Name: Yapma, test etme ve yetişkin beyin doku dilimler halinde potasyum iyon seçici Microelectrodes kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Öğrenin, yetişkin hipokampal dilimlerde potasyum iyon dinamiklerini ölçmek için monopolar potasyum iyon seçici mikroelektrotların yapımını, kalibrasyonunu ve kullanımını. Bu yöntem, merkezi sinir sisteminde potasyum homeostazının hücresel mekanizmalarını anlamaya katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Khakh laboratuvar NIH MH104069 tarafından desteklenmiştir. Mody laboratuvar NIH NS030549 tarafından desteklenmiştir. J.C.O. NIH T32 sinirsel Mikri şemalar eğitim Grant(NS058280) teşekkürler.

Tüm hayvan deneyleri Ulusal Enstitüsü, Sağlık Rehberi uygun olarak bakım ve kullanım laboratuvar hayvanları için yapılmıştır ve Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles Chancellor's hayvan Araştırma Komitesi tarafından kabul edildi. Bütün fareler ile yiyecek ve su kullanılabilir ad libitum 12 h koyu ortamda muhafaza. Bütün hayvanlar hiçbir belirgin davranış değişiklikleri ile sağlıklı, önceki çalışmalarda dahil edilmemişlerdir ve ışık döngüsü sırasında kurban edildi. Deneyler için veri--dan yetişkin fareler (6-8 hafta tüm deneyler için eski) toplanmıştır.
1. K+ selektif microelectrodes hazırlanması
<ol><li>Borosilikat cam Silanization<ol>
<li>Yeterli cam kılcal paketinden çıkarın ve 50 mL konik tüp içine yerleştirin. Dön konik tüp nazik ajitasyon HCl gecede veya en az 6 saat ile 1 M HCl. yıkama elektrotlar ile doldurun.</li>
		<li>Kısaca kılcal % 70 etanol ile durulayın ve 6-8 saat için 100-120 ° C'de tamamen kuru. Yıkanmış kılcal kapları susuz kalsiyum sülfat kurutucu ile 4 hafta daha da kullanmadan önce için saklayın.</li>
		<li>Silanization önce kılcal bir elektrot çektirmenin kullanarak iyi bahşiş çek. Kullandığımız microelectrodes yaklaşık 2-5 mikron çapında vardır. Cilt yağlar ile silanization engelleyebilir gibi her zaman eldiven ile yıkanmış kılcal başa.</li>
		<li>Microelectrodes elektrotlar alttan uç kırılma önlemek için yüksek bir cam kap içine yerleştirin. Autoclavable teyp veya benzer yapışkan bant kullanarak kapsayıcı microelectrodes saptamak.</li>
		<li>Yaklaşık 0.5 mL % 5 dichlorodimethylsilane (DDS) silanization çözeltisi azot değiştirme yöntemini kullanarak kendi kapsayıcıdan Kaldır (bkz. Şekil 2). Bir balon azot gazı ile doldurun ve bir şırınga veya tüp ve iğne için balon ekleyebilirsiniz. İğne ile uzun bir iğne ayrı bir şırınga DDS kadar çizerken DDS konteyner içine yerleştirin.</li>
		<li>Silanization çözüm dropwise Pipetler ipuçları için geçerlidir ve hemen kapağı. Microelectrodes silanization çözüm ile Önceden ısıtılmış (170-180 ° C) laboratuvar fırın içine 10-12 saat için ya da 200-220 ° C'de 30 dakika boyunca tutarak konteyner yerleştirin</li>
		<li>Kuluçka sonra fırın ve plaka fırından çıkarın. Olarak son derece sıcak plaka kuluçka makinesi çıkartırken dikkatli olun. 10-15 dakika soğumasını Züccaciye Mağazaları için oda sıcaklığında bir bankta plaka yerleştirin.</li>
		<li>Microelectrodes (kaset kesmek için bir jilet veya neşter bıçak kullanarak) plaka kaldırmak ve nem alıcı bir dolu hava geçirmez konteyner içine koyun. Silanized microelectrodes nem ücretsiz tutulması için ilâ 1 hafta silanization takip kullanılabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elektrotlar priming<ol>
<li>K+ ionophore kokteyl stok çözeltisi hazırlamak: % 5 w/v valinomycin, % 93 v/v 1,2-Dimetil-3-nitrobenzene, %2 w/v potasyum tetrakis(4-chlorophenyl) Bor11. Bu çözüm bir soluk sarı renktir. Oda sıcaklığında opak hava geçirmez bir kapta tutun. Düzgün depolanan bu çözüm aylar sürebilir eğer.</li>
		<li>10 mM 300 mM NaCl pH 7.4 arabelleğe HEPES stok çözeltisi hazırlamak. Elektrot bir kelepçe ve backfill bir şırıngaya bağlı 28 G microfil ucu kullanarak tamponlu NaCl ile sabitleyin. Tuzlu çözüm elektrot ucunu sonuna ulaştı gözlemlemek. Elektrot akım akışı ile engelleyebilir büyük baloncuklar ücretsiz olduğunu doğrulayın.</li>
		<li>Elektrot ucunu yaklaşık 10-20 µm için geniş, kör tarafı bistüri veya jilet kullanarak bölünürler.</li>
		<li>Bir micropipette kullanarak, küçük damlacık (~0.1 µl) elektrot ucuna yakın K+ ionophore uygulanır. Elektrot silanized düzgün olmuşsa damlacığı ucu kırık emilir. Dolgu için 1-2 mm K+ ionophore ve Kaldır fazla elektrot kağıt mendil kullanarak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. K+ selektif Microelectrodes kalibrasyonu
<ol><li>Kalibrasyon çözüm hazırlanması<ol>
<li>KCl eşit Osmolarite yapay serebrospinal sıvı (ACSF) çeşitli konsantrasyonları çözümleri ile KCl NaCl değiştirerek hazırlayın. Biz 0,1, 1, 4.5, 10 ve 100 mM K+ ACSF, elektrot kalibrasyon için kullanılır. Bu kalibrasyon çözümler tariflerini Tablo 1' de listelenmiştir.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Kimyasal</td>
			<td>MW</td>
			<td rowspan="2">son mM</td>
			<td rowspan="2">0,1 mM [K +]</td>
			<td rowspan="2">1 mM [K +]</td>
			<td rowspan="2">4.5 mM [K +]</td>
			<td rowspan="2">10 mM [K +]</td>
			<td rowspan="2">100 mM [K +]</td>
		</tr>
<tr>
<td>(g / mol)</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>58.44</td>
			<td>değişir</td>
			<td>1,51 g</td>
			<td>1.50 g</td>
			<td>1.44 g</td>
			<td>1.4 g</td>
			<td>0,345 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>1 M hisse senedi</td>
			<td>değişir</td>
			<td>20 µl</td>
			<td>200 µl</td>
			<td>900 µl</td>
			<td>2 ml</td>
			<td>20 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>1 M hisse senedi</td>
			<td>2</td>
			<td colspan="5">400 µl</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>1 M hisse senedi</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="5">200 µl</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>119.98</td>
			<td>1.2</td>
			<td colspan="5">0.29 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>84.01</td>
			<td>26</td>
			<td colspan="5">0,437 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-glikoz</td>
			<td>180.16</td>
			<td>10</td>
			<td colspan="5">0,360 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Su</td>
			<td colspan="7">QS 200 ml</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. Potasyum kalibrasyon çözüm
