Name: Yerli, etiketsiz Huntingtin Exon1 Monomer ve SUMO Fusion strateji kullanarak liflerinde nesil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Öğrenin, His-SUMO füzyon stratejisi kullanarak etiketsiz Huntingtin ekzon bir monomer ve fibril üretimini. Bu yöntem, yapı ve fonksiyon çalışmaları için yüksek saflıkta protein sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser öncelikle hibe CHDI Vakfı ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından finanse edildi. Biz Dr Sophie Vieweg yararlı tartışmalar için bu yeni ifade sisteminin geliştirilmesi ve Lashuel grubunun diğer üyeleriyle sırasında bu ifade sistemi ile deneyimlerini paylaşmak ve giriş ve değerli geribildirim için teşekkür ederiz. Biz de Prof. Oliver Hantschel ULP1 plazmid verdiğiniz için teşekkür ederiz. Yazarlar Dr John B. Warner ve Dr Senthil K. Thangaraj el yazması kritik İnceleme için teşekkür ederiz

<ol><li>Saudou, F., Humbert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biology+of+Huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Biology of Huntingtin.</a> Neuron. 89 (5), 910-926 (2016).</li>
<li>MacDonald, M. E., Gines, S., Gusella, J. F., Wheeler, V. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14528049">Huntington's disease.</a> Neuromolecular Medicine. 4 (1-2), 7-20 (2003).</li>
<li>Li, S., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathways+contribute+to+the+pathogenesis+of+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Multiple pathways contribute to the pathogenesis of Huntington disease.</a> Molecular Neurodegeneration. 1, 19(2006).</li>
<li>DiFiglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+Huntingtin+in+Neuronal+Intranuclear+Inclusions+and+Dystrophic+Neurites+in+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aggregation of Huntingtin in Neuronal Intranuclear Inclusions and Dystrophic Neurites in Brain.</a> Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).</li>
<li>Atwal, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+has+a+membrane+association+signal+that+can+modulate+huntingtin+aggregation%2C+nuclear+entry+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity.</a> Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).</li>
<li>Sathasivam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+splicing+of+HTT+generates+the+pathogenic+exon+1+protein+in+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Aberrant splicing of HTT generates the pathogenic exon 1 protein in Huntington disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (6), 2366-2370 (2013).</li>
<li>Mangiarini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+1+of+the+HD+gene+with+an+expanded+CAG+repeat+is+sufficient+to+cause+a+progressive+neurological+phenotype+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exon 1 of the HD gene with an expanded CAG repeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype in transgenic mice.</a> Cell. 87 (3), 493-506 (1996).</li>
<li>El-Daher, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+proteolysis+releases+non-polyQ+fragments+that+cause+toxicity+through+dynamin+1+dysregulation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Huntingtin proteolysis releases non-polyQ fragments that cause toxicity through dynamin 1 dysregulation.</a> EMBO Journal. 34 (17), 2255-2271 (2015).</li>
<li>Lunkes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteases+acting+on+mutant+Huntingtin+generate+cleaved+products+that+differentially+build+up+cytoplasmic+and+nuclear+inclusions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Proteases acting on mutant Huntingtin generate cleaved products that differentially build up cytoplasmic and nuclear inclusions.</a> Molecular Cell. 10 (2), 259-269 (2002).</li>
<li>Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Intein-based+Strategy+for+the+Production+of+Tag-free+Huntingtin+Exon+1+Proteins+Enables+New+Insights+into+the+Polyglutamine+Dependence+of+Httex1+Aggregation+and+Fibril+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An Intein-based Strategy for the Production of Tag-free Huntingtin Exon 1 Proteins Enables New Insights into the Polyglutamine Dependence of Httex1 Aggregation and Fibril Formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).</li>
<li>Georgalis, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+aggregation+monitored+by+dynamic+light+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Huntingtin aggregation monitored by dynamic light scattering.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 95 (11), 6118-6121 (1998).</li>
<li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin-encoded+polyglutamine+expansions+form+amyloid-like+protein+aggregates+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo.</a> Cell. 90 (3), 549-558 (1997).</li>
<li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+polyglutamine-containing+huntingtin+fragments+into+amyloid-like+fibrils%3A+implications+for+Huntington%27s+disease+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).</li>
<li>Muchowski, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+and+hsp40+chaperones+can+inhibit+self-assembly+of+polyglutamine+proteins+into+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (14), 7841-7846 (2000).</li>
<li>Heiser, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+huntingtin+fibrillogenesis+by+specific+antibodies+and+small+molecules%3A+implications+for+Huntington%27s+disease+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inhibition of huntingtin fibrillogenesis by specific antibodies and small molecules: implications for Huntington's disease therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (12), 6739-6744 (2000).</li>
<li>Bennett, E. J., Bence, N. F., Jayakumar, R., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+by+nuclear+or+cytoplasmic+protein+aggregates+precedes+inclusion+body+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body formation.</a> Molecular Cell. 17 (3), 351-365 (2005).</li>
<li>Tam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chaperonin+TRiC+blocks+a+huntingtin+sequence+element+that+promotes+the+conformational+switch+to+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The chaperonin TRiC blocks a huntingtin sequence element that promotes the conformational switch to aggregation.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1279-1285 (2009).</li>
<li>Nekooki-Machida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+conformations+of+in+vitro+and+in+vivo+amyloids+of+huntingtin-exon1+show+different+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinct conformations of in vitro and in vivo amyloids of huntingtin-exon1 show different cytotoxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 106 (24), 9679-9684 (2009).</li>
<li>Wacker, J. L., Zareie, M. H., Fong, H., Sarikaya, M., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+and+Hsp40+attenuate+formation+of+spherical+and+annular+polyglutamine+oligomers+by+partitioning+monomer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hsp70 and Hsp40 attenuate formation of spherical and annular polyglutamine oligomers by partitioning monomer.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 11 (12), 1215-1222 (2004).</li>
<li>Legleiter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+recognize+distinct+conformational+epitopes+formed+by+polyglutamine+in+a+mutant+huntingtin+fragment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies recognize distinct conformational epitopes formed by polyglutamine in a mutant huntingtin fragment.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (32), 21647-21658 (2009).</li>
