Bütün Dağı ayirt ve kültürlü fare yumurtalıklarda folikül miktar

Bu prosedürün genel amacı, otomatik folikül kantitasyonu ile uyumlu kültürlenmiş tüm yumurtalıkların görüntülerini elde etmektir. Bu yöntem, üreme biyolojisi alanında, farklı koşulların yumurtalık zindeliğine nasıl müdahale ettiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, daha az emek yoğun olması ve organın üç boyutlu mimarisini korumasıdır.

Bu yöntem, doğum sonrası beşinci günde kültürlenmiş fare yumurtalıkları için optimize edilmiş olsa da, embriyonik gonadlar veya genç fareler testisleri gibi diğer yaşlara ve dokulara da uygulanabilir. Temiz bir çalışma yüzeyi ile başlayın. Yüzde on çamaşır suyu ile silin ve ağartıcının çalışma alanı yüzeyinde en az beş dakika kalmasına izin verin.

Beş dakika sonra, fazla ağartıcıyı temiz kağıt havlu ve yüzde 70 etanol ile çıkarın. Diseksiyon mikroskobunu yüzde 70 etanol ile iyice temizleyin ve sahneye kuru bir kağıt havlu yerleştirin. Temiz forseps ve makasları yüzde 70 etanol ile nemlendirilmiş bir kağıt havluyla sarın.

Daha sonra konik bir tüpte 50 mililitre yumurtalık kültürü ortamı yapın ve 37 santigrat derece su banyosunda ısıtın. Ortam ısındıktan sonra, önce 35 milimetre doku kültürü plakalarına bir mililitre yumurtalık kültürü ortamı ekleyerek plakaları ve ekleri hazırlayın. Daha sonra, 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının oyuklarına yaklaşık 0,55 mililitre besiyeri ekleyin ve her bir oyuklu besiyerine bir ek yerleştirin.

Membranların ortama temas ettiğinden emin olun. 35 milimetre plakaları ve 24 oyuklu taşıyıcı plakayı 37 santigrat derece, yüzde beş karbondioksit ve atmosferik oksijen inkübatörüne yerleştirin. Ardından diseksiyon dürbününün yanına bir sıcak plaka yerleştirin ve sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın.

Doku kültürü inkübatörü diseksiyon alanına yakın değilse, yumurtalık kültürü ortamı içeren 35 milimetrelik doku kültürü kaplarından birini sıcak plakaya yerleştirin. Daha sonra taze ötenazi yapılmış kadına yüzde 70 etanol püskürterek diseksiyona başlayın ve diseksiyon mikroskobu altında kuru kağıt havlunun üzerine yerleştirin. Karın boşluğunda bir kesi yaptıktan sonra, bağırsakları çıkarın ve yumurtalıkları bulun.

Yumurtalıkları çıkarın ve 35 milimetrelik kabın içindeki kültür ortamına yerleştirin. Yumurtalıklar diseke edildikten sonra, yumurtalıkları ve bağlı dokuları daha iyi görselleştirmek için diseksiyon mikroskobunun büyütmesini artırın. Temiz ince uçlu forsepsler ile yumurtalıklara zarar vermeden bursa ve yağ dokusu gibi yumurtalık dışı tüm dokuları çıkarın.

Daha sonra, her bir yumurtalık çiftini önceden ıslatılmış bir hücre kültürü ekine yerleştirin ve organı tamamen suya batırmadan nemli tutmanın yeterli olduğundan emin olmak için ortamın hacmini ayarlayın. Ekilen organları 37 santigrat derece, yüzde beş karbondioksit ve atmosferik oksijen inkübatörüne yerleştirin. İstenen deneysel zaman noktasında, yumurtalık kültür ortamını plakadan çıkarın ve dokuyu taze hazırlanmış yüzde dört PFA çözeltisi ile kaplayarak kültürlenmiş yumurtalıkları ek parçaya sabitleyin.

