Name: GPC3 hedefleme Bispecific antikor, GPC3-S-Fab, güçlü sitotoksisite (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Öğrenin, GPC3-S-Fab bispecific antikorunun E. coli'de üretim ve saflaştırma protokolünü. Bu yöntem, GPC3 pozitif karaciğer kanseri hücrelerine karşı güçlü sitotoksisite etkisini değerlendirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser mali R & D planı, Guangdong Eyaleti (PR Çin) (2016A050503028) tarafından desteklenmiştir.

İnsan kanı toplama dahil olmak üzere tüm yordamları Sun Yat-Sen Üniversitesi Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
1. GPC3-S-Fab tasarım stratejisi
<ol><li>GPC3-S-Fab anti-GPC3 (insanlaşmış GC3313) bir anti-CD16 VHH14 (Şekil 1) ile bir Fab bağlayarak tasarlayın.</li>
	<li>Sentez ve VH-CH1-CD16-VHH ve VL-CL pET26b ve pET21a vektörel çizimler daha önce bildirilen12olarak klonu.</li>
</ol>2. dönüşüm ve kültür
<ol><li>100 Ekle VH-CH1-CD16 (Şekil 1A) ve 100 içeren ng pET26b, pET21a, yetkili BL21 100 µL VL-CL (Şekil 1A) içeren ng (DE3) hücreleri. Mix iyi ve 45-90 s, transfer, 42 ° C su banyosunda 30 dk. Incubate buz üzerinde kuluçkaya ve 3-5 dakika buz üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>Lysogeny suyu (LB) orta 500 µL BL21 içeren bir tüpün içine ekleyin (DE3) hücreleri ve sonra 37 ° c, 45-60 dakika süreyle 150 d/d BL21 yayılmış 100 µL kuluçkaya LB-agar (DE3) hücre tabaklar içeren 50 µg/mL sefaloridin ve ampisilin 100 µg/mL ve 12-16 h 37 ° C'de kuluçkaya.<ol>
<li>Lysogeny suyu (LB) orta hazırlamak: %1 wt/vol tryptone, % 0.5 wt/vol maya özü, % 1 wt/vol NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir koloni hücrelerden sefaloridin 50 µg/mL ve ampisilinve kültür 37 ° c, 220 devir/dakika, 100 µg/mL gecede içeren Süper suyu (SB) orta 5 mL aşılamak. O zaman, kültür 1 mL 100 mL 50 µg/mL sefaloridin ve ampisilin ve kültür 37 ° c, 4 h için 220 devir/dakika 100 µg/mL içeren SB orta içine aşılamak. Ardından kültür 10 mL 1 L SB orta sefaloridin 50 µg/mL ve ampisilin ve kültür 37 ° c, 220 devir/dakika 100 µg/mL içeren içine aktarın.<ol>
<li>Süper suyu orta hazırlamak: % 3.2 wt/vol tryptone, % 2 wt/vol maya özü, % 0.5 wt/vol NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>OD600 0,6 - ulaştığında 0.8, 0.2 mM son bir konsantrasyon izopropil-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) ekleyin. Kültür 16 ° c, 36-48 h periplasmic ifade için 180 rpm.</li>
</ol>3. GPC3-S-Fab Periplasmic arıtma
<ol><li>Periplasmic kesir hazırlık<ol>
<li>4000 x g, 30 dk için 4 ° C de centrifuging tarafından hücreleri toplamak, orta atın ve hücreleri tartın.</li>
		<li>4 mL buz gibi sükroz çözeltisi (20 mM Tris-HCL, pH 7.5; %25 (wt/vol) sükroz ve 1 mM EDTA) gram hücre başına iyice hücrelerde resuspend ve 15 dakika buz üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>8.500 x g (Masa Üstü Santrifüj, sabit açılı rotor), buz üzerinde 20 dk. kaldırmak için süpernatant (sukroz Kesir) ve kurtarmak o 4 ° C santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Buz gibi 5 mm MgCl2 ve PMSF (gram hücre başına 4 mL), 1 mM bir karışımında granül resuspend. Lizozim hisse senedi (15 mg/mL) gram başına 40 µL ekleyin ve buz 30 dk için kuluçkaya.</li>
		<li>8.500 x g (Masa Üstü Santrifüj, sabit açılı rotor), 4 ° C 20 dakika Transfer süpernatant (periplasmic Kesir) süreyle santrifüj kapasitesi ve buza kaydedin.</li>
		<li>Sükroz kesir ve periplasmic kesir birleştirin ve de 30.000 x g, 4 ° C'de 30 dk. kaldırmak için süpernatant ve kurtarmak o bir 50 mL konik tüp buz santrifüj kapasitesi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ni-NTA benzeşme arıtma<ol>
<li>Homojen bir süspansiyon ulaşmak, Ni-NTA özel bir taze 15 mL konik tüp için 1 mL kaldırmak ve 10 sütun birimleri (CV) denge arabellek eklemek için iyice karıştırılarak Ni-NTA özel 1 mL resuspend (25 mM Tris-HCL, pH 7.5; 1 M NaCl) equilibrate için.</li>
		<li>400 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant dikkatli bir şekilde çıkarın. Daha sonra Ni-NTA özel sükroz kesir ve periplasmic kesir içeren 50 mL tüp içine ekleyin. Rock 4 ° c 2 h için.</li>
		<li>400 x g karisimin santrifüj kapasitesi, 4 ° C'de 5 dakika süreyle dikkatli bir şekilde süpernatant ilişkisiz kesir olarak başka bir taze buz gibi tüp için çıkarın. Ni-NTA özel bir yerçekimi sütuna aktarmak.</li>
		<li>10 Ekle CV, arabellek yıkama (25 mM Tris-HCL, pH 7.5; 1 M NaCl; 20 mM, 30 mM veya 40 mM imidazole) sütun ve toplamak çamaşır kesir olarak elute. Not: Bu çözümler imidazole konsantrasyonları artan sırayla eklenmelidir.</li>
		<li>3 ekleyin elüsyon CV (25 mM Tris-HCL, pH 7.5; 300 mM NaCl; 100 mM, 200 mM, 300 mM veya imidazole 400 mM) sütun için tampon ve elüsyon kesir olarak 1, 2, 3 ve 4 elute toplamak. Not: Bu çözümler imidazole konsantrasyonları artan sırayla eklenmelidir.</li>
		<li>Diyaliz PBS (137 mM NaCl, KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4 2.7 mM) 2 L eluted fraksiyonları % 12 kontrol GPC3-S-Fab varlığı diyaliz boru (12,4 kDa) 4 ° C'de 2 h. için istimal SDS-sayfa ve sonra tarafından Coomassie mavi boyama.</li>
	</ol>
</li>
	<li>IgG-CH1 benzeşme arıtma<ol>
<li>IgG-CH1 benzeşme reçine 1 mL 50 mL konik tüp içine aktarmak ve boncuk PBS ile önce yıkayın. Daha sonra GPC3-S-Fab-den sonra adım 3.2.6 içeren diyaliz çözüm ekleyin. Rock 4 ° c 2 h için.</li>
		<li>5 min için 400 x g, santrifüj, 4 ° C. Dikkatle ve reçine bir ağırlık sütun için transfer için başka bir taze buz gibi tüp süpernatant çıkarın.</li>
		<li>10 Ekle CV çamaşır tampon (PBS) için sütun ve yıkama kesir olarak elüsyon toplamak.</li>
		<li>Koleksiyon tüpler Tris pH 9.0 (her eluted kesir mL başına 0.1 mL) 1 M ekleyerek hazırlayın. 3 CV elüsyon arabellek (glisin-HCL, pH 2.7 0.1 M) ile elute ve eluted kesir toplamak; 3 kez tekrarlayın.</li>
		<li>Diyaliz diyaliz boru (12,4 kDa) kullanarak 4 ° C'de 2 h. için PBS 2 L eluted kesirler iki kez tekrarlayın.</li>
		<li>Ultramicrospectrophotometer tarafından protein konsantrasyonu belirlemek (Molar tükenme katsayısı: 91105. 1 A280 = 0.69 mg/L).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. SDS-sayfa ve Western blot Analizi
<ol><li>5 SDS yükleme arabellek x 10 µL örnek almak ve iyice karıştırın. 5 min için 100 ° C'de protein karışımı kaynatın.<ol>
<li>5 x SDS yükleme arabellek hazırlamak: 250 mM Tris-HCL, pH 6.8, % 10 wt/vol SDS, %0,5 wt/vol bromophenol mavi, %50 vol/vol gliserol, % 5 vol/vol beta-mercaptoethanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>SDS-sayfa jel yükleme jel (% 5) ve ayrılık jeli (% 12) yukarıda açıklanan26,27,28hazırlayın.</li>
	<li>Haşlanmış protein karışımı ve protein marker 10 µL yük ve SDS-sayfayı çalıştırın.</li>
	<li>Coomassie parlak mavi çözüm ile 20 dk için sallayarak jel leke ve destaining gerçekleştirin.</li>
	<li>Western Blot, PVDF membran için aktardıktan sonra membran TBST (20 mM Tris-HCl, NaCl, %0,1 vol/vol ara 20 150 mM) ile blok + % 5 wt/vol sallayarak süre oda sıcaklığında 1 h için süt kaymağı alınmış.</li>
	<li>Membran birincil antikorlar ile kuluçkaya (Anti-O'nun veya anti-bayrak) seyreltilmiş 1:2,000 TBST + % 5 yağsız süt 1 h için.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 5 min için TBST ile yıkama ve 3 kez tekrarlayın.</li>
	<li>İkincil antikoru (Anti-fare Fc antikor HRP bağlı) seyreltilmiş 1:2,000 TBST + % 5 yağsız süt 1 h için membran kuluçkaya.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 5 min için TBST ile yıkama ve 3 kez tekrarlayın.</li>
	<li>HPR substrat film başına 1 mL ekleyin, geliştirmek ve fotoğraf çekmek.</li>
</ol>5. jel filtrasyon Analizi
<ol><li>Aşağıdaki sütun kullanın: sütun hacmi 24 mL; Denge arabellek PBS pH 7.4; Akış hızı 0.5 mL/dk odasında ılıman; Örnek hacmi 200 µL.</li>
	<li>Aşağıdaki protein güç ve konsantrasyon kullanın: 500 µL 1.2 mg/ml GPC3-S-Fab. 20.000 x g 30 dk için de santrifüj kapasitesi ve yüklemek için 200 µL al.</li>