<li>Legleiter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+huntingtin+fragments+form+oligomers+in+a+polyglutamine+length-dependent+manner+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mutant huntingtin fragments form oligomers in a polyglutamine length-dependent manner in vitro and in vivo.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (19), 14777-14790 (2010).</li>
<li>Nucifora, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+potentially+toxic+oligomers+formed+in+vitro.+from+mammalian-derived+expanded+huntingtin+exon-1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of novel potentially toxic oligomers formed in vitro. from mammalian-derived expanded huntingtin exon-1 protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 16017-16028 (2012).</li>
<li>Dahlgren, P. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17292058">Atomic force microscopy analysis of the Huntington protein nanofibril formation.</a> Nanomedicine. 1 (1), 52-57 (2005).</li>
<li>Poirier, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+spheroids+and+protofibrils+as+precursors+in+polyglutamine+fibrilization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Huntingtin spheroids and protofibrils as precursors in polyglutamine fibrilization.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 41032-41037 (2002).</li>
<li>Duim, W. C., Chen, B., Frydman, J., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction+imaging+of+huntingtin+protein+aggregates+by+fluorescence+blink-microscopy+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction imaging of huntingtin protein aggregates by fluorescence blink-microscopy and atomic force microscopy.</a> Chemphyschem. 12 (13), 2387-2390 (2011).</li>
<li>Pieri, L., Madiona, K., Bousset, L., Melki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrillar+alpha-synuclein+and+huntingtin+exon+1+assemblies+are+toxic+to+the+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fibrillar alpha-synuclein and huntingtin exon 1 assemblies are toxic to the cells.</a> Biophysical Journal. 102 (12), 2894-2905 (2012).</li>
<li>Monsellier, E., Redeker, V., Ruiz-Arlandis, G., Bousset, L., Melki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interaction+between+the+chaperone+Hsc70+and+the+N-terminal+flank+of+huntingtin+exon+1+modulates+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular interaction between the chaperone Hsc70 and the N-terminal flank of huntingtin exon 1 modulates aggregation.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (5), 2560-2576 (2015).</li>
<li>Isas, J. M., Langen, R., Siemer, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-State+Nuclear+Magnetic+Resonance+on+the+Static+and+Dynamic+Domains+of+Huntingtin+Exon-1+Fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Solid-State Nuclear Magnetic Resonance on the Static and Dynamic Domains of Huntingtin Exon-1 Fibrils.</a> Biochemistry. 54 (25), 3942-3949 (2015).</li>
<li>Malakhov, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+fusions+and+SUMO-specific+protease+for+efficient+expression+and+purification+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Function+Genomics%22%5BJournal%5D)">SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins.</a> Journal of Structural Function Genomics. 5 (1-2), 75-86 (2004).</li>
<li>Mossessova, E., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulp1-SUMO+crystal+structure+and+genetic+analysis+reveal+conserved+interactions+and+a+regulatory+element+essential+for+cell+growth+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast.</a> Molecular Cell. 5 (5), 865-876 (2000).</li>
<li>Kumari, S., Pal, R. K., Gupta, R., Goel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+X-ray+Diffraction+Dataset+for+Bacillus+licheniformis+Gamma+Glutamyl+Transpeptidase-acivicin+complex%3A+SUMO-Tag+Renders+High+Expression+and+Solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Journakl%22%5BJournal%5D)">High Resolution X-ray Diffraction Dataset for Bacillus licheniformis Gamma Glutamyl Transpeptidase-acivicin complex: SUMO-Tag Renders High Expression and Solubility.</a> Protein Journakl. 36 (1), 7-16 (2017).</li>
<li>Zhang, J., Sun, A., Dong, Y., Wei, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Production+and+Characterization+of+SAC%2C+the+Core+Domain+of+Par-4%2C+by+SUMO+Fusion+System%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recombinant Production and Characterization of SAC, the Core Domain of Par-4, by SUMO Fusion System.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. , (2017).</li>
<li>Reif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semisynthesis+of+biologically+active+glycoforms+of+the+human+cytokine+interleukin+6%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+English%22%5BJournal%5D)">Semisynthesis of biologically active glycoforms of the human cytokine interleukin 6.</a> Angewandte Chemie International Edition English. 53 (45), 12125-12131 (2014).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 253(2007).</li>
<li>Smith, B. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20512673">SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1, 41-55 (1984).</li>
<li>Lawrence, A. M., Besir, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+of+proteins+in+gels+with+Coomassie+G-250+without+organic+solvent+and+acetic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Staining of proteins in gels with Coomassie G-250 without organic solvent and acetic acid.</a> Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).</li>
<li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19892187">Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review.</a> Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).</li>
<li>Chen, S. M., Wetzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+and+disaggregation+of+polyglutamine+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Solubilization and disaggregation of polyglutamine peptides.</a> Protein Science. 10 (4), 887-891 (2001).</li>
<li>Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+proteins+and+macromolecular+complexes+by+negative+stain+EM%3A+from+grid+preparation+to+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition.</a> Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).</li>
<li>O'Nuallain, B., et al. Kinetics and thermodynamics of amyloid assembly using a high-performance liquid chromatography-based sedimentation assay. Amyloid, Prions, and Other Protein Aggregates, Pt C. 413, 34-74 (2006).</li>
<li>Greenfield, N. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15063655">Analysis of circular dichroism data.</a> Methods in Enzymology. 383, 282-317 (2004).</li>
<li>Aiken, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+threonine+3%3A+implications+for+Huntingtin+aggregation+and+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of threonine 3: implications for Huntingtin aggregation and neurotoxicity.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (43), 29427-29436 (2009).</li>
<li>Satakarni, M., Curtis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+peptides+as+fusions+with+SUMO%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant peptides as fusions with SUMO.</a> Protein Expression and Purification. 78 (2), 113-119 (2011).</li>
<li>Davies, H. A., Wilkinson, M. C., Gibson, R. P., Middleton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+the+aortic+amyloid+polypeptide+medin%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of the aortic amyloid polypeptide medin.</a> Protein Expression and Purification. 98, 32-37 (2014).</li>
<li>Chen, S., Wetzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+and+disaggregation+of+polyglutamine+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Solubilization and disaggregation of polyglutamine peptides.</a> Protein Science. 10 (4), 887-891 (2001).</li>
</ol>

