Name: Virüs gen değiştirme için fare prostat CRISPR kılavuzları teslimini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T15:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Keşfedin fare prostatında CRISPR/Cas9 ile viral gen değiştirme yöntemini. Bu teknik, prostat kanseri araştırmalarında çoklu gen düzenlemesi ve in vivo gen fonksiyonu analizi için yeni bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bay Danimarka Kanser Derneği (R146-A9394-16-S2) bir bursu tarafından finanse edildi. MFB ve MKT AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8) tarafından finanse edilmiştir. Bay ve MFB co finanse edilmiştir Graduate School, sağlık, AU. E.F.W. laboratuvar İspanyolca Bakanlığı Ekonomi (SAF2015-70857, eş ERDF-AB tarafından finanse edilen) ve grant (741888 - olay yeri inceleme-eğlenceli) gelişmiş bir ERC gelen hibe tarafından desteklenmektedir.
Liliana Fajardo Mellor (genler, geliştirme ve hastalık; teşekkür etmek istiyorum Ulusal Kanser Araştırma Merkezi) için eleştirel okuma şekilde alt alta yazılmalıdır.

Bu iletişim kuralı laboratuvar fareler cerrahi prosedürde içerir. Tüm hayvan deneyleri tek tek gözden geçirilmiş ve bir kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış gerekir. Yaklaşım hayvan kurtarma ve hayatta kalma dayalı olarak uygun anestezi, ağrı yönetimi ve aseptik cerrahi ortam her zaman emin olun. Bir Isıtma yastığı cerrahi ve anestezi kurtarma kadar hipotermi engellemek için kullanın.
1. başlangıç konuları
<ol><li>Kullanılan virüs bağlı olarak, farklı titresi gereksinimleri uygulanabilir; virüs buna göre oranında seyreltin. Not: Bu örnekte, 1 x 1012 IU/mL titresi PBS içinde seyreltilmiş bir Adeno ilişkili virüs enjekte edilir. Virüs serotip 9 vardır ve Kılavuzu RNA Pten ve Cre protein Ubikuitin promotor (şekil 1) altında ifade içerir. Pten kaybı pAKT ve Prostatik epitel13yayılması arttı.</li>
	<li>Yeterli prostat geliştirme sağlamak için ameliyat esnasında 8 haftalık bir yaşta erkek fare kullanın. Not: gösterilen bu deneyde fareler Rosa26-LSI-Cas9-EGFP knockin fareler C57BL/6J arka plan12 (şekil 1) değildir.</li>
	<li>Taze bir genel anestezi karışım hazırlamak ve mümkünse steril tutmak. Not: ameliyat sonrası daha iyi hayvan kurtarma için bir anestezi panzehir önerilir.<ol>
<li>Toplam hacmi 5 mL anestezik hazırlamak için 0.15 mL medetomidine hidroklorid (1 mg/mL), 0.4 mL midazolam (5 mg/mL) ve 0.25 mL butorphanol (10 mg/mL) ile 4,2 mL steril tuzlu su karıştırın. Not: Hayvan Kurulusları kurallarına göre inhalable isoflurane gibi alternatif anestezi yöntemleri kullanılabilir.</li>
		<li>Medetomidine hidroklorid ameliyat sonrası etkisini tersine çevirmek için 0.1 mL atipamezole (5 mg/mL) ile 4.9 mL steril tuzlu su karışımı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aseptik cerrahi ortama uygun dezenfeksiyon ve sterilizasyon hazırlayın. Otoklav cerrahi aletler kullanmadan önce.</li>
