Virüs gen değiştirme için fare prostat CRISPR kılavuzları teslimini

Bu cerrahi prosedürün genel amacı, prostat kanseri indüksiyonu için CRISPR Cas9 kılavuzlarının viral olarak verilmesi yoluyla murin prostatındaki gen ekspresyonunu değiştirmektir. Bu yöntem, prostat kanseri biyolojisindeki yeni genlerin in vivo bir ortamda analiz edilmesi ve doğrulanması ile ilgili yeni soruların ele alınmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, insan senaryosunda görüldüğü gibi yalnızca prostat hücrelerinin bir alt kümesini hedefleyerek birden fazla genin hızlı gen düzenlemesine izin

Prosedüre yeni başlayan biri, organ büyüklüğü ve başarılı bir cerrahi tamamlama için gereken hassasiyet nedeniyle ilk başta mücadele edebilir. Toplam 5 mililitre anestezik hacmini taze hazırlamak için, mililitre başına 0.15 mililitre medetomidin hidroklorür, mililitre midazolam başına 0.4 mililitre 5 mg ve mililitre butorfenol başına 0.25 mililitre 10 mg karıştırın. Ardından 4,2 mililitre steril tuzlu su ekleyin.

Ameliyat sonrası medetomidin hidroklorürün etkilerini tersine çevirmek için, anestezi panzehiri olarak mililitre atipamezol başına 0.1 mililitre 5 mg 4.9 mililitre steril tuzlu su ile karıştırın. Uygun dezenfeksiyon ve sterilizasyon ile aseptik bir cerrahi ortam hazırlayın ve cerrahi aletleri otoklavlayın. Virüsü prostata iletmek için, sekiz haftalık bir erkek fareyi metin protokolüne göre uyuşturduktan sonra; Kas gevşemesini, pedal çekilmesini ve ele gelen refleksleri değerlendirerek anestezik derinliği inceleyin.

Refleks kaybı gözlendiğinde, hayvanın alt karnını tıraş edin. Steril bir pamuklu çubuk kullanarak, kseroftalminin neden olduğu körlüğü önlemek için hayvanın gözlerini veteriner oftalmik merhemle dikkatlice örtün. Ardından, cerrahi alanı dezenfekte etmek için traşlı karnı silmek için %70 etanol ve %10 providon iyot kullanın.

Daha sonra, steril cerrahi makas kullanarak, alt karın orta hattında yaklaşık bir santimetre dikey cilt kesisi yapın. Daha sonra, ince bir nokta forseps ile, altında yatan organlara zarar vermemek için peritonu kaldırın; ve peritondan dikkatlice sekiz milimetre veya daha kısa bir kesi yapmak için cerrahi makas kullanın. Seminal vezikülü ortaya çıkarmak için yağ dokusunu nazikçe bir kenara hareket ettirin.

Daha sonra, bir halka forseps kullanarak, ön prostat tanımlanana kadar seminal vezikülü dikkatlice kaldırın. Şimdi ise 0.5 mililitrelik bir insülin şırıngası ve 30 gauge 8 milimetrelik bir iğne ile; Ön prostat epiteline toplam 30 mikrolitre virüs solüsyonu enjekte edin. Sızıntıyı en aza indirin ve sıvının doku içinde emilerek küçük bir baloncuk oluşturduğundan emin olun.

Ardından, seminal vezikülü karın boşluğuna geri yerleştirin. Sıvının doku içinde küçük bir baloncuk içinde ve sızıntı olmadan emilmesini sağlamak için, seminal veziküle paralel olarak ve ön prostat lobunun şeklini takip ederek enjekte ettiğinizden emin olun. Konik uçlu bir iğne ve 13 milimetre 3/8 daire ile perineyi 6-0 emilebilir sütürden iki ila üç basit kesintili dikişle dikin.

Daha sonra karın zarına zarar vermemek için cildi forseps ile kaldırmak; Cildi üç steril 4.8 x 6.5 milimetrelik klipslerle zımbalayın. Ameliyattan sonra daha iyi iyileşme için, steril 1 mililitrelik bir şırınga ve 27 gauge x 1/2 inçlik bir iğne kullanarak anestezi panzehirini intraperitoneal enjeksiyonla gram vücut ağırlığı başına 0.1 mililitre dozunda uygulayın. Ardından, hayvanı dikkatlice kafesine geri yerleştirin.

Tamamen iyileşene kadar hipotermiyi önlemek için işlemden sonra kafesi bir saat boyunca bir ısıtma yastığı üzerinde tutun. Hayvan enjeksiyondan birkaç dakika sonra uyanmalıdır. Hayvanı metin protokolüne göre günlük olarak izlemeye ve tedavi etmeye devam edin.

Ve yara kapandığında, cilt klipslerini çıkarın. Murin prostatına virüs iletimini değerlendirmek için, numuneler ameliyattan üç ay sonra analiz edildi. Burada gösterildiği gibi, bu çalışmada kullanılan fareler, virüs tarafından eksprese edilen Cree proteinine maruz kalmış hücrelerde GFP'yi eksprese etti.

GFP sinyali, prostat epitelinde Cree aktivitesini gösterir, ancak gen düzenlemenin CRISPR kılavuzu tarafından indüklenip indüklenmediğini göstermez. Bu immünohistokimyasal kesitler, P10 kaybını gösteren yüksek pAKT ekspresyonu olan hücrelerin odak alanlarını tanımlar. Bu panellerde, pAKT ve GFP için kostaining, prostat hücrelerinin adeno-ilişkili virüs tarafından dönüşümünü doğrulayan çift pozitif hücreleri tanımladı.

Genel olarak, bu sonuçlar, in vivo, CRISPR-Cas9 gen düzenlemesinin, Rosa26-LSL-Cas9-EGFP faresi ve adeno ile ilişkili virüs kullanılarak prostat epitelinde gerçekleştirilebileceğini göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, prosedür 15 dakika içinde yapılabilir. Bu teknik, prostat kanseri alanında birden fazla genin eş zamanlı olarak in vivo olarak incelenmesi için yapılan araştırmaların önünü açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, murin prostatına substratın nasıl verileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bazı virüslerle çalışırken son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürleri yaparken her zaman önlem alınması gerektiğini unutmayın.