	<li>Protein marker hacmi ve konsantrasyon, 100 µL sitokrom C (2 mg/mL, 12.4 kDa), 140 µL anhidraz (3 mg/mL, 29 kDa), albümin (10 mg/mL, 66 kDa) 140 µL ve alkol dehidrogenaz (5 mg/mL, 150 kDa) 200 µL bir tüpün içine alın. 20.000 x g 30 dk için de santrifüj kapasitesi ve yüklemek için 200 µL al.</li>
	<li>Her koşudan önce en az 2 ile yıkayın CV distile suyun akış hızı 0.5 mL/dak.</li>
	<li>Sütun en az 2 ile equilibrate CV denge arabelleği (PBS, pH 7,4) 0.5 mL/dk akış hızında.</li>
	<li>Otomatik olarak örnek örnek yüklemek için 0.5 mL/dk enjekte et.</li>
	<li>Denge arabelleği 0.5 mL/dk ile elute ve 280 ve 215 nm algılamak.</li>
</ol>6. Akış Sitometresi Analizi
<ol><li>HepG2 Kültür (GPC3 pozitif), Hep3B (GPC3 pozitif), Huh7 (GPC3 pozitif) ve 100 x 20 mm plastik yemekleri DMEM orta % 10 fetal Sığır serum (FBS), penisilin (100 µg/mL) ve streptomisin (50 µg/mL) 37 ° C'de içeren hücrelerde MHCC - 97H (GPC3 complement) %5 CO2.</li>
	<li>Kültür CHO (GPC3 complement) hücreleri ve tam uzunlukta insan GPC3 cDNA (GPC3 pozitif) 100 x 20 mm plastik yemekler RPMI 1640 orta %10 FBS, penisilin (100 µg/mL) ve streptomisin (50 µg/mL) 37 ° c, % 5 CO2içeren yataklık CHO/GPC3 hücreleri.</li>
	<li>Tam uzunlukta insan CD16 cDNA (CD16 pozitif) barındıran NK92/CD16 25 cm2 şişeye %10 FBS, penisilin (100 µg/mL) ve streptomisin (50 µg/mL) 37 ° c, % 5 CO2ile RPMI 1640 orta içeren kültür.</li>
	<li>Hücreleri % 70-90 birleşmesi olduğunuzda, orta atın ve PBS 2 mL hücrelerle yıkayın. 1 mL % 0.25 tripsin ekleyin ve 37 ° c için 2-3 dk (veya hücre yüzeyinden ayırmak başlayana kadar) kuluçkaya. Tripsin etkisiz hale getirmek ve hücrelerin yavaşça yukarı ve aşağı pipetting tarafından yeniden askıya almak için tam büyüme orta 1 mL ekleyin.</li>
	<li>Neubauer hemasitometre kullanarak hücre sayıları saymak ve hücre canlılığı Trypan Mavitarafından algılamak.</li>
	<li>3 x 106 hücreler her hücre satırı için toplamak. PBS + % 0,2 BSA hücreleri yeniden askıya almak için 1 mL ekleyin. 200 x g, santrifüj, 4 ° C 5 dk. iki kez tekrarlamak için.</li>
	<li>PBS + % 0,2 BSA hücreleri yeniden askıya almak için 0.3 mL ekleyin ve her 5 mL polistren yuvarlak alt tüp 100 µL (yaklaşık 1 milyon) aktarın. Not: Lütfen burada tüpler için adımları soğuk buz üstünde tutulmalıdır emin olun. Antikor hücre yüzey antijeni bağlanırken, karmaşık içselleştirmesi başlar. Soğuk tutarak, süreci önemli ölçüde yavaşladı.</li>
	<li>Her tüp için birincil antikor (GPC3-S-Fab veya insan Igg1, son konsantrasyonu 5 µg/mL) 10 µL ekleyin ve 1 h için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>PBS 1 mL ekleyin + % 0,2 BSA yıkama ve 200 x g, santrifüj, 4 ° C'de 5 dakika süreyle üç kez tekrarlayın.</li>
	<li>PBS + % 0,2 BSA, 100 µL yeniden askıya alma ve daha sonra ikincil antikoru (anti-insan IgG(H+L)-488, son konsantrasyonu 10 µg/mL) 0.5 µL ekleyin ve buz 1 h. Not için kuluçkaya: Bu adıma, lütfen hücreler gelen ışık tutmak..</li>
	<li>PBS 1 mL ekleyin + % 0,2 BSA yıkama ve 200 x g, santrifüj, 4 ° C'de 5 dakika süreyle üç kez tekrarlayın.</li>
	<li>Hücreleri tarafından akış sitometresi standart protokolü29göre analiz. Hücrelerin uyarma için 488 nm lazer ile elde etmek.</li>
</ol>7. sitotoksik deneyleri
<ol><li>Tümör hücreleri hazırlayın.<ol>
<li>Kültür HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC - 97H ve CHO hatları 6.1 6.5 adımlarda açıklandığı gibi hücre.</li>
		<li>0,5 × 105/mL hücrelere sulandırmak ve 100 µL hücreleri (iyi başına 5000 hücre) 96-şey plakalar üzerinde plakası. 6-8 h hücre eklemek izin vermek için kültür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İnsan periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) hazırlayın.<ol>
<li>PBS eşit bir birimdeki bir 50 mL konik tüp taze hazırlanmış kanı sulandırmak. Örneğin, kan 10 mL 10 mL PBS ile oranında seyreltin.</li>
		<li>Lenfosit ayrılık orta 15 mL taze 50 mL konik tüp içine al. Lenfosit ayrılık ortama tüp tarafı boyunca seyreltilmiş kan yavaş yavaş aktarın. Not: tüp dikey tutun. Lenfosit ayrılık orta yüzeyine bozulmaz.</li>
		<li>400 x g oda sıcaklığında 35 dk için de kapalı tut ile santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Yavaş yavaş üst plazma katmanı kaldırın ve PBMCs plazma-lenfosit ayrılık orta arayüz içeren beyaz kan katman al.</li>
		<li>PBS + % 2 Kişilik birimi olan PBMCs seyreltik FBS. 400 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Hücrelerle iki kez PBS + % 2 yıkama FBS. 5 dakika süreyle santrifüj 400 x g de 6,5 adımda anlatıldığı gibi hücre sayıları saymak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NK hücreleri hazırlayın.<ol>
<li>5 x 107 hücre/mL PBS + %2 FBS ve yerde bir konsantrasyon, PBMCs süspansiyon hazırlamak 5 mL polistren yuvarlak alt tüp giriyordu.</li>
		<li>İnsan NK hücre zenginleştirme kokteyl 50 µL/mL hücre ekleyin. Mix iyi ve 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>Manyetik parçacıklar NK hücre zenginleştirme kiti ve mix iyi onlar düzgün pipetting tarafından askıya alınır sağlamak için yukarı ve aşağı 5 katından fazla şiddetle resuspend. 100 µL/mL resuspended manyetik parçacıklar hücre süspansiyon aktarın. Mix iyi ve 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>PBS + %2 ekleyerek toplam hacmi 2.5 mL kadar hücre süspansiyon getirmek FBS. Tüp hücrelerde yavaşça yukarı ve aşağı 2 - 3 kez pipetting tarafından karıştırın. (Olmadan bir kap) tüp mıknatıs yerleştirin. Oda sıcaklığında 2.5 min için yerleşmek manyetik boncuklar izin.</li>
		<li>Mıknatıs kaldırın. Bir sürekli çekimde zenginleştirilmiş hücre süspansiyon yeni bir tüp içine dökme Tüp, tersine çevirin.</li>
		<li>6.5. adımda açıklandığı gibi hücre sayıları saymak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sitotoksik tepki kadar ayarla.<ol>
<li>NK hücreleri 5 × 105 hücreleri/karşılık gelen kültür ortamı kullanarak ml seyreltik. 100 µL NK hücre süspansiyon, bir 96-şey plaka üzerinde kaplama tümör hücreleri ekleyin.</li>
		<li>GPC3-S-Fab 10 µL 30 µg/mL, 3 kat seyreltme, 9 nokta (üç çoğaltır) son bir konsantrasyon, en yüksek dozla farklı konsantrasyonlarda ekleyin.</li>
		<li>37 ° c, % 5 CO2 72 h için kuluçkaya.</li>
		<li>72 h, kuluçka sonra orta kaldırmak ve DMEM orta CCK8 reaktif her kuyuya 96-şey plakaları için 10 µL içeren 100 µL ekleyin ve 37 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>450 de plaka okumak nm'de 1, 2, 3 ve 4 h CCK8 reaktif ekledikten sonra.</li>
		<li>Verileri analiz. (OD450 GPC3-S-Fab + efektör + tümör - OD450 Orta) hayatta kalma oranı hesaplamak / (OD450 tümör - OD450 Orta) × %100 ve (OD450 GPC3-S-Fab + tümör - OD450 Orta) / (OD450 tümör - OD450 Orta) × %100. Efektör hücreler NK hücreleri vardır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Weiner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+better+monoclonal+antibody-based+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Building better monoclonal antibody-based therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).</li>
<li>Rathi, C., Meibohm, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+pharmacology+of+bispecific+antibody+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs.</a> The Journal of Clinical Pharmacology. 55, Suppl 3. S21-S28 (2015).</li>
<li>Weidle, U. H., Kontermann, R. E., Brinkmann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-antigen-binding+bispecific+antibodies+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumor-antigen-binding bispecific antibodies for cancer treatment.</a> Seminars in Oncology. 41 (5), 653-660 (2014).</li>
<li>Demarest, S. J., Glaser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+therapeutics%2C+antibody+engineering%2C+and+the+merits+of+protein+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Drug+Discovery+and+Development%22%5BJournal%5D)">Antibody therapeutics, antibody engineering, and the merits of protein stability.</a> Current Opinion in Drug Discovery and Development. 11 (5), 675-687 (2008).</li>
