td></tr><<tr><td>güçlü>Küresel oluşum deneyi için gerekli malzemeler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Londra</td><td>30096</td><td>4 C & derece;</td></tr><tr><td>FBS</td><td></td><td>Biyobatı S1520-500-20</td> <td>C & deg;</td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>Lonza</td><td>17-602E-20</td> <td>C & deg;</td></tr><tr><td>Hücre kültürü şişesi T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS çözeltisi</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C & deg;</td></tr><tr><td>Corning costar ultra düşük ataşman 96 kuyulu plaka</td><td>Corning</td><td>3474</td><td>RT</td></tr><tr><td>Mikroskopi</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>RT</td></tr><tr><td>Zebra balığı ksenogreftleri için gerekli malzemelerA549</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Londra</td><td>30096</td><td>4 C & derece;</td></tr><tr><td>FBS</td><td></td><td>Biyobatı S1520-500-20</td> <td>C & deg;</td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>Lonza</td><td>17-602E-20</td> <td>C & deg;</td></tr><tr><td>Hücre kültürü şişesi T25</td><td>SPL</td><td>70025</td><td>RT</td></tr><tr><td>Hücre kültürü şişesi T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>Hücre kültürü şişesi T175</td><td>SPL</td><td>71175</td><td>RT</td></tr><tr><td>1.5ml tüp</td><td>Ekstragen</td><td>Tüpü-170-C</td><td>RT</td></tr><tr><td>24 kuyulu plaka</td><td>SPL</td><td>30024</td><td>RT</td></tr><tr><td>Petridish</td><td>SPL</td><td>10100</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS çözeltisi</td><td>Hidroklon</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C & deg;</td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71382</td><td>RT</td></tr><tr><td>Potasyum klorür (KCL)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>RT</td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat heptahidrat (MgSO4.7H2O)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td>RT</td></tr><tr><td>Kalsiyum nitrat tetrahidrat (Ca (NO3) 2)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C1396</td><td>RT</td></tr><tr><td>HEPES çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>RT</td></tr><tr><td>Etil 3-aminobenzoat metansülfonat (Trikain)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>RT</td></tr><tr><td>Fenol Kırmızısı çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>RT</td></tr><tr><td>Metilselüloz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td>RT</td></tr><tr><td>1-fenil-2-tiyoüre (PTU)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>RT</td></tr><tr><td>CM-Dil boyası</td><td>Invitrogen</td><td>C7001-20</td> <td>C & deg;</td></tr><tr><td>Cam kılcal Dünya</td><td>Hassas Aletler</td><td>TW 100F-4</td><td>RT</td></tr><tr><td>Mikropipet çektirme</td><td>Deklanşör aleti, ABD</td><td>P-97</td><td>RT</td></tr><tr><td>Mikro enjektör</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>PV820</td><td>RT</td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>KOVAX</td><td>1ml</td><td>RT</td></tr><tr><td>Mikro yükleyici</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>RT</td></tr><tr><td>Cam kaydırak</td><td>Marienfeld</td><td>HSU-1000612</td><td></td></tr><tr><td>RT Floresan mikroskobu</td><td>Leica</td><td>DE/DM 5000B</td><td>RT</td></tr></tbody></table>

preklinik antikanser coumarin ot48 pulcuklarının, koloni oluşumu deneyleri ve zebra balığı xenografts bioactivity değerlendirilmesi

