DNA onarım işlemleri, Darbe Gerilimlerinden ve uzun süreli iki iplikçikli DNA sonları ayirt mikroskobu ile karakterize

Bu yöntem, DNA onarım kompleksi oluşumu, lokalizasyonu ve çözünürlüğünün nasıl düzenlendiği gibi DNA onarım alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, değişiklikleri açık bir şekilde tespit edebilmesi ve karmaşık lokalizasyon ve kinetiği onarabilmesidir. Laboratuvarımdaki bu lisans araştırmacılarına ek olarak, üç yüksek lisans öğrencisi deneyleri gerçekleştirecek.

Bunlar Changkun Hu, Dalton Dacus ve Stephen Walterhouse olacak. Başlamak için, U2OS / DR-GFP hücrelerini 10 santimetrelik bir doku kültürü plakasında% 85 ila 90 birleşene kadar büyütün. Daha sonra ortamı çıkarın, üç mililitre EDTA ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin.

EDTA'yı bir mililitre tripsin ile değiştirin ve hücreleri 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Sonra tripsini nötralize etmek için beş mililitre DMEM ekleyin. Hücreleri saydıktan sonra, cam tabanlı 96 oyuklu bir plakada 200 mikrolitre ortamda oyuk başına altı kez 10 ila üçüncü hücreye tohumlayın.

Alternatif olarak, 10 santimetrelik bir plakaya yerleştirilmiş 12 milimetre örtü fişleri üzerinde sekiz mililitre ortamda altı kuyucuğa dört kez 10 kez tohumlayın, ardından hücreleri gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte büyütün. Çift iplikli kopmaları veya DSB'leri indüklemek için, ortamı DMEM artı% 10 FBS ile 25 mikromolar konsantrasyona seyreltilmiş hidrojen peroksit ile değiştirin ve plakayı bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri 1x PBS ile üç kez yıkayın, ardından taze DMEM ekleyin.

Hücreleri inkübe ettikten sonra sabitlemek için, plakayı üç kez yıkamak için PBS kullanın. Ardından, her bir zaman noktası için 10 santimetrelik plakadan bir kapak fişini dikkatlice çıkarmak için bir iğne ve forseps kullanın ve 24 oyuklu bir plakanın tek bir kuyucuğuna yerleştirin. % 4 PFA ekleyin ve hücreleri 15 dakika inkübe edin.

Sonra biz PBS kapak fişlerini üç kez yıkamak için. Hücrelere nüfuz etmek için% 0.5 iyonik olmayan deterjan ve PBS ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

Sonra hücreleri tekrar PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, PBS'de seyreltilmiş %3 BSA ve %0.1 iyonik olmayan deterjanı 24 oyuklu bir plakadaki kapak kızaklarına ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra, ilgilenilen onarım proteinini hedef alan birincil antikorları ekleyin ve numuneleri oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

Hücreleri PBS ile üç kez yıkadıktan sonra, DAPI ekleyin ve plakaları oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Daha sonra numuneleri ikincil antikorlarla inkübe edin. Hücreleri daha önce olduğu gibi yıkadıktan sonra, kapak kızaklarını hücre tarafı aşağı bakacak şekilde kızaklara monte etmek için montaj reaktifi kullanın.

Kapak kızaklarına dikkatlice bastırın ve fazla montaj reaktifini emmek için bir mendil kullanın. Kapak fişlerini hızlı kuruyan şeffaf oje ile kapatın ve kapak fişinin sürgü ile tam olarak kapatılmasını sağlayın. DAPI kanalına odaklanarak konfokal mikroskop görüntüleri alın.

İmmünofloresan görüntülerde çekirdekleri tanımlamak için, görüntü dosyasını ImageJ penceresine sürükleyerek veya ImageJ'deki eklenti araç çubuğundan biyo-biçim içe aktarıcıyı seçerek konfokal görüntüleri açın. Ardından kanalları böl'ü seçin. Renk seçenekleri altında, açılır menüden renkli'yi seçin.