<li>Mabry, R., Snavely, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+bispecific+antibodies%3A+The+selection+of+stable+single-chain+fragments+to+overcome+engineering+obstacles%5BTitle%5D)+AND+%22IDrugs%22%5BJournal%5D)">Therapeutic bispecific antibodies: The selection of stable single-chain fragments to overcome engineering obstacles.</a> IDrugs. 13 (8), 543-549 (2010).</li>
<li>Rothlisberger, D., Honegger, A., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+interactions+in+the+Fab+fragment%3A+a+comparative+evaluation+of+the+single-chain+Fv+and+Fab+format+engineered+with+variable+domains+of+different+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Domain interactions in the Fab fragment: a comparative evaluation of the single-chain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability.</a> Journal of Molecular Biology. 347 (4), 773-789 (2005).</li>
<li>Kijanka, M., Dorresteijn, B., Oliveira, S., van Bergen en Henegouwen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobody-based+cancer+therapy+of+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Nanobody-based cancer therapy of solid tumors.</a> Nanomedicine (London). 10 (1), 161-174 (2015).</li>
<li>Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+antigens+by+single-domain+antibody+fragments%3A+the+superfluous+luxury+of+paired+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).</li>
<li>Gonzalez-Sapienza, G., Rossotti, M. A., Tabares-da Rosa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Domain+Antibodies+As+Versatile+Affinity+Reagents+for+Analytical+and+Diagnostic+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single-Domain Antibodies As Versatile Affinity Reagents for Analytical and Diagnostic Applications.</a> Frontiers in Immunology. 8, 977(2017).</li>
<li>Fernandes, C. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Camelid+Single-Domain+Antibodies+As+an+Alternative+to+Overcome+Challenges+Related+to+the+Prevention%2C+Detection%2C+and+Control+of+Neglected+Tropical+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Camelid Single-Domain Antibodies As an Alternative to Overcome Challenges Related to the Prevention, Detection, and Control of Neglected Tropical Diseases.</a> Frontiers in Immunology. 8, 653(2017).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+bispecific+antibody%2C+S-Fab%2C+induces+potent+cancer+cell+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">A novel bispecific antibody, S-Fab, induces potent cancer cell killing.</a> Journal of Immunotherapy. 38 (9), 350-356 (2015).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-domain+antibody-linked+Fab+bispecific+antibody+Her2-S-Fab+has+potent+cytotoxicity+against+Her2-expressing+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22AMB+Express%22%5BJournal%5D)">A single-domain antibody-linked Fab bispecific antibody Her2-S-Fab has potent cytotoxicity against Her2-expressing tumor cells.</a> AMB Express. 6 (1), 32(2016).</li>
<li>Nakano, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-glypican+3+antibodies+cause+ADCC+against+human+hepatocellular+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (2), 279-284 (2009).</li>
<li>Behar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+anti-FcgammaRIII+%28CD16%29+llama+single-domain+antibodies+that+activate+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering%2C+Design%2C+and+Selection%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of anti-FcgammaRIII (CD16) llama single-domain antibodies that activate natural killer cells.</a> Protein Engineering, Design, and Selection. 21 (1), 1-10 (2008).</li>
<li>Baral, T. N., Arbabi-Ghahroudi, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22886257">Expression of single-domain antibodies in bacterial systems.</a> Methods in Molecular Biology. 911, 257-275 (2012).</li>
<li>Arbabi-Ghahroudi, M., Tanha, J., MacKenzie, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16408159">Prokaryotic expression of antibodies.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 24 (4), 501-519 (2005).</li>
<li>Spiess, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+antibodies+with+natural+architecture+produced+by+co-culture+of+bacteria+expressing+two+distinct+half-antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies.</a> Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).</li>
<li>Filmus, J., Selleck, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glypicans%3A+proteoglycans+with+a+surprise%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Glypicans: proteoglycans with a surprise.</a> Journal of Clinical Investigation. 108 (4), 497-501 (2001).</li>
<li>Baumhoer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glypican+3+expression+in+human+nonneoplastic%2C+preneoplastic%2C+and+neoplastic+tissues%3A+a+tissue+microarray+analysis+of+4%2C387+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples.</a> American Journal of Clinical Pathology. 129 (6), 899-906 (2008).</li>
<li>Llovet, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+signature+to+discriminate+dysplastic+nodules+from+early+hepatocellular+carcinoma+in+HCV+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis.</a> Gastroenterology. 131 (6), 1758-1767 (2006).</li>
<li>Zhu, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+glypican-3+expression+differentiates+the+majority+of+hepatocellular+carcinomas+from+benign+hepatic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders.</a> Gut. 48 (4), 558-564 (2001).</li>
<li>Hsu, H. C., Cheng, W., Lai, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+a+developmentally+regulated+transcript+MXR7+in+hepatocellular+carcinoma%3A+biological+significance+and+temporospatial+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution.</a> Cancer Research. 57 (22), 5179-5184 (1997).</li>
<li>Flaherty, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonclinical+evaluation+of+GMA161--an+antihuman+CD16+%28FcgammaRIII%29+monoclonal+antibody+for+treatment+of+autoimmune+disorders+in+CD16+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nonclinical evaluation of GMA161--an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice.</a> Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).</li>
<li>Sharma, R., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+phenotypic+and+functional+features+of+NK+cells+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Research%22%5BJournal%5D)">Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans.</a> Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).</li>
<li>Li, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+CD16a%2C+the+surface+receptor+of+Kupffer+cells%2C+on+the+growth+of+hepatocellular+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells.</a> International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).</li>
<li>Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li>
<li>Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pouring+and+running+a+protein+gel+by+reusing+commercial+cassettes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li>
<li>Feng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutically+targeting+glypican-3+via+a+conformation-specific+single-domain+antibody+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Bu çalışmada, biz bsAbs, yeni bir biçim oluşturmak için bir strateji mevcut GPC3-S-hangi GPC3 pozitif tümör hücreleri hedefleme NK hücreleri askere Fab. S-Fab üzerinde doğal Fab dayalı bir anti-CD16 VHH11,12ekleyerek biçimi. BsAbs içeren Fc bölge ile karşılaştırıldığında, GPC3-S-Fab kolayca bakteri büyük ölçüde periplasm olarak üretilmektedir.
İletişim kuralında tanımlanan ifade ve arıtma stratejisi kullanarak, bir çözünür ve fonksiyon...

