3D Organotypic Melanom küresel Cilt modeli

Burada, biz mevcut her iki mimari beyannamedir bir 3D organotypic Melanom küresel Cilt modeli oluşturmak için bir protokol ve bir organ/tümör vivo içinde ama aynı zamanda çok hücreli karmaşıklık barındırır sistematik deneysel müdahale.

Bu 3D organotipik melanom küresel deri modelinin genel amacı, sistematik deneysel müdahaleyi barındırırken bir organ veya tümörün in vivo olarak hem mimarisini hem de çok hücreli karmaşıklığını özetlemektir. Bu yöntem, tümör-konak etkileşimi ve terapötik müdahale gibi melanom araştırmaları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, in vivo olarak vaskülarize olmayan metastazların 3D mimarisini taklit edebilmemizdir.

Bu tekniğin etkileri, tümör heterojenliğini yansıttığı için melanom tedavisine kadar uzanır. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, birincil hücrelerin kalitesi belirleyici olduğu ve hücre süreci sırasında herhangi bir antibiyotik kullanılmadığı için mücadele edebilir. Bu tekniğin etkileri, tümör heterojenliğini yansıttığı için melanom tedavisine kadar uzanır.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü 3D melanom cilt modelinin uygun şekilde kullanılması çok önemlidir. Başlamak için, genel hücre kültürü protokollerine göre% 10 FCS içeren RPMI ortamı kullanarak melanom hücrelerini 451LU kültürleyin. Melanom sferoidleri oluşturmak için, kültürlenmiş melanom hücrelerini PBS'de yıkayın.

Sonra PBS'ye beş mililitre bir kez tripsin EDTA ekleyin. Oda sıcaklığında üç ila beş dakika inkübe edin. Tripsini nötralize etmek için% 10 FCS içeren beş mililitre RPMI ekleyin.

Daha sonra hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri hasat etmek için beş dakika boyunca 200 kez g'de santrifüjleyin. Hücre peletini %10 FCS içeren RPMI'de yeniden askıya alın.

Daha sonra, hücreleri sayın ve hücre süspansiyonunu mililitre başına 10.000 hücrelik bir nihai konsantrasyona seyreltin. Steril, yapışkan olmayan 10 santimetrelik hücre kültürü kabının kapağının iç yüzeyinde 40 adet 25 mikrolitrelik hücre süspansiyonu noktası yapmak için elektronik bir çoklu pipet kullanın. Ardından, kapağı hızlı ve yumuşak bir hareketle ters çevirin ve beş mililitre PBS içeren hücre kültürü kabına yerleştirin.

Asılı damla tabaklarını 37 santigrat derecede 5 ila 10 gün boyunca %14 karbondioksit içinde kültürleyin. İlk damla lekelenmesinden beş gün sonra, her damlaya %10 FCS içeren 10 mikrolitre RPMI eklemek için elektronik bir dağıtıcı kullanın. 10 ila 15 gün sonra, sferoidleri PBS ile kapaktan nazikçe durulayarak hasat edin.

Sferoidleri yeni, yapışkan olmayan bir hücre kültürü kabında toplayın. Cildin yeniden yapılandırılmasının dermal karşılığını oluşturmak için, 24 oyuklu bir hücre kültürü plakasına sekiz mikrometre gözenek boyutunda zar eki yerleştirin. Her bir ek için, jel nötralizasyon çözeltisinde 100.000 fibroblastı yeniden süspanse edin.

Daha sonra, fibroblast süspansiyonunu, kabarcıklar oluşturmadan 500 mikrolitrelik bir son hacimde bir ila üç oranında kollajen tip bir ile hızlı bir şekilde karıştırın. Ardından, süspansiyonu her bir kesici uca eklemek için bir pipet kullanın. Steril bir davlumbazın içine, dermal jellerin çökmesine izin vermek için ekleri 30 dakika boyunca ortam olmadan oda sıcaklığında yerleştirin.

Daha sonra, jelleri DMEM ile örtün ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Gece boyunca inkübasyondan sonra, DMEM'i dermal jellerden çıkarın ve cildin yeniden yapılandırılmasının epidermal muadilini oluşturmak için 37 santigrat derecede iki saat boyunca EGM ile dequilibrate edin. Ardından, EGM'yi jellerden çıkarmak için bir pipet kullanın.