Yazarlar bu makalenin içeriği ile hiçbir çıkar çatışması var bildirin.

Alma miligram miktarda yerli, etiketlenmemiş için Httex1 bu protokol için biz verimli bir yordam belirttiğimiz 23 ya da 43 glutamin kalıntılar içeren. Bu bir onun bir C-terminal fusion olarak Httex1 ifade ederek başarıldı6-IMAC tarafından lysate hücreden füzyon proteini izole etmek için kullanılır ve Httex1 HPLC arıtma önce i ciddi SUMO etiketi. SUMO strateji birkaç diğer proteinler üretiminde kullanılan iken, bizim Yöntem SUMO özünde oluşturmak için de kullanılabilir benzersiz özellikleri, toplama eğilimli, daha önce olduğu kanıtlanmıştır amyloidogenic protein düzensiz olduğunu gösterir 43,44üretmek ve işlemek son derece zor. Biz bir "su kuyusu-davranmak" protein üretimi için basit, kullanımı kolay ve bir iletişim kuralına benzer bir iletişim kuralı mevcut. SUMO fusion solubilizes ve Httex1 ifade ve IMAC arıtma adım sırasında stabilize. İntein strateji10 ve toplama ile gözlemlediği gibi etiketin erken bölünme olduğunu artık bir sorun.
Özünde düzensiz protein yıkımı için özellikle güvenlik açığından etkilenir. N-terminal bozulması N17 bölgesinde bu iletişim kuralını kullanan bir mesele değil, truncations Httex1 PRD içinde gelişebilir. Kesilmiş proteinler hydrophobicity, ücret ve boyut olarak Httex1 için çok benzer gibidir, kromatografik yöntemle çıkardıktan meydan okuyor, böylece ilk etapta onların oluşumunu önlemek en iyisidir. Yakından protokole yapışma, her zaman buz üzerinde çalışma ve proteaz inhibitörü yeterli miktarda kullanarak gözlenen kesme düzeyi çok düşük tutmak yardımcı olacaktır. Kesilmiş protein benzeşme etiketi de kaybetmek gibi bir füzyon etiketi C-terminus Httex1 in itibariyle uygulamak truncations PRD kolayca kaldırabilirsiniz. Ancak, yerli dizi prolin ve bizim bilgimize Httex1 sona ererken bu seçeneği uygulanamaz muhafaza edilmesi gerekiyorsa traceless ve verimli bölünme prolin sonra ikna etmek için bilinen hiçbir C-terminal füzyon Etiketler vardır.
En önemli protokol SUMO etiketi bölünme sonra ULP1 tarafından kurtarılmış Httex1 işlenmesi parçasıdır. Protein hemen RP-HPLC tarafından saf. Neyse ki, bu genellikle 10-20 dk 4 ° C'de tamamlanır bir verimli ve hızlı tepki Buna ek olarak, intein strateji birkaç saat böylece verimi en üst düzeye çıkarmak için eksik bölünme ve başlangıç toplama arasında bir denge gerektiren intein, tam bölünme için gerekli. O-ecek başlamak gibi hızlı bir iş Httex1, mutant için gereklidir 23Q değişken daha uzun süre stabil ise nispeten yüksek konsantrasyon bölünme reaksiyon mevcut toplanacak. RP-HPLC arıtma sırasında SUMO bir diğer avantajı ortaya çıkıyor: Ssp DnaB intein hidrofobik ve sopalarla güçlü sütuna iken, SUMO daha Hidrofilik ve tamamen C4 ters faz sütundan elutes. Ticari ULP1 oldukça pahalıya mal olsa da, protein yüksek verim daha önce yayımlanmış protokolleri29takip kolayca üretilmektedir.
Httex1 kullanmadan önce yükünün iletişim kuralı uygulayarak kritik öneme sahip olamaz yeterli vurguladı. PolyQ liyofilize proteinler Httex1 gibi stabildir ve saklı uzun süre olabilir ama su ve arabellekleri tamamen çözünür değildir. Varlığı ön şekillendirilmesi reaksiyonlar ya liflerinde toplama kinetik ve protein45biyofiziksel özellikleri üzerinde önemli bir etkisi olabilir. Burada açıklanan yükünün iletişim kuralı yükünün protein, ön şekillendirilmesi toplamları kaldırılması ve lyophilized bir örnek üzerinden monomeric Httex1 lik üretimi sağlar. SUMO ve intein strateji ile elde Httex1 için benzer toplama kinetik ve fibril görünümdeki görülmektedir.
Httex1 üretimi için önceki yöntemleri ile karşılaştırıldığında, burada açıklanan SUMO strateji birçok avantaj sunar ve yapısı araştırmak için olası çalışmalar aralığını ve sağlık ve hastalık bu proteinin fonksiyonel özellikleri genişletir. SUMO-Httex1 füzyon proteini kolay, bu donmuş ve depolanan veya ücretsiz mHttex1 hızlı bir şekilde toplamak çözüm için 24 saat içinde ortam sıcaklığında tuttum. İstikrar ve SUMO-Httex1 füzyon proteinlerin yüksek çözünürlük protein işlemek ve/veya aksi takdirde sonra bölünme mümkün olmazdı mHttex1 içine enzimatik ve kimyasal değişiklikler tanıtmak için büyük esneklik sağlar. Bu giriş içerir translasyonel modifikasyonlar, fluorophores, spin etiketleri, biotin Etiketler, vb burada sunulan gelişmeler 1 olmalıdır) Httex1; ilişkilerin yapı-fonksiyon aydınlatmak için gelecekteki çalışmaları kolaylaştırmak 2) Htt toplama ve patoloji yayılan araştırmak için yeni araçlar oluşturur; 3) mutant Httex1 stabilize etmek ve onun toplama önlemek moleküller tanımlamak için yeni deneyleri geliştirme sağlamak; ve 4) bilim adamları diğer alanlardan bu protein üzerinde çalışmak ve Huntington hastalığı için tedaviler bulmak için bizim macera katılmak getirmek için teşvik ediyoruz.