Monoklonal antikor şimdi geniş kanser tedavi1için kullanılır. Antikorlar esneklik nedeniyle çeşitli antikor tabanlı biçimler aktif olarak keşfedilmeyi. Monoklonal antikorlar ile karşılaştırıldığında, bsAbs iki farklı hedefler aynı anda ve verimli bir şekilde hedef ve tümör hücreleri2öldürmek için bağışıklık efektör hücreleri alımı tetiklemek tanımasını sağlayarak iki farklı antijen bağlayıcı modülleri var.
Geçerli rekombinant bsAb biçimleri genellikle iki sınıf için atanmış: Fc içeren bsAbs ve bsAbs bir Fc bölge olmadan. Çoğunlukla memeli hücrelerinde üretilir Fc içeren biçimleri ile karşılaştırıldığında, bsAbs olmadan bir Fc bölge daha küçük boyutları, avantajları daha kolay mikroorganizma ifade sistemlerinde üretilen ve tümör doku daha verimli bir şekilde nüfuz 3.
bsAbs bir Fc bölge olmadan genellikle tek-zinciri değişken parçaları (scFvs) veya Fabs3gibi bireysel bağlama moieties bağlayarak meydana gelir. Olmadan teskin etki, scFv parçaları genellikle dayalı bsAbs termal kararlılık, düşük çözünürlük veya toplama4,5için artan bir potansiyel tehlikeye. Buna ek olarak, Fab-esaslı bsAbs CH1 ve CL heterodimerization yerli Fab yan4,6' nedeniyle daha istikrarlı.
Değişken etki alanından ağır zinciri yalnızca antikorlar (VHHs, tek etki alanı antikor da bilinir) doğal ağır zincir antikorlar7aktif antijen bağlayıcı parçası vardır. VHHs yüksek afinite özellikleri, geleneksel IgGs8, düşük immünojenisite ve yüksek verim özgüllük bakteriyel ifade9' var. FV parçaları ile karşılaştırıldığında, VHHs daha yüksek termal kararlılık10var. Fab moieties ile karşılaştırıldığında, VHHs daha küçük boyutları nedeniyle CH1 ve CL eksikliği var. Böylece, S-Fab, Fab bir tek etki alanı antikor, VHH, ile bağlantı kurarak elde bsAb biçiminde tasarlanmış ve onun anti-tümör etkisi11,12için okudu.
Bu çalışmada, GPC3-S-Fab inşaatı hGC3313 ile bir anti-CD16a VHH14 Fab bağlama tarafından tanımlanmıştır. GPC3-S-Fab, verimli bir şekilde periplasmic ifade Escherichia coli (e.coli)içinde üretilmektedir. GPC3-S-Fab fonksiyonel çalışmaları GPC3-S-Fab karaciğer kanseri tedavisi için umut verici bir strateji olduğunu düşündürmektedir. Böylece, GPC3-S-Fab avantajları alternatif teknikleri ile ilgili başvuruları önceki çalışmalarda kolay üretim ve arıtma ve daha istikrarlı bsAbs içerir.
Memeli ifade ve prokaryotik ifade sistemler BsAbs çeşitli biçimlerde ifade etmek için kullanılmaktadır. Memeli ifade sistemleri, E. coliaksine-tabanlı protein ifade sistemlerine sahip pek çok faydaları, yüksek verim, düşük maliyetli ve emek tasarrufu, genetik manipülasyon ve yüksek dönüşüm verimliliği15kolaylığı dahil olmak üzere. E. colibsAbs ifade için iki temel strateji vardır: sitoplazma ve sitoplazma ve dış hücre zarlarında15arasında periplasm ifadede ifade. Sitoplazma azaltarak çevreye, periplasm bir daha oksitleyici doğru katlanır teşvik çevre ve proteinler16ortak ifade karşılaştırılır. Doğru katlanır çözünürlük, istikrar ve işlev bsAbs üretiminde önemli bir rol oynar. Bu nedenle, bir sinyal sıra pelB periplasm için salgılanmasını E. coli17yönlendirmek için S Fab N-terminus eklendi. Emin olmak için doğru katlanır, çözünürlük, termal kararlılık ve konformasyon istikrar, karmaşıklığı ve bir antikor boyutunu azaltarak sık16istihdam. S-Fab biçimi bir Fab ve bakteriyel sistemlerinde basit yapısı ve küçük boyutu nedeniyle büyük olasılıkla çok iyi ifade edilen bir VHH oluşur.
GPC3 bu GPC3-S-Fab bispecific antikor biçimde seçildi. Glypican-3 (GPC3) ile glycosylphosphatidylinositol (GPI)18hücre yüzeyine demirli heparin sülfat (HS) proteoglikan ailesinin bir üyesidir. GPC3 karaciğer kanserleri19,20,21,22çoğunluğu için hangi hesabı % 70 hepatosellüler karsinom (HCC) olguların overexpressed. GPC3 nadiren normal dokulara ifade edilir çünkü GPC3 HCC için potansiyel bir hedef teklif edildi. Birden çok fare mAbs GPC3 karşı üretilen. Ancak, sadece GC33 sınırlı anti-tümör faaliyet 22sergiledi ve bu hastalarda klinik etkinlik sergilemek için başarısız oldu. Bu çalışmada, GPC3-S-Fab NK hücreleri GPC3 tümör hücreleri14öldürmek için recruit edebilmek için gösterildi.
NK hücreleri toplamak için anti-CD16 VHH kullanıldı. CD16a esas olarak doğal öldürücü (NK) hücreler, makrofajlar, monosit ve bazı alt türlerinden T hücrelerinin üzerinde ifade bir düşük benzeşme IgG reseptör var. NK hücreleri23tarafından antikor bağımlı hücre sitotoksisite (CCDA) ilgilenmektedir. İnsan NK hücreleri iki türe, CD56 kategorize - CD16 + ve CD56 + CD16-. CD56 + CD16− NK hücreleri, CD56 aksine-CD16 + NK hücreleri serbest bırakmak daha yüksek düzeyde perforin ve granzyme B ve böylece güçlü sitotoksisite24mevcut. CD16a, ifade Kupffer hücreleri (KCs), karaciğerde ikamet makrofajlar vardır. Kupffer hücreleri karaciğer kanseri25bastırılması içinde önemli bir rol oynamaktadır. Böylece, CD16a hedefleme bsAbs T hücrelerinin karaciğer kanserine karşı ilgi çekici daha bir daha umut verici strateji olabilir.