</ol>2. fare prostat için virüs-teslim
<ol><li>Hayvan mayi enjeksiyonu ile steril 1 mL şırınga ve iğne 27G x ½" ile anestezi. Bir anestezi doz 0,01 mL/g vücut ağırlığının kullanın. Yordamı 30 dk daha uzun sürerse, anestezi enjekte edilerek korumak başlangıç 1/3 doz her 30 dak.</li>
	<li>Anestezi derinliği tarafından değerlendirilmesi kas gevşeme, pedal çekilmesi ve palpebral refleksleri inceleyin. Reflekslerin kaybı gözlenen zaman hayvanın alt karin tıraş.</li>
	<li>Dikkatle hayvanın gözleri veteriner oftalmik merhem Korneal refleks yetersizliği nedeniyle körlüğü önlemek için bir steril pamuklu çubukla kullanarak kapak.</li>
	<li>Cerrahi alan dezenfekte için % 70 etanol ve % 10 povidone iyot ile traş karın silin. Cerrahi alan çevre doğru cerrahi alanının merkezinden fırçalayın.</li>
	<li>Bir dikey cilt kesi düşük karın orta hat, yaklaşık 1 cm steril Cerrahi makas kullanarak gerçekleştirin.</li>
	<li>Karın zarını altında döşeme organlara zarar verme önlemek için para cezası nokta forseps kullanarak kaldırın. Periton ile Cerrahi makas kullanarak bir < 8 mm kesik dikkatli olun. Not: insan aksine, bir kemirgen 's prostat bezi dört ayrı loblar oluşmaktadır. Ön lob seminal vezikül eklenir.</li>
	<li>Yavaşça kenara yağ dokusu seminal vezikül ortaya çıkarmak için hareket ettirin. Bir halka forseps kullanarak dikkatli bir şekilde yukarı kaldırın (şekil 1) ön prostat olana kadar seminal vezikül tespit.</li>
	<li>Toplam hacmi 30 µL virüs (3 x 1010 viral parçacıkların) 0.5 mL insülin 30G x 8 mm iğne ile kullanarak ön prostat epiteli çözümde enjekte. Sızıntı en aza indirmek ve sıvı küçük bir kabarcık oluşturan doku içinde absorbe emin olun. Seminal vezikül karın boşluğunda yerleştirin.</li>
	<li>Periton ile 13 mm, 3/8 daire ve konik noktası iğne ile 6-0 absorbe dikiş kullanarak 2-3 basit kesintiye uğramış Dikiş dikiş.</li>
	<li>Cilt cilt toparlama Forseps ile karın zarını zarar görmesini önlemek için 3 steril 4.8 x 6,5 mm kliplerle zımbala.</li>
	<li>Daha iyi kurtarma için steril 1 mL şırınga ve iğne 27G x ½" kullanarak mayi enjeksiyonu ile anestezi panzehir 0,01 mL/g vücut ağırlığının bir doz uygulanır. Dikkatle hayvan geri onun kafes içinde yer.</li>
</ol>3. sonrası cerrahi prosedürler
<ol><li>O kafesi ameliyat 1 h bir Isıtma yastığı üzerinde işlemden sonra tamamen iyileşti kadar hipotermi önlemek için fare ile tutun. Panzehir uygulanırsa, hayvan birkaç dakika enjeksiyon sonra uyanık olmalıdır.</li>
	<li>Hayvanlar her gün için uygun yara iyileşmesi ve ağrı göstergeler izleyin. Gerekirse, ek ağrı kesici hayvan Kurulusları esaslarına göre yönetmek.</li>
	<li>Cilt klipleri 4-5 gün sonra yara kapatıldıktan sonra kaldırın.</li>
</ol>