HTT 348 kDa protein ve birçok fizyolojik fonksiyonları1' karıştığı olmuştur. HTT fazla 36 kalıntılarında onun N-terminus bir genişletilmiş polyQ bölgesini içerdiğinde, HD2,3neden olur. HD patoloji striatum ve nöronal ölüm ve atrofi etkilenen doku4,5yol açar korteks hücresel kapanımlar karakterizedir. PolyQ tekrar yolu içeren birkaç N-terminal Htt parçaları otopsi beyin HD hastalardan tespit ve huntingtin protein6proteolitik işlem tarafından oluşturulacak sanıyordum. Son yıllarda yapılan çalışmalarda Httex1 de anormal mRNA'ın porno versiyonunu nedeniyle bir araya ki öneririz. Httex1 patolojik polyQ mutasyon içerir ve onun overexpression hayvanlarda HD7böylece olası bir rol HD patoloji ve hastalık ilerleme '6Bu parçası vurgulayarak, anahtar özellikleri birçok özetlemek, 8,9.
Yüksek toplama eğilimi mutant Httex1 nedeniyle (mHttex1) genişletilmiş polyQ yolu ile Httex1 geçici füzyon proteinler için varolan ifade sistemleri çoğunluğu dayanmaktadır (glutatyon-S-transferaz (GST), thioredoxin (TRX) gibi veya maltoz bağlayıcı protein (MBP) ve/veya onun ifade, istikrar, arıtma ve/veya çözünürlük10,11,12,13,14 differentially artıran peptidler (poli-histidin) ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Füzyon ortak Httex1 için kısa bir sıra tripsin gibi proteaz için bir bölünme site içeren ile bağlantılı, tütün etch virüs (TEV) proteaz veya bölünme ve Httex1 sürümünden önce toplama başlatılması için izin vermek için PreScission veya Arıtma. Bu yöntemlerin eksikliklerini traceless bölünme nedeniyle ek artıkları ve miscleavage heterojenlik nedeniyle eksik bölünme () yanı sıra Httex1, dizisi içinde nedeniyle kesilmiş parçaları oluşturulması bırakma olasılığını içerir Vieweg ve ark. avantajları ve sınırlamalar bu yaklaşımın daha kapsamlı açıklama için bakınız)10. Biz bu sınırlamaları gidermek için son zamanlarda Synechocystis sp. geçici bir N-terminal füzyonu kullanarak etiket içermeyen yerli Httex1 üretimi ilk kez etkinleştirme bir ifade stratejisi geliştirdi (Ssp) DnaB intein Httex110. İntein göğüs arası traceless ve belirli ve mg protein miktarı verir iken, hala verimi azaltabilir iki dezavantajı uğrar: Ifade ve üzerinde bir bölünme oluşur aslında gerçekleşebileceğini intein Yani, erken bölünme birkaç saat, toplama, genişletilmiş polyQ tekrarlar ile Httex1 için özellikle nedeniyle protein kaybına neden olabilir.
Bu sınırlamaları gidermek ve yerli üretim için bizim strateji geliştirmek için etiket içermeyen Httex1, SUMO, daha tam olarak Maya homolog Smt3 Httex1 için geçici füzyon dayalı yeni bir ifade sistemi geliştirdik. SUMO sistemi rekombinant proteinlerin üretimi için ilk nerede bir artış oranı ifade ve çözünürlük SUMO füzyon protein gösterilmiştir 200429, yayınlandı. SUMO etiketi Ubikuitin protein özgü proteaz 1 (ULP1), hangi does değil istemek bir tanıma site ama SUMO Tersiyer yapısını tanır ve pratik miscleavage30olasılığını ortadan kaldırır gibi i ciddi. Ayrıca, ULP1-aracılı bölünme hızlı ve traceless ve ek artıkları bırakmaz. Füzyon etiketi, erken bölünme ile otokatalitik intein10, gözlemlediği gibi tamamen dış bir proteaz gereksinimi tarafından önlenmiş olur. SUMO strateji Rekombinant protein üretim31,32,33için günümüzde yaygın olarak kullanılırken, biz özünde düzensiz bir nesil için özellikle yararlı olur bu yazıda göstermek, toplama eğilimli, amyloidogenic protein Httex1 gibi. Biz sadelik, verimlilik ve sağlamlığı bizim SUMO-fusion tabanlı yöntemi yerli, etiket içermeyen Httex1 farklı disiplinlerden araştırmacılar için daha erişilebilir kılan ve Httex1 vitro non-yerli dizileri kullanma gereksinimini ortadan kaldırmak inanıyoruz . Httex1 yapı-fonksiyon ilişkinin aydınlatmak için gelecekteki çalışmaları kolaylaştıracak önemli bir ilerleme bu.
Protokol Httex1 bakteri kültürü 12 l arıtma açıklar, ancak protokol kolayca daha küçük veya daha büyük ölçekli üretimler için adapte. Bir polyQ tekrar uzunluğu (23Q) aşağıda ve mutant Httex1 ile üretim vahşi türü Httex1 (wtHttex1) protokolünü açıklar (mHttex1) bir polyQ ile patojenik eşik (36Q) uzunluğu (43Q) yukarıda tekrarlayın.