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Roman terapötik ajanlar içinde in vitro ve in vivo önceden klinik tarama çoğu kanser ilaç keşif önemli bir araçtır. Her ne kadar insan kanser hücre hatları 2D (boyutlu) monolayer hücre kültürlerinde terapötik bileşiklerin yanıt, 3D kültür sistemleri daha fizyolojik ilgili modelleri ilaçların etkinliğini anlamak için geliştirilmiştir. Son yıllarda, daha doğrusu tümör microenvironment taklit eden 3D kültür sistemlerinde yeni moleküller potens doğrulamak için önceden klinik araştırma bir paradigma kayması gözlendi. Bu sistemler daha fizyolojik ilgili bir şekilde hastalık durumu karakterize ve daha iyi mekanik kavrama ve belirli bir molekül farmakolojik potens anlayış kazanmak için yardım. Ayrıca, in vivo kanser modelleri iyileştirilmesinde mevcut trendi ile zebra balığı vivo içinde tümör oluşumu değerlendirmek ve terapötik ajanlar etkisini incelemek için önemli bir omurgalı model olarak ortaya çıkmıştır. Burada, biz Hidroksikumarin OT48 tedavi edici etkinliği tek başına veya akciğer kanseri hücre kültürünü A549 BH3 mimetics ile birlikte koloni oluşumu deneyleri (CFA), küresel oluşumu tahlil (SFA) dahil olmak üzere üç farklı 3D kültür sistemleri kullanarak araştırdık ve vivo zebra balığı xenografts.

Şekil 2' de, akciğer kanseri hücre satırı A549 MCBM içinde form kolonilere OT48 ile tedavi sonra tek başına veya birlikte belirtilen konsantrasyonlarda BH3 mimetic A1210477 ile seribaşı. Sonuçlar kasanın numarası, boyut ve kolonilerin toplam yüzey alanı kuluçka 10 gün sonra azaltılacağını olduğunu gösterdi.
Şekil 3' te A549 hücreleri ile OT48 tek başına veya birlikte BH...

Burada, antikanser coumarins 3D kültür ve zebra balığı kullanarak preklinik tarama mevcut.

Preklinik antikanser Coumarin OT48 pulcuklarının, koloni oluşumu deneyleri ve zebra balığı Xenografts Bioactivity değerlendirilmesi

