Yalıtım Borneo dan çene kemiğinde bezi rezervuar İçindekiler ' GC-MS ve MetaboliteDetector göre Volatilome analiz için karıncalar (karınca) patlayan
26 Ağustos 2018
Küçük işçi karınca türlerin Colobopsis explodens kendi çene kemiğinde bezi hipertrofik rezervuarlar sonraki solvent ekstraksiyon ve çözümleme gaz kromatografi-kütle spektrometresi tarafından depolanan balmumu benzeri içerik yalıtmak için kesmiştim. Ek açıklama ve kimlik uçucu bileşenlerin açık kaynak yazılım MetaboliteDetector kullanarak da açıklanmıştır.
Bu yöntem, böcek metabolomiklerindeki temel soruları cevaplamaya yardımcı olabilir. Metabolit profilleme yaklaşımı, uçucu maddelerin diğer organizmalarla etkileşimdeki rolünü açıklayarak karıncaların kimyasal ekolojisini incelemek için kullanılabilir. Sunulan iş akışının ana avantajı şudur: temelde bağımsız olarak uygulanabilen iki farklı bölümden oluşur.
Birincisi, mandibular bez rezervuarının ve içeriğinin fiziksel izolasyonu ve ikincisi, ilgilenilen biyolojik örnekte hedeflenmemiş profilleme ve uçucu organik bileşenin tanımlanması. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan yetenekli bir doktora öğrencisi olan Michaela Hoenigsberger olacak. Karıncaları diseksiyondan önce, bir davlumbazda, bir cam Petri kabını ve diseksiyon aletlerini kağıt mendiller ve hacimce bir artı bir metanol ve su karışımı kullanarak temizleyin.
Çanağı eksi 20 santigrat derecede saklayın. Ardından, silikon PTFE Septa içeren vidalı kapakları da dahil olmak üzere 1,5 mililitrelik kısa iplik şişelerinin kütlesini alın. Şişeleri buz üzerinde saklayın.
Ardından, donmuş, dövülebilir bir soğuk paketi polistiren bir köpük kutuya yerleştirin. Sonra Petri kabını soğuk paketin üzerine yerleştirin ve tabağa donmuş bir karınca koyun. Şimdi, karıncayı stereo mikroskopla inceleyin.
Gastral bölmelerinin bütünlüğünü kontrol edin. Karıncanın sağlam bir gaser bölgesi olmalıdır. Vücut yüzeylerinde düz gasterleri veya sertleşmiş mandibular bez rezervuar içeriği izleri olan karıncaları kullanmayın.
Şimdi, mandibular bez rezervuar içeriğini karıncadan izole edin. Propodyum ve yaprak sapını kavramak için forseps kullanın, ardından bu vücut segmentlerini nazikçe ayırın. Ardından, ince forseps kullanarak gasteri tergite dördüncüde tutun.
Başka bir forseps çifti ile tergit birini alın ve tergiti soyarak nazikçe çıkarın. İkinci ve üçüncü tergitleri koparmak için bu işlemi tekrarlayın, böylece mandibular bez rezervuarlarının gastrol kısmı çoğunlukla görünür olur. Mandibular bez rezervuarları C.Explodens işçi karıncalarında sarı renklidir, ancak renk beyazdan sarıya, diğer türlerde kırmızıya kadar değişebilir.
Daha sonra, bir diseksiyon iğnesi kullanarak, eşleştirilmiş mandibular bez rezervuarlarının balmumu benzeri içeriğini gastral bölmeden çizerek nazikçe çıkarın. Mandibular bez rezervuar içeriğinin, karınca gazlayıcısında bulunan diğer bezlere ve vücut yapılarına baskı uygulamadan izole edilebilen kısımlarını çıkarın. Mandibular bez rezervuarının tüm içeriğini toplamak gerekli değildir.
Şimdi, mandibular bez rezervuar içeriğini, diseksiyon iğnesinin ucuyla yapışana kadar hafifçe dokunarak alın. Daha sonra bez içeriğini soğuk 1,5 mililitrelik kısa iplikli bir şişeye aktarın. İğne ucunu flakonun duvarı boyunca hareket ettirmek ve bez içeriğini flakon duvarına bulaştırmak gerekebilir.
Koleksiyonu analiz edene kadar kapalı ve buz üzerinde tutun. Diseksiyonlar arasında, aletleri ve tabağı metanol ve su karışımı ile tekrar temizleyin. Bir analitik numune yapmak için, birden fazla karıncanın bez rezervuar içeriğini birleştirin.
Bu durumda, beş C.explodens işçi karıncadan alınan bez içeriği bir araya getirilir. Bir kontrol için, mandibular bez rezervuarlarına bitişik olan Dufour bezinden oluşan örnekleri toplayın. Glandüler içeriği çıkarmadan önce, analitik numunelerin kütlelerini belirleyin.