<table><tbody><tr><td>Uranil format (UO2(CHO2)2)</td><td>EMS</td><td>22450</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/karbon 200 ağ, Cu 50 ızgaralar</td><td>EMS</td><td>FCF200-Cu-50</td><td></td></tr><tr><td>Kuvars'tan yapılmış Yüksek Hassasiyetli Hücre SUPRASIL Hellma Analytics'ten 1 mm ışık yolu</td><td>HellmaAnalytics</td><td>110-1-40</td><td></td></tr><tr><td>Tampon Madde Dulbecco'nun (Ca ve Mg içermeyen PBS) ancinne ref 47302 (RT) SERVA</td><td>Witech</td><td>SVA4730203</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>AxonLab</td><td>A0839.0100</td><td></td></tr><tr><td>Luria Suyu (Miller'ın LB Suyu)</td><td>&nbsp; Chemie Brunschwig</td><td>1551.05</td><td></td></tr><tr><td>İzopropil &beta;-D-1-tiyokalaktopiranosit (IPTG)</td><td>AxonLab</td><td>A1008.0025</td><td></td></tr><tr><td>E. coli B ER2566</td><td>NEB</td><td>NEB # E4130</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Sigma</td><td>56750-500G</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete&nbsp; Proteaz İnhibitörü Kokteyl</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Huntingtin Antikoru, AA 1-82</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>MAB5492</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD Keçi Anti-Fare IgG (H + L)</td> <td>Licor</td><td>925-68070</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>AxonLab</td><td>A0999.0005</td><td></td></tr><tr><td>HisPrep 16/10 sütun&nbsp;</td><td>GE Sağlık</td><td>28936551</td><td></td></tr><tr><td>C4 HPLC sütunu</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4168. P0</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; 10 ve mikro; m C4 300 &Aring;, LC Kolonu 250 x 21,2 mm, Phenomenex, 19x10 mm koruma kolonu, sıcaklık ceketli değil</td></tr><tr><td>Asetonitril HPLC</td><td>MachereyNagel</td><td>C2502</td><td></td></tr><tr><td>Filtre beze Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre steril</td><td>Sarstedt AG</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre yarı mikro küvet</td><td>Reactolab SA</td><td>2534</td><td></td></tr><tr><td>Superloop, 1/16" bağlantı parçaları (&auml; KTAdesign), 50 ml</td><td>GE Healthcare</td><td>18111382</td><td></td></tr><tr><td>Trifloroasetik asit</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>GREINER Tüpleri için FPLC 16 x 100 mm, kapak. 12.0 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>7.160 102</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 100 kD Microcon&nbsp; hızlı akış filtreleri</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>MRCF0R100</td><td></td></tr><tr><td>Vibra-cell VCX130 ultrasonik sıvı işlemcisi</td><td>Sonics</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>& Auml; KTA 900 bir fraksiyon kollektörü ile donatılmıştır& nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jasco J-815 Dairesel Dikroizm</td><td>Jasco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters UPLC sistemi&nbsp;</td><td>Sular</td><td></td><td>C8 BEH doğruluğu 2.1x100 mm 1.7 mikron kolon&nbsp; , önceden ısıtılmış kolon (40 &deg; C), akış hızı 0.6 mL / dak, enjeksiyon hacmi 4 &mu; L</td></tr><tr><td>suları HPLC sistemi</td><td>Waters</td><td></td><td>2489 UV dedektörü ve 2535 kuaterner gradyan modülü, FlexInject muhafazasında 20 mL döngü</td></tr><tr><td>ESI-MS: Finnigan LTQ</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>liyofilizatör cihazı</td><td>FreeZone 2.5 Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai Spirit BioTWIN&nbsp;</td><td></td><td></td><td>LaB6 tabancası ve 4K x 4K FEI Eagle CCD kamera (FEI) ile donatılmış ve 80 kV 37 ° C'de çalışan FEI elektron mikroskobu</td></tr><tr><td>; C sallama&nbsp; kuluçka makinesi</td><td>Infors HT multitron Standart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biyofotometre artı</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

yerli, etiketsiz huntingtin exon1 monomer ve sumo fusion strateji kullanarak liflerinde nesil

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Huntington hastalığı (HD) bir devralınan ölümcül nörodejeneratif hastalık bir CAG genişletme (≥36) tarafından neden içinde HD gen exon ilk Huntingtin protein (Htt) ifadesinde kaynaklanan ya da N-terminal bunların parçaları bir genişletilmiş polyglutamine () ile polyQ) streç.
Huntingtin protein (Httex1) exon1 HD özellikleri cep içinde birçok beyannamedir en küçük Htt parçası ve hayvan modelleri ve Htt en çok çalışılmış parçaları biridir. Httex1 küçük boyutu deneysel olarak daha mükellef ile karşılaştırıldığında daha uzun parçaları veya tam uzunlukta Htt standart ve yüksek çözünürlüklü teknikleri kullanarak biyofiziksel karakterizasyonu için yapar. Ancak, yüksek toplama eğilimi mutant Httex1 (mHttex1) artan polyQ içeriği (≥42) ile verimli ifade ve bu proteinler yeterli miktarlarda üretmek ve onları erişilebilir yapmak için arıtma sistemleri geliştirmek zor yaptı Füzyon protein veya protein yerli dizi alter diğer stratejileri kullanmanıza gerek kalmadan farklı disiplinlerden bilim adamları. Burada sağlam ve en iyi duruma getirilmiş bir yöntem mevcut miligram miktarda yerli üretimi için etiket ücretsiz-küçük Ubikuitin ilgili değiştirici (SUMO) geçici fusion tabanlı Httex1. Sadelik ve verimliliği strateji Httex1, böylece bu proteinin araştırmacılar için daha erişilebilir hale getirmek ve deneyler tekrarlanabilirlik farklı laboratuvarlar arasında artırma non-yerli dizileri kullanma gereksinimini ortadan kaldırır. Bizce bu gelişmeler de Htt yanı sıra gelişmekte olan yeni tanı araçları ve tedaviler tedavi etmek ya da HD ilerlemesini yavaşlatmak yapı-fonksiyon ilişkisi elucidating yönelik gelecekteki çalışmaları kolaylaştıracaktır.

