Preklinik antikanser Coumarin OT48 pulcuklarının, koloni oluşumu deneyleri ve zebra balığı Xenografts Bioactivity değerlendirilmesi

Bu yöntem, anti-kanser etkisini tanımlamak ve in vitro ve in vivo 3D kültür sistemlerini kullanarak yeni moleküller hakkında daha iyi mekanik bilgi edinmek için ilaç keşfi alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bileşiklerin farmakolojik olarak daha fizyolojik olarak ilgili bir in vivo modeldeki farmakolojik etki çeşitleridir. Başlamak için, 75 santimetrelik bir şişede% 10 FBS ve% 1 antibiyotik ile desteklenmiş 15 mililitre RPMI 1640 hücre kültürü ortamında santimetre kare başına 20.000 A549 hücresi plakalayın.

Kültürü 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin. Deney gününde, hücre konsantrasyonunu belirlemek için bir hemositometre kullanın. Yedi dakika boyunca 400g'de santrifüjleme ile 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde 50.000 hücre toplayın ve hücreleri 100 mikrolitre steril 1x PBS'de yeniden süspanse edin.

Çoklu pipet kullanarak, 1,1 mililitre yarı katı metilselüloz bazlı ortamı veya MCBM'yi tüplere dağıtın ve her koşul için bir tüp hazırlayın. Ardından, her tüpe 110 mikrolitre FBS ekleyin. Ardından, mililitre başına 1000 hücre tasarruf edin.

Daha sonra, 2.4 mikrolitre stok hücre çözeltisini MCBM ve FBS tüplerine pipetleyin. Hücreleri ekledikten sonra, tüpleri dikey olarak tutun ve MCBM ile hücreleri iyice karıştırmak için bir dakika boyunca en yüksek hızda girdaplayın. Şimdi, numunelere tek başına veya A1210477 ile kombinasyon halinde OT48 test bileşiği ekleyin.

DMSO gibi kullanılan çözücü için kontrol olarak ayrı bir tüp hazırlayın. Ardından, numuneleri bir dakika boyunca vorteksleyin. Her tahlil için, karışımın bir mililitresini 12 oyuklu bir hücre kültürü plakasının merkez kuyucuğuna pipetleyin.

Ardından, boş kuyuları doldurmak için bir mililitre steril su veya PBS kullanın. Plakaları 10 gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin. Daha sonra, her bir kuyucuğa mililitre MTT stok çözeltisi başına beş miligramdan 200 mikrolitre ekleyin.

Plakaları on dakika inkübe ettikten sonra, menekşe rengine dönecek canlı koloniler olup olmadığını kontrol edin. Beyaz bir arka plan plakası kullanarak, aşağıdaki ayarları kullanarak görüntüleri yakalayın:Yöntem için sayısallaştır'ı seçin. Pozlama türü için hassasiyeti seçin.

Pozlama süresi için manuel ve bir saniyeyi seçin. Hassasiyet ve çözünürlük için yüksek çözünürlüğü seçin. Ardından, yakalanan görüntüleri TIFF formatında kaydedin.

ImageJ yazılımıyla, menü görüntüsünü, yazın, 8 bit'i seçerek canlı kolonileri ölçün. Menü ayarını ve eşiği seçin. Kontrol etmek için eşiği ayarlayın ve tüm koşullar için sabit tutun.

Ardından, menü analizini seçin, parçacıkları analiz edin. Verileri kaydedin ve grafiksel gösterim için bir istatistik yazılımı ile analiz edin. Stok reaktiflerini metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, 28,5 santigrat derecede UV ile sterilize edilmiş ve filtrelenmiş musluk suyu ile doldurulmuş bir bölme tankında bir dişi ve bir erkek zebra balığını ayırın ve karanlıkta koyun.

24 saatlik ayrılıktan sonra, çiftleşmeyi başlatmak için bölmeyi çıkarın. Döllenmiş yumurtaları çiftleşme tankından beş mililitre taze Danios çözeltisi içeren bir Petri kabına aktarın. Yumurtaları dikkatlice aspire etmek için bir pipet kullanarak yumurtaları üç kez yıkamak için beş mililitre Danios solüsyonu kullanın ve bunları beş mililitre taze solüsyona aktarın.

Daha sonra yumurtaları 28,5 santigrat derecede sekiz saat kuluçkaya yatırın. Pigmentasyonu engellemek ve kontaminasyonu önlemek için opak döllenmemiş yumurtaları ayırmak için% 0.03 PTU içeren Danios çözeltisine geçin. Döllenmeden 24 saat sonra, embriyoları dekoryonlaştırmak için keskin forseps kullanın.