Daha sonra, hacimce 14 parça buz gibi yüksek saflıkta etil asetat ekleyin, kütlece bir parça dokuya. Hazırlığı soğutulmuş koşullar altında beş dakika boyunca girdaplayın. Ardından, numuneleri 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanları toplayın.
Beş karınca örneğinden yaklaşık 55 ila 75 mikrolitre süpernatan beklenir. Her bir süpernatanı, 0,1 mililitrelik bir mikro uç ile önceden soğutulmuş 1,5 mililitrelik kısa iplikli bir şişeye aktarın ve şişeleri, delikler ve kırmızı kauçuk PTFE Septa içeren vidalı kapaklar kullanarak sıkıca kapatın. Eksiksiz bir GCMS ölçüm dizisi için, Hekzan içinde ticari olarak temin edilebilen alkan standart çözeltilerinin bileşik başına mililitre başına sekiz miligrama seyreltilmesiyle yapılan bir tutma indeksi kalibrasyon karışımı ile 1,5 mililitrelik kısa iplikli bir şişe hazırlayın.
Ardından, çözücü boşluğu olarak hizmet etmek için başka bir saf etil asetat şişesi hazırlayın. Gaz kromatografının soğutulmuş otomatik numune alma tepsisine, önce boş çözücüyü, ikincisi, tutma indeksi kalibant karışımını, üçüncüsü, mandibular bez rezervuar içeriği ekstraktını ve dördüncüsü, Dufour'un bez içeriği ekstraktını yükleyin. Numuneleri gaz kromatografına taşımak için tepsiyle birlikte buzun üzerine koyun.
Tepsiyi soğutulmuş otomatik numune alma cihazına yerleştirin. Her numune için, hedef bileşikler için uygun bir kolon üzerinde kromatografik ayırma için GC kütle spesifikasyonuna bir mikrolitrelik bir alikuat enjekte edin. HP-5MS UI sütunu gibi.
Ardından, uygun GC parametrelerini ayarlayın. Örneğin, dakikada bir mililitrelik sabit bir kolon akışı ile taşıyıcı gazda helyum kullanın. İki dakika boyunca 40 santigrat dereceden başlayan bir fırın sıcaklık rampası, ardından dakikada 10 santigrat dereceden 330 santigrat dereceye kadar bir rampa kullanın.
Ardından yedi dakikalık bir bekletme izledi. Bu parametrelerle giriş sıcaklığını 270 santigrat dereceye ayarlayın. Şimdi, gerekirse, GC kütle spesifikasyonu için bölme oranlarını ayarlayın.
ilgilenilen bileşikler için yeterli tepe şekilleri ve yoğunlukları sağlayacak şekilde enjeksiyon. Yardımcı sıcaklığı 350 santigrat dereceye ayarlayın. Kütle spesifikasyonu için.
Aşağıdaki parametreleri kullanın. 230 santigrat derece MS kaynak sıcaklığı, 150 santigrat derece MS dörtlü sıcaklığı, düşük kütle 30 ila yüksek kütle 500 arasında bir tarama aralığı, saniyede yaklaşık üç tarama hızı ile sonuçlanır. Ve boş çözücü ve deneysel numuneler için 4,1 dakikalık bir çözücü gecikmesi veya tutma indeksi kalibant karışımı için 6,1 dakikalık bir çözücü gecikmesi.
Ölçümler tamamlandığında, GCMS veri analiz yazılımını açın ve 64 bit Linux tabanlı işletim sistemine sahip bir bilgisayara veri aktarımını kolaylaştırmak için verileri bir AIA proje dosyası olarak taşınabilir bir depolama aygıtına aktarın. Verileri analiz etmek için, metabolit dedektör yazılımının kullanımına ilişkin protokol metni açıklamasını izleyin. Tarlada karıncalar toplandı ve iki gün boyunca eksi 20 santigrat derecede donduruldu ve daha sonra analiz edilene kadar eksi 80 santigrat derecede saklandı.
Beş C.explodens işçi karıncasından alınan mandibular bez rezervuar içeriği bir araya getirildi ve GCMS ile ölçüldü. Veri analizi, düzinelerce varsayılan bez içeriği bileşiği ortaya çıkardı. Mandibular bez rezervuar içeriği ekstraktındaki iki baskın metabolit, kolonun aşırı yüklenmesine neden oldu.