<ol start="2"><li>Elektrot kalibrasyon<ol>
<li>Tüm çözümleri ile % 95'i O2/5% CO2 deneme başlamadan önce en az 20 dakika kabarcık. Banyo 4,5 mM [K+] ile Ventriküler başlamak dakikada 3 mL oranında ACSF. K+ seçici elektrot elektrot tutucu elektrot headstage manipülatör üzerinde bağlı yerleştirin. Bu headstage için uygun bir amplifikatör bağlıdır. Elektrot ucunu banyo perfusate yerleştirin.</li>
		<li>Ag/AgCl zemin elektrot aynı çözüm içinde boğulmuş olduğunu ve akış sabit olduğundan emin olun. Kalibrasyon çözüm kademeli bir şekilde uygulayın ve olası değişiklikler mV içinde kaydetmek arasında elektrot uç. İstikrarlı bir değer sonraki çözüme geçmeden önce ulaşma potansiyeline elektrot uç bekleyin</li>
		<li>Kararlı duruma voltaj değişikliği yanıt kalibrasyon çözüm uygulamaya elektrot uç olarak ölçmek. Elektrot yanıt eğimi en az 52 58 fazla olduğunu doğrulayın ve mV başına günlük değişim [k+].</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. akut Hipokampal beyin dilimleri hazırlanması
<ol><li>Dilim çözümleri hazırlanması<ol>
<li>500 mL sukroz hazırlamak kesme çözüm oluşur: 194 mM Sükroz, 30 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 10 mM D-glikoz, 1 mM MgCl2, 1,2 mM NaH2PO4ve 26 mM NaHCO3, 290-300 mOsm, % 95'i O2 ve %5 CO2ile doymuş.</li>
		<li>1-2 litre kayıt çözüm (ACSF) oluşan hazırlamak: 124 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM D-glikoz, 2 mM CaCl2, 1,2 mM NaH2PO4ve 26 mM NaHCO3; (sonra köpüren) pH 7.3 7.4, 290-300 mOsm, % 95'i O2 ve %5 CO2ile doymuş. Çözüm kayıt ile beyin dilim sahibi odası içeren bir kabı ve 32-34 ° C'de tutmak Vibratome odası buz-su slush ile doldurun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Akut dilim hazırlık<ol>
<li>Derin bir fare çan ile 2-3 mL isoflurane precharged bir kavanoza koyarak anestezi. Ayak çimdik refleks için kontrol ve non-yanıt veren, hızlı bir şekilde hayvan iletişim kuralı gerektirir gibi keskin makas veya Giyotin bir çift kullanarak başını kesmek.</li>
		<li>Orta çizgi boyunca kafa derisi kesmek için kafatasının Kaudal bölümünden makası kullanarak 2-3 cm kesi yapmak. El ile kafa derisi geri çeker iken, iki 1 cm Yatay kesikler deliği magnum kenarlarında üzerinden kafatası yapmak. Sonra iyi makası kullanarak, bir kesi uzunluğu boyunca kafatasının arkasından orta hat burnuna kafatası kesti.</li>
		<li>İyi forseps orta hat takılı kullanarak, iki porsiyon kazıma kafatasında geri çek. Fare beyin kafatasından ayıklamak ve serebellum ve beyin Kaudal ve rostral bölümleri sırasıyla bulunan olfaktör ampuller kaldırmak için bir bıçak kullanın. Bunlar ayrı them korteks büyük çatlaklar belirlenebilir.</li>
		<li>Beyin blok süper yapıştırıcı kullanarak vibratome tepsi üzerine monte. Vibratome tepsi buz gibi soğuk kesme çözüm ile doldurun.</li>
		<li>Doku bölümleri 300 µm kalınlık, koronal uçakta kesti. Genellikle 6 koronal Hipokampal dilimleri toplanabilir.</li>
		<li>Her bölüm kesmek sonra hemen kabı 32-34 ° C'ye sıcak tutan dilim için dilimleri aktarın Bölümü içeren kabı kaldırmadan önce bölümler 20 dk için bu sıcaklıkta tutmak ve oda sıcaklığında en az 20-30 dakika kayıt önce burası.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. elektriksel olarak uyarılmış K+ Dynamics ölçümü
<ol><li>Dilim hazırlık kurma<ol>
<li>Yavaşça banyoda Pasteur pipet kullanarak beyin dilim yerleştirin ve nazikçe Platin harp naylon dizeleri ile olan yerde tutun.</li>
		<li>İki kutuplu uyarıcı elektrot uçları birbirine paralel ve dilim boyutunda düzeyiyle olun. Yavaş yavaş, 6-7 saniye boyunca, elektrotlar CA3 stratum radiatum yaklaşık 40-50 µm derin Schaffer de¤erler uyarmak için ekleyin. Koronal bölümlerde CA3 yaklaşık Hipokampus uygun lateral Hipokampal genu granül hücre katmanında bölümüyle piramit hücre katmanı düşen medial ve ventral stratum radiatum ile tespit edilebilir.</li>
		<li>Dikkatle K+Ekle-seçici elektrot CA1 stratum radiatum yaklaşık 50 µm elektrot yaklaşık 3-4 saniye içinde yavaş yavaş azaltarak derin içine. Dilimi elektrodlar uygulamadan önce elektrot arasında dengelemek için potansiyel izin: Bu genellikle 5-10 dakika sürer. Dilimi spontan sergileyen Eğer değişiklikleri ekstraselüler k+ sonra atmak ve yeni bir dilim ile bu işlemi tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>K+ sürüm ölçü uyarılmış<ol>
<li>Trenler elektrik stimülasyon (8 bakliyat) el ile uyarıcı tetiğe dijital olarak yanıt kaydederken iç karartıcı tarafından uygulanır. Uyarımı 10 Hz ve 10 µA uyarıcı genlik başlangıç 1 ms darbe genişliği de uygulanır.</li>
		<li>En fazla bir K+ yanıt genlik gelinceye artan stimülasyon genlikleri 2 kat uygulanır. Herhangi bir yanıt yoksa, 100 µm artışlarla stimülasyon sitedeki K+ elektrot daha yakın konumunu taşımak</li>
		<li>Yarım maksimal yanıt üreten uyarıcı genlik belirlemek. Deneyim, bu 40-160 µA, bağlı olarak üzerine hazırlık kalite, hayvan ve stimülasyon elektrotlar ve K+ seçici elektrot arasındaki mesafe yaş arasındadır.</li>
		<li>Bir adımda yarım maksimal yanıt üreten genlik düşük bir uyarıcı genlik aynı dilimi kullanarak (örneğin 80 µA bir yarı-azami yanıt neden oluyorsa, 40 µA kullanın) nabız sayısı artan uyarıcı trenler uygulamak. Başlangıçta, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 ile 128 bakliyat tren kullandık.</li>
		<li>K+ sinyalleri elektriksel olarak uyarılmış Schaffer de¤erler banyo aksiyon potansiyeli ateş tarafından aracılı onaylamak için 0.5 µM TTX ACSF içinde 10 dakika boyunca uygulayın ve stimülasyon protokolü. Hiçbir çatışmaya yanıt dikkat edilmelidir.</li>
		<li>Dilim deney bitirdikten sonra elektrot elektrot kalibrasyon çözüm yeniden ayarlama tarafından onun responsivity ettirmiştir ve yanıt sağlanması fazla % 10 oranında ilk kalibrasyon dan sapma değil onaylamak</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>McDonough, A. A., Youn, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+homeostasis%3A+The+knowns%2C+the+unknowns%2C+and+the+health+benefits%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Bethesda+Md%22%5BJournal%5D)">Potassium homeostasis: The knowns, the unknowns, and the health benefits.</a> Physiol Bethesda Md. 32 (2), 100-111 (2017).</li>
<li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHille%2C+B+%22Ion+channels+of+excitable+membranes%22">Ion channels of excitable membranes</a>. , Sinauer. Sunderland, MA. 507(2001).</li>
