Name: Antimikrobiyal peptidler kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından üretilen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Keşfedin, antimikrobiyal peptid nisine kanonik olmayan amino asitlerin Escherichia coli kullanılarak nasıl dahil edildiğini. Agar difüzyon testleri ve floresan mikroskopi ile antibakteriyel aktiviteyi değerlendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J.H.N., tüberküloz ve M.B. kabul AB FW7 program (SYNPEPTIDE) tarafından fon. F.-js ve T.F. Federal MEB ve bilim (BMBF Program "HSP 2020", TU-WIMIplus proje SynTUBio) ve Alman Araştırma Vakfı (küme of Excellence "Kataliz Unifying kavramlar") tarafından fon kabul edersiniz.

1. klonlama ifade vektörel çizimler ve dönüştürme bir auxotrophic üretim baskı
Burada, genler için nisin biyosentezi, yani nisABC, L. lactis alınan edilmiş ve T7 tabanlı plazmid ifade vektörel çizimler transfer. NisABC tam DNA dizileri GenBank giriş X6830734bulunabilir. Öncü peptid (nisA) için gen Ampisilin direnç confers bir evde beslenen hayvan-3a vektör yerleştirildi. Genler dehidrataz (nisB) ve cyclase (nisC) için hangi sefaloridin direnç confers bildirilen önceki35, pRSFDuet-1 vektör soktuk.
Not: nisAiçin VSLR36 prolin kalıntı çekirdek peptid içinde benzersiz işlemek için ve NisP tarafından işleme uygun prepeptide emin olmak için kodlamak için lider dizisinin son dört amino asitler (ASPR) kodon mutasyona. N-terminus adlı bağlayıcı artıkları tarafından çevrili bir hexa-histidin etiketi (bkz. şekil 1) arıtma amaçları için eklendi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig1.jpg"> Resim 1 . PTM NisA E. coli içinde biyosentezi ve şematik gösterim yanı sıra lider bölünme L. lactis göstergesi zorlanma bir sonraki etkinliği tahlil tarafından. İlk adımda, etkin olmayan lineer prenisin (benzersiz prolin (pembe) içeren bir çekirdek peptid bölgesi ve bir lider konumda 9 oluşan) kodlanmış tarafından nisA ribosomally sentez. Daha sonra prenisin posttranslationally tarafından dehydroalanine (Dha) ve dehydrobutyrine (Dhb) serin ve treonin kalıntıları susuzluktan NisB tarafından katalize olarak değiştirilir. Cyclase NisC thioether köprüler üzerinden sistein sulfhydryl gruplarıyla Dha veya Dhb ilavesi Michael oluşturur. Etkin olmayan değiştirilmiş prenisin E. coli saflaştırılmış ve antimikrobiyal aktivite için test edilmiştir. Burada, gram-pozitif L. lactis göstergesi zorlanma hücre taşınır. Lider proteaz (ok ucu tarafından belirtildiği gibi) NisP tarafından tam etkin nisin serbest bırakmak için i ciddi. Kaldırılan vitro tripsin (*) ile tedavi tarafından da olabilir. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<ol><li>Standart ısı-şok protokolü37 ya da elektroporasyon38 prolin auxotrophic dönüştürmek için kullanmak plazmid evde beslenen hayvan-3a nisA(VSLR) ve pRSFDuet-1 nisBC E. coli türe (yukarıya bakın).</li>
	<li>25-100 µL dönüştürülmüş hücre süspansiyon üzerine Ağar kaplamalar Ampisilin, sefaloridin ve %1 (w/v) glikoz içeren pipette. Plakası açıcı veya cam boncuk çözüm plakaları üzerinde eşit şekilde yaymak için kullanın.</li>
	<li>Tabak gecede 37 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>Aşağıdaki öğleden sonra bir koloni Ampisilin, sefaloridin ve 50 mL şişe %1 (w/v) glikoz içeren 10 mL LB orta aşılamak için kullanın.</li>
	<li>Kültür gecede (12-16 h) 37 ° C ve 200 devir/dakika salla.</li>
	<li>250 µL steril % 80 gliserol ve 550 µL kültür, bir 2 mL tüp içinde karıştırın ve 80 ° C'de donmuş hücre hisse senedi olarak saklamak</li>
</ol>2. yeni en az orta (NMM) hazırlık
Not: Bu protokol NMM20 kimyasal olarak tanımlanmış sıvı Bakteriyel büyüme aracı olarak kullanır. Aynı zamanda, bu kesinlikle hazırlık sırasını takip için tavsiye edilir. Aksi takdirde, yağış meydana gelebilir. Malzemeler tablo (Örneğin, hydrochlorides) listelenenlerden farklı amino asit formlar için çözünürlük kontrol edin. NMM19 değiştirilmesi cAA dışında 19 amino asitler içerir (burada, prolin) ncAA analog tarafından. Son bileşen konsantrasyonları için bkz: Tablo 1. Bakteriyel gerginliği üretim için kullanılan bağlı olarak, biotin ve tiamin isteğe bağlı olabilir.
<ol><li>Amino asit karışımı hazırlanması<ol>
<li>0.5 g Phe, Trp ve 100 mL GKD2O dağılmasına kadar birkaç damla konsantre HCL eklenmesiyle Tyr geçiyoruz.</li>
		<li>Her kalan 16 amino asitlerin 0.5 g ağırlığında. 22 mL 1 M KH2PO4 ve 1 M K2HPO448 mL ile karıştırın. GKD2O ~ 800 mL için ekleyin. Çözüm açık hale gelinceye kadar karıştırın.</li>
		<li>Çözünmüş Phe, Trp ve Tyr ekleyin ve 1 L çözümü GKD2O. seviyesini ayarlamak</li>
		<li>Bir şişe en iyi filtre ünitesi ile vakum filtrasyon sayesinde amino asit karışımı sterilize.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NMM19 hisse senedi çözümleri<ol>
<li>İlk olarak, hisse senedi çözümleri aşağıdaki bileşenlerden 1 M hazırlamak:4, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4 ve 5 M NaCl çözeltisi stok bu yüzden (NH4)2. Tarafından ısıyla sterilize.</li>
		<li>D-glikoz (1 M), CaCl2 (1 g/L), FeCl2 (1 g/L), tiamin (10 g/L), biotin (10 g/L) ve eser elementler (CuSO4, ZnCl2, MnCl2, (NH4)2MoO4; 1 mg/L 50 mL stokları hazırlamak ). Her filtrasyon tarafından olan bir şırınga filtre sterilize.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NMM19 hazırlık<ol>
<li>Son bir konsantrasyon 7.5 mM (NH4)2elde etmek için tüm hisse senedi çözümler mix SO4, 1.7 mM NaCl, 22 mM KH2PO4, 50 mM K2HPO4, 1 mM MgSO4 ve 20 mM D-glikoz, 50 mg/L amino asit karıştırın, 1 µg/L CaCl2, 1 µg/L FeCl2, 10 µg/L Tiamin, 10 mg/L biotin ve 0,01 µg/mL eser elementler.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ifade rekombinant Nisin prolin analogları SPI tarafından eklenmesi ile
Bu bölümde, rekombinant ifade prepeptide (burada: nisA) ve PTM genler (burada: nisBC) gerçekleştirilir. İlk olarak, LB karmaşık orta kullanıldığı için hücreleri tüm cAAs huzurunda yetişir. Glikoz hedef gen ekspresyonu aksi takdirde vahşi tipi peptid üretim için neden olabilir arka plan düzeyinde bastırmak için eklenir (burada: nisin) leakiness rehberleri nedeniyle. Hedef sonra cAA (burada: prolin) olduğunu tükenmiş, ncAA eklenir ve hedef gen ekspresyonu kimyasal olarak tanımlanmış ortamda indüklenen. Kuluçka sıvı kültürlerin havalandırma (Örneğin, bir 2 L Erlenmeyer şişesi 200 RPM 500 mL) ile uygun şişeler içinde gerçekleştirilmelidir.
<ol><li>Steril pipet ucu kullanarak başlangıç taze bir gecede kültür donmuş hücre hisse senedi veya taze kolonisi (bkz. Adım 1). Ampisilin, sefaloridin ve %1 (w/v) glikoz içeren 25 mL LB orta kullanın ve geceleme (12-16 h) 37 ° C'de ve 200 rpm kuluçkaya.</li>
	<li>10 mL gecede kültür (% 1 v/v) ile steril taze orta 1 L aşılamak ve 37 ° C ve 200 rpm OD600 kadar kuluçkaya 0,5 =.</li>
	<li>4 ° C'de santrifüj 4500 x g de 15 dakika.</li>
	<li>Süpernatant dökün ve Pelet 20 mL NMM19 (2.3 adımda hazırlanan) içeren antibiyotikler ve %1 (w/v) glikoz ile resuspend. 4 ° C'de santrifüj 4500 x g de 10 dakika.</li>
	<li>Hücre Pelet 500 mL aynı orta resuspend ve 30 ° C ve 1 h için 200 d/d kuluçkaya. Not: Bu adımda cAA tükenmesi (burada, prolin) yer alır.</li>
	<li>Kültür eşit parçaya (bir her ncAA) bölün. Her kültür ile 1 mM izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) teşvik ve tedarik 1 mM prolin analogları (4S/R- fluoroproline, 4S/R- hidroksiprolin veya 4S/R- methanoproline). Not: denetimi gibi bir kültür 1 mM prolin, vahşi tipi peptid üretimde ortaya çıkan ile sağlanabilir.</li>
	<li>28 ° c gece (12-16 h) ve 200 rpm kuluçkaya.</li>
	<li>50 mL tüpler için 5000 x g., 20 dk 4 ° C'de kültürlerde süpernatant dökün ve granül-80 ° C'de arıtma kadar saklamak hücre santrifüj kapasitesi.</li>
</ol>4. izolasyon ve O'nun öğesini Nisin analogları arıtma
Peptidler koşullarla guanidin hidroklorür (GuHCl)39, güçlü bir denaturant denaturing altında saf.
Dikkat: GuHCl yuttu veya inhale ve cilt ve ciddi göz tahrişine neden olursa zararlıdır. Göz koruması ve eldiven giymek.
<ol><li>Arabellek (5 M GuHCl, 300 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7,4), yıkama tampon (300 mM NaCl, 25 mM Tris, 25 mM imidazole, pH 7,4) ve elüsyon tampon (300 mM NaCl, 25 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7,4) bağlama 250 mL hazırlayın. Bunlar için katı bir 250 mL şişe içine aktarmak ve ilâ 200 mL GKD2ile O. Mix dolduracağım ve pH 7.4 1 M NaOH veya HCl ile için ayarlayın. Daha sonra 250 mL şişe ilk filtre birimini kullanan tüm tampon çözeltiler GKD2ile O. filtre doldurun.</li>
	<li>Hücre lizis Burada, bir sonicator (200 W maksimum yüksek frekans (HF) çıkış) birlikte kullanılır; Not hücre bozulması için gerekli güç ayarlarını diğer enstrümanlar için farklı olabilir. Tüm adımlar buz üzerinde gerçekleştirilir. Alternatif olarak, kimyasal hücre lizis, sıvı homogenizer veya bir kahve makinesi kullanılabilir.<ol>
<li>12 mL bağlama arabellek her santrifüj tüpü (adımından 3.8) ekleyin ve vortexing tarafından resuspend.</li>
		<li>Sonicator sonda ucu hücre süspansiyon daldırın. Nabız 1 ile % 40 genlik ayarla sonicator s / 5 kapalı s 15 dakika. Not: sonicator ucunu ertelenmiş önlemek için örnek arasında temiz. Sonicator sonda % 70 etanol ile silin.</li>
		<li>15.000 x g hücre artıkları cips de 40 dk 4 ° C'de lysed hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi. Supernatants yeni bir tepki tüp aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Benzeşme Kromatografi İmmobilize metal iyon benzeşme Kromatografi (IMAC)40için Peristaltik pompa veya bir FPLC sistemi (burada Ni-NTA reçine ile dolu) 1 mL kartuş ile kullanılabilir. Arabellekleri hazırlanması için bkz: adım 4.1. Not: üretilen rekombinant peptid 6. adımda lideri peptidaz olgun nisin serbest NisP, tarafından kaldırılır bir N-ölümcül O'nun öğesini lideri, taşıyor bu yana IMAC arıtma mümkün olabilir. Arıtma, oda sıcaklığında veya 4 ° C'de gerçekleştirmek Bir akış hızı dakikada 1 ml varsa IMAC kartuş için kullanın.<ol>
<li>İlk olarak, 5 sütun cilt (cv) depolama arabellek kaldırmak için GKD2O kartuşla yıkayın.</li>
		<li>10 ile equilibrate cv bağlama arabellek.</li>
		<li>İşlem hücre bir şırınga parçacıkları kaldırmak için filtre sonra kartuş ile uygulayın lysate (Adım 4.2) kullanıyor.</li>
		<li>Yıkama 15 ile cv spesifik olmayan ve ilişkisiz malzeme çıkarmak için yıkama arabelleği.</li>
		<li>10 ile elute cv elüsyon arabellek ve toplamak 1 mL kesirler 1,5 mL tüpler. Kesirler için kısa vadeli (3 gün) 4 ° C'de veya uzun dönem için-20 ° C'de depolayın.</li>
		<li>İçin depolama, 10 kartuşla yıkama GKD2O cv takip 5 tarafından cv % 20 etanol.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. LC-ESI-TOF kütle spektrometrik analizi Nisin analogları
Not: Bkz: belgeleri tablo araçları için sıvı Kromatografi electrospray iyonlaşma uçuş zaman kütle spektrometresi ile (LC-ESI-TOF-MS) birleştiğinde örneğin.
<ol><li> </li><li> </li></ol><ol><li><ol><li></li><li> </li><li></li><li></li><li></li><li> </li><li><li></ol></li><li><ol><li></li><li><li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li></li></ol></li></ol><ol><li><ol><li><li></li><li><li></li><li><li></ol></li><li><ol><li><li><li><li></ol></li><li><ol><li></li></ol></li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