<ol><li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+incidence+and+mortality+worldwide%3A+sources%2C+methods+and+major+patterns+in+GLOBOCAN+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012.</a> Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).</li>
<li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).</li>
<li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Clinical+Genomics+of+Advanced+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer.</a> Cell. 162, 454(2015).</li>
<li>Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19937345">Animal transgenesis: an overview.</a> Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+prostate+epithelial+cell-specific+Cre+transgenic+mouse+model+for+tissue-specific+gene+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation.</a> Mech Dev. 101, 61-69 (2001).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+biallelic+inactivation+of+Pten+in+the+mouse+prostate+leads+to+prostate+cancer+accompanied+by+increased+epithelial+cell+proliferation+but+not+by+reduced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis.</a> Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+p53-dependent+cellular+senescence+in+suppression+of+Pten-deficient+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis.</a> Nature. 436, 725-730 (2005).</li>
<li>Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+of+generating+prostate-specific+Cre-LoxP+gene+switching+via+intraductal+delivery+of+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus.</a> Prostate. 65, 1-9 (2005).</li>
<li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+JUNB%2FAP-1+promotes+invasive+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer.</a> Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+novel+GEM+model+for+metastatic+prostate+cancer+analysis+and+therapy%2C+reveals+myc+as+a+driver+of+Pten-mutant+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis.</a> Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vivo+validation+of+candidate+drivers+derived+from+the+PTEN-mutant+prostate+metastasis+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome.</a> Methods. 77-78, 197-204 (2015).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159, 440-455 (2014).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate-specific+deletion+of+the+murine+Pten+tumor+suppressor+gene+leads+to+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer.</a> Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+analysis+indicates+monoclonal+origin+of+lethal+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer.</a> Nat Med. 15, 559-565 (2009).</li>
<li>Haffner, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+clonal+origin+of+lethal+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer.</a> J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).</li>
<li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).</li>
<li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Aspects+of+Development+and+Structure+in+the+Prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Cancer+Inst+Monogr%22%5BJournal%5D)">Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate.</a> Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).</li>
<li>McNeal, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+prostate%3A+an+historical+survey+of+divergent+views%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views.</a> Prostate. 1, 3-13 (1980).</li>
<li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX9+elevation+in+the+prostate+promotes+proliferation+and+cooperates+with+PTEN+loss+to+drive+tumor+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation.</a> Cancer Res. 70, 979-987 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu protokol için biz ön lobunda gen ekspresyonu fare prostat virüs enjeksiyonu ile değiştirmek için bir yöntem prostat kanseri (Şekil 2) bir güçlü yeni fare modeli oluşturma açıklanmaktadır. Bir Adenovirus başarılı yönetim ilk Leow ve ark. 20058tarafından tanımlanmıştır. Biz daha önce nasıl bir Adenovirus için Cre recombinase protein kodlama zaman alıcı çarpı işareti-doğurmak için doku özgü silme 9 (şekil 2B</stron...