<li>Kofuji, P., Ceelen, P., Zahs, K. R., Surbeck, L. W., Lester, H. A., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+inactivation+of+an+inwardly+rectifying+potassium+channel+%28Kir4.1+subunit%29+in+mice%3A+Phenotypic+impact+in+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic inactivation of an inwardly rectifying potassium channel (Kir4.1 subunit) in mice: Phenotypic impact in retina.</a> J Neurosci. 20 (15), 5733-5740 (2000).</li>
<li>Sibille, J., Dao Duc, K., Holcman, D., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroglial+potassium+cycle+during+neurotransmission%3A+role+of+Kir4.1+channels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">The neuroglial potassium cycle during neurotransmission: role of Kir4.1 channels.</a> PLoS Comput Biol. 11 (3), e1004137(2015).</li>
<li>Tong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+Kir4.1+ion+channel+deficits+contribute+to+neuronal+dysfunction+in+Huntington%27s+disease+model+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice.</a> Nat Neurosci. 17 (5), 694-703 (2014).</li>
<li>Datta, D., Sarkar, K., Mukherjee, S., Meshik, X., Stroscio, M. A., Dutta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+oxide+and+DNA+aptamer+based+sub-nanomolar+potassium+detecting+optical+nanosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Graphene oxide and DNA aptamer based sub-nanomolar potassium detecting optical nanosensor.</a> Nanotechnology. 28 (32), 325502(2017).</li>
<li>Bandara, H. M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palladium-Mediated+Synthesis+of+a+Near-Infrared+Fluorescent+K%2B+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22+J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Palladium-Mediated Synthesis of a Near-Infrared Fluorescent K+ Sensor.</a> J Org Chem. 82 (15), 8199-8205 (2017).</li>
<li>Depauw, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+selective+potassium+sensor+for+the+detection+of+potassium+in+living+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Weinh+Bergstr+Ger%22%5BJournal%5D)">A highly selective potassium sensor for the detection of potassium in living tissues.</a> Chem Weinh Bergstr Ger. 22 (42), 14902-14911 (2016).</li>
<li>Machado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofouling-Resistant+Impedimetric+Sensor+for+Array+High-Resolution+Extracellular+Potassium+Monitoring+in+the+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Biofouling-Resistant Impedimetric Sensor for Array High-Resolution Extracellular Potassium Monitoring in the Brain.</a> Biosensors. 6 (4), (2016).</li>
<li>Rose, M. C., Henkens, R. W. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0304416574902049">Stability of sodium and potassium complexes of valinomycin.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Gen Subj. 372 (2), 426-435 (1974).</li>
<li>Ammann, D., Chao, P., Simon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valinomycin-based+K%2B+selective+microelectrodes+with+low+electrical+membrane+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance.</a> Neurosci Lett. 74 (2), 221-226 (1987).</li>
<li>Amzica, F., Steriade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+and+glial+membrane+potentials+during+sleep+and+paroxysmal+oscillations+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal and glial membrane potentials during sleep and paroxysmal oscillations in the neocortex.</a> J Neurosci. 20 (17), 6648-6665 (2000).</li>
<li>Amzica, F., Steriade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+significance+of+K-complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep+Med+Rev%22%5BJournal%5D)">The functional significance of K-complexes.</a> Sleep Med Rev. 6 (2), 139-149 (2002).</li>
<li>MacVicar, B. A., Feighan, D., Brown, A., Ransom, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+optical+signals+in+the+rat+optic+nerve%3A+role+for+K%28%2B%29+uptake+via+NKCC1+and+swelling+of+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Intrinsic optical signals in the rat optic nerve: role for K(+) uptake via NKCC1 and swelling of astrocytes.</a> Glia. 37 (2), 114-123 (2002).</li>
<li>Chever, O., Djukic, B., McCarthy, K. D., Amzica, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+Kir4.1+channel+in+excess+potassium+clearance%3A+an+in+vivo+study+on+anesthetized+glial-conditional+Kir4.1+knock-out+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Implication of Kir4.1 channel in excess potassium clearance: an in vivo study on anesthetized glial-conditional Kir4.1 knock-out mice.</a> J Neurosci. 30 (47), 15769-15777 (2010).</li>
<li>Hall, D. G. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp9603039">Ion-selective membrane electrodes: A general limiting treatment of interference effects.</a> J Phys Chem. 100 (17), 7230-7236 (1996).</li>
<li>Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-barreled+and+Concentric+Microelectrodes+for+Measurement+of+Extracellular+Ion+Signals+in+Brain+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue.</a> J Vis Exp. (103), e53058(2015).</li>
<li>Larsen, B. R., MacAulay, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kir4.1-mediated+spatial+buffering+of+K%28%2B%29%3A+Experimental+challenges+in+determination+of+its+temporal+and+quantitative+contribution+to+K%28%2B%29+clearance+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+Austin+Tex%22%5BJournal%5D)">Kir4.1-mediated spatial buffering of K(+): Experimental challenges in determination of its temporal and quantitative contribution to K(+) clearance in the brain.</a> Channels Austin Tex. 8 (6), 544-550 (2014).</li>
<li>Mei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+recording+of+circadian+rhythms+in+brains+of+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Biz burada tarif yöntemi bize K+ dynamics yetişkin fareler tarafından yapılan yanıt Schaffer de¤erler akut Hipokampal dilimleri içinde elektrik stimülasyon olarak değerlendirmek izin verdi. K+ iyon seçici microelectrodes hazırlama bizim daha önce açıklanan yordamları12,13,14,15' e benzer bir yöntemdir. Ancak, hızlı ve basit K+ selektif microelectrodes hazırlamak...

