Name: Tek hücreli genom sıralama için bir üretilen iş Ultrahigh mikrosıvısal Platform (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Öğrenin, mikroakışkan cihazlar kullanarak on binlerce tek hücrenin barkodlu genomik dizileme verilerini nasıl üreteceğinizi. Bu yüksek verimli yöntem, genomik heterojeniteyi koruyarak hücreleri tek tek kapsüller ve barkodlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser bir kariyer Ödülü (grant numarası DBI-1253293); aracılığıyla Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) (grant numaraları HG007233-01, R01-EB019453-01, 1R21HG007233, DP2-AR068129-01, R01-HG008978); ve Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı yaşayan dökümhaneler Program (sözleşme numaralarını HR0011-12-C-0065, N66001-12-C-4211, HR0011-12-C-0066).

<ol><li>Navin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+evolution+inferred+by+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.</a> Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).</li>
<li>Ni, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+copy+number+variation+patterns+among+single+circulating+tumor+cells+of+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21083-21088 (2013).</li>
<li>Schmidt, H., Hensel, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14726454">Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 17, 14-56 (2004).</li>
<li>Martínez, J. L., Baquero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+among+strategies+associated+with+bacterial+infection%3A+pathogenicity+epidemicity%2C+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Interactions among strategies associated with bacterial infection: pathogenicity epidemicity, and antibiotic resistance.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 647-679 (2002).</li>
<li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+genomes+from+uncultivated+environmental+microorganisms+using+FACS-based+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics.</a> Nature Protocols. 9 (5), 1038-1048 (2014).</li>
<li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+phylogeny+and+coding+potential+of+microbial+dark+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter.</a> Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).</li>
<li>Zhang, H., Liu, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tweezers+for+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Optical tweezers for single cells.</a> Journal of the Royal Society Interface. 5 (24), 671-690 (2008).</li>
<li>Xu, L., Brito, I. L., Alm, E. J., Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+microfluidics+for+digital+quantification+and+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Virtual microfluidics for digital quantification and single-cell sequencing.</a> Nature Methods. 13 (9), 759-762 (2016).</li>
<li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+clonal+origins+of+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia+by+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dissecting the clonal origins of childhood acute lymphoblastic leukemia by single-cell genomics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17947-17952 (2014).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-cell+labeling+%28Hi-SCL%29+for+RNA-Seq+using+drop-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-cell labeling (Hi-SCL) for RNA-Seq using drop-based microfluidics.</a> PLoS One. 10 (5), 1-14 (2015).</li>
<li>Amini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haplotype-resolved+whole-genome+sequencing+by+contiguity-preserving+transposition+and+combinatorial+indexing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Haplotype-resolved whole-genome sequencing by contiguity-preserving transposition and combinatorial indexing.</a> Nature Reviews Genetics. 46 (12), 1343-1349 (2014).</li>
<li>Zheng, G. X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haplotyping+germline+and+cancer+genomes+with+high-throughput+linked-read+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Haplotyping germline and cancer genomes with high-throughput linked-read sequencing.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 303-311 (2016).</li>
<li>Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+massively+parallel+single-molecule+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing.</a> Nature Communications. 7, 11784(2016).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Lan, F., Demaree, B., Ahmed, N., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genome+sequencing+at+ultra-high-throughput+with+microfluidic+droplet+barcoding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell genome sequencing at ultra-high-throughput with microfluidic droplet barcoding.</a> Nature Biotechnology. 35 (7), 640-646 (2017).</li>
<li>Novak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiplex+gene+detection+and+sequencing+with+microfluidically+generated+agarose+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+Internation+Edition%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiplex gene detection and sequencing with microfluidically generated agarose emulsions.</a> Angewandte Chemie Internation Edition. 50 (2), 390-395 (2011).</li>
<li>Gill, C., Van De Wijgert, J. H. H. M., Blow, F., Darby, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+lysis+methods+for+the+extraction+of+bacterial+DNA+for+analysis+of+the+vaginal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of lysis methods for the extraction of bacterial DNA for analysis of the vaginal microbiota.</a> PLoS One. 11 (9), 1-16 (2016).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn5+transposase+and+tagmentation+procedures+for+massively+scaled+sequencing+projects%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects.</a> Genome Research. 24 (12), 2033-2040 (2014).</li>
<li>Abate, A. R., Chen, C. H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beating+Poisson+encapsulation+statistics+using+close-packed+ordering%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering.</a> Lab on a Chip. 9 (18), 2628(2009).</li>
<li>Jain, A., Yang, A. H. J., Erickson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-based+optical+waveguides+with+live+cell+encapsulation+and+integrated+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Optic+Letters%22%5BJournal%5D)">Gel-based optical waveguides with live cell encapsulation and integrated microfluidics.</a> Optic Letters. 37 (9), 1472(2012).</li>
<li>Karbaschi, M., Shahi, P., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+chemical-free+breaking+of+microfluidic+emulsions+with+a+hand-held+antistatic+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Rapid chemical-free breaking of microfluidic emulsions with a hand-held antistatic gun.</a> Biomicrofluidics. 11 (4), 1-6 (2017).</li>
<li>Gole, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+polymerase+cloning+and+genome+sequencing+of+single+cells+using+nanoliter+microwells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells.</a> Nature Biotechnology. 31 (12), 1126-1132 (2013).</li>
<li>Chao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+analysis+reveals+significant+changes+of+microbial+compositions+and+protective+functions+during+drinking+water+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Metagenomic analysis reveals significant changes of microbial compositions and protective functions during drinking water treatment.</a> Scientific Reports. 3 (1), 3550(2013).</li>
<li>Fierer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-biome+metagenomic+analyses+of+soil+microbial+communities+and+their+functional+attributes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), 21390-21395 (2012).</li>
<li>Mande, S. S., Mohammed, M. H., Ghosh, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+metagenomic+sequences%3A+methods+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Classification of metagenomic sequences: methods and challenges.</a> Briefings in Bioinformatics. 13 (6), 669-681 (2012).</li>
<li>Eastburn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+droplet+enrichment+for+targeted+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Microfluidic droplet enrichment for targeted sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 43 (13), e86(2015).</li>
<li>Clark, I. C., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+helix+in+a+haystack%3A+nucleic+acid+cytometry+with+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Finding a helix in a haystack: nucleic acid cytometry with droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 17 (12), 2032-2045 (2017).</li>
</ol>

Bu iş akışı ile ilgili patent olabilir misyonu biyo için hangi Adam R. Abate lisanslı bir hissedar olduğunu.