SPI prolin analogları sokmak için kullanarak, hedeflenen nisin yapıları önemli ölçüde, roman peptid türevleri oluşturma benzersiz sıra kombinasyonları ve kimyasal özellikleri ile değiştirilebilir. Bu şekilde, klasik gen teknolojisinin temel sınırı, hangi 20 cAAs yan zinciri kimyaları için sınırlıdır atlatılabilir. İn vivo olarak yukarıda nisin kimyasal çeşitlendirilmesi doğal PTMs tamamlayacak ve önemli ölçüde RiPPs kimyasal alanı artırmak için genel bir yaklaşım gösterir. Bizce doğal amino asitler repertuarı genişletmek özellikle amper için büyük söz sahibidir. Proteinler, işlevleri muazzam bir dizi üç boyutlu yapılarda 20 cAAs tanımlanmış bir düzenleme ile gerçekleştirilebilir. 7-100 aa uzunluğu3sadece, gibi yapısal özellikleri cAAs yoluyla ulaşmak için yolu amper için sınırlı olacaktır. Böylece doğal amper RiPPs şeklinde genellikle yoğun olarak post-translationally tarihinde4olan şaşırtıcı değildir. Aynı şekilde ncAAs alternatif yapı taşları olarak onların farmakokinetik ve Farmakodinamik parametreleri (orada Baumann vd 201735 ve referanslar bakın) geliştirmek için büyük sözü tutun.
Bu iş faydaları bir deneysel nispeten kolay kurulum, kolay yürütme ve yüksek tekrarlanabilirlik kullanılan SPI metodolojisi. Küresel ikame nedeniyle hedef peptidler içine birden fazla site ncAA birleşme de mümkün olduğunu. Öte yandan, yöntem amino asitlerin sık sık hedef gen ürünü içinde meydana gelen değişimi için yeterli olmayabilir. Prensip olarak, istenmeyen pozisyonlar site yönettiği mutagenesis tarafından değiştirilebilir, ancak bu ek değişiklikler de yapısı ve bioactivity de dahil olmak üzere çeşitli AMP özellikler etkileyebilir. Üretim için bir auxotrophic zor kullanıma hazır olduğunda, birkaç ncAAs genetik düzeyde kapsamlı değişiklikler gerektirmeden test edilebilir. Ayrıca, yöntem auxotrophic E. coli için sınırlı değildir suşları, ama doğal üretim ana bilgisayar kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Örneğin, Zhou ve ark. SPI roman RiPPs üretiminin da inşaat olduğunu gösterdi doğal olarak Trp-auxotroph L. lactis: kullanarak tanımlanan medya, üç triptofan analogları nisin50dört pozisyonlarda dahil.
SPI yöntemi için küresel değiştirme-in belgili tanımlık seçilmek yol açar bu yana cAA ncAA tarafından genellikle geniş bir hedef peptidler ve proteinler için uygulanabilir. Bir aralığı auxotrophic E. coli suşları mevcuttur (bkz. Adım 1), birkaç cAAs yerine ncAAs tarafından test edilecek her izin. Analogları metAkullanarak dahil bir araya geldi-eksik suşları (Örneğin, B834(DE3)) en çok istihdam edilmektedir. Azidohomoalanine (Aha) ve homopropargylglycine (Hpg), verimli bir şekilde birleştirilebilen piyasada bulunan ncAAs isostructural Met analogları örnekleridir. Her ikisi de ek bir uyumlu ALKİN ya da azid işlevleri, anılan sıraya göre taşıyan moleküller izin bioorthogonal kolları tanıtmak. Örneğin, floresan boyalar veya polietilen glikol (PEG) moieties (I) bakır tarafından eklenebilir-katalize azid ALKİN cycloaddition (CuAAC)51.
Her ne kadar her iki rekombinant ncAA birleşme yöntemi (SPI ve SCS) genellikle yeterli hedef miktarda elde etmek, verimleri kez göre karşılık gelen peptidler ve proteinler vahşi tipi üretim azalır. Eroine kez üretim verimliliği ile ilişkilendirmek gibi ek arıtma adımlar, özellikle düşük bol türler için gerekli olabilir. Rekombinant nisin üretim bu özel durumda, O'nun öğesini lideri sıra büyük ölçüde RiPP arıtma hücre lysates üzerinden seçici zenginleştirme basitleştirir. Bu protokol için gösterilen arıtma saflık ve nisin konsantrasyonu artırır, ancak genellikle AMP eroine verim ve belirli etkinliğini belirlemek için yeterli verim. IMAC yanı sıra sık kullanılan AMP arıtma yöntemleri HPLC, iyon Kromatografi (IEC) ve yağış içerir (örneğin. aseton veya trichloroacetic asit (TCA) kullanarak) veya bir multistep arıtma düzeni52 ortaya çıkan kombinasyon bunların - . Bu unutulmamalıdır ki onların yaygın olarak polycationic doğa IEC arıtma kolaylaştırabilir. Dağılması sık arıtılmış amper depolamak için kullanılır.
İdeal olarak, birleşme için amper içine ncAAs uygun fiyatlarla piyasada bulunan ya da olmalıdır kolayca basit ve tekrarlanabilir kimyasal sentez iletişim kuralları tarafından üretilen. SPI yöntemi için eşit derecede önemli bir önkoşul ncAA tanınan, aktif ve soydaş tRNA endojen veya ortak ifade aaRS tarafından tahsil olmasıdır. Bu amino asit harekete geçirmek ya da tRNA aminoacylation tahlil53tarafından test edilmiş vitro olabilir. Kolay bir alternatif olarak SPI test ifadeler gibi yeşil flüoresan protein (GFP) modeli proteinlerin varlığı hem de yürütülen ve ncAA takviyesi olmaması durumunda gerçekleştirilebilir. Ayrıca, çözünürlük büyüme orta ve hücre geçirgenliği hem de kimyasal istikrar önemli faktörler oluşturmaktadır.
Bu örnekte, antimikrobiyal aktivite bir gram-pozitif göstergesi yük kullanarak gösterildi. Lider peptidaz NisP ifade eder gibi son adım nisin olgunlaşma katalizlenir. Lider sıra kaldırılması da saf NisP50 veya tripsin54ile tedavi tarafından gerçekleştirilen vitro (O'nun-arıtma amaçlar için öğesini) olabilir. Bu eser kapsamı dışındadır, patojen organizmalar ve kökenlerinin dirençli suşların bakteriyostatik veya bakteri yok edici inhibisyonu için benzer bir metodoloji kullanarak amper tarafından sınanabilir. Klinik hedef türler arasında MRSA, MDR Mycobacterium tüberküloz, VRE, Acinetobacter baumannii, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa ve Klebsiella pneumoniaebulunur. Agar plaka Difüzyon yanı sıra tahlil burada anlatılan büyüme inhibisyon da bakteriyel türler ile aşılanmış ve AMP ile desteklenmiş uygun sıvı medya kullanarak gerçekleştirilebilir. Suyu seyreltme yöntemleri kullanarak, minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) saf peptidler55kullanarak belirlenebilir. Burada sunulan faaliyet tahlil de bioactivity ve AMP içeren çözümler göreli başvuru bileşenleri, örneğin ticari olarak mevcut nisin potens tahmin etmek için kullanılabilir.
Rekombinant RiPPs sık sık sık PTM genlerin eş ifade içeren uygun39, yapımıdır. En kısa zamanda üretim zorlanma uygun bir ncAA içeren bir kimyasal olarak tanımlanmış veya sentetik en az orta aktarılır, karşılık gelen cAA kalıntı özgü değiştirilmesi yer alır. Böylece, diğer RiPPs rekombinant üretim mümkün olduğunu ve koşullar nerede hedef ürün yeterli miktarda ncAA birleşme ve PTM verim-ebilmek bulunmak koşuluyla aynı metodoloji tarafından üretilebilir. Konak hücre Proteom yanı sıra, peptid PTM makine Ayrıca SPI sırasında ncAA değiştirilmiş olabileceğini unutmayın. Sonuç olarak, hedef ifade indüksiyon zamanlaması ve aşağıdaki kuluçka süresinin uzunluğu optimizasyonu gerektirebilir. NcAA birleşme PTM enzimler içine onların istikrar ve etkinlik etkileyebilir beri işlenmiş RiPP üretimi ilke olarak etkilenebilir. Yeterli PTM enzim etkinliği işlenmiş prepeptide oluşumu ile MS ve bioactivity deneyleri tarafından tespit olarak belirtilir. Yukarıda tanıtılan gibi farklı indüklenebilir rehberleri PTM üretmek için istihdam olabilir genlerinde ilk (ncAA yokluğu) takip habercisi peptid gen indüksiyon tarafından ncAA huzurunda. Genel olarak, hedef peptid cAA içeren üretim habercisi gen sıkı bir baskı gerekli bu yüzden ncAA toplamadan önce bastırılmış gerekir. Bu protokolde, bu katabolik baskı, glikoz büyüme orta aracılığıyla elde edilir. Özellikle prepeptide işleme için gerekli PTM enzimler genellikle genetik olarak uzak ana bilgisayardan kaynaklanan beri rekombinant üretim henüz olmamıştır eğer ilgili genlerin ifade sıcaklık ve kodon kullanımı en iyi duruma getirme gerektirebilir kurulan. Prensip olarak, prepeptide içinde ncAAs varlığı tanıma ve işleme PTM enzimlerin nisin durumunda NisBC ve NisP engelleyebilir. NcAA kuruluşunun amper içine, böylece ilk uygun ifade koşulları ve AMP etkinliği tahlil güvenilirliğini belirlemek için küçük ölçekli ifade deneyler gerçekleştirmek için önerilir.