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Bu yöntem, anti-kanser etkisini tanımlamak ve in vitro ve in vivo 3D kültür sistemlerini kullanarak yeni moleküller hakkında daha iyi mekanik bilgi edinmek için ilaç keşfi alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bileşiklerin farmakolojik olarak daha fizyolojik olarak ilgili bir in vivo modeldeki farmakolojik etki çeşitleridir. Başlamak için, 75 santimetrelik bir şişede% 10 FBS ve% 1 antibiyotik ile desteklenmiş 15 mililitre RPMI 1640 hücre kültürü ortamında santimetre kare başına 20.000 A549 hücresi plakalayın.Kültürü 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin. Deney gününde, hücre konsantrasyonunu belirlemek için bir hemositometre kullanın. Yedi dakika boyunca 400g'de santrifüjleme ile 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde 50.000 hücre toplayın ve hücreleri 100 mikrolitre steril 1x PBS'de yeniden süspanse edin.Çoklu pipet kullanarak, 1,1 mililitre yarı katı metilselüloz bazlı ortamı veya MCBM'yi tüplere dağıtın ve her koşul için bir tüp hazırlayın. Ardından, her tüpe 110 mikrolitre FBS ekleyin. Ardından, mililitre başına 1000 hücre tasarruf edin.Daha sonra, 2.4 mikrolitre stok hücre çözeltisini MCBM ve FBS tüplerine pipetleyin. Hücreleri ekledikten sonra, tüpleri dikey olarak tutun ve MCBM ile hücreleri iyice karıştırmak için bir dakika boyunca en yüksek hızda girdaplayın. Şimdi, numunelere tek başına veya A1210477 ile kombinasyon halinde OT48 test bileşiği ekleyin.DMSO gibi kullanılan çözücü için kontrol olarak ayrı bir tüp hazırlayın. Ardından, numuneleri bir dakika boyunca vorteksleyin. Her tahlil için, karışımın bir mililitresini 12 oyuklu bir hücre kültürü plakasının merkez kuyucuğuna pipetleyin.Ardından, boş kuyuları doldurmak için bir mililitre steril su veya PBS kullanın. Plakaları 10 gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin. Daha sonra, her bir kuyucuğa mililitre MTT stok çözeltisi başına beş miligramdan 200 mikrolitre ekleyin.Plakaları on dakika inkübe ettikten sonra, menekşe rengine dönecek canlı koloniler olup olmadığını kontrol edin. Beyaz bir arka plan plakası kullanarak, aşağıdaki ayarları kullanarak görüntüleri yakalayın:Yöntem için sayısallaştır'ı seçin. Pozlama türü için hassasiyeti seçin.Pozlama süresi için manuel ve bir saniyeyi seçin. Hassasiyet ve çözünürlük için yüksek çözünürlüğü seçin. Ardından, yakalanan görüntüleri TIFF formatında kaydedin.ImageJ yazılımıyla, menü görüntüsünü, yazın, 8 bit'i seçerek canlı kolonileri ölçün. Menü ayarını ve eşiği seçin. Kontrol etmek için eşiği ayarlayın ve tüm koşullar için sabit tutun.Ardından, menü analizini seçin, parçacıkları analiz edin. Verileri kaydedin ve grafiksel gösterim için bir istatistik yazılımı ile analiz edin. Stok reaktiflerini metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, 28,5 santigrat derecede UV ile sterilize edilmiş ve filtrelenmiş musluk suyu ile doldurulmuş bir bölme tankında bir dişi ve bir erkek zebra balığını ayırın ve karanlıkta koyun.24 saatlik ayrılıktan sonra, çiftleşmeyi başlatmak için bölmeyi çıkarın. Döllenmiş yumurtaları çiftleşme tankından beş mililitre taze Danios çözeltisi içeren bir Petri kabına aktarın. Yumurtaları dikkatlice aspire etmek için bir pipet kullanarak yumurtaları üç kez yıkamak için beş mililitre Danios solüsyonu kullanın ve bunları beş mililitre taze solüsyona aktarın.Daha sonra yumurtaları 28,5 santigrat derecede sekiz saat kuluçkaya yatırın. Pigmentasyonu engellemek ve kontaminasyonu önlemek için opak döllenmemiş yumurtaları ayırmak için% 0.03 PTU içeren Danios çözeltisine geçin. Döllenmeden 24 saat sonra, embriyoları dekoryonlaştırmak için keskin forseps kullanın.Daha sonra, embriyoları döllenmeden 48 saat sonrasına kadar PTU ile Danios solüsyonunda inkübe edin. A549 hücrelerini tohumladıktan ve metin protokolüne göre bileşiklerle inkübe ettikten sonra, tedavinin bitiminden 24 saat önce, hücreleri lekelemek ve iki saat boyunca inkübe etmek için floresan hücre izleyici boyası CM-Dil'in dört mikromolarını ekleyin. İnkübasyonun ardından, hücreleri tripsinize etmek için% 0.05 Tripsin-EDTA kullanın.Daha sonra, enjeksiyondan önce 50 mikrolitre fenol kırmızı PBS çözeltisinde on ila altıncı hücreyi seyreltin. Kanser hücrelerinin mikroenjeksiyonunu yapmak için, aşağıdaki program ayarlarını kullanarak 1.0 milimetrelik bir cam kılcal damar çekin: Keskin bir kenar oluşturmak için kılcal damarı kesmek için bir şırınga kullanın. Ardından, mikrokılcal damarları 20 mikrolitre hücre fenol kırmızısı çözeltisi ile doldurun.Zebra balığını metin protokolüne göre uyuşturduktan sonra, üç ila beş enjeksiyonla altı ila on nanolitre enjekte ederek yumurta sarısı torbasına 100 ila 200 hücre enjekte edin. Mikroenjeksiyonlar, hücrelerin doğru hacminin enjekte edildiğinden ve enjeksiyon yaralanmasının minimum olduğundan emin olmak için çok dikkatli ve hassas bir şekilde yapılmalı ve yanal bir fissürden kaçınmak için karbondioksit basıncı optimal olmalıdır. Enjeksiyondan sonra, balığın PTU içeren beş mililitre taze Danios çözeltisinde on ila 30 dakika iyileşmesine izin verin.Balıkları bir mililitre Danios PTU çözeltisi ile 24 oyuklu plakaya aktarın ve 72 saat boyunca 28,5 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkayı takiben, balıkları metin protokolüne göre uyuşturduktan sonra,% 3 metil selüloz damlası ile bir cam slayt üzerinde hareketsiz hale getirin. 620 ila 750 nanometre dalga boyunda 5x floresan görüntüler çekin.Floresan tümörlerin boyutunu seçmek için ImageJ yazılımını kullanın: seçin ve ölçün. Ardından, floresan değerlerini kaydedin ve grafiksel gösterim için bir istatistik yazılımı ile analiz edin. Bu deneyde, akciğer kanseri hücre hattı A549, tek başına OT48 ile veya burada görülen konsantrasyonda BH3 mimetik, A1210477 ile kombinasyon halinde tedavi edildikten sonra koloniler oluşturmak üzere MCBM'ye ekildi.Sonuçlar, kombinasyonun, on günlük inkübasyondan sonra kolonilerin sayısını, boyutunu ve toplam yüzey alanını önemli ölçüde azalttığını gösterdi. Burada, tek başına OT48 ile veya BH3 mimetik A1210477 ile kombinasyon halinde muameleden sonra, hücrelerin U-alt plaka tekniği kullanılarak sferoidler oluşturmasına izin verildi. Üç günlük bir inkübasyonun ardından, sferoidler görüntülendi ve ölçüldü ve 3D görüntüler oluşturuldu.Bu şekil, tedavi edilen hücreler zebra balığı yumurta sarısı torbasına enjekte edildiğinde oluşan floresan tümörlerin nicelleştirilmesinden kaynaklanan tümör oluşumu üzerindeki OT48 ve/veya A1210477 inhibitör potansiyelini göstermektedir. Bu prosedürü denerken, verilerin istatistiksel değerlendirmesini etkileyen önemli değişikliklerden kaçınmak için her koşul için balık sayısını on veya daha fazla tutmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, zebra balığı ksenogreftinde hedef protein ekspresyonunu değerlendirmek için histolojik analiz gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.Bu teknik, ilaç keşfi alanındaki araştırmacıların, zebra balığı ksenogreftinde in vivo bir mikro ortamda bileşiklerin etkinliğini keşfetmelerinin yolunu açıyor. Bu videoyu izledikten sonra, bir 3D kültür ortamında ilaç etkinliğinin nasıl doğrulanacağını iyi anlamış olmalısınız.