Potasyum iyon konsantrasyonlarının sıkıca beyinde düzenlenir ve onların dalgalanmaları istirahat membran potansiyeli tüm hücrelerin üzerinde güçlü bir etkisi uygulamak. Bu kritik katkıları ışığında Biyoloji önemli bir amacı sıkı K+ konsantrasyonu düzenlemek için kullanılan hücresel ve biyofiziksel mekanizmaları hücre dışı alan vücut1 farklı organlarda belirlemektir , 2. bu çalışmalarda önemli bir gereksinimi K+ konsantrasyonları doğru ölçmek için yeteneğidir. Sağlıklı ve hastalıklı Birleşik beyinde homeostazı potasyum katkıda birçok bileşeni tanımlanan3,4,5, olmasına rağmen daha fazla ilerleme özel yapısı nedeniyle yavaşladı İyon seçici microelectrodes potasyum ölçüm için hazırlanıyor. Elektrot sensörler K+ konsantrasyonları vitro, dokusu dilimlerin ve içinde vivoölçmek için altın standart temsil eder.
K+ için yeni yaklaşımlar izleme bunlar biyolojik ilgili aralığı K+ konsantrasyonları algılamaz veya tamamen biyolojik sistemlerde, her ne kadar incelenmesi değil ancak optik sensörler, kullanarak ilk sonuçları geliştiriliyor gelecek vaat eden6,7,8görünür. Elektrot dizilerin Uzaysal çözünürlük9artırabilirsiniz optik sensörler için karşılaştırıldığında, microelectrodes temelde bir nokta kaynak ölçüyle iyonlar, sınırlı olmakla birlikte. Bu makale K+ dynamics izlemek için tek namlulu elektrot sensörler üzerinde duruluyor.
Bu çalışmada, biz K+ selektif microelectrodes, (104 kat K+ Na+ seçicilik) çok seçici izin veren bir valinomycin tabanlı potasyum ionophore kullanarak yapmak için detaylı kademeli işlemler raporu K+ membranlar10üzerinden hareket. Doğal olarak meydana gelen bir polipeptit valinomycin K+ geçirgen gözenek davranır ve K+ akış aşağı 's elektrokimyasal gradyan kolaylaştırır. Biz de elektrotlar, kalibre açıklar nasıl depolamak ve bunları kullanmak ve nihayet onları K+ konsantrasyon dinamiklerini akut Hipokampal beyin dilimleri yetişkin fareler üzerinden ölçmek için daÃ ° ã½tma. Böyle elektrotlar ile birlikte hücre dışı K+ dynamics düzenleyen için önerilen belirli iyon kanalları eksikliği genetiği değiştirilmiş fare kullanımı K ortam konsantrasyonu kontrol etmek için sinir sistemi tarafından kullanılan hücresel mekanizmaları ortaya çıkarmak + ekstrasellüler ortamında.

<table><tbody><tr><td>Vibratom</td><td>DSK</td><td>Microslicer Zero 1</td><td></td></tr><tr><td>Fare: C57BL/6NTac doğuştan fareler</td><td>Taconic</td><td>Stock#B6</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Elektrot çektirmesi</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl öğütülmüş pelet</td><td>WPI</td><td>EP2</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP10.3</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Özel microfil 28G uç</td><td>Dünya hassas aletleri</td><td>CMF28G</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten Çubuk</td><td>Sistemleri</td><td>716000</td><td></td></tr><tr><td>Bipolar uyarıcı elektrotlar</td><td>FHC</td><td>MX21XEW (T01)</td><td></td></tr> <tr><td>Uyaran izolatörü</td><td>Dünya hassas aletleri</td><td>A365</td><td></td></tr><tr><td>Çim S88 Stimülatör</td><td>Çim Aletleri Şirketi</td><td>S88</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat cam pipetler</td><td>Dünya hassas aletler</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>A - D kartı</td><td>Digidata 1322A</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Sinyal Amplifikatörü</td><td>Multiclamp 700A veya 700B</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Headstage</td><td>CV-7B Cat 1</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Yama bilgisayarı</td><td>Dell</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum</td><td>Klorür Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat Monobazik</td><td>Sigma</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>D-glikoz</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür</td><td>Sigma</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>valinomisin</td><td>Sigma</td><td>V0627-10mg</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dimetil-3-nitrobenzen</td><td>Sigma</td><td>40870-25ml</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum tetrakis (4-klorofenil)borat</td><td>Sigma</td><td>60591-100mg</td><td></td></tr><tr>heptan <td>Sigma</td><td>85126-5ml</td><td></td>TTX Cayman<td>içinde% 5 dimetildiklorosilan</td></tr><tr><td></td><td> Kimya Şirketi</td><td>14964</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Sigma</td><td>H1758-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma</td><td>S9378-5kg</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Mikromanipülatör</td><td>Sutter</td><td>MP-285 / ROE-200 / MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>Objektif lens</td><td>Olympus</td><td>PlanAPO 10xW</td><td></td></tr></tbody></table>

yapma, test etme ve yetişkin beyin doku dilimler halinde potasyum iyon seçici microelectrodes kullanma

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Potasyum iyonları hücre istirahat membran potansiyelini önemli ölçüde katkıda bulunmak, bu nedenle, ve ekstraselüler K+ konsantrasyonu hücre uyarılabilirlik çok önemli bir regülatör. Aksiyon potansiyeli altında yatan voltaj bağımlı iyon kanalları için kapalı, açık ve Inaktif devletler arasında denge ilerletmeniz istirahat membran potansiyeli ve hücresel uyarılabilirlik ekstraselüler K+ etkiler konsantrasyonları değişmiş başlatma ve iletken. Bu nedenle, doğrudan hücre dışı K+ dynamics sağlık ve hastalıklı Birleşik ölçmek için değerlidir. Burada, nasıl yapmak, kalibre ve monopolar K+tarif-seçici microelectrodes. Biz onları elektriksel olarak uyarılmış K+ konsantrasyon dynamics ölçmek için yetişkin Hipokampal beyin dilimler halinde dağıtılabilir. Böyle elektrotlar akılcı kullanımı ekstraselüler K+ konsantrasyonları sinir sisteminde kontrol hücresel ve biyofizik mekanizmalar değerlendirmek için gerekli araç kitinin önemli bir parçasıdır.

Hücre dışı K+seçici ölçüm için iyon-seçici microelectrodes temiz borosilikat cam Pipetler (şekil 1A) silanization ile hidrofobik bir tabaka ile kaplı hazırladık. Bu kaplama valinomycin elektrot uç vasıl dinlenme ve sadece K+ akı elektrot uç (şekil 1B) dar bir delikten izin vermeyi içeren K+ ionophore sağlar. Elektrotlar göre backfilled tuzlu çözüm ve K+ ionophore ile priming sonra elekt...

Potasyum iyonları hücre istirahat membran potansiyelini katkıda bulunmak ve ekstraselüler K+ konsantrasyon hücresel uyarılabilirlik çok önemli bir düzenleyicisidir. Biz nasıl yapmak, kalibre ve monopolar K+tarif-seçici microelectrodes. Böyle elektrotları kullanarak elektriksel olarak uyarılmış K+ konsantrasyon dynamics yetişkin Hipokampal dilimleri içinde ölçüm sağlar.

Yapma, test etme ve yetişkin beyin doku dilimler halinde potasyum iyon seçici Microelectrodes kullanma

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Bu tekniğin genel amacı, monopolar potasyum iyon seçici mikroelektrotları yapmak, kalibre etmek ve kullanmaktır. Bu tür elektrotların kullanılması, yetişkin beyin dilimlerinde uyarılmış potasyum iyonu konsantrasyon dinamiklerinin kantitatif değerlendirmesini sağlar. Bu yöntem, merkezi sinir sistemindeki potasyum iyonu homeostazı için hücresel ve moleküler mekanizmaların tanımlanması gibi fizyolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu tekniğin temel avantajı, kolay ve anlaşılır bir üretim yöntemi olmasının yanı sıra, mikroelektrot sensörlerinin potasyum iyon konsantrasyonunun ölçümü için altın standardı temsil etmesidir. Borosilikat cam kılcal damarları silanizasyona hazırlamak için bunları 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Konik tüpü bir molar hidroklorik asit ile doldurun ve cam kılcal damarları en az altı saat boyunca gece boyunca hafif çalkalama ile hidroklorik asit içinde inkübe edin.Daha sonra, kılcal damarları% 70 etanol ile kısa bir süre durulayın ve ardından altı ila sekiz saat boyunca 100 ila 120 santigrat derecede tamamen kurutun. Yıkanmış kılcal damarları, daha fazla kullanmadan önce susuz kalsiyum sülfat kurutucu içeren kaplarda dört haftaya

making-testing-using-potassium-ion-selective-microelectrodes-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu piramidal nöronların elektriksel kayıtlar yapma amaçlı bir Organotipik kültür neokortikal dilim hazırlama hazırlamak ve sürdürmek için bir protokoldür.

Neokorteks bir Organotipik Dilim Hazırlık Tüm Hücre Kaydı

GABA-aktive tek kanal akımları (GABAA kanalları, GABAA reseptörleri) ve nöronlarda sinaptik üreten ve tonik akımları ölçmek için yama klemp tekniği kullanır. Sağlık ve hastalık kanalların aktivasyonu nöronal eksitabilite...

Rat Beyin Dilimleri GABA-aktive Tek kanallı ve Tonik Akımlar

Nöronlar ilk elektrofizyolojik karakterizedir. Ardından kaydedilen nöron sitoplazma aspire ve nörotransmitter sentezi enzimler, iyon kanalları ve reseptörler mRNA'ların ifade algılamak için ters transkripsiyon-PCR analizi tabi.

Voltaj-kapılı potasyum Kanal mRNA gösterilmeden Tek hücreli RT-PCR teknikleri kullanarak Nigral Nöronlar

Video, fare koronal hipokampal beyin dilimlerinin elektriksel stimülasyonu üzerinde uyarılmış potasyum iyonu konsantrasyon dinamiklerini göstermektedir. Hipokampustaki CA3 bölgesinin stratum radiatumuna bir bipolar uyarıcı elektrot yerleştirilir ve CA1 stratum radiatumuna bir potasyum iyonu seçici elektrot yerleştirilir. Elektriksel stimülasyon, potasyum iyonu salınımına neden olan bir aksiyon potansiyeline neden olur. Son olarak, bir inhibitör molekülün varlığında uyarılmış potasyum iyonu...

