Plazmid DNA teslimat için fare mesane Urothelium elektroporasyon tarafından roman yöntemi

Bu yöntemin genel amacı, gen aşırı ekspresyonu veya genom düzenleme için in vivo olarak canlı farelerin mesane ürotelyumuna DNA plazmitlerini iletmektir. Bu yöntem, farklı genetik mutasyonların mesane kanserinin ilerlemesini nasıl teşvik ettiği gibi mesane kanseri alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, viral vektörlerle ilişkili güvenlik endişeleri ve teknik engeller olmadan genleri mesaneye iletmek için hızlı ve kolay bir yol sağlamasıdır.

İlk olarak, mesane için iyi çalışmayan DNA iletimi için herhangi bir mühendislik ilişkili virüsü kullanmaya çalışmak için bu yöntem için fikrim vardı. Bu tekniğin anlamı, gen terapisine de uzanabilir, çünkü elektroporasyon, DNA plazmitlerinin ürotelyal hücrelere verimli bir şekilde verilmesini sağlayabilir. Prosedürü göstermek için laboratuvarımdan Ofir Stefanson ve Yueli Liu olacak.

Bu prosedüre başlamak için tüm cerrahi aletleri otoklavlayın ve çalışma alanını %70 etanol ile sterilize edin. Steril koşulları korumak için sonraki prosedürleri gerçekleştirirken cerrahi aletlere ve eldivenlere sık sık %70 etanol püskürtün. Başlamak için fareyi uyuşturun ve cerrahi alanı tıraş edin.

İdrarı boşaltmak için katetere kayganlaştırıcı uygulayın ve dış yüzeyinin tamamen kaplandığından emin olun. Ardından, kateteri farenin üretra açıklığına yerleştirin ve mesaneye ulaşana kadar yavaşça itin. İdrar tükenmesine yardımcı olmak için karnına hafifçe bastırın.

Daha sonra, idrarı bir pipetle bir atık behere atın, ardından 80 mikrolitre PBS'yi kateterin dış ucuna, diğer ucu hala mesanede olacak şekilde pipetleyin. Ardından, katetere dikkatlice bir milimetrelik bir şırınga takın. PBS'yi mesaneye enjekte etmek için şırıngayı yavaşça itin.

Mesanede hava kabarcıkları oluşmasını önlemek için kateterde bir miktar PBS bırakın. Daha sonra şırıngayı çıkarın ve PBS'nin mesaneden boşalmasını bekleyin. PBS'yi boşaltmak için karnı hafifçe bastırın, ardından kateterdeki PBS'yi bir pipetle atık kabına atın.

PBS yıkamayı iki kez daha tekrarlayın. Her mesanenin transfekte etmesi için, mikrolitre başına bir mikrogramda en az 20 mikrolitre DNA plazmidi hazırlayın. Daha sonra, 20 mikrolitre plazmit çözeltisine bir mikrolitre tripan mavisi ve 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpü ve iyice karıştırmak için pipet ekleyin.

Plazmidi vermek için karına% 70 etanol uygulayın. Mesanenin üzerindeki karın derisini açmak için bir santimetrelik dikey bir kesi yapın. Ardından, mesaneyi ortaya çıkarmak için kas tabakasını kesin.

Kateterin dış ucuna en az 20 mikrolitre plazmid artı tripan mavisi solüsyonu pipetleyin ve şırıngaya çıkarın. Ardından, plazmit çözeltisini mesaneye enjekte edin. Mesane maviye dönerse, enjeksiyon başarılı olur.

Mesanede hava kabarcıkları oluşmasını önlemek için kateterde bir miktar sıvı bırakın. Daha sonra, dış üretral orifis'i alın ve kateteri ve şırıngayı çıkarın. Dış üretral deliği sıkmak için bir ip kullanın.

İp ile iki ilmek yapın ve ardından iki düğümle bağlayın. Bu, iki kişinin işbirliği yapmasını gerektiren çok önemli bir adımdır. Plazmitlerin dışarı sızmaması için düğümlerin sıkı olduğundan emin olun.

Şimdi, elektroporasyon jeneratörünü açın. Mesaneyi iki elektrotla sıkıştırın ve elektroporasyon yapmak için ayak pedalına basın. Mesaneyi destekli tutmak için, karın kesisinin arkası cımbızla sıkıştırılabilir.

Cımbız ve elektrotlar arasında herhangi bir temastan kaçının çünkü bu bir kıvılcım oluşturabilir. Yapıldığında karın ve cilt deliğini steril, cerrahi dikiş ile dikin. İpi çıkarın ve klipleri uygulayın.

Yaranın üzerine iyot uygulayın ve ardından hayvanı izofluran sisteminden çıkarın. Ameliyat sonrası ağrıyı hafifletmek için deri altına buprenorfin analjezik uygulayın. Hayvanı ısıtma yastığı üzerinde tutun ve tamamen iyileştikten sonra ev kafesine geri koyun.

Hayvanı normal hareketlilik, içme ve beslenme davranışları açısından günde en az bir kez kontrol edin ve kesi iyileşene kadar enfeksiyon belirtisi yok. Ardından, bir hafta sonra klipsleri çıkarın. Hayvan tımarlamada azalma, artan saldırganlık ve seslendirme gibi ağrı semptomları gösteriyorsa, sonraki buprenorfin analjezik enjeksiyonlarını uygulayın.

Mesane ürotelyumuna başarılı gen iletimini göstermek için, üretradan 20 mikrolitre pCAG-GFP plazmid ve tripan mavisi çözeltisi enjekte edildi ve beş elektrik darbesi uygulandı. Burada, 48 saat sonra mesaneyi yeşile çeviren başarılı elektroporasyon gösterilirken, elektroporasyona tabi tutulmayan negatif bir kontrol mesanesi GFP sinyali göstermedi. Seksiyonel mesane dokularının immünofloresan boyaması CK5, CK18 ve GFP antikorları ile yapıldı.

GFP sinyalinin şemsiye, ara ve bazal hücrelerde mevcut olduğu, ancak kas tabakasında bulunmadığı, ürotelyuma plazmit iletiminin iyi bir özgüllüğü olduğu gözlendi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 15 dakika içinde gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, mesane kanseri alanındaki araştırmacıların, hastalığın ilerleme mekanizmalarını incelemek için yeni otokton fare modelleri oluşturmalarının yolunu açıyor.