Httex1 E. coli bir N-terminal ile ifade onun6-SUMO etiket. İfade ve arıtma füzyon proteinin temsilcisi sonuçları Şekil 1' de özetlenmiştir. Çünkü Met1 tam i ciddi vivo içinde42Htt ve Ala2 ile başlar 2-90 kalıntılarının Httex1 dizisi oluşur. Tam sırası ifade füzyon proteinin Şekil 1içindeAgösterilir, amino asitler numaralandırma 23Q değişkenine anlamına gelir. Plazmid, yakın bir gelecekte toplumla paylaşılması gereken Addgene yatırılacaktır. Plazmid ve ifade füzyon protein bir şematik resim 1'Bgösterilir. His6-SUMO Httex1 bir orta seviye (Şekil 1C<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig1.jpg"> <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig1large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig2.jpg"> <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig3.jpg"> <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig3large.jpg" target="_blank"></a>

Burada, yerli, etiket içermeyen monomerleri miktarlarda miligram ve liflerinde küçük Ubikuitin ilgili değiştirici (SUMO) geçici fusion tabanlı exon1 Huntingtin protein (Httex1) üretimi için sağlam ve en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı mevcut.

Yerli, etiketsiz Huntingtin Exon1 Monomer ve SUMO Fusion strateji kullanarak liflerinde nesil

