Dejeneratif Tenocyte insanlardan elde etmek için bir protokol

Bu yöntem, insan dejeneratif tenosit biyolojisi ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, çünkü sadece birkaç çalışma insan dejeneratif tenosit izolasyonunu ve kültürünü ayrıntılı olarak tanımlamıştır. Bu tekniğin temel avantajı, dejeneratif doku standart epikondilit cerrahisi sırasında elde edildiğinden, ek hasta yaralanması olmadan insan dejeneratif tenosit elde edebilmemizdir. Prosedürü gösterecek olanlar Üçüncü Seviyemden Dr.Soo-Hong Han, Minjung Baek ve Hyung Kyung Kim olacak.

Dejeneratif bir tendosit doku örneği elde etmek için, lateral epikondilin hemen ön medialinde üç ila beş santimetrelik bir cilt kesisi yapmak için 15 numaralı bir cerrahi neşter kullanın ve lateral dirseği ortaya çıkarmak için eklem seviyesinin proksimalinde ve ekstansör carpi radialis longus'u görsel olarak bulun ekstansör aponevroz arayüzünde. Ekstansör carpi radialis longus ile arayüzdeki ekstansör aponevroz arasında iki ila üç milimetre derinliğinde bir yarma kesisi yapmak için neşteri kullanın. Ekstansör carpi radialis longus'un anterior retraksiyonundan sonra, patolojik dejeneratif dokuyu karakteristik donuk grimsi rengi ve tipik olarak ödemli ve kırılgan dokusu ile bulun ve neşter ve mini bıçakları dikkatli ama keskin bir şekilde tüm dejeneratif dokuyu rezeke etmek için kullanın.

Tüm doku toplandıktan sonra, yarayı standart protokollere göre emilmeyen dikiş materyali ile kapatın ve çevresindeki tüm dokuyu yaklaşık bir santimetreküplük bir doku örneğinden dikkatlice çıkarın, temiz tendon dokusunu kesilir kesilmez 10 mililitre PBS'ye yerleştirin. Daha sonra, hasat edilen dokunun yaklaşık yarısını 12 saat boyunca kimyasal bir davlumbazda nötr tamponlu% 10 formalin içinde sabitleyin. Bir tenosit kültürü oluşturmak için, hasat edilen kontrol ve dejenere doku örneklerinin diğer yarısını taze PBS içeren ayrı doku kültürü kaplarına aktarın ve dokuları bir metreküp veya daha küçük parçalar halinde doğrayın, doku parçalarını mililitre başına 30 miligram kollajenaz ile desteklenmiş 30 mililitre DMEM'de sindirin, bir saat boyunca doku grubu başına iki kez.

Sindirimin sonunda, hücre çözeltilerini ayrı ayrı 100 mikron hücre süzgeçlerinden süzün ve kollajenazı tüp başına bir mililitre FBS ile etkisiz hale getirin. Tenositleri santrifüjleme ile toplayın ve peletleri% 10 FBS ve% 1 antibiyotik, antimikotik çözelti konsantrasyonu ile desteklenmiş 10 mililitre DMEM başına 10 ila beşinci hücrede üç kez yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücreleri koşul başına 100 santimetrelik bir kültür kabına tohumlayın ve tenositleri bir hafta boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatöründe kültürleyin ve kültür ortamını% 80'lik bir birleşmeye ulaşılana kadar her üç günde bir değiştirin.

İmmünositokimyasal analiz için, deney grubu başına sekiz oyuklu odacıklı bir slaydın her bir oyuğuna 200 mikrolitre taze ortamda iki kez 10 ila beşinci hücreye aktarın ve hücreleri 24 saat boyunca birleşecek şekilde büyütün. Ertesi gün, hücreleri PBS ile yıkayın, ardından oyuk başına 500 mikrolitre% 4 formaldehit ile fiksasyon ve 10 dakika boyunca PBS'de% 0.5 triton X 100 ile geçirgenlik sağlayın. Spesifik olmayan herhangi bir bağlanmayı bloke etmek için, hücreleri deneysel olarak uygun olduğu şekilde% 1 sığır serum albümini ve% 0.05 Tween 20 ile PBS'de inkübe edin, ardından gece boyunca dört santigrat derecede floresan etiketli primer antikorlarla inkübe edin.