Daha sonra, embriyoları döllenmeden 48 saat sonrasına kadar PTU ile Danios solüsyonunda inkübe edin. A549 hücrelerini tohumladıktan ve metin protokolüne göre bileşiklerle inkübe ettikten sonra, tedavinin bitiminden 24 saat önce, hücreleri lekelemek ve iki saat boyunca inkübe etmek için floresan hücre izleyici boyası CM-Dil'in dört mikromolarını ekleyin. İnkübasyonun ardından, hücreleri tripsinize etmek için% 0.05 Tripsin-EDTA kullanın.

Daha sonra, enjeksiyondan önce 50 mikrolitre fenol kırmızı PBS çözeltisinde on ila altıncı hücreyi seyreltin. Kanser hücrelerinin mikroenjeksiyonunu yapmak için, aşağıdaki program ayarlarını kullanarak 1.0 milimetrelik bir cam kılcal damar çekin: Keskin bir kenar oluşturmak için kılcal damarı kesmek için bir şırınga kullanın. Ardından, mikrokılcal damarları 20 mikrolitre hücre fenol kırmızısı çözeltisi ile doldurun.

Zebra balığını metin protokolüne göre uyuşturduktan sonra, üç ila beş enjeksiyonla altı ila on nanolitre enjekte ederek yumurta sarısı torbasına 100 ila 200 hücre enjekte edin. Mikroenjeksiyonlar, hücrelerin doğru hacminin enjekte edildiğinden ve enjeksiyon yaralanmasının minimum olduğundan emin olmak için çok dikkatli ve hassas bir şekilde yapılmalı ve yanal bir fissürden kaçınmak için karbondioksit basıncı optimal olmalıdır. Enjeksiyondan sonra, balığın PTU içeren beş mililitre taze Danios çözeltisinde on ila 30 dakika iyileşmesine izin verin.

Balıkları bir mililitre Danios PTU çözeltisi ile 24 oyuklu plakaya aktarın ve 72 saat boyunca 28,5 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkayı takiben, balıkları metin protokolüne göre uyuşturduktan sonra,% 3 metil selüloz damlası ile bir cam slayt üzerinde hareketsiz hale getirin. 620 ila 750 nanometre dalga boyunda 5x floresan görüntüler çekin.

Floresan tümörlerin boyutunu seçmek için ImageJ yazılımını kullanın: seçin ve ölçün. Ardından, floresan değerlerini kaydedin ve grafiksel gösterim için bir istatistik yazılımı ile analiz edin. Bu deneyde, akciğer kanseri hücre hattı A549, tek başına OT48 ile veya burada görülen konsantrasyonda BH3 mimetik, A1210477 ile kombinasyon halinde tedavi edildikten sonra koloniler oluşturmak üzere MCBM'ye ekildi.

Sonuçlar, kombinasyonun, on günlük inkübasyondan sonra kolonilerin sayısını, boyutunu ve toplam yüzey alanını önemli ölçüde azalttığını gösterdi. Burada, tek başına OT48 ile veya BH3 mimetik A1210477 ile kombinasyon halinde muameleden sonra, hücrelerin U-alt plaka tekniği kullanılarak sferoidler oluşturmasına izin verildi. Üç günlük bir inkübasyonun ardından, sferoidler görüntülendi ve ölçüldü ve 3D görüntüler oluşturuldu.

Bu şekil, tedavi edilen hücreler zebra balığı yumurta sarısı torbasına enjekte edildiğinde oluşan floresan tümörlerin nicelleştirilmesinden kaynaklanan tümör oluşumu üzerindeki OT48 ve/veya A1210477 inhibitör potansiyelini göstermektedir. Bu prosedürü denerken, verilerin istatistiksel değerlendirmesini etkileyen önemli değişikliklerden kaçınmak için her koşul için balık sayısını on veya daha fazla tutmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, zebra balığı ksenogreftinde hedef protein ekspresyonunu değerlendirmek için histolojik analiz gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Bu teknik, ilaç keşfi alanındaki araştırmacıların, zebra balığı ksenogreftinde in vivo bir mikro ortamda bileşiklerin etkinliğini keşfetmelerinin yolunu açıyor. Bu videoyu izledikten sonra, bir 3D kültür ortamında ilaç etkinliğinin nasıl doğrulanacağını iyi anlamış olmalısınız.