Tek hücreli genom sıralama için bir üretilen iş Ultrahigh mikrosıvısal Platform

Bu deneyin genel amacı, bir dizi mikroakışkan cihaz kullanarak on binlerce tek hücreden barkodlu genomik dizileme verileri üretmektir. Bu yöntem, benzersiz tek hücreli dizileme verimi sağlar. Hücreleri ayrı ayrı kapsüllemek, parçalamak ve barkodlamak için mikroakışkanlar kullanıyoruz ve dizileme çalışmalarında geleneksel şokta kaybolan altta yatan genomik heterojenliği koruyoruz.

Bu tekniğin temel avantajı, yüksek verim olması ve on binlerce hücreden tek hücreli veri üretebilmesidir. Bu gösterimde mikroplarla çalışmamıza rağmen, iş akışı, mikroakışkan cihaz boyutlarında küçük değişiklikler yapılarak farklı hücre tipleriyle kullanım için uyarlanabilir. Protokole başlamak için, 1X Tris-EDTA veya TE tamponunda hacim başına ağırlıkça %3 olan düşük erime sıcaklıklı agarozdan bir mililitre hazırlayın.

Agaroz solüsyonunu şırınga yüklenene kadar 90 derecelik bir ısı bloğunda tutun. Hücreleri bir mililitre fosfat tamponlu salin veya PBS içinde yeniden süspanse edin ve hücreleri döndürün. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini PBS'de hacim yoğunluğu gradyan ortamına bir mililitre% 17 hacimde yeniden süspanse edin ve şırınga yüklenene kadar hücreleri buz üzerinde tutun.

Daha sonra, ağırlık başına %2 ağırlık PFPE-PEG yüzey aktif madde içeren florlu yağ veya HFE içeren üç mililitrelik bir şırınga yükleyin. 27 gauge iğne ile takın ve bir şırınga pompasına yerleştirin. Hücre süspansiyonunu ve erimiş agarozu, her ikisi de 27 gauge iğnelerle donatılmış bir mililitrelik şırıngalara yükleyin ve bunları şırınga pompalarına yerleştirin.

Ardından, bir alan ısıtıcısını yükseğe ayarlayın ve ısıtma yüzeyini şırıngadan 10 santimetre uzağa yerleştirin. Şırıngada ölçülen sıcaklığın yaklaşık 80 santigrat derece olduğundan emin olun. Tüpleri cihaza yerleştirmeden önce, hattaki havayı çıkarmak için pompaları doldurun.

Şırınga iğnelerini polietilen veya PE boru parçaları kullanarak mikroakışkan cihaz girişlerine bağlayın. Prize bir parça boru bağlayın ve serbest ucu 15 mililitrelik bir toplama tüpüne yerleştirin. Damlattıktan sonra, agarozun tamamen jelleşmesini sağlamak için toplama tüpünü 30 dakika boyunca dört santigrat dereceye yerleştirin.

Agaroz damlacıklarının üst tabakasını rahatsız etmemeye dikkat ederek, 20 gauge iğne ile donatılmış üç mililitrelik bir şırınga kullanarak alt yağ tabakasını toplama tüpünden çıkarın. Agaroz damlalarını yüzey aktif madde katmanlarından kırmak için HFE'ye hacim başına bir mililitre %10 hacim PFO ekleyin. Homojen ve topaksız olması gereken emülsiyonları iyice kaplamak için çözeltiyi bir dakika boyunca yukarı ve aşağı pipetleyin.

Agaroz mikrojellerini toplamak için konik tüpü bir dakika boyunca 2.000 kez g'de döndürün. PFO/HFE süpernatantını aspire edin ve mikrojellerin artık yüzey aktif madde katmanlarından arınmış ve berrak olduğundan emin olun. Mikrojelleri yıkadıktan sonra, 10 mikrolitrelik bir jel alikotunu 1X nükleik asit boyası ile boyayarak mikroskop altında 400X büyütmede mikrojellerdeki hücre kapsüllemesini doğrulayın.

Bir ko-akışlı damla yapıcı cihazın hücre girişini küçük bir parça kurşun lehim ile tıkayın. Tüpleri cihaza yerleştirmeden önce, hattaki havayı çıkarmak için pompaları doldurun. Prize bir parça boru bağlayın ve serbest ucu 0,2 mililitrelik bir PCR tüpüne yerleştirin.

Damla yapmak için ekrandaki akış hızlarını kullanın. Damlaları, her tüpte yaklaşık 50 mikrolitre damla olacak şekilde PCR tüplerine toplayın. Damla dökümünden sonra, jel yüklemeli pipet uçları kullanarak emülsiyonlardan HFE yağının alt tabakasını dikkatlice çıkarın ve ağırlık başına %5 ağırlık PFPE-PEG yüzey aktif madde içeren FC-40 florlu yağ ile değiştirin.