SIC seq mikrosıvısal iş akışı binlerce bakteri hücreleri tek hücre genomu sıralama veri üretir. Dijital barkod microgel kapsüllenmiş hücrelerin genleri spliced NGS veri silico deconvolution içine aynı hücreden kaynaklanan barkodlu okuma grupları için izin verir. Bilinen bileşimi gibi bir mikrobiyal topluluğu ile bir denetim deneme barkod grupları saflığı değerlendirmek için gereklidir. Yüksek saflıkta gruplar büyük bir kısmı hücre sarma hızı çok yüksekse veya önemli damlacık çapraz bulaşma mikrosıvısal işlem adımları sırasında meydana gelen gösterir. Poisson istatistiklere göre barkod ve hücreleri 1 parçacık oranı tüm boş olmayan damlacıklar % 5'den az birden fazla kapsülleme olayların sınırlamak her 10 damla için hedef oranında kapsüllü. Kapsülleme oranı doğrulama dropmaking işlemi sırasında kritik önemini bu yüzden bundan daha yüksek bir kapsülleme oranı katlanarak, birini oranda artırır. Farklı hücrelerdeki aynı barkod sıra paylaşımı okuma bioinformatically ayrılmış olamaz, çünkü kullanıcılar birden çok hücreyi tek bir microgel kapsüllemenin özellikle dikkatli olmanız gerekir. Durumda 1 hücre 2 farklı barkod alır, bereket ölçümleri barkod sırası tarafından sayarken etkiye sahip olsa da barkod grup saflık etkilenmez.
Damlacık çapraz bulaşma da suboptimal birleşme koşulları nedeniyle ortaya çıkabilir. Başarılı bir operasyon sırasında mikrosıvısal birleşme aygıt (Şekil 5) controllably 1 microgel ile 1 barkod damlacık ve PCR reaktif hacmi eşleştirebilirsiniz. Sigara-mükemmel akış oranları yanlış oranlarıyla eşleştirme damlacık neden olacaktır: 1 barkod 2 microgels ile örneğin eşleştirilmiş. Protokol listelenen tüm akış oranları tahminleri olması amaçlanmıştır ve aygıt geometri ve damlacık boyutlarda küçük farklılıklar bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. Fotoğraf makinesi ile yüksek hızlı kayıt yeteneklere erişimi olan kullanıcılar (> 10.000 kare/s) doğru damlacık birleşme başında ve mikrosıvısal işlemi boyunca doğrulamanız gerekir. Bir yüksek hızlı kamera erişimi olmayan kullanıcılar birleştirilmiş çıktı küçük bir hacim toplamak ve el ile mikroskop altında damlacık boyutları ölçmek. Damlacık boyutu düzgün olmalıdır: reinjection gore buna göre azaltılacak birleştirilmemiş barkodlar veya microgel damla bir fazlalığı gösterir.
Kendi bütünlüğünü korumak için microgels ve microdroplets ele alırken birkaç genel önlemler alınmalıdır. Microgels, mekanik olarak sağlam olsa da, yeterince kırma ve tam jelleşme sağlamak için gereken adımları yıkama önce soğutmalı gerekir. Sigara küresel microgels özel değildi bir gösterge vardır kuvvetlendirmek için yeterli zaman verilirse. Microgels yıkarken, süspansiyonlar ürün kayıplarını önlemek için gerekli hızlarda spin aşağı. Özel hidrojel su yakından eşleşen bir kırılma indisi vardır ve kullanıcılar dikkatli aspirasyon öncesinde jel sıvı sınır belirlemek gerekir bu yüzden tüp22içinde görmek zor olabilir. Petrol su damlacıkları birleştirme tarafından statik kuvvetleri23 laboratuvar eldiven ve boru birikmesi yatkındır. Bu nedenle, damlacık reinjection şırınga çıplak elle yükleme ve pompa priming önce bir anti-statik silahla reinjection çizgilerin tedavisinde önerilir. Büyük birleştiler damlacıkları yavaş yavaş şırınga emülsiyonlar döner ve el ile onların büyük batmaz kuvvet nedeniyle üst biriktikçe daha büyük damla aspirating tarafından kaldırılabilir.
SiC-seq olduğunu, tek hücreli genom sıralama göstermek için ilk teknoloji > 50.000 bakteri hücreleri. Bu platform varolan yaklaşımlar içinde üretilen iş önemli avantaj sunar ve türdeş olmayan mikrobiyal topluluklar daha derin bir örnekleme sağlar. Bugüne kadar mikrosıvısal teknolojileri tek hücreli genom sıralama için microchambers9 ve microwells24 hücre izolasyon ve güçlendirme için ama sadece onlarca yüzlerce hücre aralığındaki throughputs ile istihdam. Akış tek hücreleri wellplates5,6 ' sıralama hiçbir özel mikrosıvısal araçları gerektirir ama aynı şekilde düşük bir üretilen iş sahip. Verilen bu çevreden toprak ve su örnekleri sık, Alfa farklılıkların var > 1.000 türler, seviye25,26, SIC seq organizmalar çok daha fazla sayıda örnek için onun yetenek sayesinde son derece avantajlı. SIC seq iş akışı laboratuvar kültür, doğal çevre, ya da bir yaşam ana hücre girişleri için uyarlanabilir kaynaklanıyor. Bir hücre örneği yalnızca bir sulu süspansiyon olması ve büyük parçacıkların ücretsiz (> 10 µm) uygun mikrosıvısal Kapsülleme için olmak. Örneğin, yöntem bir örnek yıkama bir dizi kullanarak ve hücreleri kapsülleme17önce ön işlemden için adımları filtreleme deniz suyu daha önce uygulandı.
SIC seq Protokolü nispeten seyrek bir sıralama veri miktarı her tek hücreden oluşturur ve tüm uygulamalar için uygun olmayabilir. Arama bazı Biyoinformatik algoritmaları de novo genom derleme veya tek nükleotid varyant (SNV) gibi verimli çalışması için daha yüksek kapsama derinlikleri gerektirir. Bunun yerine, böylece algoritmalar okuma büyük kümeleri üzerinde uygulanabilir barkod grupları kümelenmiş silico taksonomik binning yöntemleri27 tarafından olabilir. Nispeten düşük tüm tedarikçilerden etkinliğini SIC seq iş akışının da giriş örnek durumu düşük nerede durumlarda zorluklar takdim edebilir miyim? SiC-seq bir Poisson dağıtılmış barkod kapsülleme basamakta dayanır, bu nedenle hücreleri yaklaşık yüzde 10'u moleküler bir barkod almak ve son Kütüphane hazırlık adımı sırasında güçlendirilmiş. Bu diğer tedarikçilerden microdroplet tabanlı düzenleri10' a benzer olmakla birlikte, değerli hücre örnekleri ile çalışan kullanıcılar sıralama için yeterli kitaplığı verimi elde zorluk olabilir ve PCR döngüleri son sayısını artırmak gerekebilir amplifikasyon adım. Başka bir potansiyel kullanıcıları için mikrosıvısal uzmanlığı ile böylece genel barkodlama verimlilik getiren dijital PCR adım sonra olumlu barkod damlacıkları sıralamak için çözümdür > % 8528.
Bir potansiyel gelecekteki yönünü SIC seq teknolojisi için iş akışı yeni klinik tek hücre çalışmaları için önünü memeli hücreleri ile kullanmak için adapte olduğunu. Örnek olarak, kopya numarası varyasyon tek kanser arasında bir analizini hücreleri Mayıs heterojenite kanser patoloji2' deki rolü bizim anlayış daha fazla. Alternatif olarak, SIC seq yoklama ve DNA dizileri faiz29 zenginleştirmek için mevcut yöntemler ile entegre altgrupları hedeflenen tek hücreli sıralama veya hücrelerin nadir suşları sağlayacak. Çevre örnekleri ile bilinen bir metabolik yolu üzerinden genlerde hedef olabilir ve Roman genomik Adaları tanımlamak için genlerin komşu yanında içeriksel analiz. Gelen bir insan ana bilgisayar ortamında düşük-titresi patojen bakteri örnekleri izole olabilir ve daha fazla incelemek için tek hücre düzeyinde yakından virülans genotypic onların kökeni sıralı.