Algılama ve prostat kanseri tedavisinde son on yıl içinde önemli ölçüde iyileştirilmiştir. Hala, prostat kanseri insidansı, yaşam beklentisi artıyor. Bir tahmini 1.1 milyon yeni vaka ile dünya çapında, kanserle ilgili ölüm erkekler 1' deki en yaygın nedenleri arasındadır. Prostat kanseri gelişimi içinde yavaş, ama ne zaman kanser için gelişmiş bir metastatik devlet ilerlemiştir, sınırlı tedavi seçenekleri nedeniyle prognozu kötüdür. Şimdiye kadar sadece birkaç genler bu kanserde ortak sürücüleri olarak tespit edilmiştir ve onun heterojenite ve multifocality engellemektedir, biyolojik ve targetable hastalığı sürücüleri2,3.
Klasik teknikleri üreten GEMMs kez onların karmaşıklığı, zamanında giderleri ve masrafları tarafından Engelli. Koşullu nakavt modelleri ne zaman germline4' te inaktive embriyonik ölümcül neden prostat kanseri aday genler, eğitim için yaygın olarak kullanılmaktadır. En yaygın modelleri tarafından değiştirilmiş Probasin5 tahrik Prostat spesifik Cre recombinase veya ek çarpı işareti-doğurmak tarafından et entegre bir PSA6 organizatörü içerir. Bu modellerinde gen ilgi Hiperplazi hayvanın idrar yolu işlev7bozabilen tüm organ içinde üreten çoğu prostat epitel hücrelerinin hedeflenecektir.
Fare prostat ön LOB içine enjeksiyonla Cre proteinin viral teslim sadece birkaç hücre8hedefleyerek bu sorunu çözebilirsiniz. Laboratuvarları teknik önkoşulları, uzmanlık ve hedefler yöntem yarar--dan çok çeşitli olası değişimler dikkate alarak. Başarılı yaklaşımlar Adenovirus JunB ve Pten9 veya Lentivirus Pten ve Trp5310 Hedefleme hedefleme kullanan diğerleri arasında göstermiştir. Transgenes, luciferase gibi viral yapı veya et ekleme Ayrıca11Imaging bioluminescence yoluyla hastalık progresyon non-invaziv izleme olanak sağlar.
Genom CRISPR/Cas9 teknolojisini temel alan düzenleme yeni ve hızlı bir fırsat kanser hızlı somatik knockouts12nesil aracılığıyla çalışma ortaya koymaktadır. İçin fare prostat LOB anterior yönettiği tek Kılavuzu RNA'ların (sgRNAs) viral teslimini prostat kanseri fizyolojik olarak daha alakalı bir model oluşturur. Bu şekilde, seçilen mutasyonlar taşıyan tek hücreleri istila ve genişleme verebilir klonlar oluşabilir. Ayrıca, birden çok hedef genlerin için Kılavuzu RNA'ların kullanımını farklı genler Hücre klonlar değişiklikler ile oluşturur. Bu tümör heterojenite ve doğal seleksiyon basınç her gen değişikliğini veya epistatic mekanizmalar önemini ortaya çıkarabilir kanser ilerlemesine izin verir.
Burada fare prostat gen ekspresyonu İLETİMLERİNİZE için viral parçacıkların sunmak için bir yöntem mevcut. Karın küçük bir kesi, fare ön prostat LOB maruz ve viral parçacıkların LOB enjekte edilir. Beş gün sonrası cerrahi, cerrahi klipleri deriden kaldırılabilir ve prostat kanseri 8 hafta sonra analiz edilebilir. Genel olarak, bu küçük etkisi: fare ve fare ödün vermeden geliştirmek daha büyük tümör sağlayan bir hızlı ve maliyet-etkin yordamdır.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Ekipman< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>B6J.129 (B6N) -Gt (ROSA) 26Sortm1 (CAG-cas9 *, -EGFP) Fezh / J fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>26175</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml U-100 insülin şırıngası</td><td>BD</td><td>324825</td> virüs <td>enjeksiyonu için</td></tr><tr><td>1 ml şırınga</td><td>BD</td><td>300013</td> anestezi <td>enjeksiyonu için</td></tr><tr><td>30 G 1/2' ' anestezi</td><td>enjeksiyonu için</td>iğne <td>BD</td><td>304000</td></tr><tr><td>6-0 Polisorb Sütür</td><td>Medtronic</td><td>GL889</td><td>peritonu kapatmak için</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık sterilize cerrahi örtü</td><td>birden fazla tedarikçi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isıtma yastığı</td><td>birden fazla tedarikçi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Povidon-İyot Hazırlık Pedi</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-70</td><td></td></tr><tr><td>Süsleme Karın</td><td>tıraşı için</td>makine <td>Aesculap</td><td>GT415</td></tr><tr><td>Dumont Forseps</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Halsey Mikro İğne Tutucu</td><td>FST</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>İris Makası</td><td>FST</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Dar Model Forseps</td><td>FST</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Halka Forseps</td><td>FST</td><td>11106-09</td><td></td></tr><tr><td>Yara Klipsi Sistem Kolu, Klipsler dahil</td><td>F.S.T</td><td>12030-01</td> cildi <td>kapatmak için</td></tr><tr><td>Yara Klipsi Sistem Sökücü</td><td>FST</td><td>12030-04</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td>farklı modeller kullanılmıştır</td></tr><tr><td><güçlü>Reaktifler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Antisedan</td><td></td><td></td><td>Hayvan tesisinden elde edilen</td></tr><tr><td>Butorphanol</td><td></td><td></td><td>Hayvan tesisinden elde edilen</td></tr><tr><td>Medetomidinhidroklorid</td><td></td><td></td><td>Hayvan tesisinden elde edilen</td></tr><tr><td>Midazolam</td><td></td><td></td><td>hayvan tesisinden elde edilen</td></tr><tr><td>%100 Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-103</td><td></td></tr><tr><td>Göz merhemi</td><td>Takeda</td><td>7242</td><td></td></tr><tr><td>Virüs (AAV, AV)</td> bu protokolde kullanılan <td>çoklu tedarikçi</td><td></td><td>virüsü, kurum içi üretim</td></tr><tr><td>pAKT antikorudur</td><td>CST</td><td>4060</td><td>kullanılan 1:200 dilüsyon</td></tr><tr><td>GFP anitbody</td><td>CST</td><td>2956</td><td>kullanılan 1:100 dilüsyondur</td></tr></tbody></table>