Hedef bakteriyel enfeksiyonların tedavisi antibiyotik yirminci yüzyılın keşfi ve patojen mikroorganizmaların etkin karşı yeni antimikrobiyal bileşiklerin paralel geliştirme. Ancak, metisiline dirençli Staphylococcusaureus (MRSA), Vankomisin dirençli enterokoklar (VRE), gibi kökenlerinin dirençli patojenler ortaya çıkması nedeniyle MDR (kökenlerinin dayanıklı) Salmonella typhimurium fajının yazın 10 (DT10 ), ve Klebsiella pneumoniae, acilen yeni antimikrobiyal ajanlar1oluşturmak gerekli. Antimikrobiyal peptidler (Amper) onların fizikokimyasal özellikleri, esneklik, boyutu, hydrophobicity ve eylem2modu sayesinde yeni ilaçların geliştirilmesi için umut verici aday olan çok yönlü, genellikle çok özel bileşiklerdir. Amper küçük peptidler genellikle oluşan 7-100 amino asitleri vardır. Çoğu zaman, onlar zengin etkileşim hedeflenen mikrobiyal hücre karşılıklı kullanılıyorsa3membran ile pozitif yüklü arginin ve lizin artıkları Katyonik bir yapıya sahip. Amper belirli bir alt grubu olan ribosomally sentezlenmiş ve posttranslationally modifiye peptidler (RiPPs)4. Bunlar mantar Krallığı ve alan'ın bakterilerin çoğu organizma tarafından üretilmektedir. İyi bilinen ve yaygın olarak kullanılan RiPPs biridir nisin, doğal laktik asit bakteri Lactococcus lactis (L. lactis) tarafından üretilen. Bir panel, gram pozitif bakterilerin karşı etkin, nisin olarak gıda sektöründe bir biopreservative Antimikrobiyal Özellikleri ve gelişmiş direnç hedeflenen mikrobiyal suşları5yokluğu nedeniyle 50 yıldan fazla için kullanılmıştır. Çalışmalar göstermiştir bu nisin oynattığını ve bakteriyel hücre zarlarında, antimikrobiyal aktivite6her iki gram pozitif ve gram-negatif patojenlere karşı önde gelen gözenekler oluşturur. Lipid II için bağlama tarafından bakteriyel hücre duvarı sentezi Inhibe7' dir. Nisin nisA tarafından bir lider ve bir çekirdek peptid bölgesi (şekil 1) oluşan bir doğrusal habercisi peptid kodlanır. Ribozomal sentez sonra prenisin ilk dehidrataz NisB tarafından değiştirilir. Burada, prepeptide çekirdek bölge serin ve treonin kalıntılarında dehydroalanine (Dha) ve dehydrobutyrine (Dhb)8için susuz kalmış. Daha sonra susuz artıkları formu lanthionine halkalara sistein ile birleştiğinde (Bu nedenle adı "lantibiotic" lanthionine yüzüğü içeren antibiyotikler için) bir enzim katalize Michael ek tarafından. Ardından bu değişiklik (PTM) cyclase NisC tarafından katalizlenir. L. lactis, değiştirilmiş prenisin sonra hücreden dışarı ışınlama NIST tarafından taşınır ve lider peptid İndinavir olgun ve aktif nisin formu9serbest bırakmak için NisP i ciddi. Sorumlu lider peptidaz NisP bir yüksek substrat özgüllüğü vardır, bu yana yalnızca işlemleri nisin verimli bir şekilde değiştiren10.
Genel olarak, etkin RiPPs büyük ölçüde kısa peptidler, Örneğin, üzerinden asetilasyon, glikozilasyon, metilasyon veya fosforilasyon kimyasal alanını artırmak PTM enzimler (örneğin NisBC), eylemden neden. Bu karmaşıklık düzeyini daha da ncAAs doğrudan birleşme tarafından genişletilebilir. Sık sık mümkün iken, amper kimyasal sentez onların yapısal karmaşıklık nedeniyle büyük ölçekli üretim için bir mücadeledir. Örneğin, 71 tepki adımda lantibiotic lactosin S toplam kimyasal sentez bir son verim % 10 ve bu nisin sadece %0,00311,12ham bir verim ile sağlanır. Bu nedenle, biyolojik üretimi üretimi yüksek ürün toplama ve doğru stereocenters nedeniyle bir alternatif sunuyor.
Bugün kadar 150'den fazla ncAAs, Fonksiyonel grupların Flor veya azides, içeren sahip Örneğin, rekombinant proteinlerin dahil olması ve ncAA-modified amper çeşitli örnekler bildirilen13,14olmuştur, 15,16. NcAAs giriş ile roman fizikokimyasal özellikleri için konvansiyonel mutagenesis göre oluşturulur. Muhtemelen roman antibiyotiklere önde gelen varolan peptidler çeşitliliği artırılabilir.
NcAAs birleşme rekombinant peptidler içine bir yöntem auxotrophic bakteri suşları17kullan seçeneğine göre seçici basınç birleşme (SPI) olduğunu. Bu suşların ncAA karşılık gelen cAA analog sentezleme yeteneği olmayan. Metodoloji sık gözlenen rahat substrat özgüllüğü, birçok doğal aminoasil tRNA sentetaz (aaRSs)18bir özellik kullanır. Onların doğal cAA yüzeylerde dışında bu enzimler kez tanımak ve istenen ncAA etkinleştirmek ve soydaş onların tRNA(s) şarj etmek için yeteneğine sahiptir. Bu ncAA ribozomal birleşme için hedef gen ürünü bir kalıntı özgü şekilde (Yani, cAA → ncAA ikame) yol açar. Bu istenen ncAA kurallı amino asit yapısal ve kimyasal olarak benzer olduğunda elbette mümkündür ve hücre fizyolojisi, çeviri makine ve hedef sıra peptid veya protein tarafından tolere. Deneysel kurulumunuza içinde auxotrophic konak hücreleri tanımlanmış orta yerine kullanılacak yerel amino asit sınırlayan bir konsantrasyon ile sağlanan kültürlü. Hücresel büyüme veya exchange tarafından hücre içi cAA tükenmesi cAA-Alerjik orta yol açar. Sonraki adımda, ncAA eklenir ve hedef gen ekspresyonu indüklenen. Kaçınılmaz olarak, ncAAs şimdi de birçok diğer proteinler arasında konak hücre içinde hedef gen ekspresyonu bu evre sırasında dahil edilmiştir. Escherichia coli (e.coli) zorlanma ile güçlü bir düzenleyici denetimi altında hedef gen taşıyan bir plazmid dönüştürülür beri her şeye rağmen SPI Kur toksisitesi düşük bir seviyede tutulur (genellikle son derece rekabetçi T7 organizatörü / RNA polimeraz sistemi)19. Hemen sonra (genellikle cAA yetersiz kaldığında) indüksiyon, hücreleri büyümek için ateşkes ana bilgisayar ve sitoplazmik onların enzimatik makineleri esas olarak plazmid dayalı hedef gen ifade için kullanılır. Site yönettiği mutagenesis site (ler) kalıntı özgü ncAA yüklemesinin hedef gen20dakikaya tanımlamak için kullanılabilir.
NcAAs birleşme için bir model peptid pentacyclic AMP nisin A seçildi. 34 amino asit uzunluğunda ve sadece bir tek prolin kalıntı çekirdek peptid sırayla (şekil 1) vardır. Subtilisin, ericin A ve S ve epidermin de olduğu gibi nisin Z ve nisin Q olduğu gibi korunmuş prolin etkinlik9,21için gerekli gibi görünüyor. CAA prolin peptit-prolyl Amid döndürme ve ikincil yapı istikrar özellikle önemli bir rol oynar. Onun yan zinciri halka biçimler (exo / endo puckers) Amid bağı bir termodinamik stabilization için sorumludur. Hedeflenen kimyasal değişiklikler (örneğin, hydroxylations, fluorinations, methylations) prolyl puckers kez eleştirel katlama istikrar, iskele sertlik ve birçok biyolojik yapıları22fonksiyonlarını etkiler. Böylece, Pro→ prolin analog oyuncu değişikliği roman ve sıradışı özellikleri ile B, nisin, ikinci halka halka bağışlamak beklemek akla yatkın.
Burada, prolin auxotrophic e.coli suşu rekombinant nisin üretimi için kullanıldı. Bu değişiklik enzim genlerini nisBCyanı sıra prepeptide gen nisA ifade gerektirir. Genetik olarak kodlanmış peptid ürün bir N-ölümcül O'nun öğesini lideri arıtma yoluyla benzeşme Kromatografi için taşıyor. Aktivite tayini için ifade ve NisPT salgılayan L. lactis rekombinant nisin türevleri E. coli hücre lysates veya saf peptid örnekleri (şekil 1) etkinleştirmek için kullanılır. Olgun AMP lideri bölünme sonra NisP tarafından yayımlanır. Bu agar Difüzyon yönteminde AMP örnek katı büyüme orta dağılır ve gram-pozitif mikroorganizma büyümesini inhibe. Kuluçka sonra bu görsel olarak büyüme inhibisyon haleler tarafından görülebilir. L. lactis ek olarak bir göstergesi olarak, antimikrobiyal aktivite Enterococcus faecalistir, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus ve Lactobacillus johnsonii karşı gösterdi nisin türevleri modifiye 21,23.
NcAAs RiPPs içinde birleştirmek için bir alternatif ve deneysel olarak farklı24stop kodonu bastırma (SCS) yöntemidir. Bunun için dik bir tRNA / aminoasil tRNA sentetaz (aaRS) çifti için karşılık gelen ncAA gereklidir. İdeal olarak, tüm bu üç bioorthogonal, endojen tRNA ve aaRSs kurduklarını değil Yani, bileşenleridir. Bir ncAA özgü aaRS enzim etkin site modifikasyonu ve genetik mutasyona uğramış sentetaz25kütüphanelerin tarama tarafından oluşturulabilir. Ayrıca, bir ncAA giriş hangi atanır ve hangi cAA için kodlamak değil bir kodon gerektirir. Genellikle, kehribar kodonu kullanılan24,26yaşında.
Son zamanlarda, SPI α chloroacetamide içeren ve tıklama kimya uyumlu ncAAs birleşme NisA27içine kurulmuştur. Örneğin, Nε- ayırma-lizin Kement peptid captistruin siteye özgü (SCS) ve kalıntı özgü (SPI) birleşme yöntem ve daha sonra değiştirilmiş içinde vitro içine rutenyum katalize sentezde28 tarafından kurulmuştur . SPI, ile karşılaştırıldığında SCS yöntemi bir dik tRNA beri daha karmaşıktır / aaRS çifti birlikte ifade olması gerekir. Bugüne kadar o-çiftleri prolin birleşme için gelişmiş29olmuştur, ama bizim bilgi en iyi şekilde, hiçbir örnek prolin analog şirketleşme bildirilmiştir.
Bu tüm ncAAs SPI metodoloji kullanarak eklenebilir olması gerekmektedir. İlk olarak, sitoplazma içine ncAAs alımını çok sayıda gram-negatif bakteriler E.coli için iç membran sitoplazmik membran katıştırılır taşıma proteinler tarafından düzenlenmiştir. Normalde, E. coli yapısal olarak çok çeşitli amino asit analogları yan zincirleri ile hücre içine taşıma kapasitesine sahip ve kimyasal olarak kanonik amino asitler benzer. İkinci,30hücre metabolizması ve Fizyoloji Host için toksik olduğu gibi birçok kimyasal olarak reaktif ya da kararsız ncAAs hücre büyümesinde doğru bir inhibitörü olarak hareket. Böylece, alımı ve toksisitesi ncAA üretim ana bilgisayar için önceden test edilmelidir. Bir yan etki olarak PTM makinelerin inactivation önlemek için bir kesinlikle kontrollü ifade Kur sorumlu genlerin doğal amino asit modifikasyon enzimleri (Örneğin, nisBC) dahil etmek için kullanılabilir ve ncAA hedef gen ( içine Örneğin, nisA). Bu iki farklı rehberleri ve hedef gen ekspresyonu, indüksiyon özel olarak tasarlanmış SPI protokolleri31' de gösterildiği gibi kullanarak gerçekleştirilebilir. Yukarıda belirtildiği gibi ncAA harekete geçirmek ve soydaş tRNA şarj sağlar aaRS rahat substrat özgüllüğü SPI yöntemi kullanır. Daha sonra tRNA Amid bağı oluşumu tarafından takip ve hedef (poli) peptid katlama ribozom teslim edilir. Bu işlemlerde proofreading ve mekanizmaları düzenleme ilgili32olabilir. Bu nedenlerden dolayı bir hedef için büyük önem taşıyor cAA için yapısal ve kimyasal olarak benzer ncAA. Diğer önemli noktaları yeterli kararlılık vardır (hem büyüme medya ve hücresel metabolizma maruz) ve ncAA çözünürlük. Ayrıca, ticari olarak kullanılabilir veya kimyasal sentez kolay olmalıdır.
Burada, SPI, rekombinant RiPPs içine ncAAs ve kalıntı özgü eklenmesi izin için bir protokol açıklayın. Özellikle, farklı prolin analogları antimikrobiyal peptid nisin A birleştirilir basili ana bilgisayar organizma olarak kullanarak. Kütle spektrometresi amino asit yerine doğrulamak için kullanılır ve peptid ürünleri büyüme inhibisyon deneyleri ve mikrobiyal göstergesi suşları kullanarak Floresans mikroskobu kullanılarak bioactivity için analiz edilir.
Başarılı rekombinant nisin ifade ile tanımlanmış ncAAs için temel gereksinimi uygun prolin auxotrophic gerektirir e.coli suşu. Bunun için auxotrophy, proA işlevsel olmayan, örneğin genomik nakavtla elde olmalı. Hücreleri tamamen yoksun hücre içi Pro biyosentezi (Yani, silmek-in proABC) reversion için olasılığı vardır olmadan istikrarlı auxotrophs. Yaygın olarak kullanılan gen nakavt fajının iletim veya tek gen nakavt Datsenko & Wanner33göre yöntemlerdir. Ayrıca, proA nakavt suşları Addgene, CGSC veya Keio koleksiyonu gibi kamu depoları elde edilebilir. Burada gösterilen rekombinant nisABC ifade T7 rehberleri kullanımına dayanıyor beri ifade ana bilgisayar zorlanma indüklenebilir bir gen T7 RNA polimeraz için taşımak zorunda. Bu λDE3 prophage giriş içine örneğin ticari seti kullanarak ana bilgisayar genom tarafından gerçekleştirilebilir. Alternatif olarak, soy BL21(DE3) gibi yukarıda açıklandığı gibi auxotrophic yapılabilir.