Ardından, termal döngüyü programlayın. Tüpleri cihaza yerleştirmeden önce, hattaki havayı çıkarmak için pompaları doldurun. HFE, etiketleme karışımı ve mikrojeller içeren şırıngaları, PE boru parçaları kullanarak mikroakışkan cihaz girişlerine bağlayın.

Prize bir parça boru bağlayın ve serbest ucu, piston bir mililitre çizgisine çekilmiş olarak bir mililitrelik boş bir şırıngaya yerleştirin. Ardından, 400X büyütmede bir ışık mikroskobu altında mikrojel kapsülleme oranını doğrulayın. Etiketleme emülsiyonlarını içeren şırıngayı bir iğne ile yerleştirin ve genomik DNA'yı parçalamak için 55 santigrat derecede bir saat boyunca bir ısı bloğunda veya fırında dik olarak inkübe edin.

FC-40 yağ fraksiyonunu ağırlık başına %2 HFE ağırlık PFPE-PEG ile değiştirerek barkod damlacıklarını birleşme için hazırlayın. Damlaları dikkatlice bir mililitrelik bir şırıngaya aktarın, bir iğne ile yerleştirin ve bir şırınga pompasına yerleştirin. İnkübe edilmiş ve etiketlenmiş mikrojel damlacık şırıngasını bir şırınga pompasına yükleyin.

Ardından, üç sodyum klorür şırıngasını PE boru parçaları kullanarak iki elektrot girişine ve tek hendek girişine bağlayın. Tüpleri cihaza yerleştirmeden önce, hattaki havayı çıkarmak için pompaları doldurun. Pompalara monte edilmiş üç HFE şırıngayı, PE boru parçaları kullanarak iki ara yağ girişine ve damla yapma yağı girişine bağlayın.

Ardından, boruyu şırınga iğnelerine bağlamadan önce tüm damlacık reenjeksiyon tüplerini antistatik bir tabancayla vurun. PCR karışım şırıngasını, mikrojel damla şırıngasını ve barkod damla şırıngasını PE boru ile ilgili girişlerine bağlayın. Elektrot şırıngasının iğnesini bir timsah klipsi kullanarak soğuk katotlu bir floresan invertöre bağlayın.

İnvertörün DC güç kaynağını iki volta ayarlayın. Çift birleştirme cihazını önerilen akış hızlarıyla çalıştırın. Damlaları, her tüpte yaklaşık 50 mikrolitre emülsiyon bulunan PCR tüplerine toplayın.

Termal döngüden önce, jel yüklemeli pipet uçları kullanarak emülsiyonlardan HFE yağının alt tabakasını dikkatlice çıkarın ve bunları, ağırlık başına %5 ağırlık PFPE-PEG yüzey aktif madde içeren FC-40 florlu yağ ile değiştirin. Ardından, döngüyü programlayın. Termal döngü damlacıklarından DNA'yı geri kazanmak için, damlacıkları bir mikrosantrifüj tüpüne toplayın ve 20 mikrolitre PFO kullanarak emülsiyonları kırın.

Karıştırmak için 10 saniye girdaplayın. Tüpü döndürün. Üst sulu tabakayı bir pipet kullanarak tüpten dikkatlice çıkarın ve yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Yağ fazını atın. Ardından son olarak kütüphane hazırlama, sıralama ve analiz adımlarına geçin. Barkod sayımlarının grup boyutuna karşı bir histogramı, geçerli barkod gruplarının önemli bir bölümünün, PCR mutasyona uğramış yetimleri hariç tutan grup eşik boyutu başına 7,5 kilobaz çiftinin hemen üzerinde olduğunu gösterir.

Üç gram negatif bakteri, beş gram pozitif bakteri ve iki mayadan oluşan sentetik 10 hücreli bir topluluktan elde edilen hücre tiplerinin nispi bolluğu, ham okumalar ve barkod grupları sayılarak hesaplandı. Tüm barkod gruplarından B.subtilis okumalarının dairesel bir kapsama haritası, ortalama kapsama alanının 5,55X olduğu, gözlemlenebilir bırakma bölgeleri olmaksızın SiC-seq okumalarının tekdüzeliğini gösterir. Kapsamın tekdüzeliği, normalleştirilmiş kapsama değerlerinin frekans dağılımı ile doğrulandı.

Bu prosedürü denerken, her 10 damlacık için yaklaşık bir barkod veya hücrelik bir kapsülleme oranını korumak önemlidir. Bu, tek hücreli verileri karıştırabilecek bir çift kapsülleme olayı olasılığını sınırlar. Bu videoyu izledikten sonra, tek hücreli dizileme verileri oluşturmak için kullanılan mikroakışkan cihazların nasıl kurulacağını ve çalıştırılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik sekiz saat veya dört saatlik iki günde çalıştırılabilir.