<table><tbody><tr><td>Çalkalama kuluçka makinesi</td><td>Thermo Fisher</td><td>MAXQ 4000</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalama kuluçka makinesi</td><td>Zhicheng</td><td>ZWYR-D2402</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Cence</td><td>GL-10MD</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Beckman coulter</td><td>Avanti j-26S XPI</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Ultraviyole spektrofotometre</td><td>Thermo Fisher</td><td>Nanodrop</td><td></td></tr><tr><td>Analitik poliakrilamid jel elektroforez cihazı</td><td>Mini-PROTEAN&reg; Tetra</td><td>Bio-rad</td><td></td></tr><tr><td>Trans-blot aparatı</td><td>Kriter</td><td>Bio-rad</td><td></td></tr><tr><td>Görüntüleme sistemi</td><td>Bio-rad</td><td>chemidoc tm XRS+</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Protein Sıvı kromatogramı</td><td>GE Healthcare</td><td>AKTA avant</td><td></td></tr><tr><td>GF sütunu</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9909-44 Superdex 200 Artış 10/300 GL</td><td></td></tr><tr><td>Akış Sitometresi</td><td>Beckman Coulter</td><td>FC500</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>eppendorf</td><td>5702R</td><td></td></tr><tr><td>Envision plaka okuyucu</td><td>TECAN</td><td>Infinite F50</td><td></td></tr><tr><td>Anti His-tag</td><td>eBioscience</td><td>14-6657-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-Bayrak etiketi</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan(H & L)-488</td><td>A11013</td><td>İnvitrojen</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare IgG HRP'ye bağlı antikor</td><td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA-Agaroz</td><td>Tribioscience</td><td>TBS9202-100</td><td></td></tr><tr><td>IgG-CH1 afinite reçinesi</td><td>Thermo Fisher</td><td>194320005</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Plaque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>NK hücre zenginleştirme kiti</td><td>Kök Hücre</td><td>19055</td><td></td></tr><tr><td>Mıknatıs</td><td>Kök Hücre</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>CCK8 kiti</td><td>Dojindo</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11995500CP</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>C11875500CP</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Gibco</td><td>15050-057</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>Standart işaretleyici</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MWGF200</td><td>Jel filtrasyonu</td></tr><tr><td>İzopropil-BD-tiyo-galaktopiranosid (IPTG)</td> <td>VWR kimyasalları</td><td>VWRC0487-100G</td><td></td></tr><tr><td>Diyaliz tüpü</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0655-100FT</td><td></td></tr><tr><td>Knanamycine</td><td>VWR</td><td>VWRC0408-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>VWR</td><td>VWRC0339-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Thermo Fisher</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td>Thermo Fisher</td><td>LP0021B</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100241</td><td></td></tr><tr><td>Trizma tabanı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6791-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900106</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>aladdin</td><td>A110752-500g</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>aladdin</td><td>P112134-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900020</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sangon Biotech</td><td>A505255-0250</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Fosfat, Monobazik Susuz (KH2PO4)</td> <td>VWR</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat, Dibazik, Susuz (Na2HPO4)</td> <td>VWR</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>VWR</td><td>60-24-2</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetil Sülfonil Florür (PMSF)</td><td>VWR</td><td>329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Lizozim</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L6876-25G</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Parlak Mavi R250</td><td>VWR</td><td>VWRC0472-50G</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500922-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini (BSA)</td><td>VWR</td><td>VWRC0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900122</td><td></td></tr><tr><td>100mm x 20mm plastik tabak</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>25cm2 şişe</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu hücre kültürü kümesi</td><td>Corning</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sangon Biyoteknoloji</td><td>A610498-0005</td><td></td></tr><tr><td>CHO</td><td>Çin Bilimler Akademisi Tip Kültürü Koleksiyonu</td><td>GNHa 3</td><td></td></tr><tr><td>MHCC-97H</td><td>Çin Bilimler Akademisi Tip Kültürü Koleksiyonu</td><td>SCSP-528</td><td></td></tr><tr><td>HepG2</td><td>Çin Bilimler Akademisi Tip Kültürü Koleksiyonu</td><td>TCHu 72</td><td></td></tr><tr><td>Huh7</td><td>Çin Bilimler Akademisi Tip Kültürü Koleksiyonu</td><td>TCHu182</td><td></td></tr><tr><td>Hep3B</td><td>Çin Bilimler Akademisi Tip Kültürü Koleksiyonu</td><td>TCHu106</td><td></td></tr><tr><td>NK92</td><td>ATCC</td><td>CRL2408</td><td></td></tr></tbody></table>

