Vasküler Hyperpermeability indükleyici ajanlar cilt mil tahlil ile değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, geçirgenliği arttırıcı ajanların intradermal enjeksiyonu ile indüklenen fare dermisindeki vasküler sızıntıyı ölçmektir. Bu prosedür, hangi moleküllerin vasküler sızıntıyı uyarabileceği veya inhibe edebileceği ve ilgili sinyal yollarının neler olduğu gibi in vivo vasküler geçirgenliğin düzenlenmesi ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedürün temel avantajı, hızlı ve nispeten basit olması ve çoğunlukla yaygın laboratuvar reaktifleri ve malzemeleri kullanmasıdır.

Bu tekniğin etkileri, patolojik ödemli hastalıkların tedavisine kadar uzanır. Özellikle, araştırmacılar bu testi yeni moleküler hedefleri tanımlamak ve ilgili ilaçları vasküler geçirgenliği nispeten hızlı ve basit bir şekilde inhibe etme yetenekleri açısından test etmek için kullanabilirler. Histamin inhibitörü Pirilamin Maleat ve Evans Blue Dye'ın her ikisi de% 0.9 tuzlu su çözeltisi içinde ayrı çözeltiler hazırlayın.

Daha sonra laminer bir akış kabininde çalışarak, 0.22 mikrometrelik bir filtreden geçirerek çözeltileri sterilize edin. İki çözeltiyi 30 gauge iğnelerle donatılmış ayrı bir mililitrelik şırıngalara yükleyin. Ardından, fareyi tırmalayın.

Ardından fareyi, baş yere ve karın yukarı doğru yönlendirilecek şekilde eğin. Fare yerleştirildikten sonra, intraperitoneal enjeksiyon ile vücut ağırlığının gramı başına 10 mikrolitre Pirilamin Maleat çözeltisi uygulayın. Daha sonra, vazodilatasyonu teşvik etmek için, fareyi 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir ısı odasına yerleştirin.

Ardından fareyi bir fare sınırlayıcıya getirin. Ardından, daha fazla vazodilatasyon için kuyruğu% 70 etanol ile ovalayın. 100 mikrolitre Evans Blue Dye solüsyonunu kuyruk damarından intravenöz olarak uygulayın.

Kanamayı önlemek için, kuyruğu bir parmak ile başparmak arasında hızlı bir şekilde tutun ve enjeksiyon bölgesine baskı uygulayın. Evans Blue Dye'ın farenin kuyruk damarına intravenöz enjeksiyonu, bu prosedür içinde zor ve kritik bir adımdır. Buna göre, prosedürün geri kalanına devam etmeden önce araştırmacıların bu enjeksiyonu gerçekleştirme konusunda yetkin olmaları önemlidir.

Yetkinliğin oluşturulması önceden uygulama gerektirecektir. VEGF reaktifini, dozun son hacmi 20 mikrolitre olacak şekilde seyreltmek için steril fosfat tamponlu salin çözeltileri kullanın. Ardından VEGF geçirgenliği indükleyen reaktifi ve araç kontrolünü 31 gauge iğne ile donatılmış iki ayrı 300 mikrolitrelik şırıngaya yükleyin.

İğneyi cilt ile 15 derecelik açıda tutun ve 20 mikrolitre VEGF'yi intradermal olarak farenin yan tarafına enjekte edin. Başarılı enjeksiyonu doğrulamak için cilt içinde kabarık bir baloncuk bulun. En az bir santimetre aralıklarla iki ek bölgede intradermal enjeksiyonlar yapın.

Ardından, ikinci kanadı ortaya çıkarmak için fareyi çevirin ve araç solüsyonu ile üçlü enjeksiyonları tekrarlayın. Enjeksiyon bölgelerinin her biri için kağıt üzerinde bir kayıt tutun ve enjeksiyon prosedürünün sonlandırıldığı zaman için bir kayıt tutun. Ardından fareyi ev kafesine aktarın.