virüs gen değiştirme için fare prostat crispr kılavuzları teslimini

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Artan bir prostat kanseri insidansı ile yeni tümör sürücüleri veya modülatörler kimliği çok önemlidir. Prostat kanseri için genetik fare modelleri (et) tümör heterojenite ve onun karmaşık microevolution dynamics tarafından engel vardır. Geleneksel prostat kanseri fare modelleri içerir, diğerleri arasında germline ve koşullu altını gizleme, oncogenes ve xenograft modelleri transgenik ifadesi. Bu modeller de novo mutasyonların, zaman alıcı, karmaşık ve pahalı olduğunu. Ayrıca, insan prostat kanseri hücreleri yalnızca küçük bir bölümünün içinde izole bir olay olarak gelişmeye bilinen ise geleneksel modellerin çoğu prostat epiteli, çoğunluğu hedef. Prostat kanseri başlatma, hem de gelişmiş hastalık ilerleme benzetimini yapmak değerli modelleri gerekir.
Burada bir kaç prostat epitel hücrelerinde transducing hücreleri tarafından tarafından viral parçacıkların hedeflemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Fare prostat için tasarlanmış bir virüs teslim prostat epiteli gen ekspresyonu değiştirilmesini sağlar. Bu vesile ile virüs türü ve miktarı gen değişikliğini için hedeflenen hücreleri kanser başlatılması için birkaç hücre ve gen tedavisi için birçok hücre transducing tarafından tanımlayacaktır. Cerrahi tabanlı enjeksiyonuyla ön LOB, idrar izlemek, distal tümör bu modelde hayvan idrar işlev bozulması olmadan genişletebilirsiniz. Ayrıca, yalnızca alt küme küme küme prostat epitel hücrelerinin hedefleyerek teknik tümör klonal genişleme sağlar ve bu nedenle insan tümör başlatma, ilerleme gibi işgal Bazal membran aracılığıyla taklit eder.
Bu roman tekniği geliştirilmiş fizyolojik alaka ile güçlü prostat kanseri modeli sağlar. Hayvan acı sınırlıdır ve hiçbir ek ıslahı gerekli olduğundan, genel olarak hayvan sayısı azalır. Aynı zamanda, yeni aday genler ve yolları analizi, hızlandırılmış hangi sırayla daha fazla etkili maliyetidir.

Virüs teslim fare prostat için değerlendirmek için örnekleri ameliyattan sonra üç ay analiz edildi. Rosa26-LSI-Cas9-EGFP fareler12 GFP virüs tarafından ifade edilen Cre protein maruz kalmış olan hücrelerde hızlı. Prostat örnekleri GFP sinyal (şekil 2A) ile alanları tanımlamak için bir Floresans mikroskobu ile incelendi. GFP sinyal prostat epiteli ama olsun gene düzenleme CRISPR Kılavuzu tarafından uyarılan değil Cre faaliyet gösterir. ...

Bu iletişim kuralı virüs teslim edilmek üzere fare prostat yeni kurulan bir yöntem açıklanır. CRISPR/Cas9 teknolojisi, gen overexpression veya Cre recombinase teslim kullanarak, teknik gen ifadesinin orthotopic değişiklik sağlar ve prostat kanseri için bir roman fare modeli uygular.