gpc3 hedefleme bispecific antikor, gpc3-s-fab, güçlü sitotoksisite

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

Bu iletişim kuralı İnşaat ve bispecific antikor (bsAb), GPC3-S-Fab fonksiyonel çalışmaları açıklanmaktadır. bsAbs iki farklı kolları aracılığıyla iki farklı epitopları tanıyabilir. bsAbs aktif olarak yeteneklerini doğrudan bağışıklık hücreleri tümör hücrelerini öldürmek için recruit için inceledik. Şu anda, bsAbs çoğunluğu rekombinant proteinler, Fc içeren bsAbs olarak veya daha küçük bsAb türevleri Fc bölge olmadan şeklinde üretilmektedir. Bu çalışmada, GPC3-S-Fab, bir antikor parçası (Fab) tabanlı bispecific antikor anti-GPC3 antikor GC33 bir anti-CD16 tek etki alanı antikor ile Fab bağlama tarafından tasarlanmıştır. GPC3-S-Fab Escherichia coli ifade edilen ve iki benzeşme chromatographies tarafından arıtılmış. Saf GPC3-S-Fab özellikle bağlamak ve GPC3 pozitif karaciğer kanseri hücrelerini öldürmek doğal katil hücreler, işe alma tarafından GPC3-S-Fab potansiyel bir uygulama karaciğer kanseri tedavisi öneriyor.

GPC3-S-Fab arıtma
GPC3-S-Fab E. coli bir iki adım benzeşme saflaştırma tarafından ilk Ni-NTA-özel, IgG-CH1 benzeşme arıtma tarafından takip ile saflaştırıldı. İki adım benzeşme arıtma sonra GPC3-S-Fab homojenliği ile 1:1 (Şekil 2A) yakın iki zincir için saflaştırıldı. VH-CH1-CD16 VHH ve VL-CL polipeptitler varlığı onların farklı C-terminal etiketleri tarafından belirlenebil...

Burada, içinde bispecific antikor GPC3-S-Fab üretmek için bir protokol mevcut Escherichia coli. Saf GPC3-S-Fab güçlü sitotoksisite karşı GPC3 pozitif karaciğer kanseri hücreleri vardır.