Buharlaşmayı önlemek için plakanın kenarlarını parafin filmle kapatın ve numuneleri gece boyunca dört santigrat dereceye yerleştirin. Dokuyu yüzde 70 etanol ile üç kez durulayın. Daha sonra, daha fazla işleme tabi tutuluncaya kadar dört santigrat derecede yüzde 70 etanol ile doldurulmuş sintilasyon şişelerinde saklayın.

Yüzde 70 etanolü şişelerden çıkararak ve sabit dokuyu PBS ile oda sıcaklığında en az dört saat çalkalayarak yıkayarak boyamaya başlayın. PBS'yi çıkardıktan sonra, yumurtalıkları tamamen batırmak için yeterli geçirgenlik çözeltisi ekleyin. Bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında dört saat inkübe edin.

Geçirgenlik solüsyonunu, yumurtalıkları tamamen batırmak için yeterli engelleme solüsyonu ile değiştirin. Daha sonra kapalı şişeleri oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcı üzerinde en az 12 saat inkübe edin. Bloke ettikten sonra, ekleri 24 oyuklu bir plakaya yerleştirin ve yumurtalıkların tamamen suya batırıldığından emin olmak için yaklaşık 750 mikrolitre birincil antikor çözeltisi ekleyin.

Daha sonra kapalı plakayı orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında dört gün boyunca inkübe edin. Dört gün sonra, birincil antikoru çıkarın ve bol miktarda yıkama solüsyonu ekleyin. Yumurtalıkları gece boyunca yıkayın.

Ertesi gün, taze yıkama solüsyonu ile değiştirin ve orbital çalkalayıcı üzerinde iki saat veya daha fazla inkübe edin. Yıkamalardan sonra ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Numuneleri ışıktan koruyun ve iki gün boyunca oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.

İki gün sonra, ikincil antikor çözeltisini numunelerden çıkarın ve yıkama çözeltisi ekleyin. ScaleS0 temizleme çözümünü hazırlayarak başlayın. Çözeltiyi ters çevirerek karıştırın ve 50 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

ScaleS0 temizleme solüsyonunun gazını alın. Daha sonra yıkama solüsyonunu immün yolla boyanmış yumurtalıklardan çıkarın. Temizleme solüsyonunu ekleyin.

Plakayı alüminyum folyo ile örtün ve orbital çalkalayıcıya geri koyun. Lekelenme ve temizleme aşamalarında sabırlı olmak son derece önemlidir. Doku şeffaf hale geldiğinde, kültürlenmiş yumurtalıkları içeren ek zarları dikkatlice çıkarmak için ince uçlu bir neşter kullanın.

Numuneyi bir cam slayt üzerine yerleştirin ve numuneyi bir lamel ile nazikçe kapatın. Ardından, numuneleri optik kesit alabilen bir mikroskopta görüntülemeye devam edin. Bu görüntü, temizlenmemiş doğum sonrası beşinci gün yumurtalığını göstermektedir.

Burada, yumurtalık, temizleme çözeltisinin eklenmesinden bir saat sonra gösterilir. Yumurtalık, temizleme çözeltisine daldırıldıktan birkaç dakika sonra yarı saydam hale gelmeye başlayacaktır. Kültürlenmiş yumurtalıkların temizlenmeden optik olarak kesilmesi mümkündür, ancak dokunun derinliklerindeki hücreler, arka plandan ayırt edilmesi zor bir sinyale sahiptir ve bu da uygun oosit miktarını engeller.

Buna karşılık, bu temsili görüntü, tüm organ boyunca oosit nicelemesinin mümkün olduğu temizlenmiş bir örneği göstermektedir. Bu prosedürü denerken, antikorların doku boyunca yayılması gerektiğini hatırlamak önemlidir; Bu nedenle, daha kalın dokular daha uzun kuluçka süresi gerektirecektir. Bu videoyu izledikten sonra, tüm yumurtalıkların nasıl kültürleneceğini, boyanacağını ve görüntüleneceğini iyi anlamış olmalısınız.

Metin, basit folikül ölçümü için kullanılabilecek ücretsiz bir yazılım olan Fiji ImageJ'in kullanımını açıklamaktadır. Paraformaldehit ve sodyum azid ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken çeker ocak ve kişisel koruyucu ekipman kullanımı gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.