<table><tbody><tr><td>sodyum klorür</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>P029</td><td></td></tr><tr><td>guanidin hidroklorür</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>0035.2</td><td></td></tr><tr><td>dipotasyum hidrojen fosfat</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>P749.3</td><td></td></tr><tr><td>potasyum dihidrojen fosfat</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>3904.3</td><td></td></tr><tr><td>sodyum dihidrojen fosfat monohidrat</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>disodyum hidrojen fosfat</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>P030.2</td><td></td></tr><tr><td>L-alanin</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>3076.2</td><td></td></tr><tr><td>L-arginin</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>3144.3</td><td></td></tr><tr><td>L-asparagin monohidrat</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>HN23.1</td><td></td></tr><tr><td>L-aspartik asit</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>T202.1</td><td></td></tr><tr><td>L-sistein</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>3467.3</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>3772.1</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamik asit</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>3774.1</td><td></td></tr><tr><td>L-glisin</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>3187.3</td><td></td></tr><tr><td>L-histidin</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>3852.3</td><td></td></tr><tr><td>L-izolösin</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>3922.3</td><td></td></tr><tr><td>L-lösin</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>3984.3</td><td></td></tr><tr><td>L-lizin monohidrat</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>4207.2</td><td></td></tr><tr><td>L-metiyonin</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>9359.4</td><td></td></tr><tr><td>L-fenilalanin</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>4491.2</td><td></td></tr><tr><td>L-prolin</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>T205.3</td><td></td></tr><tr><td>L-serin</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>4682.4</td><td></td></tr><tr><td>L-treonin</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>T206.2</td><td></td></tr><tr><td>L-triptofan</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>4858.2</td><td></td></tr><tr><td>L-tirozin</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>T207.2</td><td></td></tr><tr><td>L-valin</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>4879.4</td><td></td></tr><tr><td>amonyum sülfat</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>3746.3</td><td></td></tr><tr><td>magnezyum sülfat</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>0261.2</td><td></td></tr><tr><td>D-glikoz</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>6780</td><td>erimiş agar kalsiyum klorür içine eklemek için% 20 (a / h) çözelti hazırlayın</td></tr><tr><td></td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>PN93.2</td><td></td></tr><tr><td>demir (II) klorür</td><td>Sigma-Aldrich, Almanya</td><td>372870</td><td></td></tr><tr><td>tiamin hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich, Almanya</td><td>T1270</td><td></td></tr><tr><td>biotin</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>3822.2</td><td></td></tr><tr><td>bakır(II) sülfat</td><td>Merck, Almanya</td><td>102792</td><td></td></tr><tr><td>manganez(II) klorür</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>KK36.2</td><td></td></tr><tr><td>çinko klorür</td><td>Merck, Almanya</td><td>108816</td><td></td></tr><tr><td>immonium ortomolibdat</td><td>Sigma-Aldrich, Almanya</td><td>277908</td><td></td></tr><tr><td>gliserol</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>7533.3</td><td></td></tr><tr><td>izopropil ve beta;-D-1-tiyokalaktopiranosid</td><td>Sigma-Aldrich, Almanya</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>ampisilin sodyum tuzu</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>K029.5</td><td>çalışma konsantrasyonu 100 &mikro; E. coli için g / mL, ddH <2 / sub ></td></tr> kan <tr><td>amisin sülfat</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>T832.2</td><td>çalışma konsantrasyonu 50 & mikro'da 100 mg / mL stok hazırlayın; E. coli için g / mL, ddH 2 O</td></tr><tr><td>kloramfenikol</td> Carl <td>Roth, Almanya</td><td>3886.1</td><td>çalışma konsantrasyonu 5 & mikro'da 50 mg / mL stok hazırlayın; L. lactis için g / mL, etanol</td></tr> <tr><td>(4S) -floroprolin</td><td>Bachem, İsviçre</td><td>F-3970</td> (4R) -floroprolin Bachem, İsviçre F-3975 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(4S) -hidroksiprolin</td><td>Bachem, İsviçre</td><td>F-1395</td><td></td></tr> <tr><td>(4R) -hidroksiprolin</td><td>Bachem, İsviçre</td><td>F-2980</td><td></td></tr> <tr><td>(4S) -metanoprolin</td><td></td><td></td><td>kimyasal olarak sentezlenmiş</td></tr> <tr><td>(4R) -metanotrolin</td><td></td><td></td><td>kimyasal olarak sentezlenmiş</td></tr><tr><td>hidroklorik asit (HCl)</td> <td>Carl Roth, Almanya</td><td>P074.4</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>VWR, Almanya</td><td>20825.324</td><td></td></tr><tr><td>M17 et suyu</td><td>Sigmal-Aldrich, Almanya</td><td>56156</td><td>ticari ürün, bkz. Terzaghi BE & Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6):807-13 içindekiler ve hazırlık için</td></tr><tr><td>agar-agar</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>5210.5</td><td></td></tr><tr><td>Lactococcus lactis'ten Nisin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Almanya</td><td>N5764</td><td>ticari ürünü, biyoaktivite</td></tr><tr><td>dimetil sülfoksit (DMSO)</td> için referans olarak <td>kullanılabilirCarl Roth, Almanya</td><td>A994.1</td><td></td></tr><tr><td>imidazol</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>3899.3</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS için 1.5 mL otomatik örnekleyici şişesi</td><td>Sigma-Aldrich, Almanya</td><td>Supelco 854165</td><td></td></tr><tr><td>asetonitril</td><td>VWR, Almanya</td><td>HiPerSolv LC-MS için CHROMANORM ULTRA, 83642</td><td>LC-MS sınıfı gerekli</td></tr><tr><td>formik asit</td><td>VWR, Almanya</td><td>HiPerSolv LC-MS için CHROMANORM, 84865</td><td>LC-MS sınıfı gereklidir</td></tr><tr><td>1 mL Ni-NTA IMAC kolonu, örneğin HisTrap FF Crude GE</td><td>Healthcare, UK</td><td>29-0486-31</td> IMAC 0.45 ve mikro <td>için farklı üreticiler ve reçineler mevcuttur</td></tr><tr><td>; m şişe üstü filtre ünitesi</td><td>VWR, Almanya</td><td>10040-470</td> vakum pompası 0.45 ve mikro <td>kullanarak çözeltilerin steril filtrasyonu</td></tr><tr><td>; m şırınga filtresi PVDF membranı</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>CCY1.1</td> bir <td>şırınga kullanarak çözeltilerin steril filtrasyonu ve hücre lizatlarından partikülleri uzaklaştırmak için</td></tr><tr><td>luer-lock şırınga, PP, 50 ml</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>T552.2</td><td>çözeltilerin steril filtrasyonu&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>1,5 mL Eppendorf tüpleri</td><td>Eppendorf, Almanya</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>petri kapları (polistiren, steril)</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>TA19</td><td></td></tr><tr><td>Nil kırmızısı</td><td>Sigma-Aldrich, Almanya</td><td>72485</td><td></td></tr><tr><td>E. coli & Delta; proA suşu</td><td>CGSC, Keio koleksiyonu</td><td>JW0233-2</td><td>prolin-oksotrofik E. coli K-12 suşu</td></tr><tr><td>E. coli B834 (DE3)</td> <td>Novagen (Merck), Almanya</td><td>69041</td><td>metiyonin-oksotrofik E. coli B suşu</td></tr> <tr><td>ve lambda; DE3 Lizojenizasyon Kiti</td><td>Novagen (Merck), Almanya</td><td>69734-3</td><td></td></tr><tr><td>Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPT</td><td></td><td></td><td>bakteri indikatör suşu, bakınız Khusainov R & Kuipers OP, PLoS One, 8 (9),</td></tr><tr><td>1,5 mL Eppendorf tüpleri için</td> e74890 tezgah üstü santrifüj <td>Eppendorf, Almanya</td><td>5427 R</td><td></td></tr><tr><td>peristaltik pompa</td><td>GE Healthcare, İngiltere</td><td>P1</td><td></td></tr><tr><td>FPLC sistemi</td><td>GE Healthcare, UK</td> <td>& AUML; kta Purifier 10 veya benzeri</td><td></td></tr><tr><td>ters mikroskop</td><td>Nikon</td><td>TI Eclipse geniş alan floresan mikroskobu&nbsp; 100x (NA 1.4) objektif ve Cıva Lambası</td><td>ile floresan mikroskobu</td></tr><tr><td>elektron çarpma CCD (EMCCD) kamera</td> için örnek kurulum <td>Andor Technologies, İngiltere</td><td>Andor Luca&nbsp;</td><td>Floresan mikroskobu için örnek kurulum</td></tr><tr><td>floresan uyarma filtresi</td><td>Thorlabs, ABD</td><td>Dikroik küp (TLV-U-MF2-TRITC)</td><td>floresan mikroskobu için örnek kurulum</td></tr><tr><td>Floresan Emisyon Filtresi</td><td>AHF Analysentechnik, Almanya</td><td>T 560 LPXR</td><td>örnek floresan mikroskobu</td></tr><tr><td>kapak kayması için kurulum 24 x 60 mm</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>LH26.1</td><td>floresan mikroskobu için örnek kurulum</td></tr><tr><td>Daldırma Yağı</td><td>Carl Zeiss, Almanya</td><td>Immersol 518 F</td><td>floresan mikroskobu</td></tr><tr><td>probu sonicator</td> için örnek kurulum <td>Bandelin, Almanya</td><td>Sonopuls HD3200 sonotrotlu MS-72</td><td>200 W maksimum HF çıkışı</td></tr><tr><td>C5 HPLC kolonu (2.1x100 mm, 3 & mikro; m parçacık boyutu)</td><td>Sigma-Aldrich, Almanya</td><td>567227-U</td><td>kütle spektrometresi için örnek kurulum</td></tr><tr><td>HPLC sistemine bağlı ESI-TOF</td><td>AGILENT, ABD</td><td>Kütle spektrometresi için</td> <td>1260 HPLC örnek kurulumu ile Agilent 6530 Doğru Kütle QTOF</td></tr></tbody></table>