Virüs gen değiştirme için fare prostat CRISPR kılavuzları teslimini

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Bu cerrahi prosedürün genel amacı, prostat kanseri indüksiyonu için CRISPR Cas9 kılavuzlarının viral olarak verilmesi yoluyla murin prostatındaki gen ekspresyonunu değiştirmektir. Bu yöntem, prostat kanseri biyolojisindeki yeni genlerin in vivo bir ortamda analiz edilmesi ve doğrulanması ile ilgili yeni soruların ele alınmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, insan senaryosunda görüldüğü gibi yalnızca prostat hücrelerinin bir alt kümesini hedefleyerek birden fazla genin hızlı gen düzenlemesine izin vermesidir.Prosedüre yeni başlayan biri, organ büyüklüğü ve başarılı bir cerrahi tamamlama için gereken hassasiyet nedeniyle ilk başta mücadele edebilir. Toplam 5 mililitre anestezik hacmini taze hazırlamak için, mililitre başına 0.15 mililitre medetomidin hidroklorür, mililitre midazolam başına 0.4 mililitre 5 mg ve mililitre butorfenol başına 0.25 mililitre 10 mg karıştırın. Ardından 4,2 mililitre steril tuzlu su ekleyin.Ameliyat sonrası medetomidin hidroklorürün etkilerini tersine çevirmek için, anestezi panzehiri olarak mililitre atipamezol başına 0.1 mililitre 5 mg 4.9 mililitre steril tuzlu su ile karıştırın. Uygun dezenfeksiyon ve sterilizasyon ile aseptik bir cerrahi ortam hazırlayın ve cerrahi aletleri otoklavlayın. Virüsü prostata iletmek için, sekiz haftalık bir erkek fareyi metin protokolüne göre uyuşturduktan sonra; Kas gevşemesini, pedal çekilmesini ve ele gelen refleksleri değerlendirerek anestezik derinliği inceleyin.Refleks kaybı gözlendiğinde, hayvanın alt karnını tıraş edin. Steril bir pamuklu çubuk kullanarak, kseroftalminin neden olduğu körlüğü önlemek için hayvanın gözlerini veteriner oftalmik merhemle dikkatlice örtün. Ardından, cerrahi alanı dezenfekte etmek için traşlı karnı silmek için %70 etanol ve %10 providon iyot kullanın.Daha sonra, steril cerrahi makas kullanarak, alt karın orta hattında yaklaşık bir santimetre dikey cilt kesisi yapın. Daha sonra, ince bir nokta forseps ile, altında yatan organlara zarar vermemek için peritonu kaldırın; ve peritondan dikkatlice sekiz milimetre veya daha kısa bir kesi yapmak için cerrahi makas kullanın. Seminal vezikülü ortaya çıkarmak için yağ dokusunu nazikçe bir kenara hareket ettirin.Daha sonra, bir halka forseps kullanarak, ön prostat tanımlanana kadar seminal vezikülü dikkatlice kaldırın. Şimdi ise 0.5 mililitrelik bir insülin şırıngası ve 30 gauge 8 milimetrelik bir iğne ile; Ön prostat epiteline toplam 30 mikrolitre virüs solüsyonu enjekte edin. Sızıntıyı en aza indirin ve sıvının doku içinde emilerek küçük bir baloncuk oluşturduğundan emin olun.Ardından, seminal vezikülü karın boşluğuna geri yerleştirin. Sıvının doku içinde küçük bir baloncuk içinde ve sızıntı olmadan emilmesini sağlamak için, seminal veziküle paralel olarak ve ön prostat lobunun şeklini takip ederek enjekte ettiğinizden emin olun. Konik uçlu bir iğne ve 13 milimetre 3/8 daire ile perineyi 6-0 emilebilir sütürden iki ila üç basit kesintili dikişle dikin.Daha sonra karın zarına zarar vermemek için cildi forseps ile kaldırmak; Cildi üç steril 4.8 x 6.5 milimetrelik klipslerle zımbalayın. Ameliyattan sonra daha iyi iyileşme için, steril 1 mililitrelik bir şırınga ve 27 gauge x 1/2 inçlik bir iğne kullanarak anestezi panzehirini intraperitoneal enjeksiyonla gram vücut ağırlığı başına 0.1 mililitre dozunda uygulayın. Ardından, hayvanı dikkatlice kafesine geri yerleştirin.Tamamen iyileşene kadar hipotermiyi önlemek için işlemden sonra kafesi bir saat boyunca bir ısıtma yastığı üzerinde tutun. Hayvan enjeksiyondan birkaç dakika sonra uyanmalıdır. Hayvanı metin protokolüne göre günlük olarak izlemeye ve tedavi etmeye devam edin.Ve yara kapandığında, cilt klipslerini çıkarın. Murin prostatına virüs iletimini değerlendirmek için, numuneler ameliyattan üç ay sonra analiz edildi. Burada gösterildiği gibi, bu çalışmada kullanılan fareler, virüs tarafından eksprese edilen Cree proteinine maruz kalmış hücrelerde GFP'yi eksprese etti.GFP sinyali, prostat epitelinde Cree aktivitesini gösterir, ancak gen düzenlemenin CRISPR kılavuzu tarafından indüklenip indüklenmediğini göstermez. Bu immünohistokimyasal kesitler, P10 kaybını gösteren yüksek pAKT ekspresyonu olan hücrelerin odak alanlarını tanımlar. Bu panellerde, pAKT ve GFP için kostaining, prostat hücrelerinin adeno-ilişkili virüs tarafından dönüşümünü doğrulayan çift pozitif hücreleri tanımladı.Genel olarak, bu sonuçlar, in vivo, CRISPR-Cas9 gen düzenlemesinin, Rosa26-LSL-Cas9-EGFP faresi ve adeno ile ilişkili virüs kullanılarak prostat epitelinde gerçekleştirilebileceğini göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, prosedür 15 dakika içinde yapılabilir. Bu teknik, prostat kanseri alanında birden fazla genin eş zamanlı olarak in vivo olarak incelenmesi için yapılan araştırmaların önünü açmıştır.Bu videoyu izledikten sonra, murin prostatına substratın nasıl verileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bazı virüslerle çalışırken son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürleri yaparken her zaman önlem alınması gerektiğini unutmayın.