Hücresel kimlik ve işlevi, bir organizmanın tamamını içeren bir plan potansiyel kodlama'nın genom hizmet vermektedir. Genom düzeyinde Hücresel biyoloji bir anlayış türdeş olmayan hücre popülasyonlarının içinde gözlenen fenotipik çeşitlilik açıklayabilir. Bu heterojenlik biyolojik sistemlerde belirgindir ve insan sağlığı ve hastalığı geniş etkiler. Örneğin, tümör hücreleri arasında gen kopya numarası varyasyonlar evrim ve yayılmasını kanseri1,2bağlıdır. Bakteriyel enfeksiyonlar, patojen Adaları genleri küçük bir kısmını mevcut yatay olarak transfer edilebilir ve için belgili tanımlık hızla çoğalmak-in antibiyotik dirençli bakteri3,4kurşun. Genleri tek hücre düzeyinde eğitim bir birincil DNA elde edilebilir, aynı zamanda hücreleri binlerce analiz etmek gerek genotip tam çeşitliliği örnek için düşük miktarlarda mücadeledir. Bu nedenlerden dolayı deneysel üretilen iş kısıtlamalar yapılan çalışmaların sonuçları en bol hücreler doğru kutuplama tek hücreli, etkinliğini engel. Sıralama5,6, Optik cımbız7, toplu jelleri8ve havacilik9 olarak sıkıştırılma akışı gibi tek hücreli yalıtım teknikleri hücreler sıralama için yüzlerce işleyebilme yeteneği olan; Ancak, bu çoğu örnekleri yalnızca küçük bir kısmını temsil eder. Tek hücreli genom sıralama ile önemli ölçüde daha yüksek üretilen iş için bir yöntem daha derin ve daha kapsamlı hücre popülasyonlarının, böylece bu topluluklar içinde genotypic çeşitlilik rolü elucidating profilleme sağlayacak.
Damlacık Havacilik hücreleri ve biyolojik kimyasalları picoliter ölçekli reaktörler milyonlarca içinde yüksek-den geçerek manipülasyon sağlar. Türdeş olmayan doku10,11,12, hücreleri arasında fark ifade desen çalışması için kullanılan teknolojiler microdroplet bugüne kadar derin uzun moleküller13,14 sıra ,15ve davranış kromatin immunoprecipitation sıralama (ChiP-seq) analizleri tek hücreleri16. Gerçekten de, microdroplets yüksek üretilen iş, bölümlere işlemleri, tek hücreli genomik uygulamalar için mükellef yapma yeteneğine sahiptirler. Bu teknoloji geliştirme ancak kendi benzersiz teknolojik sorunlar sunar. Hücreleri lysed saflaştırılmış ve aynı şekilde örnek hücre popülasyonlarının için en az önyargı ile güçlendirilmiş. Ayrıca, memeli hücrelerinde poliadenile mRNA transkript var. hiçbir karşılaştırılabilir moleküler motifi hedef nükleik asit yakalanması kolaylaştırmak için genom Bu nedenlerden dolayı tek hücreli genom sıralama microdroplet platformlarında uygulamak zor olmuştur.
Bu çalışmada, biz daha önce raporlanmış tek hücreli mikrosıvısal yaklaşımımız bir tek deneme17hücrelerde, on binlerce genleri sıralama yetenekli detaylı bir protokol sağlar. SiC-seq, adı verilen bu teknoloji sayesinde bakteri hücreleri mikron çaplı hydrogels içinde kapsüllenir ve tek tek lysed, tagmented ve genomik DNA hücrenin üzerine spliced benzersiz oligonükleotid barkod içeren bir microdroplet ile birleştirilmiş bir tek örtüşme uzantısı polimeraz zincir tepkimesi (PCR). Hydrogels izole konteyner içinde yüksek molekül ağırlıklı genomik DNA sterically, deterjanlar ve erişmek ve barkodlama18önce DNA arındırmak için litik enzimler gibi daha küçük moleküller izin kaplı olarak hizmet vermektedir. Bu iletişim kuralı işler > saatler, barkodlu kütüphane sıralama için hazır sonuçlanan 50.000 tek hücreler. Nasıl yapılacağını takiben, okuma, okuma, milyonlarca oluşan bir dataset her hücresel bir dizin ile sonuçlanan onların tek hücreli barkod sırasına göre demultiplexed.