preclinical-assessment-bioactivity-anticancer-coumarin-ot48-spheroids

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu videoda, zebra balığı hastasından türetilmiş bir ksenogreft modeli oluşturma tekniği açıklanmaktadır. Örnek protokolünde, Gemsitabin ve Navitoclax ilaçlarının pankreas tümörü ksenogreft modeli üzerindeki etkinliğini değerlendiriyoruz.

Zebra Balığı Hasta Kaynaklı Ksenogreft (zPDX): Bir Kanser Modeli

Bu videoda, akciğer kanseri hücrelerinin süresiz olarak çoğalma ve bireysel koloniler oluşturma yeteneğini belirlemeye yardımcı olan koloni oluşumu testi açıklanmaktadır. Bir antikanser ajanının koloni oluşturan hücreler üzerindeki etkisini, ortaya çıkan kolonilerin sayısındaki ve/veya boyutundaki değişiklikleri analiz ederek analiz edebiliriz.

Koloni Oluşumu Deneyi: Antikanser Ajanların Koloni Oluşturan Akciğer Kanseri Hücreleri Üzerindeki Etkinliğinin Değerlendirilmesi

Bu videoda, in vivo tümör oluşumunu değerlendirmek ve terapötik ajanların etkisini incelemek için zebra balığı ksenogreft testi açıklanmaktadır.

Zebra Balığı Ksenogreft Testi: Zebra Balığı İn Vivo Tedavisinde Terapötiklerin Tümörojenite Üzerine Anti-kanser Etkinliğini Değerlendirmek İçin Bir Yöntem

Bu videoda, transgenik zebra balığı tümör modeli kullanarak melanom modifiye eden genleri taramak için bir yöntem açıklanmaktadır. Melanoma neden olan bir miniCoopR vektörü enjekte edildiğinde, zebra balığı melanom geliştirir ve bu nedenle zebra balığında tümör gelişimini etkileyen genetik faktörleri incelemek için kullanılabilir.

miniCoopR Vektör Tabanlı Transgenez: Zebra Balığı Tümör Modelinde Melanoma Neden Olan Genleri Taramak İçin Bir Teknik

Bir zebrafish otokton tümör modeli kullanılarak melanoma düzenleyiciler için ekran için hızlı bir şekilde sunulmaktadır. Bu melanosit aday melanom genlerin ifadesi için izin miniCoopR vektör yararlanır. Melanom sağkalım eğrileri, bir işgal testi, ölçek melanosit antikor boyama için bir protokol ve bir melanom nakli tahlil elde bir yöntem tarif edilmiştir.