Bu nedenle aynı numune, 50'ye bir gibi daha yüksek bir bölünme oranında tekrar analiz edildi. Mandibular bez rezervuar içeriğinin Dufour bezinin bileşenine göre çapraz kontaminasyonu, Dufour bezi örneklerinin incelenmesi ile araştırıldı. Bu tür kirleticiler, yaklaşık 29 dakika başlayan geç alıkonma süreleri sergiledi.
Tespit edilen varsayılan mandibular bez rezervuar içeriği metabolitleri, kurum içi bir kütüphaneye spektrum ve retansiyon indeksi benzerliğinin bir kombinasyonuna dayalı olarak tanımlandı. Bu şekilde, tespit edilen metabolitlerin yaklaşık% 10'unun kimliğini doğrulamak mümkün olmuştur, bunlardan bazıları bir ila beş bileşik olarak listelenmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, MS ölçümünü seçerek metabolitleri bir seferde nasıl izole edeceğinizi, ekstrakte edeceğinizi ve belirleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.
Bir kez ustalaştıktan sonra, aynı numunenin izolasyonu, çözücü ekstraksiyonu ve veri toplama, uygun şekilde gerçekleştirilirse yaklaşık iki saat içinde yapılabilir. Uçucu organik bileşik profilinin karmaşıklığına bağlı olarak, veri değerlendirmesi için gereken süre değişecektir. Bu prosedürü denerken, numuneyi toplamadan analize kadar kalıcı olarak soğuk tutmayı unutmamak önemlidir.
Ayrıca, bölümden önce, karıncanın gaster'ının fiziksel olarak sağlam olduğu doğrulanmalıdır. Bu prosedür aynı zamanda, metabolik bileşim ve farklı çevresel koşullar veya mutlak konserve bileşen miktarları gibi ek soruları yanıtlamak için metabolitlerin karşılaştırmalı veya mutlak miktar tayini ile birleştirilebilir. Uygun bir şekilde, bu protokolün ekstraksiyon, ölçüm ve veri değerlendirme adımları, diğer böcekler, mikroorganizmalar veya bitkiler gibi birden fazla biyolojik sisteme de uygulanabilir.
Genel Bakış
Bu çalışma, Colobopsis explodens karınca türünün küçük işçilerinin mandibula bezi rezervuarlarındaki balmumu benzeri içeriklerin izole edilmesi ve analiz edilmesi için bir yöntem sunmaktadır. Yaklaşım, metabolit profilleme için fiziksel diseksiyonu gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi ile birleştirmektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Böcek Metabolomiği
- Kimyasal Ekoloji
- Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometrisi
Arka Plan
- Karıncaların kimyasal ekolojisini anlamak, diğer organizmalarla olan etkileşimlerini incelemek için kritik öneme sahiptir.
- Mandibular bez rezervuarları, bu etkileşimlerde rol oynayan uçucu organik bileşikler içerir.
- Önceki yöntemler, bu bileşiklerin izolasyonu ve analizi için kapsamlı bir yaklaşımdan yoksundu.
- Bu çalışma, etkili bir analiz için iki bölümlü bir iş akışı sunmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Karınca mandibular bezlerinden uçucu bileşenlerin izole edilmesi ve analiz edilmesi için bir yöntem geliştirmek.
- Bu uçucu maddelerin karıncaların kimyasal iletişimindeki rolunu aydınlatmak.
- Böcek metabolomiği alanındaki araştırmacılar için tekrarlanabilir bir protokol sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- C. explodens işçi karıncalardan mandibular bez rezervuarlarının diseksiyonu.
- Bez içeriklerinin etil asetat kullanılarak solvent ekstraksiyonu.
- Uçucu bileşiklerin profillenmesi için gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi.
- Metabolitlerin anotasyonu ve tanımlanması için MetaboliteDetector kullanımı.
Ana Sonuçlar
- Mandibular bezlerden balmumu benzeri içeriklerin başarılı bir şekilde izole edilmesi.
- GC-MS kullanılarak çeşitli uçucu organik bileşiklerin tanımlanması.
- Yöntemin karınca metabolitlerinin profillenmesindeki etkinliğinin gösterilmesi.
- Karınca kimyasal ekolojisinin incelenmesindeki potansiyel uygulamalar.
Sonuçlar
- Sunulan yöntem, karınca bez içeriklerinin analizi için güvenilir bir yaklaşım sağlamaktadır.
- Bulgular, karıncalardaki kimyasal iletişimin anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır.
- Bu iş akışı, diğer böcek türleri ve çalışmalar için uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Bu protokol, model olmayan böceklerdeki özelleşmiş bez dokularının izolasyonunu ve uçucu metabolit profillemesini sağlayarak, kimyasal ekolojide hedef doğrulamasını ve biyoaktif bileşik keşfinde mekanistik risk azaltma çalışmalarını destekler. Mandibuler bez rezervuar analizi için tekrarlanabilir bir iş akışı sunarak, pestisit geliştirme veya türler arası sinyalleşme çalışmalarında potansiyel uygulamaları olan yeni uçucuların tanımlanmasını kolaylaştırır. Yöntemin farklı biyolojik sistemlere uyarlanabilirliği, standartlaştırılmış ve ölçeklenebilir numune hazırlama gerektiren erken aşama keşif süreçlerindeki faydasını artırmaktadır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Fonksiyonel karakterizasyon için biyoaktif bez salgılarının izole edilmesi yoluyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Soğuk zincirleme taşıma ile toplama sonrası metabolit değişimini minimize eden standart bir diseksiyon protokolü sağlar.
- Öngörücü Değer: Uçucu profilleri savunma veya sinyalleşme gibi ekolojik fonksiyonlarla ilişkilendirerek öncü madde tanımlamasını destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Örnek grupları genelinde uçucu bileşiklerin tespiti için analiz standardizasyonuna olanak tanıyan kantitatif GC-MS verileri üretir.
- Operasyonel Değer: Otomatik sıvı taşıma ve GC-MS enjeksiyon sistemleri ile uyumlu solvent ekstraksiyonu ve süpernatant hazırlığını kolaylaştırır.
- Ölçeklenebilirlik: Havuzlanmış karınca örnekleri, metabolit tanımlamasındaki istatistiksel güveni artıran tekrarlı ölçümlere imkan tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Metabolit profillerinin farklı çevresel koşullar veya türler arasında karşılaştırılmasına olanak tanıyarak, kimyasal iletişim sistemlerinde biyobelirteç keşfini destekler.
- Mekanistik Risk Azaltma: Komşu bezlerden (örneğin Dufour bezi) kaynaklanan çapraz kontaminasyonun kontrol altına alınmasıyla, bileşik özgüllüğünün araştırılmasına imkan tanır.
- Öngörücü Güvenilirlik: MetaboliteDetector'da tutma indeksi ve spektral eşleştirmenin kullanılması, sonraki fonksiyonel analizler için anotasyon güvenilirliğini artırır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, erken hedef araştırmasından öncü bileşik optimizasyonuna kadar olan keşif sürekliliğine, özellikle de bez salgılarının biyoaktif molekül kaynakları olduğu doğal ürün keşif süreçlerine uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Beze özgü metabolitlerin izolasyonuna olanak tanıyarak, uçucu maddelerin türler arası etkileşimlerdeki rolüne ilişkin hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Örnek başına düzinelerce muhtemel bileşiğin tespit edilmesini sağlayan, yüksek çözünürlüklü GC-MS taramasına uygun ekstraktlar üretir.
- Analitik: Deneysel ve kontrol örnekleri arasında karşılaştırmalı analize imkan veren kromatografik ve kütle spektral veriler oluşturur.
- Translasyonel Araştırma: Bez metabolit profillerini ekolojik fonksiyonlarla ilişkilendirerek, ileri fonksiyonel doğrulama için bileşik seçimini bilgilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Ekstraksiyon ve GC-MS basamakları diğer böcek türlerine, mikroorganizmalara veya bitki sistemlerine uygulanarak platformun çok yönlülüğünü artırabilir.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Beze spesifik izolasyon ve kontaminasyon kontrolleri aracılığıyla mekanistik belirsizliği azaltarak hedef doğrulama güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış soğuk zincir numune taşıma ve çözücü ekstraksiyon oranları ile tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Erken aşama uçuculuk ve saflık verileri sağlayarak doğal ürün keşfindeki devam/durdur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Tespit sıklığı, bolluk ve varsayımsal tanımlama güvenine dayalı olarak metabolitlerin riske göre ayarlanmış önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Çapraz kontaminasyon olmadan bez rezervuarlarını izole etmek için mikrodiseksiyon ve stereo mikroskopi uzmanlığı gerektirir.
- Soğutmalı otomatik örnekleyiciye ve 330°C'ye kadar sıcaklık programlı analiz kapasitesine sahip GC-MS cihazına bağımlıdır.
- Standartlaştırılmış solvent ekstraksiyon protokolleri (etil asetat hacim-kütle oranı) ve toplamadan analize kadar soğuk zincir bakımını zorunlu kılar.
- Farklı biyolojik matrisler için alıkonma indeksi kalibrasyonunun ve MetaboliteDetector parametrelerinin adaptasyonunu gerektirir.
- Yeterli süpernatant hacmine ulaşmak için (beş karıncadan 55–75 µL) havuzlanmış numunelere duyulan ihtiyaçla sınırlıdır, bu durum nadir türler için işlem hacmini etkiler.