<table><tbody><tr><td>3" silikon gofretler, P tipi, bakire test sınıfı</td><td>Üniversite Gofretleri</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025 fotorezist</td><td>Microchem</td><td>17030192</td><td></td></tr><tr><td>Spin kaplayıcı</td><td>Özel Kaplama Sistemleri</td><td>G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>Fotoğraf Maskeleri</td><td>CadArt Servisleri</td> <td>(özel)</td> <td>Maske tasarımları için Ek Dosyalara Bakın</td></tr><tr><td>PGMEA geliştiricisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>484431</tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>109827</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 silikon elastomer kiti</td><td>Krayden</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Gaz giderme odası</td><td>Bel-Art</td><td>42025</td><td></td></tr><tr><td>0.75 mm biyopsi zımbası</td><td>World Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>Cam mikroskop slaytları (75 mm x 50 mm)</td><td>Corning</td><td>294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Aquapel (hidrofobik cam tedavisi)</td><td>Pittsburgh Glass Works</td><td>47100</td><td></td></tr><tr><td>PE-2 polietilen boru</td><td>Bilimsel Ürünler</td><td>B31695-PE / 2</td><td></td></tr><tr><td>1 mL şırıngalar</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>27 gauge iğneler</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>Yeni Çağ Pompa Sistemleri</td><td>NE-501</td><td></td></tr><tr><td>Novec HFE-7500 florlu yağ ( HFE)</td><td>3M</td><td>98-0212-2928-5</td><td></td></tr><tr><td>FC-40 florlu yağ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9755</td><td></td></tr><tr><td>PEG-PFPE yüzey aktif madde</td><td>Ran Biotechnologies</td><td>008-FluoroSurfaktan</td><td></td></tr><tr><td>Alan ısıtıcısı</td><td>Lasko&nbsp;</td><td>CD09250&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz, düşük jelleşme sıcaklığı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>a9414</td><td></td></tr><tr><td>TE (10X)</td><td>Rockland</td><td>mb-007</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X, pH 7.4</td><td>E& K Bilimsel Ürünler</td><td>EK-65083</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep (yoğunluk gradyan ortamı)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>d1556</td><td></td></tr><tr><td>1H, 1H, 2H-Perfloro-1-Oktanol (PFO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>370533</td><td></td></tr><tr><td>Açıklığı 80 (sorbitan monooleat)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>s6760</td><td></td></tr><tr><td>Hekzan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>139386</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (polisorbat 20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p2287</td><td></td></tr><tr><td>Lizozim Tip IV</td><td>MP Biyomedikaller</td><td>195303</td><td></td></tr><tr><td>Mutanolizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase (maya litik enzimi)</td> <td>Zymo Research</td><td>e1004</td><td></td></tr><tr><td>Lysostaphin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7386</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH 7.5, 1M</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Teknova</td><td>d9750</td><td></td></tr><tr><td>Lityum dodesil sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9781</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>New England Biosciences</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 Kanıt (% 100)</td><td>Koptec</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I (nükleik asit boyası)</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>PEG 6k</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81260</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (oktilfenol etoksilat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>t8787</td><td></td></tr><tr><td>Nextera DNA Kitaplığı Hazırlık Kiti</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1030</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start Flex Master Mix (Yüksek Kaliteli Hot Start Master Mix)</td><td>New England Biosciences</td><td>m05365</td><td></td></tr><tr><td>Platin Multipleks PCR Master Mix (Taq Master Mix)</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4464263</td><td></td></tr><tr><td>Warmstart 2.0 Bst Polimeraz (izotermal polimeraz)</td><td>New England Biosciences</td> Nextera XT kitinden <td>m0538m</td><td></td></tr><tr><td>NT tamponu (nötralizasyon tamponu)</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td></td></tr><tr><td>Soğuk katot floresan invertör</td> <td>(özel)</td> <td>(özel)</td><td></td></tr><tr><td>DC güç kaynağı</td><td>Mastech</td><td>HY1503D</td><td></td></tr><tr><td>Zerostat 3 anti-statik tabanca</td><td>Milty</td><td>5036694022153</td><td></td></tr><tr><td>3D baskılı santrifüj şırınga tutucu</td> <td>(özel)</td> <td>(özel)</td> <td>3D baskı dosyası için Ek Dosyalara bakın</td></tr><tr><td>Zymo DNA Clean & Yoğunlaştırıcı-5</td><td>Zymo Araştırma</td><td>D4003</td><td></td></tr></tbody></table>

tek hücreli genom sıralama için bir üretilen iş ultrahigh mikrosıvısal platform

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sıralama teknolojileri üzerinden toplu bir paradigma kayması tek hücreli çözünürlükte yanıt-e doğru hücresel heterojenite rolü gelişen bir anlayış biyolojik sistemlerde uğramıştır. Ancak, tek hücreli sıralama büyük nüfusun by kısıtlamaları genleri sıralama için işleme engel olmuştur. Bu yazıda, tek kişilik hücrelerin genleri izole, yükseltmek için damlacık Havacilik kullanır tek hücreli genom sıralama (SiC-seq) ve barkod için bir yöntem açıklanmaktadır. Microgels hücre katma sağlar compartmentalized arıtma ve tagmentation DNA, bir mikrosıvısal birleşme verimli bir şekilde her genom benzersiz tek hücreli oligonükleotid barkod ile çiftleri iken izin > sıralı için 50.000 tek hücreler Çalıştır. Sıralama veri barkod, tek hücrelerden kaynaklanan okuma grupları oluşturma tarafından demultiplexed. Yüksek işlem hacmi ve düşük-önyargı yöntemi tek hücreli sıralama olarak, SIC seq genomik çalışmalar çeşitli hücre popülasyonlarının hedef daha geniş bir dizi sağlayacaktır.