GPC3 hedefleme Bispecific antikor, GPC3-S-Fab, güçlü sitotoksisite

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

Bu yöntem, bakterilerde bispesifik bir antikorun nasıl üretileceği ve saflaştırılmış antikorun işlevinin nasıl belirleneceği gibi bispesifik antikor alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, GPC3-S-Fab'ın E.coli'den kolayca üretilebilmesi ve saflaştırılabilmesidir. Periplazmik fraksiyonu hazırlamak için, önce hücre süspansiyonunu dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 4.000 g'da santrifüjleyin.Ardından, ortamı dışarı atın ve hücreleri tartın. Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini her bir hücre gramı için dört mililitre buz gibi soğuk sükroz çözeltisi içinde çözün. Hücre süspansiyonunu buz üzerinde 15 dakika inkübe edin.15 dakika sonra, hücre süspansiyonunu dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 8.500 g'da santrifüjleyin. Ardından, sükroz fraksiyonunu içeren süpernatanı pipetleyin ve buz üzerinde saklayın. Hücre peletini buz gibi soğuk beş milimolar magnezyum klorür ve bir milimolar PMSF karışımında yeniden süspanse edin.Daha sonra, hücre süspansiyonuna lizozom stoğunun mililitresi başına 40 mikrolitre 15 miligram ekleyin. Lizozom stoğunu ekledikten sonra, hücre süspansiyonunu 30 dakika buz üzerinde bırakın. Kuluçka süresi bittikten sonra sükroz ve periplazmik fraksiyonları birleştirin.Daha sonra, sükroz-periplazmik fraksiyonu 30.000 g'da dört santigrat derecede 30 dakika santrifüjleyin. Santrifüjleme bittikten sonra, süpernatanı 50 mililitrelik konik bir tüpe buz üzerine aktarın. Daha sonra, homojen bir süspansiyon elde etmek için bir mililitre nikel-NTA agarozu süpernatan ile karıştırın ve yeniden süspanse edin, ardından bir mililitre nikel-NTA agarozu 15 mililitrelik taze bir konik tüpe koyun.Agaroza, dengeleme tamponunun 10 sütun hacmini ekleyin. Daha sonra agarozu 400 g'da beş dakika santrifüjleyin. Santrifüjleme sonrası, süpernatanı dikkatlice çıkarın ve nikel-NTA agarozu sakaroz-periplazmik fraksiyona ekleyin.Ardından, sükroz-periplazmik fraksiyon içeren tüpü iki saat boyunca dört santigrat derecede sallayın. Tekrar karışımı santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı dikkatlice taze buz gibi soğuk bir tüpe çıkarın, çünkü bu bağlanmamış fraksiyondur.Süpernatan aktarıldıktan sonra, yerçekimi sütununa nikel-NTA agarozu ekleyin. Ardından, sütuna üç sütun hacmi elüsyon tamponu ekleyin. Daha sonra, elüatı sırasıyla bir, iki, üç ve dört elüsyon fraksiyonları olarak toplayın.96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda 100 mikrolitrede 5.000 hücreyi seyreltin ve tohumlayın. Takmak için plakayı 37 santigrat derecede altı ila sekiz saat inkübe edin. PBMC'leri hazırlamak için, önce taze hazırlanmış kanı 50 mililitrelik konik bir tüpte eşit hacimde fosfat tamponlu salin ile seyreltin.Yeni 50 mililitrelik konik bir tüpe 15 mililitre lenfosit ayırma ortamı pipetleyin. Daha sonra, seyreltilmiş kanı tüpün duvarları boyunca dikkatlice lenfosit ayırma ortamına aktarın. Hücreleri 400 g'da frenler kapalıyken oda sıcaklığında 35 dakika santrifüjleyin.Santrifüjleme sonrası, üst plazma tabakasını dikkatlice dışarı çekin. Ardından, PBMC'leri içeren beyaz kan tabakasını pipetleyin. Elde edilen bu PBMC'leri, fosfat tamponlu salin hacminin iki katı ile %2 fetal sığır serumu ile seyreltin.Ardından, PBMC süspansiyonunu santrifüjleyin. Hücre peletini %2 fetal sığır serumu içeren fosfat tamponlu salin ve tekrar santrifüj ile yıkayın. Santrifüjlemeden sonra hücre numarasını sayın.Doğal öldürücü hücreleri hazırlamak için, PBMC'leri fosfat tamponlu salin içinde% 2 fetal sığır salini ile sulandırın. Ardından, karışımı polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. PBMC karışımına mililitre başına 50 mikrolitre doğal öldürücü hücre zenginleştirme kokteyli ekleyin.İçeriği karıştırın ve tüpü 10 dakika bekletin. Daha sonra, zenginleştirme kokteylinde bulunan manyetik parçacıkları, parçacıklar eşit şekilde süspanse edilecek şekilde birden çok kez pipetleyerek yeniden süspanse edin ve karıştırın. Ardından, hücre süspansiyonuna mililitre manyetik parçacık başına 100 mikrolitre ekleyin.Hücre süspansiyonu manyetik parçacıklarını karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Beş dakika sonra, hücre süspansiyonuna% 2 fetal sığır serumu ile 2.5 mililitre fosfat tamponlu salin ekleyin. Tüpteki hücreleri karıştırmak için iki ila üç kez hafifçe pipetleyin.Tüpü mıknatısın üzerine yerleştirin ve manyetik boncukların oda sıcaklığında 2,5 dakika oturmasına izin verin. Daha sonra, tek bir hareket hareketiyle, tüpü ters çevirin ve zenginleştirilmiş hücre süspansiyonunu yeni bir tüpe dökün. Yine, hücre sayısını sayın.Sayım bittiğinde, doğal öldürücü hücreleri kültür ortamında seyreltin. Daha sonra, 96 oyuklu bir plakada kaplanmış tümör hücrelerine 100 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Sitotoksisite testlerini ayarlamak için, 96 oyuklu plakaya 10 mikrolitre değişen konsantrasyonlarda GPC3-S-Fab antikoru ekleyin.Ardından, plakayı 72 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Belirlenen inkübasyon süresinden sonra, ortamı aspire edin. Ardından, 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 10 mikrolitre CCK reaktifi içeren 100 mikrolitre DMEM ortamı ekleyin.Yine, plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyon sonrası, CCK8 reaktifinin eklenmesinden dört saat sonrasına kadar plakayı her ardışık saatte bir 450 nanometrede okuyun. GPC3-S-Fab antikoru, iki aşamalı bir afinite saflaştırması kullanılarak saflaştırılır.Burada, iki panel, antikorun sırasıyla nikel-NTA agaroz ve IgG-CH1 afinite saflaştırma kolonları kullanılarak saflaştırıldığını göstermektedir. Daha sonra, GPC3-S-Fab antikorunun bağlanma afinitesi, GPC3 pozitif ve negatif kanser hücre hatları kullanılarak değerlendirilir. GPC3-S-Fab, Hep3B, Huh7, Hep2G ve CHO/GPC3 gibi tüm GPC3 pozitif hücrelere bağlanır.İlginç bir şekilde, MHCC-97H ve CHO gibi GPC3 negatif hücreler kullanıldığında bağlanma gözlenmez veya minimum bağlanma gözlenir. GPC3-S-Fab'ın sitotoksisitesi, taze doğal öldürücü hücrelerle inkübe edilen tümör hücrelerinin varlığında da incelenir. Antikor GPC3-S-Fab, doğal öldürücü hücrelerin varlığında doza bağlı bir şekilde HepG2, Hep3B ve Huh7 yedi hücrelerine karşı güçlü sitotoksisite ortaya çıkarır.Bununla birlikte, MHCC-97H hücreleri üzerinde doğal öldürücü hücrelerin yokluğunda böyle bir sitotoksisite gözlenmez. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa altı saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, adımları buz üzerinde tutmayı unutmamak önemlidir.Bu prosedürü takiben, in vivo tümör etkisi gibi ek soruları yanıtlamak için ksenogreft modelleme gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, bispesifik antikor alanındaki araştırmacıların in vitro antitümör etkilerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, tümör hücrelerini, özellikle NK hücrelerinin izolasyonunu hedef alan fonksiyonel bir bispesifik antikorun nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız.