antimikrobiyal peptidler kanonik olmayan amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından üretilen

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Doğa bireysel amino asit yapı taşları sırasını değiştirerek yeni protein işlevler oluşturmak için olanaklar bir çeşitlilik vardır. Ancak, tüm çeşitlerini 20 kurallı amino asitler üzerinde (cAAs) temel alır. Ek fizikokimyasal özellikleri polipeptitler tanıtmak için bir yol kanonik olmayan amino asitler (ncAAs) birleşme giderek protein mühendisliğinde kullanılır. Onların nispeten kısa uzunluğu nedeniyle, ncAAs tarafından ribosomally sentezlenmiş ve post-translationally modifiye peptidler değişiklik özellikle çekici olduğunu. Yeni işlevler ve kimyasal kolları tarafından belirli değişimleri arasında bireysel-ebilmek var olmak oluşturmak. Seçici basınç birleşme (SPI) yöntemi bir temel amino asit kimyasal olarak tanımlanan büyüme medya mahrum auxotrophic ana bilgisayar suşları kullanır. Çeşitli yapısal ve kimyasal olarak benzer amino asit analogları sonra karşılık gelen aminoasil tRNA sentetaz tarafından etkinleştirilebilir ve kalıntı özgü cAA(s) → ncAA(s) oyuncu değişikliği hedef peptid veya protein sırada sağlar. Her ne kadar SPI yöntemi bağlamında, ncAAs da ana bilgisayar Proteom rekombinant gen ekspresyonu aşamasında dahil edilmiştir, hücrenin kaynakları çoğunluğu hedef gen ifade için atanır. Bu kez değiştirilmiş hedef yüksek miktarda ile eşlik ncAAs verimli kalıntı özgü birleşme sağlar. Sunulan çalışma altı prolin analogları vivo içinde birleşme antimikrobiyal peptid nisin, doğal olarak Lactococcus lactistarafından üretilen bir lantibiotic içine anlatılmaktadır. Nisin Antimikrobiyal Özellikleri değişti ve daha fazla ifade auxotrophic Escherichia coli ve fermantasyon sırasında genişletilmiş suşları tanımlanmış büyüme medya. Böylece, etkileri ile ncAAs cAAs kalıntı özgü değiştirme değişiklik antimikrobiyal aktivite ve özgüllük teslim edebilirsiniz. Antimikrobiyal aktivite deneyleri ve floresan mikroskopi yeni nisin değişik bir gram-pozitif Lactococcus lactis göstergesi yük büyüme inhibisyonu için test etmek için kullanılır. Kütle spektroskopisi ncAA birleşme içinde biyoaktif nisin değişik doğrulamak için kullanılır.

Bu iletişim kuralı SPI yöntemi ile ncAA-modified nisin türevleri üretimi prolin analogları ve kalıntı özgü eklenmesi ile sağlamak için tasarlanmıştır. Daha önce fizibilite ve 24 mg/L verimi tam olarak değiştirilmiş vahşi tipi nisin39rekombinant üretimi için rapor edilmiştir. SPI yöntemini kullanarak, hedef peptit/protein verimleri sık iyi ve miktarları vahşi tipi üretim48yakın ulaşabilirsiniz. İlk deneyler rekombinant vahşi tipi RiPP üretim seçilmiş auxotrophic ana test edilmelidir. Burada, prolin auxotrophic E. coli MG1655 Δçizersek:: frt Δyordam:: frt (DE3) ana bilgisayar zorlanma kullanıldı. NcAAs, yetiştirme ve indüksiyon birleşme için zamanlama yanı sıra orta kompozisyon ve sıcaklık maksimum peptid verim doğru optimize edilebilir.
Antimikrobiyal aktivite tahlil Vahşi-türü rekombinant nisin üretim ve arıtma protokol yukarıdaki sonrası yapıldı. Bu durumda, prolin ncAA türevleri adımda 3.6 yerine kullanılmıştır. Bir antimikrobiyal aktivite tahlil RiPP üretim doğrulamak ve antimikrobiyal aktivite öncesi ve sonrası arıtma karşılaştırmak için kullanıldı. Faaliyet tahlil için elüsyon kesirler ve IMAC akışı aracılığıyla doğrudan kullanılan ve gram-pozitif L. lactis göstergesi zorlanma (Şekil 2) karşı test edilmiştir. Bu zorlanma NisP, E. coli hücre lysates içinde yer alan nisin türevleri ifade eder veya saf peptid örnekleri, sırasıyla, lider peptid proteolitik bölünme tarafından aktif hale gibi. Belli ki, akış yoluyla büyüme inhibitör faaliyet gösterdi. Bu biyoaktif malzeme IMAC sütunu bağlama değil tarafından açıklanabilir. Tüm test edilen elüsyon kesirler artmış aktivite IMAC tarafından O'nun öğesini peptid bir konsantrasyon gösteren unpurified örnek göre gösterdi. Not elüsyon tampon (olarak negatif kontrol) L. lactis büyüme bu tahlil etkisi değil.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig2.jpg"> Resim 2 . IMAC arıtma recombinantly vahşi tipi nisin üretilen sonra test antimikrobiyal etkinliği. Elüsyon kesirler 5 ila 15 ve aracılığıyla akış IMAC arınma test edildi unpurified hücre lysate (OD600 normalleştirme için seyreltilmiş) ile karşılaştırıldığında L. lactis göstergesi zorlanma karşı. Büyüme inhibisyon haleler boyutunu antimikrobiyal aktivite gösterir. Kloramfenikol 400 µg/mL bir konsantrasyon, olumlu bir denetim ve IMAC elüsyon tampon negatif kontrol kullanıldı. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Recombinantly antimikrobiyal aktivitesini kanıtlamak için altı farklı prolin analogları içeren türevleri, L. lactis göstergesi zorlanma inhibisyonu test etmek için bir faaliyet tahlil gerçekleştirildi nisin üretti. Şekil 3 büyüme inhibisyon beş prolin analogları kullanılarak üretilen altı örnekleri gösterir. En iyi sonuçları (değerlendirilecektir halo boyutları gibi) birleşme deneyleri analog (4R) için - fluoroproline, (4R) - gözlendi hidroksiprolin ve (4S)-methanoproline. Büyüme inhibisyon halo boyutu yaban tipi nisin için karşılaştırma üretilen ve buna paralel olarak, tüm üç nisin değişik benzer inhibisyon gücü gösterdi test. Ancak, halo boyutu tek başına olamaz AMP konsantrasyonu belirlenmemiştir belirli bir aktiviteyi kıçlarını kullanılır. Bu nedenle, deneyleri sadece niteliksel olup elde edilen nisin versiyonlarının antimikrobiyal aktivite korunmuş kaybolması veya test etmek için hizmet vermektedir. Belirli etkinliğini belirlemek için konsantrasyon nisin versiyonlarının quantified (bkz: tartışma) olması gerekir.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig3.jpg"> Şekil 3 . Antimikrobiyal aktivite tahlil nisin türevlerini içeren hücre lysates üretilen yolu ile SPI prolin analogları ile. Nisin türevleri rekombinant vahşi-türü örnekleri ile karşılaştırılması. Tüm örneklerinin OD600olduğu-hücre lizis hasat hücre kültür yoğunluğu göreli olarak sonra normalleştirilmiş. Haleler bioactivity göstergesi zorlanma büyüme inhibisyonu şeklinde gösterir. İlk sıra soldan sağa: (4R)-fluoroproline, (4R) - hidroksiprolin, (4R) - methanoproline ve kloramfenikol (400 µg/mL; antimikrobiyal olumlu denetim). İkinci satır: (4S)-fluoroproline, (4S) - hidroksiprolin, (4S) - methanoproline ve prolin (vahşi tipi kontrol). Not kimyasal adlandırma; Örneğin, (4R) - fluoroproline da adlandırılır trans-4 - fluoroproline. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
LC-ESI-TOF kütle spektrometresi IMAC arıtma sonraki ncAAs birleşme haline nisin LC-ESI-TOF kütle spektrometresi tarafından analiz edildi. Şekil 4 gösterir (4R) içeren bir nisin değişken deconvoluted kitle spectra-fluoroproline. Bu varyant yukarıda açıklandığı gibi saflaştırılmış ve hala lider taşınan LC-ESI-TOF kütle spektrometresi tarafından daha sonra analiz IMAC yapıldı. Şekil 4A ana tepe (4R) içeren değiştirilmiş nisin karşılık gelen-fluoroproline 6883.18 Da deconvoluted bir kitle ile (hesaplanan kütle 6882.05 Da, hesaplanan prolin ile karşılık gelen vahşi tipi peptid kütlesi 9 6864.06 Da konumdur). Alt bereket ve daha yüksek kütle ile iki doruklarına karşılık sodyum adducts belirtildiği gibi. Şekil 4 B ana farklı ücret tür deconvolution algoritması tarafından bulunan bileşik gösterir. Örneğin, 1148.11 m/z zirve six-fold şarj edilmiş türlere karşılık gelir ([M + 6H]6 +).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig4.jpg"> Şekil 4 . LC-ESI-TOF kütle spektrometresi (4R) içeren IMAC saflaştırılmış rekombinant nisin versiyonlarının-fluoroproline. (A) (iç metin içinde dışarı Yakınlaştırılmış) kütle spektrometresi Kromatografik (hala lider taşıyan) nisin varyant (4R) için Deconvoluted-fluoroproline (beklenen kitleler (Da): [M + H]+ 6882.05, [M + Na]+ = 6904.03, = [M + 2Na]2 + 6926.02 =). (B) spectra türler [M + H]+için bileşik. Beklenen kitleler (Da): [M + 5H]5 + 1377.41, = [M + 6 H]6 + 1148.01, = [M + 7 H]7 + 984.15, = [M + 8 H]8 + 861.26, = [M + 9 H]9 + 765.67, = [M + 10 H]10 + 689.21, = [M + 11 H]11 + 626.64, = [M + 12 H] 12 + 574.50 =. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Floresans mikroskobu Rekombinant nisin ve ncAA içeren türevleri antimikrobiyal aktivite Floresans mikroskobu ile L. lactis göstergesi zorlanma doğrudan gözlem tarafından da gösterilebilir. Nil kırmızı, son derece hidrofobik bir floresan boya bakteriyel hücre zarı leke için kullanıldı. Şekil 5 hücre kültürü ve tek hücre morfolojisi toplama durumundan nitel değişimi gösterir. Hücreleri Nil kırmızı lekeli ve mikroskopi kapak slaytta yatırılır. Üst satır başında doğrudan hücreleri gösterir ne zaman tampon, rekombinant vahşi tipi nisin nisin (4R) içeren veya -fluoroproline, ya da (4R)-hidroksiprolin olduklarını da sözlerine ekledi. Alt paneli kuluçka 20 dakika sonra karşılık gelen görüntüleri gösterir.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig5.jpg"> Şekil 5 . Gram-pozitif hücreler rekombinant nisin efektleri Floresans mikroskobu. 30 µL L. lactis göstergesi zorlanma mikroskobik görüntülerini (OD600 = 1) kırmızı (önce üst paneli) alınmıştır Nil ile işaretlenmiş ve (alt paneli) sonra 20 dk kuluçka 1 µL arabelleği(a)0.3 µL rekombinant vahşi tipi nisin (B) ile ve (4R) içeren 0.6 µL nisin türevleri-fluoroproline (C) ve (4R)-hidroksiprolin (D). Mavi daireler toplanmış veya deforme hücre, mavi oklar noktası nerede Difüzyon floresan membran parçalarının gözlenen bölgelere bölgeleriyle işaretleyin. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Şekil 5 A gösterir hücrelerinin genel görünümü gözlem 20 dakika içinde değişmedi. Sadece zaman gül sırasında yatırılır hücre sayısı ve bu nedenle, hücreleri daha büyük bir miktarda gözlenen bölge 80 µm x 80 µm içinde görünür. Şekil 5 B yabani türü nisin maruz 20 dakika sonra gram-pozitif hücreleri toplanan ortaya çıktı ve bulanık (mavi daireler ile işaretli) gösterir, düz ne zaman düşük miktarlarda (burada, 0.3 µL IMAC elüsyon) eklenmiştir. Buna ek olarak, hafif malzeme hücrelerden Nil ile kırmızı işaretli membran parçaları (mavi oklarla işaretlenmiş) süre sırasında seferber edildi gösteren arabellek içine yayılmış. Nisin6,49ile tedavi üzerine gerçekleşmesini gösterildiği bu bulgular hücre lizis göstermektedir. Benzer etkileri nisin varyant (4R) içeren ile kuluçka sonra - fluoroproline (şekil 5C) ve (4R) içeren nisin - gözlendi hidroksiprolin (şekil 5D) her iki gösterilen büyük tutarları çarpık ve toplanan hücre denetimi örneğini (şekil 5A) işaretli tersine 20 dakika sonra.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Bileşen</td>
			<td>Konsantrasyon</td>
		</tr>
<tr>
<td>(NH4) 2 Yani4 </td>
			<td>7.5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>8.5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>22 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2HPO4
</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4
</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-glikoz</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tüm kanonik amino asitler (eski yerine koymak için bir hariç)</td>
			<td>50 mg/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>CA2 +
</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fe2 +
</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eser elementler (Cu2 +, Zn2 +, Mn2 +, MoOH2 +)</td>
			<td>0,01 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tiamin</td>
			<td>10 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotin</td>
			<td>10 µg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. Adım 2 göre hazırlık sonra kompozisyon NMM19 kimyasal olarak tanımlanmış Bakteriyel büyüme orta.