SIC seq deneysel iş akışı bir yumuşak litografi yordam (Şekil 1) kullanarak fabrikasyon 3 PDMS mikrosıvısal cihazları içerir. Bir iş akışı dropmaker (Şekil 3A) 25 µm benzersiz bir tek hücreli tanımlayıcı genomik DNA etiketleme için dijital barkod damlacıkları oluşturur. Barkod oligonucleotides PCR güçlendirme (Tablo 2, BAR astar) için kolları tarafından çevrili bir 15 bp dejenere sırasında oluşur. Barkodlar tek molekül kapsülleme elde etmek için bir femtomolar konsantrasyon seyreltilmiş ve bütün damlacıklar ya 0 ya da 1 barkod fragment(s) alırsınız. Bir barkod içeren damlacıklar, Çift iplikçikli barkod amplicons çok sayıda kopyasını verimli güçlendirilmiş. Nükleik asit leke başarılı amplifikasyon doğrulamak ve barkod parçaları (Şekil 4B) kapsülleme oranını ölçmek için kullanılır. Microgels bir bakteri hücre süspansiyon ve erimiş özel jel eşit akış oranları (Şekil 2A), ortak akan tarafından oluşturulur. İş akış dropmaking süreci etkili sulu çözümler 2 katına sulandırır. gibi özel iki kez istenen son konsantrasyonu, hazırlanır. Özel soğudukça damlacığı küresel hacminin işgal 25 µm çapı microgel katılaşır.
Yıkama ve lizis adımlar bir dizi yüksek molekül ağırlıklı genomik DNA'microgels (Şekil 2B) arındırır. Emülsiyonlar kırdıktan sonra sulu yıkama geniş hacimli izleme aşağı akım enzimatik tedavi inhibe olabilir organik çözücüler sulandırmak için yapılmaktadır. Yıkanmış microgels hücre sarma hızı (Şekil 4A) doğrulamak için mikroskop altında gözlenir. Bir kokteyl enzim geniş litik aktivite ile bakteri ve ökaryotik mikroplar19hücre duvarlarını sindirmek için microgel süspansiyon eklenir. İndinavir K ve deterjan ile ikinci bir tedavi proteinler düşürür ve hücre artıkları solubilizes.
Tagmentation saf DNA'ın küçük tagmented DNA parçalarının microgels18arasında difüzyon kaynaklanan potansiyel çapraz bulaşma kaçınmak için damlacıkları gerçekleştirilir. Bir damlacık saklama aygıtı (Şekil 3B) her microgel aynı anda aynı zamanda "o ile önceden yüklenmiş oligonükleotid20etiketleme ise" çift iplikçikli DNA parçaları bir tampon ve tagmentation enzim ile compartmentalizes. Microgels 1 microgel için her damla birkaç birini21 (Şekil 4 c) ile yaklaşan kapsülleme oranları elde parçacıkları, yakın Paketli olarak damlacıkları yüklenir.
Mikrosıvısal iş akışı (Şekil 2C) son adımında bir aygıt 1 barkod damla, 1 damla microgel içeren ve kontrollü bir işlemdir amplifikasyon karışımda birleştiren bir çift birleşme işlemi gerçekleştirir. İlk olarak, PCR reaktif içeren bir damlacık eşleştirilmiş ve sarı (Şekil 5) gösterilen bölge bir barkod düşüş birleştirilir. Tuzlu su elektrotlar mikrosıvısal kanaldaki damlacık birleşme tetikler yüksek elektrik alanı degrade üretir. Benzer bir şekilde, ilk birleştirilmiş damlacık microgel damlacık ile eşleştirilmiş ve kırmızı ile gösterilen bölgede ikinci kez birleşti. Damlacıkları toplanır ve termal çip dışı bir tek-örtüşme uzantısında (SOE) PCR sağlanıncaya. Üst üste gelen tamamlayıcı biter barkod ve tagmented genomik DNA füzyon ve sadece doğru barkodlu yapıları, üstel amplifikasyon izin verir.
Sıralama veri ilk okuma kalitesi ile filtre ve Okunma 15-bp tek hücreli barkod sırasına göre gruplandırarak ayrıştırılır. Barkod grubunda geçerli kabul edilmesi, okuma en az sayıda içermelidir; Bu eşik Analizi yararlı bir sıralama veri miktarı ile hücrelere sınırlar ve PCR mutasyona uğramış barkod "öksüz" kümesinden kaldırır. Çalıştırmak bu örnekte, Grup başına 7,5 kbps minimum ayarlanır (50 okuma 150 bp her). Bir çubuk grafik Grup boyutu karşı barkod sayar geçerli barkod grupları önemli bir bölümünü sadece eşik boyutunu (6A rakam) olduğunu gösterir.
Denetim nerede mikrobiyal topluluk kompozisyon bilinmektedir deneyde, saflık ve göreli bereket ölçümleri SIC seq çalıştırmak kalitesini değerlendirmek için kullanılır. Burada, 3 gram-negatif bakteriler, 5 gram-pozitif bakteri ve 2 Mayalar içeren sentetik bir 10 hücreli topluluk analiz edilir. Verilen barkod grubunda saflığı en yaygın genom okuma grubunda toplam sayısı bölü grubunda Eşleme okuma sayısı olarak tanımlanır. Barkod gruplar büyük çoğunluğu eroine 0,95 (ekil 6B) büyük var. Hücre tiplerinin göreli bereket ham okuma sayma ve sayım grupları kendi üye okuma (Şekil 6C) uzlaşma için karşılık gelen bir hücre tipi nerede atanır barkod grupları tarafından hesaplanır. Okuma ve barkod grupları bolluk izlemek öyle ki bazı türler orantısız küçük veya büyük barkod gruplar halinde bulunmayan hücre popülasyonlarının örnek olduğunu belirten kabaca eşit oranlarda. Tek bir tür tüm barkod gruplarından toplam kapsama komplo yüksek kapsama az veya hiç çıkarma bölgesi (Şekil 7) içeren tüm genomu arasında gösterir. Kapsama tekdüzelik normalleştirilmiş kapsama değerleri, ortalama merkezli birçok değeri ile bir frekans dağılımı ile doğrulanabilir (Şekil 7, iç metin).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig1.jpg"> Resim 1 : Fotolitografi tarafından mikrosıvısal cihazların imalat. (A)Master kalıpları tek özelliği yüksekliği ile SU-8 fotorezist silikon gofret üzerine bir tabaka kaplama spin tarafından imal edilmiştir. Fotorezist sonra photolithographic maskesi ve UV ışığı, crosslinking maruz kalan SU-8 ile desenli. Son olarak, uncrosslinked SU-8 bir geliştirici banyosunda feshedilmiştir. Elde edilen kalıp tam mikrosıvısal aygıt üretmek için cam slayda gümrüklü PDMS döküm için kullanılır. ()B) bir çift-tabaka aygıt için fabrikasyon benzer şekilde spin kaplama ve pozlama adımları ile başlar. Aşağıdaki adımları sonra bir iki katlı aygıt oluşturmak için yinelenir. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig2.jpg"> Resim 2: SIC seq iş akışı genel bakış. (A) A mikrobiyal süspansiyon erimiş özel microgels tek kişilik hücrelerde kapsüllemek için bir dropmaker cihaz ile birlikte akıyordu. (B) microgels yıkar bakteriyel genomik DNA arındırmak için bir dizi tabi tutulmaktadır. Litik enzimler gram-pozitif bakteri ve Maya hücre duvarlarını sindirmek ve deterjan hücresel enkaz solubilizes. Microgels yeniden damlacıkları çapraz bulaşma azaltmak tagmentation için içine saklanmış. (C) mikrosıvısal birleşme birleştirir dijital PCR barkod, tagmented microgel genom ve amplifikasyon karışımı bir hızda &gt; 1 kHz. Çip dışı SOE-PCR tagmented genom üzerine benzersiz bir tek hücreli barkod tutturmak ve seçmeli olarak tamamen yükselterek barkodlu yapıları. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig3.jpg"> Şekil 3: Mikrosıvısal cihazlar dropmaking ve microgel yeniden Kapsülleme için. (A) Bu panel bir iş akışı dropmaker (şekil yüksekliği 25 µm) gösterir. Hücreleri ve erimiş özel 25 µm x 25 µm merkezinde 25 µm damlacıkları üretmek için eşit akış oranları cihazın içine tanıtıldı. Dijital barkod dropmaking için hücre giriş takılı ve PCR karışımı özel giriş giriliyor. (B) Bu panel bir microgel yeniden saklama aygıtı (özelliği yüksekliği 25 µm) gösterir. Microgels içine onların yakın Paketli sipariş korumak ve bir tagmentation Mix 25 µm x 30 µm merkezinde yeniden kapsülleme önce alıyorsanız bir huni şeklinde giriş akışı. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig4.jpg"> Şekil 4 : Filmler damlacıkları ve microgels. 25 µm microgels enzimatik lizis önce yıkanmış (A) Bu panel gösterir. Bakteri fluorescently kapsülleme oranı miktar için lekeli. Poisson yükleme istatistik hücreleri 1 10 damla bir hızda kapsüllü veya çoklu-kapsülleme olayları sıklığını en aza indirmek için daha az olmalıdır dikte. (B) Bu panel 25 µm dijital barkod damlacıkları ile bir nükleik asit leke tedavi floresans mikroskobu görüntüsünü gösterir. Güçlendirilmiş barkod parçaları içeren damlacıklar güçlü floresans sinyal üretirler. (C) Bu panel 50 µm damla yeniden kapsüllü microgels gösterir. Kapat-ambalaj microgels damla başına 1 jel kaç birini ile yaklaşan kapsülleme oranları sağlar. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig5.jpg"> Şekil 5 : Mikrosıvısal Çift Kişilik birleşme aygıt için tek hücreli genom tedarikçidir. Bir iki adım birleşme işlemi barkod damlacıkları ile yüksek işlem hacmi itibariyle tagmented genleri çiftleri. Bir damlacık PCR karışımı ilk oluşturulan ve barkod damlacık tuzlu su elektrotları kullanarak sarı renkle gösterilen bölge içinde birleştirilir. Daha sonra bir microgel içeren bir damlacık tanıttı ve kırmızı ile gösterilen bölgede ikinci kez birleşti. Yağ giriş reinjected damlacıkları arasındaki boşluğu hassas kontrol sağlar. Barkod reinjection odası ve spacer petrol mavi gölgeli kısa 25 µm tabaka yerleştirilir. Diğer tüm aygıt özellikleri toplam yüksekliği 45 µm ile kalın katmana ait. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig6.jpg"> Şekil 6 : Barkod grup ölçümleri 10 hücreli sentetik mikrobiyal topluluğunun. (A) Bu panel grubu boyutları barkod dağılımı gösterir. Grup bir boyut sayısı katlanarak grup büyüklüğü arttıkça azalır. Grup başına 7,5 kbps minimum eşik analizi bilgi yeterli miktarda sahip gruplara sınırlar ve PCR mutasyona uğramış sıra "yetimler." kaldırır (B) Bu panel grup eroine barkod dağılımını gösterir. Büyük çoğunluğu (&gt; % 90) gruplarıdır çok yüksek saflık (&gt; % 95). (C) Bu panel 10 tür okuma ve barkod grubu düzeyinde hesaplanan göreli bolluk gösterir. Sayım yöntemleri 2 Barkod Grup boyutu türler arasında tutarlı hale gelir gösteren benzer sonuçlar. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig7.jpg"> Şekil 7 : Toplamak genomik kapsama Bacillus subtilis barkod gruplar. Bakteri B. subtilis için eşleme tüm barkod gruplardan okuma (N = 9,398) havuzlu ve toplam olarak analiz edilebilir. Dairesel kapsama alanı Haritası SIC seq okuma hiçbir gözlemlenebilir çıkarma bölgeler ile kapsama tekdüzelik göstermektedir. Kesikli çizgi çevresi ortalama kapsamı gösterir (5,55 x). Bir toplu üsleri genom genelindeki ortalama yakınındaki bir derinlikte kaplıdır göreli kapsama frekansları iç metin histogramını gösterir kesikli çizgiyle temsil. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Aygıt</td>
			<td>1 katman yüksekliği (µm)</td>
			<td>1 katman Spin hızı (devir/dakika)</td>
			<td>2 katman yüksekliği (µm)</td>
			<td>2 katman Spin hızı (devir/dakika)</td>
		</tr>
<tr>
<td>İş akışı dropmaker</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Jel yeniden encapsulator</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Çift Kişilik birleşme</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>20</td>
			<td>5000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: mikrosıvısal cihaz üretim parametreleri. Bu tablo (SU-8 3025 için üreticinin belirtimlerine bağlı olarak) kaplama fotorezist spin için gerekli kendi hızlarında SIC seq akışında kullanılan mikrosıvısal aygıtlar listesini gösterir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Etiket</td>
			<td colspan="5">Sıra (5' &gt; 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td>BAR</td>
			<td colspan="5">GCAGCTGGCGTAATAGCGAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNNNNNNNNNNNNNNNTAAGCCAGCCCCGACACT</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA_BAR</td>
			<td colspan="5">CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>P7_BAR</td>
			<td colspan="5">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCTGGCGTAATAGCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>P5_DNA</td>
			<td colspan="5">AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>I7_READ</td>
			<td colspan="5">GCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Astar diziler.
Ek dosya 1: <a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_1-SiC-seq_device_masks.dwg" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek dosya 2: <a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_2-centrifuge_syringe_holder_1mL.dwg" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Tek hücreli sıralama genotypic heterojenlik biyolojik sistemlerde ortaya çıkarır, ama daha fazla işlem hacmi derin topluluk kompozisyon ve işlev profil oluşturma için gerekli güncel teknolojileri eksikliği. Burada, biz bir mikrosıvısal iş akışı sıralama için tarif > 50.000 tek hücreli genleri farklı popülasyonlar hücre.

Tek hücreli genom sıralama için bir üretilen iş Ultrahigh mikrosıvısal Platform

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Bu deneyin genel amacı, bir dizi mikroakışkan cihaz kullanarak on binlerce tek hücreden barkodlu genomik dizileme verileri üretmektir. Bu yöntem, benzersiz tek hücreli dizileme verimi sağlar. Hücreleri ayrı ayrı kapsüllemek, parçalamak ve barkodlamak için mikroakışkanlar kullanıyoruz ve dizileme çalışmalarında geleneksel şokta kaybolan altta yatan genomik heterojenliği koruyoruz.Bu tekniğin temel avantajı, yüksek verim olması ve on binlerce hücreden tek hücreli veri üretebilmesidir. Bu gösterimde mikroplarla çalışmamıza rağmen, iş akışı, mikroakışkan cihaz boyutlarında küçük değişiklikler yapılarak farklı hücre tipleriyle kullanım için uyarlanabilir. Protokole başlamak için, 1X Tris-EDTA veya TE tamponunda hacim başına ağırlıkça %3 olan düşük erime sıcaklıklı agarozdan bir mililitre hazırlayın.Agaroz solüsyonunu şırınga yüklenene kadar 90 derecelik bir ısı bloğunda tutun. Hücreleri bir mililitre fosfat tamponlu salin veya PBS içinde yeniden süspanse edin ve hücreleri döndürün. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini PBS'de hacim yoğunluğu gradyan ortamına bir mililitre% 17 hacimde yeniden süspanse edin ve şırınga yüklenene kadar hücreleri buz üzerinde tutun.Daha sonra, ağırlık başına %2 ağırlık PFPE-PEG yüzey aktif madde içeren florlu yağ veya HFE içeren üç mililitrelik bir şırınga yükleyin. 27 gauge iğne ile takın ve bir şırınga pompasına yerleştirin. Hücre süspansiyonunu ve erimiş agarozu, her ikisi de 27 gauge iğnelerle donatılmış bir mililitrelik şırıngalara yükleyin ve bunları şırınga pompalarına yerleştirin.Ardından, bir alan ısıtıcısını yükseğe ayarlayın ve ısıtma yüzeyini şırıngadan 10 santimetre uzağa yerleştirin. Şırıngada ölçülen sıcaklığın yaklaşık 80 santigrat derece olduğundan emin olun. Tüpleri cihaza yerleştirmeden önce, hattaki havayı çıkarmak için pompaları doldurun.Şırınga iğnelerini polietilen veya PE boru parçaları kullanarak mikroakışkan cihaz girişlerine bağlayın. Prize bir parça boru bağlayın ve serbest ucu 15 mililitrelik bir toplama tüpüne yerleştirin. Damlattıktan sonra, agarozun tamamen jelleşmesini sağlamak için toplama tüpünü 30 dakika boyunca dört santigrat dereceye yerleştirin.Agaroz damlacıklarının üst tabakasını rahatsız etmemeye dikkat ederek, 20 gauge iğne ile donatılmış üç mililitrelik bir şırınga kullanarak alt yağ tabakasını toplama tüpünden çıkarın. Agaroz damlalarını yüzey aktif madde katmanlarından kırmak için HFE'ye hacim başına bir mililitre %10 hacim PFO ekleyin. Homojen ve topaksız olması gereken emülsiyonları iyice kaplamak için çözeltiyi bir dakika boyunca yukarı ve aşağı pipetleyin.Agaroz mikrojellerini toplamak için konik tüpü bir dakika boyunca 2.000 kez g'de döndürün. PFO/HFE süpernatantını aspire edin ve mikrojellerin artık yüzey aktif madde katmanlarından arınmış ve berrak olduğundan emin olun. Mikrojelleri yıkadıktan sonra, 10 mikrolitrelik bir jel alikotunu 1X nükleik asit boyası ile boyayarak mikroskop altında 400X büyütmede mikrojellerdeki hücre kapsüllemesini doğrulayın.Bir ko-akışlı damla yapıcı cihazın hücre girişini küçük bir parça kurşun lehim ile tıkayın. Tüpleri cihaza yerleştirmeden önce, hattaki havayı çıkarmak için pompaları doldurun. Prize bir parça boru bağlayın ve serbest ucu 0,2 mililitrelik bir PCR tüpüne yerleştirin.Damla yapmak için ekrandaki akış hızlarını kullanın. Damlaları, her tüpte yaklaşık 50 mikrolitre damla olacak şekilde PCR tüplerine toplayın. Damla dökümünden sonra, jel yüklemeli pipet uçları kullanarak emülsiyonlardan HFE yağının alt tabakasını dikkatlice çıkarın ve ağırlık başına %5 ağırlık PFPE-PEG yüzey aktif madde içeren FC-40 florlu yağ ile değiştirin.Ardından, termal döngüyü programlayın. Tüpleri cihaza yerleştirmeden önce, hattaki havayı çıkarmak için pompaları doldurun. HFE, etiketleme karışımı ve mikrojeller içeren şırıngaları, PE boru parçaları kullanarak mikroakışkan cihaz girişlerine bağlayın.Prize bir parça boru bağlayın ve serbest ucu, piston bir mililitre çizgisine çekilmiş olarak bir mililitrelik boş bir şırıngaya yerleştirin. Ardından, 400X büyütmede bir ışık mikroskobu altında mikrojel kapsülleme oranını doğrulayın. Etiketleme emülsiyonlarını içeren şırıngayı bir iğne ile yerleştirin ve genomik DNA'yı parçalamak için 55 santigrat derecede bir saat boyunca bir ısı bloğunda veya fırında dik olarak inkübe edin.FC-40 yağ fraksiyonunu ağırlık başına %2 HFE ağırlık PFPE-PEG ile değiştirerek barkod damlacıklarını birleşme için hazırlayın. Damlaları dikkatlice bir mililitrelik bir şırıngaya aktarın, bir iğne ile yerleştirin ve bir şırınga pompasına yerleştirin. İnkübe edilmiş ve etiketlenmiş mikrojel damlacık şırıngasını bir şırınga pompasına yükleyin.Ardından, üç sodyum klorür şırıngasını PE boru parçaları kullanarak iki elektrot girişine ve tek hendek girişine bağlayın. Tüpleri cihaza yerleştirmeden önce, hattaki havayı çıkarmak için pompaları doldurun. Pompalara monte edilmiş üç HFE şırıngayı, PE boru parçaları kullanarak iki ara yağ girişine ve damla yapma yağı girişine bağlayın.Ardından, boruyu şırınga iğnelerine bağlamadan önce tüm damlacık reenjeksiyon tüplerini antistatik bir tabancayla vurun. PCR karışım şırıngasını, mikrojel damla şırıngasını ve barkod damla şırıngasını PE boru ile ilgili girişlerine bağlayın. Elektrot şırıngasının iğnesini bir timsah klipsi kullanarak soğuk katotlu bir floresan invertöre bağlayın.İnvertörün DC güç kaynağını iki volta ayarlayın. Çift birleştirme cihazını önerilen akış hızlarıyla çalıştırın. Damlaları, her tüpte yaklaşık 50 mikrolitre emülsiyon bulunan PCR tüplerine toplayın.Termal döngüden önce, jel yüklemeli pipet uçları kullanarak emülsiyonlardan HFE yağının alt tabakasını dikkatlice çıkarın ve bunları, ağırlık başına %5 ağırlık PFPE-PEG yüzey aktif madde içeren FC-40 florlu yağ ile değiştirin. Ardından, döngüyü programlayın. Termal döngü damlacıklarından DNA'yı geri kazanmak için, damlacıkları bir mikrosantrifüj tüpüne toplayın ve 20 mikrolitre PFO kullanarak emülsiyonları kırın.Karıştırmak için 10 saniye girdaplayın. Tüpü döndürün. Üst sulu tabakayı bir pipet kullanarak tüpten dikkatlice çıkarın ve yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Yağ fazını atın. Ardından son olarak kütüphane hazırlama, sıralama ve analiz adımlarına geçin. Barkod sayımlarının grup boyutuna karşı bir histogramı, geçerli barkod gruplarının önemli bir bölümünün, PCR mutasyona uğramış yetimleri hariç tutan grup eşik boyutu başına 7,5 kilobaz çiftinin hemen üzerinde olduğunu gösterir.Üç gram negatif bakteri, beş gram pozitif bakteri ve iki mayadan oluşan sentetik 10 hücreli bir topluluktan elde edilen hücre tiplerinin nispi bolluğu, ham okumalar ve barkod grupları sayılarak hesaplandı. Tüm barkod gruplarından B.subtilis okumalarının dairesel bir kapsama haritası, ortalama kapsama alanının 5,55X olduğu, gözlemlenebilir bırakma bölgeleri olmaksızın SiC-seq okumalarının tekdüzeliğini gösterir. Kapsamın tekdüzeliği, normalleştirilmiş kapsama değerlerinin frekans dağılımı ile doğrulandı.Bu prosedürü denerken, her 10 damlacık için yaklaşık bir barkod veya hücrelik bir kapsülleme oranını korumak önemlidir. Bu, tek hücreli verileri karıştırabilecek bir çift kapsülleme olayı olasılığını sınırlar. Bu videoyu izledikten sonra, tek hücreli dizileme verileri oluşturmak için kullanılan mikroakışkan cihazların nasıl kurulacağını ve çalıştırılacağını iyi anlamış olmalısınız.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik sekiz saat veya dört saatlik iki günde çalıştırılabilir.