a-gpc3-targeting-bispecific-antibody-gpc3-s-fab-with-potent

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Belirli hücreleri diğer hücrelere zarar vermeden ortadan kaldırmak, özellikle kurulu dokularda son derece zordur, ancak doku mühendisliği alanında acil bir hücre eliminasyon yöntemine ihtiyaç vardır. Burada, yakın kızılötesi fotoimmünoterapi (NIR-PIT) kullanarak karışık bir 3D hücre kültüründen spesifik hücre eliminasyonu için bir yöntem sunuyoruz.

Bir Yakın Kızılötesi Photoimmunotherapy Tekniği Karışık 3D Kültür seçici hücre Eliminasyon

Sıvı ve katı tümör hücrelerini hedefleyen kimerik antijen reseptör T hücrelerinin gücünü değerlendirmek için kantitatif gerçek zamanlı in vitro sitoz ispat sistemini tanımlıyoruz. Bu protokol diğer bağışıklık etki hücreleri değerlendirmek için uzatılabilir, yanı sıra kombinasyon tedavileri.

Katı ve Hematolojik Kanser Hücrelerini Hedefleyen İmhimik Antijen Reseptör T Hücreleri Için Gerçek Zamanlı Potens Tsay

Bu çalışma, bir pomalidomür bazlı sentez ve karakterizasyon açıklar, yeni bir yaklaşım olarak bir roman yaklaşımı ve E3 Ubiquitin ligaz cereblon (CRBN), thalidomür analogların hedefi bozulması teşvik etmek.

Pomalidomür tabanlı homo-PROTACs tarafından E3 Ubiquitin ligase Cereblon kimyasal Inaktivasyonu

Antijenik peptid ve Fc-III mimetik (DCAF) çift fonksiyonlu bir konjuge gelişimi zararlı antikorların ortadan kaldırılması için yeni bir yeniliktir. Burada, Dang virüsü enfeksiyonu sırasında antikorbağımlı geliştirme etkisini ortadan kaldırmak için seçici olarak 4G2 antikor engelleyebilir DCAF1 molekülünün sentezi için ayrıntılı bir protokol açıklar.

Antijenik Peptid ve Fc-III Mimetics (DCAF) Çift Fonksiyonlu Konjuge tarafından Hedefli Antikor Engelleme

Burada fare tümörü ksenogreft modellerinde antikorların in vivo lokalizasyonunu incelemek için bir protokol sayılmaktadır.

Hedef Antijen Spesifik Terapötik Antikor tümör ve doku dağılımının analizi

Burada, T hücresi ile ilgilenen bispesifik antikorların anti-tümör etkinliğini ve mekanizmasını değerlendirmek için yapılan çalışmalarda, bispesifik antikor kaynaklı T hücresi kaçakçılığının tümörlere in vivo izlenmesini kolaylaştırmak için insan T hücrelerini lusiferaz ile dönüştürmek için bir yöntem tanımlanmıştır.

Luciferaz Dönüştürülmüş İnsan T Hücrelerini Kullanarak Bispesifik Antikor Kaynaklı T Hücresi Kaçakçılığını İzleme

Bu protokol, terapötik bir anti-HER-2 antikoru varlığında doğal öldürücü hücre aracılı meme kanseri hücresi öldürmeyi modüle eden bileşikleri tanımlamak için otomatik, görüntü tabanlı yüksek verimli bir teknik sunar.

Antikor Bağımlı Hücresel Sitotoksisiteyi Modifiye Eden Bileşiklerin Tanımlanması için Yüksek İçerikli Tarama Testi

Burada, antitümör antikorların önemli bir kanser hücresi öldürme mekanizması olan ADCC mekanizmasını modüle eden bileşikleri tanımlamak için bir yöntem sunuyoruz. NK hücrelerinin sitotoksik etkisi, Trastuzumab varlığında meme kanseri hücre sferoidlerinde ölçülür. Görüntü analizi, sferoidlerdeki canlı ve ölü öldürücü ve hedef hücreleri tanımlar.

Bir Tümör Sferoid Modelinde Antikora Bağımlı Hücresel Sitotoksisitenin Ölçülmesi: İlaç Keşfi Uygulaması

Burada, insan iPSC'den türetilmiş kimerik antijen reseptörü (CAR) eksprese eden doğal öldürücü hücreleri çeşitli malignitelere karşı daha iyi öldürme ile ayırt etmek ve genişletmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu protokol, doğal öldürücü (NK) optimize edilmiş iPSC'den türetilmiş CAR-NK hücrelerinin farklılaşmasını ve genişlemesini ve çeşitli tümör hücre hatlarına karşı antitümör aktivitesinin ölçümünü gösterir.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kimerik Antijen Reseptörü İfade Eden Doğal Öldürücü Hücrelerdeki Gelişmeler

Burada, tek hücre düzeyinde hücre öldürmeyi incelemek için bir T hücresini ve bir kanser hedef hücresini kapsülleyen çift emülsiyon damlacıkları oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, büyük bir T hücresi popülasyonu içinde hem sitotoksik moleküllerin hem de hedef hücre apoptozunun ikili miktar tayinine izin verir.

Kimerik Antijen Reseptörü T hücrelerini Tek Hücre Düzeyinde Değerlendirmek için Damlacık Bazlı Sitotoksisite Testi

Öğrenin, GPC3-S-Fab bispecific antikorunun E. coli'de üretim ve saflaştırma protokolünü. Bu yöntem, GPC3 pozitif karaciğer kanseri hücrelerine karşı güçlü sitotoksisite etkisini değerlendirmeyi sağlar.

GPC3 hedefleme Bispecific antikor, GPC3-S-Fab, güçlü sitotoksisite

Daha fazla video keşfet