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Bu yöntem, proteinin doğal dizisini taşıyan etiketsiz ekzon üretmemize izin verir ve bu proteinin yapı işlevini incelemek için yeni fırsatlar sunar, böylece sağlık ve hastalıktaki işlevini anlamamızı sağlar. Buradaki ana avantajlar, yöntemin basitliği, verimliliği ve sağlamlığıdır. Bu yöntem, dizinin heterojenliğini ortadan kaldırarak, farklı laboratuvarlar arasında karşılaştırma ve tekrarlanabilirliği mümkün kılacak ve kolaylaştıracaktır.Bu yöntem Huntingtin ekzon bir üretimi için geliştirilmiş olsa da, amiloid-beta peptit ve alfa-sinüklein gibi diğer agregasyona eğilimli sistemlere de uygulanabilir. İlk olarak, 0.45 mikrometrelik bir şırınga filtresi kullanarak His-SUMO Huntingtin ekzon bir füzyon proteini içeren önceden izole edilmiş bir süpernatantı filtreleyin. SDS-PAGE analizi için filtrelenmiş süpernatantın 20 mikrolitrelik bir örneğini çıkarın.Arıtılmış lizatı bir Superloop'a doldurun. His-SUMO Huntingtin ekzon bir füzyon proteinini, dört santigrat derecede hızlı performanslı bir sıvı kromatografi sistemi üzerinde hareketsizleştirilmiş metal afinite kromatografisi ile arıtılmış bakteri lizatından izole edin. Bağlanmamış proteinleri yıkamak için dakikada 10 mililitrede 10 sütun hacmi veya 200 mililitre tampon A'yı geçirin.Füzyon proteinini dakikada iki mililitrede 2.5 sütun hacmi veya 50 mililitre %100 tampon B ile elute edin. SDS-PAGE analizi için her fraksiyondan 20 mikrolitre alın. Her numuneye 20 mikrolitre yükleme boyası ekleyin.Ham proteinin iki mikrolitresini, bağlanmamış fraksiyonunu, yıkama fraksiyonunu ve elüsyon zirvesinin her bir fraksiyonunu %15'lik bir jel üzerine yükleyin. Jeli 180 voltta 90 dakika çalıştırın. Çalışma bittiğinde, jeli üreticinin talimatlarına göre Coomassie boyası ile boyayın.Füzyon proteinini içeren fraksiyonları kromatogramın zirvesine göre bir araya getirin. Daha sonra havuzlanan fraksiyonlara 100 milimolar DTT ve 100 milimolar L-sistein ekleyin ve tüpü hafifçe ters çevirerek çözün. HPLC saflaştırması için çözücü A'yı hazırlamak için, iki litrelik bir şişe suya iki mililitre trifloroasetik asit ekleyin.Çözücü B'yi hazırlamak için, 2,5 litrelik bir asetonitril şişesine 2,5 mililitre trifloroasetik asit ekleyin. HPLC sistemini üreticinin önerdiği şekilde hazırlayın. Temiz bir sütun sağlamak için boş bir çalışma gerçekleştirin.Bunu takiben, UPLC ile bölünme reaksiyonunu izlemek için ULP1 ilavesinden önce 100 mikrolitre füzyon proteini alın. 20 mililitre füzyon proteinini 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve 0.4 mililitre ULP1 stok çözeltisi ekleyin. Numuneyi buz üzerinde inkübe edin ve kalan füzyon proteinini buz üzerinde tutun.Proteini ara adımlar sırasında saklamayın ve tamamlanana kadar saflaştırmaya devam edin. Her 10 dakikada bir, UPLC'nin ilerlemesini izlemek için 100 mikrolitre bölünme reaksiyonunu çıkarın. Numuneleri santrifüjledikten sonra, her süpernatantın iki mikrolitresini UPLC ile analiz edin.ULP1 eklenmeden önce numune için elde edilen kromatogramları ve daha sonra alınan numuneleri karşılaştırın. SUMO bölünmesi tamamlandıktan sonra, numuneyi 22 mikrometrelik bir şırınga filtresi ile filtreleyin. Daha sonra, filtrelenmiş numuneyi ters fazlı HPLC ile saflaştırın.HPLC fraksiyonlarını UPLC ve ESI-MS ile analiz edin. 50 mililitrelik plastik tüplerde benzer saflıkta havuz fraksiyonları. Numuneleri sıvı nitrojen içinde dondurun ve liyofilize edin.Daha sonra liyofilize proteini iki mililitrelik plastik tüplere aktarın ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. 1.5 mililitrelik bir tüpte 100 mikrogram liyofilize Huntingtin ekzonunu, sekiz mikrolitre saf trifloroasetik asitten birini çözün. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe ettikten sonra, trifloroasetik asidi bir davlumbaz altında bir nitrojen veya argon akışı ile dikkatlice buharlaştırın.Protein kuruduktan sonra 100 mikrolitre suda çözün. Daha sonra iki mikrolitre numuneyi UPLC ile analiz edin. Şimdi 20 mikrolitre protein çözeltisini 20 mikrolitre 2X yükleme boyası ile karıştırın.SDS-PAGE ile bir ila 10 mikrogram protein örneklerini analiz edin. Jeli 180 voltta 90 dakika çalıştırın. Çalışma bittiğinde, jeli üreticinin talimatlarına göre Coomassie boyası ile boyayın.50 mililitrelik bir tüpte 10 mililitre DPBS hazırlayın. DPBS çözeltisini her kullanımdan önce 2 mikrometrelik bir filtreden filtreleyin. Bunu takiben, 1.5 milimetrelik bir tüpte 150 mikrolitre liyofilize Huntingtin ekzonunu 12 mikrolitre saf trifloroasetik asitte bir çözün.Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe ettikten sonra, trifloroasetik asidi bir çeker ocakta bir nitrojen veya argon akışı ile dikkatlice buharlaştırın. Ayrıştırılmış proteini bir mililitre önceden soğutulmuş DPBS içinde çözün ve pH'ı bir molar sodyum hidroksit ile 7.2 ile 7.4 arasında ayarlayın. Daha sonra protein çözeltisini 100 kilodaltonluk bir santrifüj filtreden 1.5 mililitrelik plastik tüplere süzün.Amino asit analizi tespitine dayalı bir UPLC kalibrasyon eğrisi kullanarak Huntingtin ekzon konsantrasyonunu belirleyin. Ardından, üç mikromolar Huntingtin ekzon bir konsantrasyonu elde etmek için eklenmesi gereken DPBS miktarını hesaplayın. Hesaplanan DPBS miktarını test tüpüne ekleyerek proteini üç mikromolar kadar seyreltin.Agregasyon protokolünün başlangıcına kadar tüpü buz üzerinde tutun. Elektro-mikroskopi ve diğer tekniklerle doğrulama, ayrıştırma protokolünün önceden oluşturulmuş agregaların uzaklaştırılmasında başarılı olduğunu doğrulamak için gerçekleştirilmelidir. İfade edilen füzyon proteininin tam amino asit dizisi burada gösterilmiştir.Plazmid ve eksprese edilen füzyon proteininin bir şeması burada gösterilmektedir. His-SUMO Huntingtin ekzon bir orta seviyede eksprese edilir ve füzyon proteininin çoğu, hem 23 glutamin hem de 43 glutamin varyantı için lizizden sonra çözünür fraksiyonda bulunur. Hem vahşi tip hem de mutant füzyon proteini, hareketsizleştirilmiş metal afinite kromatografisi ile yaklaşık% 80 saflığa kadar zenginleştirilebilir.His-SUMO etiketinin bölünmesi ve Huntingtin ekzon olanın saflaştırılması burada gösterilmektedir. Orijinal füzyon proteini zirvesi tüketilir ve His-SUMO etiketine ve Huntingtin ekzon tanesine karşılık gelen iki yeni ve iyi ayrılmış tepe noktası ortaya çıkar. Hem Huntingtin ekzon bir 23 glutamin hem de 43 glutamin, ters faz HPLC ile His-SUMO etiketinden ayrılabilir ve UPLC, MS ve SDS-PAGE analizi ile gösterildiği gibi yüksek saflıkta elde edilmiştir.Bir sedimantasyon deneyi ile belirlendiği gibi, m-Huntingtin ekzon bir fibril oluşumunun agregasyon kinetiği, 48 saatlik inkübasyondan sonra çözünür proteinin tamamen tükendiğini gösterir. Protein ikincil yapısının CD spektroskopisi, Huntingtin ekzon bir 43 glutamininin yapılandırılmamış olandan beta tabakası açısından zengin konformasyona kaydığını gösterir. Bu yapısal değişime, TEM tarafından gözlemlendiği gibi uzun fibriller agregatların oluşumu eşlik eder.Bir kez ustalaştıktan sonra, Huntingtin ekzon birinin ekspresyonu ve saflaştırılması için bu yöntem, uygun şekilde gerçekleştirilirse üç gün içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, Huntingtin ekzon bir proteininin, özellikle genleşmiş poliglutamin gerilmesine sahip proteinin, toplanma eğiliminin çok yüksek olduğunu hatırlamak çok önemlidir. Bu yöntem sayesinde, yeterli miktarda Huntingtin ekzon bir proteini üretebiliyor ve proteinin yapısını, agregasyonunu ve toksisitesini araştırmak ve hastalıkla ilişkili Huntingtin ekzon bir formunu tespit etmek ve ölçmek için yeni tahliller geliştirmek için daha önce erişilemeyen çalışmaları gerçekleştirebiliyoruz.SUMO füzyon proteininin stabilitesi ve yüksek çözünürlüğü, proteinin manipüle edilmesinde daha fazla esneklik sağlar ve aksi takdirde bölünmeden sonra mümkün olmayacak olan füzyon proteinleri bağlamında modifikasyonun başlatılmasına izin verir. Bu yöntemin basitliği ve verimliliğinin, doğal olmayan diziler ve model sistemler kullanma ihtiyacını ortadan kaldıracağını ve farklı disiplinlerden araştırmacıları bu önemli proteinin biyolojisini anlama ve Huntington hastalığının tedavisi için etkili terapötikler geliştirme arayışımıza katılmaya teşvik edeceğini umuyoruz.