Protokol Escherichia colisunar-lactococcal antimikrobiyal peptid nisin içine seçici basınç birleşme kanonik olmayan amino asit (ncAAs) dayalı. Özelliklerini rekombinant ifade ile ikame ile tanımlanmış büyüme medya istenen ncAAs sırasında değiştirilebilir. Bioactivity ortaya çıkan değişimler büyüme inhibisyon deneyleri ve floresan mikroskopi tarafından eşleştirilir.

Antimikrobiyal peptidler kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından üretilen

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

Bu metodolojinin genel amacı, kanonik olmayan amino asitleri ribozomal olarak sentezlenmiş antimikrobiyal peptitlere dahil etmektir. Yeni denatüre peptit üretilir, ncAA'nın varlığı kontrol edilir ve agar difüzyon deneyleri kullanılarak antimikrobiyal aktivite açısından test edilir. Bu yöntem, antimikrobiyaller veya bakteriler alanında, belirli peptit pozisyonlarının etki modunda veya direnç gelişimindeki rolü gibi bazı önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Aynı prensipleri takiben, daha az peptitler gibi çeşitli frooplar üretilebilir ve MRSA gibi patojenlere karşı dedektiflik test edilebilir. Patojenlerle savaşmak ve antimikrobiyal ilaçların eksikliklerini gidermek için antimikrobiyal ajanların geliştirilmesi için doğada yeni olan peptitler üretilebilir. Bu tekniğin temel avantajı, kanonik olmayan amino asitlerin çeşitliliğinin, genetik düzeyde değişiklik gerektirmeden paralel olarak test edilebilmesidir.Sonuç olarak, paralel olarak birkaç modifiye Peptit üretmek nispeten kolaydır. Bu işleme başlamak için, 100 mililitrelik bir Erlenmeyer şişesinde antibiyotik ve yüzde bir glikoz içeren 25 mililitre LB ortamı hazırlayın. Yeni dönüştürülmüş bakteri hücrelerinden oluşan bir koloni veya donmuş bir hücre stoğundan elde edilen hücreler kullanarak aşılayın.Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derece ve 200 rpm'de inkübe edin. Ertesi gün, bir litre steril taze ortama 10 mililitre gece boyunca kültür ekleyin. Kültürü, her biri iki litrelik bir Erlenmeyer şişesinde 500 mililitrelik iki kültüre karıştırın ve bölün ve iki saat boyunca 37 santigrat derece ve 200 rpm'de inkübe edin İki saat sonra, boş olarak steril ortam kullanarak OD 600'ü ölçün.İnkübasyona devam edin ve OD 600 0.5'e eşit olana kadar OD'yi düzenli aralıklarla ölçün. Daha sonra, hem bakteri kültürlerini çekin hem de 15 dakika boyunca dört santigrat derece ve 4.500 x g'da santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı dökün ve atın.Antibiyotik ve yüzde bir glikoz içeren 20 mililitre NMM19 ile buz üzerine yerleştirilen santrifüj kovasındaki hücre peletini yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 10 dakika boyunca dört santigrat derece ve 4.500 x g'da santrifüjleyin. Daha sonra, hücre peletini buz üzerinde aynı taze ortamın beş mililitresinde yeniden süspanse edin.Hücre süspansiyonunu 500 mililitrelik taze bir ortama aktarın ve bir saat boyunca 30 santigrat derece ve 200 rpm'de inkübe edin. Bir saat sonra, kültürü, sırasıyla her ncAA veya kontrol için bir tane olmak üzere, ayrı şişelerde iki eşit parçaya bölün. Her kültüre, stok ncAA'yı bir milimolar nihai konsantrasyona ekleyin ve vahşi tip kontrolüne, bir milimolar için L-prolin stoğu ekleyin.Ardından, bir milimolar IPTG kullanarak hedef gen ekspresyonunu indükleyin. Kültürleri gece boyunca 28 santigrat derece ve 200 rpm'de inkübe edin. Ertesi gün, OD'yi ölçün ve aktivite tahlilleri için her kültürden bir mililitre alın.Her kültürün kalan hücrelerini, 20 dakika boyunca dört santigrat derece ve 5.000 x g'da tekrar tekrar santrifüjleyerek toplayın. Her seferinde, tüm hücreler toplanana kadar süpernatanı çıkarın ve atın. Hücre peletlerini peptit saflaştırılana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.GM17-agar plakalarını hazırlamak için, önce 25 mililitrelik bir Erlenmeyer şişesinde yüzde bir glikoz ve mililitre kloramfenikol başına beş mikrogram ile M17 suyunda donmuş gliserol stoğundan indikatör suşunun gece boyunca beş mililitrelik bir kültürünü hazırlayın. 30 santigrat dereceyi sallamadan inkübe edin. Ertesi gün, boş olarak GM17 ortamını kullanarak OD'yi ölçün Beş mililitre taze ortamı yeni bir şişeye ekleyin.0.1'e eşit bir OD 600'e aşılayın ve inkübasyona devam edin. İki saat sonra, değer 0,4 ila 0,6'ya ulaşana kadar OD'yi düzenli aralıklarla ölçün. Daha sonra ön kültürü buzun üzerine yerleştirin ve tutun.Bir cam ortam şişesinde 4,5 gram agar tartarak yüzde 1,5 agar yapın. 300 mililitre çift damıtılmış su ekleyin, ardından karıştırın ve otoklavlayın. 300 mililitre çift damıtılmış su ve otoklavda iki x M17 suyu hazırlayın.Mililitre başına 10 mikrogram kloramfenikol ve yüzde iki glikoz içeren 25 mililitre iki x M17 suyuna bir mililitre Lactococcus lactis ön kültürü ekleyin. Daha sonra 25 mililitre ılık erimiş agar karışımı ekleyin ve çözeltiyi büyük bir petri kabına dökün. Steril koşulları koruyarak, plakayı 10 ila 15 dakika kurutun.Ardından, bir cam Pasteur pipetinin uçlarını alevle sterilize edin Pipet soğuduktan sonra, katılaşmış agarda delikler oluşturmak için geniş ucunu kullanın. Her numune için petri kabının alt kısmını, ilgili delik konumunun yanında etiketleyin. Aktivite tahlili için, E.coli üretim kültürlerinin bir mililitre numunelerini alın ve bunları 7.000 x g'da üç dakika santrifüjleyin, kalan ortamı aspire edin ve hücre peletini pipetleme yoluyla 500 mikrolitre sodyum fosfat tamponunda yeniden süspanse edin.Daha sonra, sonikatör probunun ucunu hücre süspansiyonuna batırarak numuneyi buz üzerinde sonikleştirin. Sonikasyonu başlatın. Daha sonra, hücre lizatını 13.000 x g'da 10 dakika boyunca pelet hücresi kalıntılarına santrifüjleyin.Süpernatanı buz üzerindeki yeni bir reaksiyon tüpüne aktarın. Süpernatantları, hasat edilen hücre yoğunluğuna göre 0.6'ya eşit bir OD 600'ün bir mililitresine seyreltin ve normalleştirin, sodyum fosfat tamponu ile karıştırın. Antimikrobiyal aktiviteyi test etmek için, indikatör agarın belirlenen deliğine 40 mikrolitre normalleştirilmiş numune ekleyin.Tüm numuneler agarın içine yayılana kadar bekleyin. Plakayı gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, düz yataklı bir tarayıcı veya dijital kamera kullanarak agar plakasının fotoğraflarını çekin.Büyüme inhibisyonu halo boyutu elle veya yazılım kullanılarak ölçülebilir. Floresan mikroskobu için, DMSO'da 10 milimolar Nil kırmızı stok çözeltisi hazırlayın. Aktivite tahlili için, OD 600'e kadar olan indikatör suşu, bire eşittir.Kültürün bir mililitresini dört santigrat derecede ve 5.000 x g'da üç dakika santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı atın ve numuneyi bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. Ardından, numuneyi santrifüjleyin ve tekrar askıya alın.Daha sonra, bir mikrolitre Nil kırmızısı stok çözeltisi ekleyin ve hafifçe karıştırın. Mikroskobik görüntü elde etmek için, 520 nanometrede heyecan verici bir şekilde bir kapak slaytına 30 mikrolitre hücre hazırlığı ekleyin. Çekim süresini 0,2 saniyeye, kinetik serileri 0,1 Hertz'e ve seri uzunluğunu 200 görüntüye ayarlayın.Ardından, 0.3 ila 1.5 mikrolitre hücre lizatı veya saflaştırılmış peptit numuneleri ekleyin. Floresan emisyonunu 560 nanometreye eşit veya daha büyük bir dalga boyunda izleyin ve kaydedin. Görüntü dizilerini avi dosyaları olarak saklayın ve görüntüleri ImageJ ile analiz edin.Bu şekil, prolin analogları içeren rekombinant antimikrobiyal peptitler tarafından bakteriyel indikatör suşunun büyüme inhibisyonunu göstermektedir. Agar kaynak difüzyon testinin bir parçası olarak, inhibisyon haleleri numune pozisyonlarının etrafında görünür hale gelir. Bu video, antimikrobiyal peptitlerin eklenmesi olmadan indikatör suşunun hızlandırılmış floresan mikroskobunu gösterir.Fazla mesai, bakteri hücreleri sadece tampon eklendiği için kapak lamı üzerinde biriktirilir, hücrelerin görünümü 20 dakikalık gözlem içinde değişmez. Bu floresan mikroskobu zaman atlamalı, bir antimikrobiyal peptidin indikatör suşunun hücreleri üzerindeki etkilerini gösterir. Fazla mesai, bakteri hücreleri, okla vurgulandığı gibi kanonik olmayan amino asit 4R hidroksiprolin içeren bir nisin varyantına maruz kaldıktan sonra toplanmış ve bulanık görünür.Dairelerle işaretlenmiş hafif malzeme, hücrelerden tampona yayılır ve bu da zar parçalarının harekete geçirildiğini gösterir. Bu şekil, yabani tip nisin veya kanonik olmayan amino asitler içeren bir varyantın mevcut olduğu indikatör suşun inkübe edilmesinden sonraki etkileri göstermektedir. Antimikrobiyal peptitlere maruz kaldıktan sonra, bakteri hücreleri daireler tarafından gösterildiği gibi toplanır.Hücre lizatlarını gösteren hafif malzeme, oklarla gösterildiği gibi hücrelerin etrafında görünür hale gelir. Negatif kontrolün aksine, 20 dakikalık inkübasyondan sonra büyük miktarda çarpık ve agrega hücre bulunur. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik dört gün içinde gerçekleştirilebilir.Bu, ncAA modifiye peptitlerin üretimini ve agar kaynak difüzyon testleri ve floresan mikroskobu kullanılarak aktivite testini içerir. Bu prosedürü denerken, taze bakteri kültürleri ve uygun büyüme ortamları kullanmayı unutmamak ve bunları dikkatli bir şekilde ele almak önemlidir. Aktivite testi için her zaman uygun pozitif ve negatif kontrolleri dahil edin.Bu prosedürü takiben, afinite kromatografisi ve/veya HPLC ile diğer peptit saflaştırma yöntemleri gerçekleştirilebilir. Kanonik olmayan amino asidin dahil edildiğini kanıtlamak için kütle spektrometresi zorunludur. Geliştirildikten sonra, bu teknik, araştırmacıların daha yeni antimikrobiyal peptitleri keşfetmelerinin yolunu açtı, diğer antibakteriyel veya mikrobiyal konakçı, farklı peptitler üzerinde üretim ve antimikrobiyal aktivitenin test edilmesi için kullanılabilir.Bu videoyu izledikten sonra, kanonik olmayan amino asitlerin antimikrobiyal peptitlere nasıl dahil edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

antimicrobial-peptides-produced-selective-pressure-incorporation-non

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Mikrodalga ışınlaması kullanılarak siklik peptitlerin sentezi için basit ve genel bir yöntem özetlenmiştir. Bu prosedür, yan zincirleri ve farmakoforik kısımları korurken farklı konformasyonların bir koleksiyonu ile omurga siklik peptitlerinin sentezini sağlar ve bu nedenle biyoaktif konformasyonun taranmasına izin verir.

Mikrodalga Radyasyon Kullanımı Potansiyel Antiparazitik Therapeutics gibi omurga Siklik Peptit Kütüphanesi Gelişimi

Tıbbi, farmasötik, yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için Kanonik olmayan amino asit analoglarının proteinlere kalıntıya özgü dahil edilmesi için kullanımı kolay, hücresiz bir ekspresyon protokolü sunulmuştur.

Bir Kullanarak Modeli Proteinler içine Kuralsız Amino Asit kalıntı özgü Ortaklığın<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hücre içermeyen Transkripsiyon-çeviri Sistemi

Bu iletişim kuralının amacı farklı proteinler arasında tutarlı terminoloji ve sınıflandırma ölçütlerini yoksun bir grup için bir referans geliştirmektir. Bu başvuru analizleri ve bir bütün olarak grup tartışma kolaylaştıracak ve kurulan adlarına ek olarak kullanılabilir.

Oluşturma ve tartışma ve proteinler arasında farklı grup sınıflandırılması kolaylaştırmak için bir başvuru uygulama

Sentetik Biyoloji Mühendisliği proteinlerin kanonik olmayan amino asitlerin co-translational ekleme kullanarak benzersiz özellikleri ile sağlar. Burada, GFP türü fluorophore "altın" floresan protein (GdFP) olarak adlandırdığı roman Floresans spektroskopik özellikleri ile hayalice kırmızı kaymıştır bir türevi E. coli seçici basınç birleşme (SPI) yolu ile nasıl üretilir sundu.

Mühendislik kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından 'Altın' floresan ve kütle spektrometresi ve floresan göre Protein analizi

Burada Ayagin Gram-negatif Escherichia coli (e.coli) üretmek için bir protokol mevcut spheroplasts ve gram-pozitif Bacillus megaterium (B. megaterium) önceki açıkça görselleştirmek ve hızla karakterize peptid-bakteri etkileşimler. Bu yerelleştirme ve peptidler translocating membran tanımlamak için sistematik bir yöntem sağlar.

Üretim ve bakteriyel Spheroplasts ve önceki antimikrobiyal peptid yerelleştirme karakterize etmek için görselleştirme

Bu çalışmada, aynı anda doğruluk, hassasiyet ve yüksek verim elde etmek için nadir kodon zengin işaretçileri kullanarak amino asit overüreticilerinin belirlenmesi geleneksel toksik analog tabanlı yöntem için alternatif bir strateji sunar.

Nadir-Codon zengin Işaretçileri kullanarak amino asit Overüreticiler tanımlama

Klasik bölgeye yönelik mutagenezin sınırlamalarının üstesinden gelmek için, spesifik modifikasyonlara sahip prolin analogları birkaç floresan proteinine dahil edildi. Hidrojenin flor ile veya prolin kalıntılarındaki tekli çift bağlarla ("moleküler cerrahi") değiştirilmesinin, katlanmaları ve ışıkla etkileşimleri de dahil olmak üzere temel protein özelliklerini nasıl etkilediğini gösteriyoruz.

Floresan Proteinlerde Prolin Analogları ile Prolinin Kalıntıya Özgü Değişimi: Omurganın "Moleküler Cerrahisi" Katlanma ve Stabiliteyi Nasıl Etkiler?

Bu protokol, peptitlerin ve küçük moleküllü antifungal ajanlar gibi diğer bileşiklerin Candida albicans'a karşı antifungal aktivitesi hakkında nicel veriler elde etmek için bir yöntemi açıklar. Büyüme inhibisyonunu ölçmek için koloni oluşturan birimleri saymak yerine optik yoğunluk kullanımı, zamandan ve kaynaklardan tasarruf sağlar.

Peptitlerin Candida albicans'a Karşı Antifungal Aktivitesinin Ölçülmesi

Bu protokol, katyonik peptid Mel4 ile RK758 peptit taklidi olan antimikrobiyal aktivite ve sitotoksisitenin üretilmesi ve değerlendirilmesi için bir yöntem tanımlar. Kimyasal sentez, rekombinant ifade ve standartlaştırılmış fonksiyonel testleri entegre ederek, peptit ve küçük molekül taklitlerinin üretimi ve testi için daha verimli bir iş akışı sağlar.

Antimikrobiyal Peptitler ve Taklitlerinin Üretimi ve Testi

Isotachophoresis (ITP) toksini tanıma ve numune hazırlama kadar uygulamaları ile sağlam bir elektrokinetik ayırma ve zenginleştirme tekniktir. Ayırma ve küçük moleküller ve hücre kültürü lizatı nükleik asitlerin saflaştırılması tespiti: Biz ITP fiziksel prensipleri ve iki özel örnek uygulamalar için bu tekniği uygulayarak metodolojisi gözden geçirin.

İyonların ayrılması ve Nükleik Asit Saflaştırılması için on-chip Isotachophoresis

Keşfedin, antimikrobiyal peptid nisine kanonik olmayan amino asitlerin Escherichia coli kullanılarak nasıl dahil edildiğini. Agar difüzyon testleri ve floresan mikroskopi ile antibakteriyel aktiviteyi değerlendirin.

Antimikrobiyal peptidler kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından üretilen

Daha fazla video keşfet