Bir Zebra balığı Otokton Tümör Modeli kullanılarak Melanom Değiştiricileri için Tarama

Bu yöntem etkili bir kanser hücrelerinin damar invaziv yeteneğini test etmek zebrafish embriyolar kullanır. Floresan kanser hücrelerinin gelişmekte olan embriyo precardiac sinüs ve yumurta sarısı kesesinin içine enjekte edilir. Kanser hücresi vasküler invazyon ve damar dışına 24-96 saat sonra kuyruk bölgenin floresan mikroskobu ile değerlendirilir.

Zebra balığı Kanser Hücrelerinin Vasküler İnvaziv Yetenek (Test<em&gt; Danio rerio</em&gt;)

Zebrabalığı ksenogreft modelleri, in vivo mikroortamda yüksek üretimli ilaç taraması ve insan kanser hücrelerinin floresan görüntülemesini sağlar. Zebra balığında hasta kaynaklı lösemi örnekleri üzerinde otomatik floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi kullanılarak büyük ölçekli, otomatik ilaç taraması için bir iş akışı geliştirdik.

Zebrabalığında Primer Hasta Kaynaklı Tümör Xenograftların İlaç Taraması

Burada, ksnograftlar ve tümör davranış analizi, tam montajlı immünofluoresans ve konfokal görüntüleme nicelemesi için yönergeler oluşturmak için ipuçları içeren adım adım bir protokol sunuyoruz.

Zebra Balığı Larva Xenografts ve Tümör Davranış AnaliziNin Üretimi

Preklinik modeller, kanser biyolojisi bilgisini ilerletmeyi ve tedavi etkinliğini öngörmeyi amaçlamaktadır. Bu yazıda, zebra balığı bazlı hasta kaynaklı ksenogreftlerin (zPDX'ler) tümör doku fragmanları ile üretilmesi açıklanmaktadır. zPDX'ler, terapötik etkisi nakledilen dokunun hücre apoptozu açısından değerlendirilen kemoterapi ile tedavi edildi.

Kemosensitivite Testi için Pankreas Kanserinden Zebra Balığı Hasta Kaynaklı Ksenogreftlerin Kurulması

Bu protokol, primer kanser hücrelerinden 3D tümör kültürü modelleri oluşturmayı ve hücre canlılık testleri ve mikroskobik incelemeler kullanarak ilaçlara duyarlılıklarını değerlendirmeyi açıklamaktadır.

Hasta Kaynaklı Tümör Örneklerinden 3 Boyutlu Sferoidlerin Oluşturulması ve İlaçlara Duyarlılıklarının Değerlendirilmesi

Bu protokol, zebra balığı larvalarında döllenmeden 3-7 gün sonra bir ilaç tarama prosedürünü ve ardından morfolojik değerlendirmeyi tanımlar.

Erken Evre Zebra Balığı Larvalarında Küçük Molekül Taraması ve Toksisite Testi

Keşfedin, antikanser kumarinlerin preklinik etkinliğini 3D kültür ve zebra balığı modelleriyle değerlendirin. A549 hücreleriyle koloni oluşumu ve xenograft deneyleri, ilaç keşfi için mekanizmalı bilgiler sunar.

Preklinik antikanser Coumarin OT48 pulcuklarının, koloni oluşumu deneyleri ve zebra balığı Xenografts Bioactivity değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal

Preklinik antikanser Coumarin OT48 pulcuklarının, koloni oluşumu deneyleri ve zebra balığı Xenografts Bioactivity değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet