Yapma, test etme ve yetişkin beyin doku dilimler halinde potasyum iyon seçici Microelectrodes kullanma

Bu tekniğin genel amacı, monopolar potasyum iyon seçici mikroelektrotları yapmak, kalibre etmek ve kullanmaktır. Bu tür elektrotların kullanılması, yetişkin beyin dilimlerinde uyarılmış potasyum iyonu konsantrasyon dinamiklerinin kantitatif değerlendirmesini sağlar. Bu yöntem, merkezi sinir sistemindeki potasyum iyonu homeostazı için hücresel ve moleküler mekanizmaların tanımlanması gibi fizyolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, kolay ve anlaşılır bir üretim yöntemi olmasının yanı sıra, mikroelektrot sensörlerinin potasyum iyon konsantrasyonunun ölçümü için altın standardı temsil etmesidir. Borosilikat cam kılcal damarları silanizasyona hazırlamak için bunları 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Konik tüpü bir molar hidroklorik asit ile doldurun ve cam kılcal damarları en az altı saat boyunca gece boyunca hafif çalkalama ile hidroklorik asit içinde inkübe edin.

Daha sonra, kılcal damarları% 70 etanol ile kısa bir süre durulayın ve ardından altı ila sekiz saat boyunca 100 ila 120 santigrat derecede tamamen kurutun. Yıkanmış kılcal damarları, daha fazla kullanmadan önce susuz kalsiyum sülfat kurutucu içeren kaplarda dört haftaya kadar saklayın. Silanizasyondan önce, bir mikroelektrot çektirmesi kullanarak kılcal damarları ince bir uca çekin.

Ardından, mikroelektrotları otoklavlanabilir bant kullanarak bir cam kaba yerleştirin, böylece uç kırılmasını önlemek için elektrotlar alttan yükseltilir. Daha sonra, nitrojen değiştirme yöntemini kullanarak yaklaşık 0,5 mililitre% 5 DDS silanizasyon çözeltisini kabından çıkarın. Bir balonu nitrojen gazı ile doldurun ve balona bir şırınga veya tüp ve iğne takın.

Ardından, DDS'yi daha uzun bir iğne ile ayrı bir şırıngaya çekerken iğneyi DDS kabına yerleştirin. Daha sonra, silanizasyon solüsyonunu pipetlerin uçlarına damla damla uygulayın ve hemen kabın üzerini kapatın. Silanizasyon solüsyonlu mikroelektrotları tutan kabı, 10 ila 12 saat boyunca 170 ila 180 santigrat derecede veya 200 ila 220 santigrat derecede 30 dakika boyunca önceden ısıtılmış bir laboratuvar fırınına yerleştirin.

Kuluçka işleminden sonra, plakayı fırından çıkarın. Cam eşyaların soğumasını sağlamak için plakayı oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika bir tezgahın üzerine koyun. Mikroelektrotları plakadan çıkarın ve kurutucu dolu hava geçirmez bir kaba koyun.

Nemden uzak tutulan silanize mikroelektrotlar, silanizasyonu takiben bir haftaya kadar kullanılabilir. Elektrotları astarlamak için, bir potasyum iyonofor kokteyli stok çözeltisi hazırlayın ve oda sıcaklığında hava geçirmez, opak bir kapta saklayın. Daha sonra, pH 7.4'te 10 milimolar HEPES tamponlu 300 milimolar sodyum klorürden oluşan bir stok çözeltisi hazırlayın.

Elektrodu bir kelepçeye sabitleyin. Daha sonra, kör bir alet kullanarak, elektrotun ucunu yaklaşık 10 ila 20 mikrometre genişliğinde tırmıklayın, ardından bir şırıngaya bağlı 28 gauge MicroFil ucu kullanarak elektrodu HEPES tamponlu sodyum klorür ile doldurun. Tuzlu su çözeltisinin mikroelektrot ucunun sonuna ulaştığını gözlemleyin ve mikroelektrotta akım akışını engelleyebilecek büyük kabarcıklar bulunmadığından emin olun.

Bir mikropipet kullanarak, mikroelektrotun ucuna yakın bir yere küçük bir damla potasyum iyonofor uygulayın. Elektrot uygun şekilde silanize edilmişse, damlacık kırık uca emilecektir. Elektrodu potasyum iyonofor ile yaklaşık 1 milimetreye kadar doldurun ve fazlalığı kağıt mendil kullanarak çıkarın.

Mikroelektrotları kalibre etmek için, deneye başlamadan önce tüm kalibrasyonu ve tampon çözeltilerini en az 20 dakika boyunca %95 oksijen/%5 karbondioksit ile dilimleyin. Banyoyu dakikada üç mililitre hızında 4.5 milimolar potasyum iyonu içeren ACSF ile perfüze etmeye başlayın. Potasyum iyonu seçici elektrodu, manipülatör üzerindeki elektrot kafasına bağlı elektrot tutucusuna yerleştirin.

Ardından, elektrotun ucunu banyo perfüzatına yerleştirin. Gümüş/gümüş klorür toprak elektrodunun aynı çözeltide yıkandığından ve akışın sabit olduğundan emin olun. Kalibrasyon çözeltilerini adım adım uygulayın ve elektrot ucu boyunca milivolt cinsinden potansiyel değişiklikleri kaydedin.

Bir sonraki çözüme geçmeden önce elektrot ucundaki potansiyelin sabit bir değere ulaşmasını bekleyin. Ardından, kalibrasyon çözeltilerinin elektrot ucuna uygulanmasına yanıt olarak kararlı durum voltaj değişimini ölçün. Elektrot voltaj tepkisinin eğiminin, potasyum konsantrasyonundaki on kat değişiklik başına en az 52 ve 59 milivolttan büyük olmadığını onaylayın.

Hipokampal dilimler hazırlamak için, kafa derisini orta hat boyunca kesmek için kafatasının kaudal kısmından iki ila üç santimetrelik bir kesi yapın. Kafa derisini manuel olarak geri çekerken, kafatasının kenarları boyunca foramen magnumdan birer santimetrelik iki yatay kesi yapın. Daha sonra, ince makaslar kullanarak, kafatasının arkasından buruna kadar orta hat boyunca bir kesi yapın.

Ardından, orta çizginin yakınına ince forseps yerleştirin ve kesilmiş kafatasını iki parça halinde geri çekin. Fare beynini kafatasından çıkarın ve sırasıyla beynin kaudal ve rostral kısımlarında bulunan beyincik, prefrontal korteks ve koku soğancıklarını çıkarmak için bir bıçak kullanın. Ardından, Süper Yapıştırıcı kullanarak beyin bloğunu vibratom tepsisine monte edin.

Vibratom tepsisini buz gibi kesme solüsyonuyla doldurun. Daha sonra, koronal düzlükte 300 mikrometre kalınlığında doku kesitleri kesin. Genellikle dört ila altı koronal hipokampal dilim toplanabilir.

Her bölüm kesildikten sonra, dilimi hemen 32 ila 34 santigrat dereceye kadar ısıtılmış dilim tutma kabına aktarın. Kayıttan önce en az 20 ila 30 dakika boyunca beheri bölümlerle birlikte oda sıcaklığına aktarmadan önce bölümleri 20 dakika bu sıcaklıkta tutun. Potasyum iyon dinamiklerini ölçmek için, beyin dilimini bir Pasteur pipeti kullanarak banyoya nazikçe yerleştirin ve naylon ipli bir platin arp ile nazikçe yerinde tutun.

Bipolar uyarıcı elektrotun uçlarının yaklaşık olarak birbirine paralel olduğundan ve dilimin düzlüğü ile aynı seviyede olduğundan emin olun. Beş ila yedi saniye boyunca, Schaffer teminatlarını uyarmak için elektrotları yaklaşık 40 ila 50 mikrometre derinliğindeki CA3 stratum radiatumuna yavaşça yerleştirin. Ardından, potasyum iyonu seçici elektrodu, elektrodu yaklaşık üç ila dört saniye boyunca yavaşça indirerek yaklaşık 50 mikrometre derinliğe kadar CA1 stratum radiatumuna dikkatlice yerleştirin.

Genellikle beş ila 10 dakika süren dilime stimülasyonlar uygulamadan önce elektrot boyunca potansiyelin stabilize olmasına izin verin. Dilim, hücre dışı potasyum iyon konsantrasyonlarında aşırı spontan değişiklikler gösterirse, işlemi atın ve yeni bir dilimle tekrarlayın. Uyarılmış potasyum iyonu salınımını ölçmek için, yanıtları dijital olarak kaydederken uyaran izolatörü aracılığıyla elektriksel stimülasyon trenleri uygulayın.

10 mikroamper uyaran genliğinden başlayarak 10 hertz ve darbe başına bir milisaniyede stimülasyon uygulayın. Maksimum potasyum yanıt genliği tespit edilene kadar iki kat artan stimülasyon genlikleri uygulayın. Herhangi bir yanıt gözlenmezse, potasyum iyonu seçici elektrotun konumunu 100 mikrometrelik artışlarla stimülasyon bölgesine yaklaştırın.

Potasyum iyonu konsantrasyonu değişikliklerine, elektrikle aktive olan Shaffer teminatlarının aksiyon potansiyeli ateşlemesinin aracılık ettiğini doğrulamak için, banyo ACSF'de 10 dakika boyunca 0.5 mikromolar TTX uygulayın ve stimülasyon protokolünü tekrarlayın. Uyarılmış tepkiler gözlenmemelidir. Elektrotları geri doldurulmuş HEPES tamponlu salin çözeltisi ve potasyum iyonofor ile astarladıktan sonra, elektrotlar, banyo potasyum iyonu konsantrasyonlarındaki kademeli değişikliklere hızlı tepkileri ve banyo potasyum iyonu değişikliklerine doğrusal tepki için test edilebilir. 0.1 ila 100 milimolar kalibrasyon aralığı boyunca Nernst denklemi tarafından tahmin edilen bir şekilde.

Kararlı durum potansiyeli, potasyum iyon konsantrasyonundaki on kat değişim başına yaklaşık V 58.2 milivolt ve en az 52 milivolt olması gereken çizginin eğimini belirlemek için banyo potasyum iyonu konsantrasyonuna karşı çizilebilir. Potasyum seçici elektrotların duyarlılığı daha fazla test edildi ve potasyumda 5.5 milimolar bir artışa yanıt, yaklaşık 85 milisaniyelik yükselme ve bozunma süresi sabitleri ile gözlendi. Uyarıcı ve potasyum iyon seçici elektrotlar dokuya yerleştirildikten ve kayıt stabil bir taban çizgisine ulaştıktan sonra, artan akım genliğine sahip darbeler uygulanabilir.

Bu aktivitenin dalga şekli, TTX uygulaması ile ortadan kaldırılan üstel bozunma hızı ile potasyumda hızlı bir artış olarak ortaya çıkar. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik dikkatli ve doğru bir şekilde yapılırsa yaklaşık üç ila dört saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, doğru kayıtları mümkün kılmak için elektrot ucunu mümkün olduğunca küçük, ancak düşük gürültüye izin verecek kadar büyük tutmayı unutmamak önemlidir.