an-ultrahigh-throughput-microfluidic-platform-for-single-cell-genome

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Burada örnek sınırlı miktarda çalışma, özellikle microRNA (miRNA) ekspresyon düzeyleri için bir maliyet ve zaman etkili yüksek verimli bir tarama aracı olarak mikroakışkan platformu ile birlikte optimize edilmiş bir multiplex ters transkriptaz kantitatif PCR (QRT PCR) protokolü açıklamak.

Yüksek Verimli MicroRNA Profil: Optimize edilmiş, Multiplex QRT-PCR Fluidigm Dinamik ArrayTM IFCS Nanoliter Ölçeğinde

Biz protein dizilerin ifade etmek için bir mikroakışkan bir yaklaşım sunuyoruz. Cihaz, mikro-mekanik vana ile kontrol reaksiyon odaları binlerce oluşur. Mikroakışkan cihaz bir mikro baskılı gen kütüphanesi ile birleştirilmiştir. Bu genler daha sonra transkripsiyonu ve deneysel kullanıma hazır bir protein dizisi sonucunda, on-chip çevrilir.

Bir mikroakışkan Platform kullanarak Yüksek throughput Protein Ekspresyonu Jeneratör

Biz mikro ölçekli hücre stimülasyonu deneyler için otomatik bir hücre kültürü ve sorgulama platformu geliştirdik. Platform yetiştirilmesi ve hücrelerin küçük nüfus uyarıcı ve moleküler analizler için lizatları kurtarma, basit, çok yönlü ve hassas kontrol sağlar. Platform de değerli hücreleri ve / veya reaktif kullanmak çalışmalar için uygundur.

Mikro ölçekli Hücre Stimülasyon deneyler için Çok Yönlü Otomatik Platformu

Bu yazıda tek bir hücre analizi için bir mikroakışkan çip sunuyoruz. Bu sağlar: hücre içi proteinler, enzimler, kofaktörler, ve floresan deneyleri veya bağışıklık aracılığıyla ikinci haberciler miktar.

Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

Bu protokol, bir mikroakışkan cihaz kullanarak otomatik küçük hacimli (0,15–1,5 ml) parçacık ayırma işlemleri gerçekleştirmek için bir sistem mimarisini tanımlar ve akustoakışkan cihaz performansını ve çalışmasını optimize etme yöntemlerini tartışır.

Bir mikroakışkan Hassas Küçük hacimli Numune İşleme Platformu ve Akustik mikrocihazda Ayrı Biyolojik Parçacıklar Boyutu Kullanımı

Burada, yüksek verimli tek hücre izolasyonu ve uzun süreli klonal kültüre izin vermek için yeni bir mikro kuyu tasarım konseptini kullanan mikroakışkan bir platformla tek hücreleri izole etmek ve kültürlemek için bir protokol sunuyoruz.

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Nanopore sıralamasını uzak konumlarda ve kaynak kötü ayarlarında maliyet-etkili sıralamaya izin veren bir yeni teknoloji. Burada, mRNAs 'ın bu şartlar ile uyumlu olan tüm kandan sıralanması için bir protokol sunuyoruz.

Nanopore sıralamayı kullanarak tüm kan mRNA sıralaması

PdMS tabanlı, çok katmanlı, mikroakışkan bir cihazın in vitro transkripsiyon ve çeviri (IVTT) reaksiyonlarının uzun süreler boyunca gerçekleştirilmesine olanak sağlayan üretim süreci anlatılmaktadır. Ayrıca, bu reaksiyonları uzun süre ler boyunca otomatikleştirmek ve korumak için gereken donanım ve yazılıma kapsamlı bir genel bakış sağlanır.

Uzun Süreli Hücresiz Gen Ekspresyonunun İletimi için Çok Katmanlı Mikroakışkan Platform

Biz yetişkin bir fare beyin yarımkürenin farklı parçalanmış bölgelerinden mikroglia izolasyoniçin bir protokol sağlamak, tam uzunlukta transkripsiyon derin tek hücreli RNA sıralama için yarı otomatik kütüphane hazırlık izledi. Bu yöntem, sağlık ve hastalık mikroglia fonksiyonel heterojenite açıklığa kavuşturmak için yardımcı olacaktır.

Derin Tek Hücreli RNA Sıralamaiçin Bir Yetişkin Fare Beyin Yarımküre'den Bölgeye Özgü MikrogliaNın İzolasyon

1500 kültür ünitesi, bir dizi gelişmiş peristaltik pompa ve yerinde karıştırma modülünden oluşan karmaşık yaşam makineleri üzerinde yüksek verimli çalışmalar için mikroakışkan bir sistem sunuyoruz. Mikroakışkan çip, vivodaki son derece karmaşık ve dinamik mikro çevresel koşulların analizini sağlar.

Yüksek Verimli Mikroakışkan Cihaz Kullanarak Dinamik ÇevreSel Koşulların Üretilmesi

Dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC'ler), kanserin ilerlemesi ve metastazının incelenmesi için kritik öneme sahiptir. Bu makale, CTC zenginleştirme ve tek CTC dizilimi için yüksek verimli, entegre bir protokol sunmakta, kontaminasyon ve dizileme maliyetlerini azaltırken yakalama verimliliğini ve CTC saflığını artırmakta, böylece hassas onkoloji araştırmalarını ve klinik uygulamaları ilerletmektedir.

Mikroakışkan Tabanlı Yüksek Verimli Dolaşımdaki Tümör Hücresi Sıralama ve Tek Hücre Dizileme Teknolojisi

Öğrenin, mikroakışkan cihazlar kullanarak on binlerce tek hücrenin barkodlu genomik dizileme verilerini nasıl üreteceğinizi. Bu yüksek verimli yöntem, genomik heterojeniteyi koruyarak hücreleri tek tek kapsüller ve barkodlar.

Tek hücreli genom sıralama için bir üretilen iş Ultrahigh mikrosıvısal Platform

Daha fazla video keşfet