Ertesi sabah, hücreleri ışıktan korunan oda sıcaklığında bir saat boyunca uygun ikincil antikorlarla etiketleyin ve numuneleri oda başına 0,5 mikrolitre uygun bir floresan montaj ortamı ile monte edin. Daha sonra numuneleri bir floresan mikroskobunda 400 kez objektif altında görüntüleyin. Dokunun patolojik analizi için, resmi ve sabit kontrol ve dejenere tendon dokusu örneklerini dört ila beş mililitre parafine gömün ve her parafin bloğundan dört ila beş mikron kesit elde edin.

Eozin içindeki hematoksilen veya H & E boyama için, numuneleri ksilen içinde beş dakikalık üç daldırma ile deparafinize edin, ardından kademeli etanol daldırmaları ile hidrasyon ve iki dakikalık bir musluk suyu yıkaması yapın. Daha sonra, numuneleri beş dakika boyunca hematoksilen ile etiketleyin, ardından iki dakikalık bir su yıkama daha yapın. Durulanmış numuneleri üç saniye boyunca %1 hidroklorik asit ve %70 etanole batırın, ardından üç dakikalık bir su yıkayın.

Asidi %0,5 amonyak içine 10 saniye daldırarak nötralize edin, ardından üç dakikalık bir su yıkama daha yapın. Nötralize edilmiş numuneleri beş dakika boyunca eozin ile etiketleyin ve H & E lekeli numuneleri kademeli etanol daldırmalarıyla kurutun. Üç ksilen daldırmasından sonra, numuneleri uygun bir montaj ortamı ve bir kapak sürgüsü ile monte edin.

Doku örneklerinin immünohistokimyasal analizini yapmak için, aşağıdaki küçük değişikliklerle üreticinin talimatlarına göre bağ polimeri rafine tespit kitini kullanın. Gösterildiği gibi ksilen ile deparafinizasyondan sonra, numuneleri antijen alımı için 100 santigrat derecede 30 dakika boyunca bağ epitop alma çözeltisine daldırın, ardından herhangi bir endojen peroksidazı söndürmek için hidrojen peroksit içinde beş dakikalık bir inkübasyon yapın. Daha sonra, bölümleri oda sıcaklığında on beş dakika boyunca ilgilenilen birincil antikorlarla etiketleyin.

İnkübasyonun sonunda, numuneleri oda sıcaklığında 50 dakika boyunca uygun biyotin içermeyen polimerik yaban turpu peroksidaz bağlayıcı ikincil antikor konjuge sistemi ile etiketleyin. Daha sonra bölümleri bir kapak kızağı ile uygun montaj ortamına monte edin ve numuneleri 400 kat büyütmede bir ışık mikroskobu üzerinde görüntüleyin. H&E analizleri, dejenere lateral epikondilitten toplanan dokunun, polarite kaybı ve ince, düz, güçlü bir şekilde paketlenmiş paralel lif yapıları ile düzensiz kollajen demetleri gösterdiğini ortaya koymaktadır.

Gerçekten de, kollajen demetleri, dejenere doku bölümlerinde Alcian Blue boyaması için pozitiftir, bu da hasarlı doku içinde artmış bir proteoglikan ve glikozaminoglikan varlığını gösterir. Dejenere tendonların immünohistokimyasal analizi, kontrol, sağlıklı tendon dokusu örneklerinde gözlenmeyen vasküler endotelyal büyüme faktörüne sitoplazmik granüler pozitif reaksiyonu da gösterir. Her iki kültürlenmiş doku örnek hücresi tipi, kültürlenmiş hücrelerin çoğu mohawk ve tenomodulin proteinleri gibi temsili tenosit belirteçlerini eksprese eden ve uzun bir görünüm gösteren immünoflorakimya ile tenosit olarak doğrulanabilir.

Dikkat çekici bir şekilde, dejeneratif tenositler, sağlıklı kontrollerden toplanan tenositlere kıyasla kültürde daha yüksek bir proliferasyon oranı ve ayrıca tendinopati gelişimi ile ilişkili olduğu bilinen çoklu genlerin daha yüksek bir ekspresyonu gösterir. Sonuç olarak, dejeneratif tenosit kullanan bu doğrulanmış protokol, tendon biyolojisinde gelecekteki araştırmaların ve yeni müdahalelerin test edilmesinin önünü açmaktadır.