virus-delivery-crispr-guides-to-murine-prostate-for-gene

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu videoda, adenovirüs tabanlı bir dağıtım sistemi kullanarak prostat bezi hücrelerindeki belirli genleri düzenlemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Yaklaşım, prostat kanseri için yeni fare modelleri geliştirmek için CRISPR teknolojisini kullanarak gen ekspresyonunun ortotopik ve lokalize değiştirilmesine izin verir.

Genetik Olarak Tasarlanmış Fare Modellerinde Prostat Kanserinin Modellenmesi: Fare Ön Prostat Lob Hücrelerinde CRISPR/Cas9 Aracılı Lokalize Gen Düzenleme Tekniği

CRISPR / Cas9 sistemi bilimsel topluluk hedeflenen genom düzenleme erişilebilir ve uygun fiyatlı hale getirmek için potansiyel sunmaktadır. Bu protokol CRISPR / Cas9 sistemi kullanılarak ilgilenilen geni nakavt, sonra yetişkin fare beyninin içine stereotaxically onları enjekte edecektir virüsleri oluşturmak için nasıl göstermek için tasarlanmıştır.

Tasarımı, Ambalaj ve Yüksek Titre CRISPR Retro ve Lentivirüslerden teslimi Stereotaksik enjeksiyon yoluyla

Bir iletişim kuralı için hızlı fare CRISPR/Cas9-aracılı gene bozulma ve insan birincil hematopoetik hücreler bu makalede açıklanan. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins elektroporasyon ile vitro transkripsiyon ve ticari Cas9 ile oluşturulan sgRNAs ile tanıtılmaktadır. Yüksek Düzenleme verimliliği sınırlı zaman ve maliyet ile elde edilir.

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Bu iletişim kuralı, prostat kanseri hücreleri, sonraki kastrasyon içi Prostatik enjeksiyon göstermek için hedeftir. Orthotopic önceden klinik androjen bağlı ve kısırlaştırma dayanıklı prostat kanseri hastalığı klinik tümör microenvironment ve immün bir ana bilgisayar bağlamında incelemek için kritik modellerdir.