Bilincini geri kazanana ve kafesin etrafında hareket etmeye başlayana kadar fareyi izlemeye devam edin. Fareyi çağırmadan önce VEGF solüsyonunun 20 dakika etki etmesine izin verin. Bu aşamada, aynı prosedürü takiben tüm farelere sırayla VEGFA ve araç enjekte edin.

20 dakika sonra, ötenazi yapılmış her fareyi sırtına yerleştirin ve ayaklarını temiz bir dokuya sarılmış bir mantar panoya sabitleyin. Daha sonra, künt makas yardımıyla, alt karın bölgesinden ölü farenin göğsüne üç ila dört santimetre uzunluğunda dikey bir kesi yapın. Ardından, cildi kanadın her iki tarafından kızdırmak için forseps ve neşter kullanın.

Sızıntı bölgesinin etrafındaki bölgelerde varsa herhangi bir yağı çıkarmak için neşter kullanın. Ardından, sızan Evans Blue Dye ile cilt bölgelerini çıkarmak için forseps ve neşter kullanın. Eksize edilen cilt bölgeleri benzer büyüklükte olmalıdır.

Deri örneklerini 1,5 mililitrelik tüplere aktarın ve buna göre etiketleyin. Açık tüpü gece boyunca bir ısı bloğuna yerleştirerek numuneyi kurutun. Kurutma tamamlandıktan sonra, bir davlumbazda numuneye 250 mikrolitre deiyonize formamid ekleyin.

Tüpün kapağını kapatın ve Evans Boyasını çıkarmak için gece boyunca bir ısı bloğuna yerleştirin. Numuneleri tezgah üstü santrifüjde 40 dakika boyunca 10.000 g veya daha yüksek sıcaklıkta santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, santrifüjlenmiş numuneden her bir boya içeren süpernatantın 100 mikrolitresini bir çeker ocakta çalışan 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına aktarın.

Bir spektrofotometre kullanarak Evans Blue absorbansını okuyun. VEGF'nin neden olduğu vasküler sızıntıyı incelemek için, fareye fosfat tamponlu salin içinde 50 nanogram VEGFA veya araç olarak sadece fosfat tamponlu salin enjekte edilir. Görüntü, VEGFA enjekte edilen deri örneklerinde sızan Evans Blue Dye birikiminde, yerinde araç kontrolüne kıyasla bir artış olduğunu göstermektedir.

Bu 96 oyuklu plaka görüntüsü, deri örneğinden formamid içinde ekstrakte edilen yüklü Evans Blue Dye'ı göstermektedir. Bu grafiksel çizim, eşleştirilmiş VEGFA ve yalnızca araç kontrol numunelerinin normalleştirilmiş absorbans değerlerini gösterir. Grafik, 50 nanogram VEGFA enjekte etmenin, yalnızca araca kıyasla Evans Dye sızıntısını önemli ölçüde artırdığını gösteriyor.

Bu grafik, araç numunelerine karşı VEGFA için optik yoğunluktaki kıvrım değişikliklerinin miktarının belirlenmesinden sonra elde edilir. Grafik, sadece araca kıyasla VEGFA uygulandıktan sonra vasküler sızıntıda ortalama üç kat artış olduğunu göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu tekniğin ana bölümü uygun şekilde yapılırsa iki saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü gerçekleştirirken, spesifik olmayan vasküler sızıntıyı ve fareler arasındaki varyasyonu hesaba katmak için ajan kaynaklı vasküler sızıntıyı araç kaynaklı vasküler sızıntıya normalleştirmek önemlidir. Bu prosedür, bir proteinin vasküler geçirgenliği inhibe etmek için hedeflenip hedeflenemeyeceği gibi soruları yanıtlamak için ilaç uygulaması gibi diğer yöntemlerle birleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, vasküler biyoloji alanındaki araştırmacıların, vasküler sızıntı için gerekli olan temel sinyal bileşenlerini tanımlayan genetik olarak değiştirilmiş farelerde vasküler hiper geçirgenliğin moleküler mekanizmalarını keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, fare dermisinde vasküler sızıntının nasıl indükleneceğini ve ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.