generation-native-untagged-huntingtin-exon1-monomer-fibrils-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Proteinler ya doğal bir yapıyı benimseyebilir ya da çözünmeyen amiloid'e yanlış katlanabilir. Yanlış katlanma yolunu destekleyen koşullar, farklı tipte amiloid fibrillerin oluşumuna yol açar. Burada açıklanan yöntemler, doğal proteinlerin in vitro olarak amiloid'e hızlı bir şekilde dönüştürülmesine izin verir.

İn vitro Yerli Proteinlerden Hızlı Amiloid Üretimi

Özel plazmitlerin sentezi emek ve zaman alıcıdır. Bu protokol, özel DNA klonlama prosedürünün işini ve süresini azaltmak için Gibson montaj klonlamasının kullanımını açıklar. Açıklanan protokol ayrıca, geleneksel kes ve yapıştır DNA klonlamasına benzer maliyetle memeli ekspresyonu için güvenilir etiketli protein yapıları üretir.

Plazmid vektörler oluşturulması Gibson tertibatı kullanılarak insan uzama faktör-1α bir promotörün regülasyonu altında FLAG-etiketli Proteinlerinin İfade

Bu rapor, özellikle memeli hücrelerinde hedef genlerin eklenmesini düzenleyen yeni Yapay Ekleme faktörler (ASFS) tasarım ve yapı için biyoteknolojik yöntemi tarif etmektedir. Bu yöntem ayrıca, RNA metabolizması diğer yönlerini işlemek için çeşitli yapay faktörleri mühendisi genişletilebilir.

Yapay Faktörler Mühendislik Özellikle İnsan Hücreleri alternatif bağlantı işleyin için

Fare beyin ve hücre kültür çözünür ve çözünmez mutant huntingtin türlerinin ayırma için bir yöntemi açıklanmıştır. Açıklanan yöntemi karakterizasyonu ve miktar huntingtin protein akı ve protein homeostazı hastalık patogenezinde ve tedirginlikler huzurunda analiz AIDS için...

Çözünür ve çözünmez Huntingtin türler çözümlenmesi için ayırma

Çeşitli antianlamlı oligonucleotides (AONs) exon eklenmesi (splice modülasyon) teşvik ve spinal kas atrofisi (SMA) için SMN ifade kurtarma gösterilmiştir. Burada, biz AON lipotransfection SMN2 gen ve SMA hasta fibroblastlar etkinliğini belirlemek için değerlendirme yöntemleri exon eklenmesi ikna etmek için bir iletişim kuralı tanımlamak.

Tarafından indüklenen Exon dahil değerlendirilmesi Splice SMA hasta fibroblastlar anahtarlama antianlamlı Oligonucleotides

Bu makalede, toplama üzerinde floresan proteinlerin etkisi ve hızlı değerlendirme bağlamında yeni uncharacterized floresan protein misfolded polyglutamine genişlemesi floresan gazetecilere toksisitesi değerlendirmek için iletişim kurallarını açıklar.

Floresan proteinlerin etkisi Polyglutamine toksisite deneyleri Maya kullanılarak füzyon ortakları

Bu makalenin amacı, monomerik Alfa-synuclein, sonraki kalite kontrol ve önceden biçimlendirilmiş liflerinde in vivo kullanımı liflerinde nesil için gerekli adımları özetlemesidir.

Monomers ve Use In vivo Alfa-Synuclein önceden biçimlendirilmiş fibrils üretimi

Bu protokol, cilt fibroblastlarının miyoblastlara dönüşümünü ve farklılaşmalarını miyotüplere açıklar. Hücre hatları nöromüsküler bozukluğu olan hastalardan türetilmiştir ve patolojik mekanizmaları araştırmak ve terapötik stratejileri test etmek için kullanılabilir.

Nöromüsküler Bozukluklar için Tedavileri Araştırmak için İnsan Fibroblastlarının Myoblastlara Doğrudan Yeniden Programlanması

HEK293 hücrelerinde yapı tasarımı, geçici transfeksiyon ve tam uzunlukta insan huntingtin protein varyantlarının ekspresyonu ve saflaştırılmasını kapsayan ölçeklenebilir protokoller sunuyoruz.

Geçici İfade Sistemi Kullanarak Memeli Hücrelerinde Tam Boy İnsan Huntingtin Varyantlarının Verimli ve Ölçeklenebilir Üretimi

Burada, fotoafinite etiketlemesi kullanarak küçük molekül bağlayıcı proteinlerin tanımlanması için bir yöntem açıklıyoruz. Bu tekniğin avantajı, hedef proteinlerin bağlanma ve kovalent etiketlemesinin canlı hücresel ortamda gerçekleşmesi ve hücre lizizi üzerine doğal protein yapısını ve bağlanma koşullarını bozma riskini ortadan kaldırmasıdır.

Canlı hücre fotoafinite Etiketleme tarafından Yerli Hücresel Ortamında Küçük Molekül bağlayıcı proteinlerin belirlenmesi

Öğrenin, His-SUMO füzyon stratejisi kullanarak etiketsiz Huntingtin ekzon bir monomer ve fibril üretimini. Bu yöntem, yapı ve fonksiyon çalışmaları için yüksek saflıkta protein sağlar.

Yerli, etiketsiz Huntingtin Exon1 Monomer ve SUMO Fusion strateji kullanarak liflerinde nesil

Daha fazla video keşfet