Kollarındaki ve floresan Orthotopic Syngeneic fare modeli androjen bağlı ve kısırlaştırma dayanıklı prostat kanseri

Burada vivo içinde kalp gen rekombinant Adeno-Associated virüs (rAAV) kullanarak farelerde düzenleme taşımak için detaylı bir protokol sağlamak-CRISPR teslimini aracılı. Bu iletişim kuralı distrofik kardiyomiyopati Duchenne kas distrofisi tedavisinde umut verici bir tedavi stratejisi teklifler ve kardiyak özgü nakavt postnatal farelerde oluşturmak için kullanılabilir.

Virüs-aracılı teslim CRISPR kardiyak Gene farelerde düzenleme için Adeno ilişkili

Biz'DNA plazmid dır fare mesane vivo içinde İdrar Kateterizasyon ve elektroporasyon ürotelyal hücre içine bir roman yöntemi açıklanmaktadır. Kesesi hastalıkları otokton fare modelleri oluşturmak için hızlı ve kolay bir yol sunar.

Plazmid DNA teslimat için fare mesane Urothelium elektroporasyon tarafından roman yöntemi

Burada, immün yetmetik farelerin deri ve ağız boşluğundaki çeşitli genlerin işlevlerini aynı anda değerlendirmek için utero embriyonik lentiviral enjeksiyonlarda ultrason güdümlü ultrason güdümlü kullanarak hızlı ve doğrudan bir in vivo CRISPR / Cas9 tarama metodolojisini açıklıyoruz.

Fare Derisi ve Ağız Boşluğundaki Gen İşlevlerini Aynı Anda Değerlendirmek için Vivo CRISPR/Cas9 Taraması

Mevcut protokol, Gja1'de tam uzunlukta Connexin43 jenerasyonunu koruyan, ancak daha küçük GJA1-20k dahili olarak çevrilmiş izoformun translasyonunu önleyen tek bir M213L mutasyonunu tanımlamaktadır.

Tam Boy Proteinin İfadesini Korurken mRNA'dan Bir İç Translasyonel Başlangıç Bölgesinin Çıkarılması

Bu protokol, mikroRNA küme ağ analizi için düzenli aralıklarla aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) gen düzenleme iş akışını tanımlayan yüksek verimli bir kümelenmiş ve tek bir deneyde 35 kb kadar büyük benzersiz miRNA kümesi üyesi delesyon kombinasyonları taşıyan genetiği değiştirilmiş hücre hatlarından oluşan bir panelin hızlı bir şekilde üretilmesini sağlar.

MicroRNA Küme Ağ Analizi için CRISPR Gen Düzenleme Aracı

Burada, CRISPR RNP Zygotes Elektroporasyonu (CRISPR-EZ) adı verilen genetiği değiştirilmiş farelerin verimli bir şekilde üretilmesi için tasarlanmış basit bir tekniği açıklıyoruz. Bu yöntem, elektroporasyon yoluyla düzenleme reaktiflerini embriyolara %100'e yaklaşan bir verimlilikle teslim eder. Bu protokol, memeli embriyolarındaki nokta mutasyonları, küçük genomik eklemeler ve delesyonlar için etkilidir.

Zigotların CRISPR Elektroporasyonu ile Farelerin Verimli Genom Düzenlemesi

Th17 farklılaşmasının incelenmesinde gen düzenleme için etkili bir alternatif sağlayan, Cas9 transgenik farelerden alınan birincil T hücrelerine kılavuz RNA'nın retroviral transdüksiyonu için bir protokol sunuyoruz.

İn vitro Th17 farklılaşmasının incelenmesi için retroviral CRISPR/Cas9 aracılı gen hedeflemesi

Keşfedin fare prostatında CRISPR/Cas9 ile viral gen değiştirme yöntemini. Bu teknik, prostat kanseri araştırmalarında çoklu gen düzenlemesi ve in vivo gen fonksiyonu analizi için yeni bir model sunar.

Virüs gen değiştirme için fare prostat CRISPR kılavuzları teslimini

Daha fazla video keşfet