Daha sonra, her bir jelin üzerine 100 mikrolitre EGM içinde yeniden süspanse edilmiş 100.000 keratinositi dikkatlice tohumlayın. Keratinositlerin dermal jele yapışmasını sağlamak için rekonstrüksiyonları 37 santigrat derecede bir buçuk saat inkübe edin. Bir pipet ucu kullanarak, kalan jeli ek duvardan dikkatlice çıkarın.

Daha sonra, her bir rekonstrüksiyonu 800 mikrolitre EGM ile örtün ve yedi gün boyunca% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede kültürleyin. Küçük, geniş bir pipet ucuyla kalan jeli iç duvardan dikkatlice çıkarın. Sekizinci günde, ekleri altı kuyulu bir plakanın ayrı kuyucuklarına yerleştirin.

Daha sonra, cildin yeniden yapılandırılmasının sadece tabanını kaplamak için her bir oyuğa 1.2 ila 1.4 metastatik melanom ortamı ekleyin. Ardından,% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede 10 ila 17 gün inkübe edin. Her bir oyuğa sadece 1.2 ila 1.4 mL metastatik melanom ortamı ekleyin, böylece cildin yeniden yapılandırılması kuyunun dibinden orta ile beslenir, ancak orta ile kaplanmaz.

Melanom sferoidlerini tam cilt rekonstrüksiyonlarının dermal muadili ile entegre etmek için, sferoidleri asılı bir damla hücre kültürü kabının kapağından dikkatlice durulamak için PBS'yi kullanın. Her tam cilt rekonstrüksiyonu için, steril, yapışkan olmayan bir hücre kültürü kabında 10 ila 20 sferoid toplayın. Fazla PBS'yi dikkatlice çıkarmak için bir Pasteur pipeti kullanın.

Daha sonra, sferoidleri minimum hacimde EGM ile aspire edin. Daha sonra bunları 100.000 fibroblast içeren gerekli hacimde jel nötralizasyon çözeltisine aktarın. Her bir ek için, sferoid süspansiyonu 500 mikrolitrelik bir nihai hacimde bir ila üç oranında kollajen tip bir ile karıştırın.

Son olarak, daha önce açıklanan protokolde belirtildiği gibi organotipik tam cilt rekonstrüksiyonları oluşturun. Normal insan derisi, 3D organotipik cilt rekonstrüksiyonunu doğrulamak için cilt rekonstrüksiyonu ile karşılaştırılır. Parafin bölümlerinin hematoksilen eozin boyaması, cilt rekonstrüksiyonunun dermis ve epidermisinin normal cilttekilerle karşılaştırılabilir olduğunu gösterir.

Normal insan derisi ve deri rekonstrüksiyonu, epidermal farklılaşmayı karşılaştırmak için immünohistokimyasal olarak analiz edilir. Epidermal tabakalaşma belirteçlerine, yani keratin 14, keratin 10 ve involukrin ve filagrin'e karşı immün boyama, cildin yeniden yapılandırılması ile normal cilt arasında benzer seviyelerde keratinamid farklılaşmasını gösterir. Laminin beşe karşı immün boyama, bazal laminanın, normal cilde benzer şekilde, cildin yeniden yapılandırılmasının epidermal ve dermal muadillerini fizyolojik olarak bağlamak için oluşturulduğunu gösterir.

Melanom sferoid deri rekonstrüksiyonunun parafin bölümünün hematoksilen eozin boyaması, melanom sferoidlerinin hücresel dağılımının, in vivo vaskülarize olmayan insan melanom cilt metastazlarınınkine benzer olduğunu gösterir. Histolojik inceleme, melanom hücrelerinin periferik proliferatif bir alt popülasyonunun ve merkezi nekrotik alt popülasyonunun varlığını ortaya koymaktadır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa yaklaşık 40 gün içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, en iyi kalitede birincil hücreleri kullanmak önemlidir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, melanom araştırmacılarının in vivo taklit eden bir ortamda in vitro duyarlılığı keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, bir insan 3D organotipik melanom cilt modelinin nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.