Koronal Hipokampal Dilimlerde Uyarılmış Potasyum İyonu Konsantrasyon Dinamiğinin Ölçümü

Bu video, elektrik sinyallerini ölçmek ve karşılaştırmak için iyon seçici ve iyontoforez mikroelektrotları kullanarak bir beyin dilimindeki hücre dışı boşluğun nasıl karakterize edileceğini gösterir. Bu işlem, boşluğun hacim fraksiyonunu ve bükülme derecesini belirlemeye yardımcı olur.

İyon Seçici ve İyontoforez Mikroelektrotları Kullanılarak Bir Beyin Dilimindeki Hücre Dışı Boşluğun Karakterize Edilmesi

Biz eksitotoksisite kaynaklı beyin hasarı dahil moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilecek bir beyin kesit modeli geliştirdik. Bu teknik açıdan olgun beyin dokusunu oluşturur ve kısmen sağlam nöronal devreleri, hücresel etkileşimleri ve postsinaptik bölmeleri korurken, deney için gerekli olan hayvan sayısı azalır.

Bir olarak Beyin Microslices arasında excitotoxic uyarılması<em&gt; In vitro</em&gt; İnme Model

Bu yazıda, kesme için özel modifikasyonlar (sükroz eklemek gibi) olmadan ve dilim hazırlamadan önce hayvanın intrakardiyal perfüzyonu olmadan geleneksel bir fizyolojik çözelti kullanarak, fizyolojik sıcaklıkta akut beyin dilimleri hazırlamak için bir yöntem gösteriyoruz.

Slice It Hot: Fizyolojik Sıcaklık Akut Yetişkin Beyin Dilimleme

Akut beyin dilimlerinde sinaptik olarak eşleşmiş nöronların yama-kelepçe kayıtları ve eş zamanlı hücre içi biyosit dolumu, yapısal ve fonksiyonel özelliklerinin ilişkili bir analizine izin verir. Bu protokolün amacı, nöronal mikro devrelerden elektrofizyolojik kaydın temel teknik adımlarını ve bunların müteakip morfolojik analizlerini tanımlamaktır.

Akut Beyin Dilimleri nöronal Mikro şemalar Elektrofizyolojik ve Morfolojik Karakterizasyonu Eşleştirilmiş Patch-Kelepçe Kayıtlar Kullanma

Beyin dokusundaki iyon konsantrasyonlarının ölçümü için iki tip iyon seçici mikroelektrotun (çift namlulu ve eş merkezli) üretimini, kalibrasyonunu ve özelliklerini gösteriyoruz. Bunlar daha sonra uyarıcı aktivitenin hem hücre dışı potasyum hem de sodyum konsantrasyonlarını değiştirdiğini göstermek için fare hipokampal dilim hazırlığında kullanılır.

Beyin Dokusu Ölçme Ekstraselüler Ion Sinyalleri için Çift namlulu ve Konsantrik Mikroelektronlar

Bu iletişim kuralı bir en iyi duruma getirilmiş Nuygulanmasını gösteren-metil-D-glucamine (NMDG) koruyucu kurtarma yöntemi beyin dilim hazırlık. Bir tek medya formülasyon güvenilir bir şekilde sağlıklı beyin dilimleri her yaştan ve çeşitli deneysel uygulamalar için hayvanlardan elde etmek için kullanılır.

En iyi duruma getirilmiş bir Nkullanarak akut beyin dilimleri hazırlanması-metil-D-glucamine koruyucu kurtarma yöntemi

Microglia, yerleşik bağışıklık hücreleri beynin, çabuk morfolojik değişiklikler ile çevrenin değişiklikler cevap. Bu protokol iki fotonlu mikroskobu serotonin veya ATP doğru mikroglial süreçlerinde fareler dilim akut beyin cazibe çalışmak için nasıl kullanılacağını açıklar.

Mikroglial süreçleri cazibe ATP veya Serotonin akut beyin dilimleri içinde doğru iki fotonlu görüntüleme

Öğrenin, yetişkin hipokampal dilimlerde potasyum iyon dinamiklerini ölçmek için monopolar potasyum iyon seçici mikroelektrotların yapımını, kalibrasyonunu ve kullanımını. Bu yöntem, merkezi sinir sisteminde potasyum homeostazının hücresel mekanizmalarını anlamaya katkı sağlar.

Yapma, test etme ve yetişkin beyin doku dilimler halinde potasyum iyon seçici Microelectrodes kullanma

Daha fazla video keşfet