DAPI ve histon H2AX görüntülerini ayrı pencereler olarak açmak için Tamam'ı seçin ve DAPI görüntüsünü seçin. Ardından, çekirdeği seçmek için eşiği ayarla seçeneğinde görüntü araç çubuğunu seçin. Ardından, eşik penceresinin alt çubuğunu tamamen sağa kaydırarak görüntü eşiğini ayarlayın.

Çekirdekler belirgin ana hatlarla tamamen kırmızı görünene ve arka plan siyah olana kadar üst çubuğu ayarlayın. Ardından analiz araç çubuğunu ve parçacıkları analiz et seçeneğini seçin. Çekirdeğin minimum boyutunu girin.

Göster açılır menüsünden ana hatları seçin, ardından yöneticiye ekle seçeneğini seçin. ROI yöneticisi penceresini açmak için Tamam'a tıklayın. ROI yöneticisi penceresinden, seçime göre çekirdeklere numaralar atayın.

H2AX odaklarını ve immünofloresan mikroskobu görüntülerini ölçmek için ImageJ'yi kullanmak için H2AX odakları penceresini seçin. Ardından işlem araç çubuğunu seçin ve çekirdek içindeki odakları bulmak için maksimum bul'u seçin. Çıktı türü açılır menüsünden, tek nokta seçeneğini belirleyin ve maksimum odakları görselleştirmek için önizleme noktası seçimini seçin.

Ardından, görüntünün floresan yoğunluğuna bağlı olarak bir gürültü tolerans değeri girin. ROI yöneticisi penceresinden, H2AX odaklarının ölçülmesi gereken çekirdekleri seçin. Seçilen çekirdeklerdeki maksimum odak sayısını ölçmek için ölçüyü seçin.

Ham yoğunluk değerlerini kopyalayın ve veri analizi için yazılıma yapıştırın. Bu videoda daha önce gösterildiği gibi hücreleri 96 oyuklu plakalara kapak kızakları ile oturttuktan sonra, I-SceI ekspresyon vektörü ile hücreleri transfekte etmek için lipid bazlı bir transfeksiyon ajanı kullanarak çift iplikli kırılmaları indükleyin. Daha önce gösterildiği gibi vix geçirgen ve bloke hücreleri yıkadıktan sonra hayal etmek için, gama H2AX'e karşı antikorlar ekleyin ve ilgilenilen proteini onarın.

1x PBS ile 96 kuyulu plaka kapağı üç kez kayar. Daha sonra 96 oyuklu plaka kapak fişlerini ikincil antikorlarla inkübe edin. Son olarak, büyük bir nükleer gama H2AX odağına sahip hücreleri tanımladıktan sonra, ilgilenilen onarım proteini ile kolokalizasyon gösterenleri manuel olarak sayın.

Bu şekil, 90'lık bir gürültü ayrımını gösterir ve doğru odak sayısını işaretler. Kenardaki çekirdekler ve çekirdeğin dışındaki odaklar, niceleme sırasında sayılmaz. Burada gösterilen panel, 50'lik düşük bir gürültü toleransını göstermektedir.

Çekirdeğin dışında ve çekirdeğin içinde çok sayıda maksimum tanımlanır. Bu hücrede 220 gibi yüksek bir gürültü toleransı bulunur. Sadece tek bir odak tespit edildi.

Bir gama H2AX odağının ve ilgilenilen bir onarım proteininin kolokalizasyonu bu şekilde gösterilmiştir. Burada transfekte edilmemiş bir hücre gösterilmiştir ve sağ üstte nükleer olmayan gama H2AX odağına sahip bir hücre gösterilmektedir. Daha yüksek büyütme oranında, gerçek bir iç odak ile nükleer olmayan veya dış odak arasında daha net bir resim ayırt edilebilir.

Son olarak, bir onarım proteininin kolokalizasyonu olmadan bir nükleer gama H2AX odağı örneği burada gösterilmiştir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa birkaç gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü takiben, ilgilenilen onarım proteinleri arasındaki etkileşimleri belirlemek için ko-mutor çökeltme gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, DNA'da geçici çift iplikçik kırılmalarını indükleyerek DNA onarım komplekslerinin oluşumunu ve çözünürlüğünü nasıl gözlemleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Ayrıca, uzun süreli lezyonları indükleyerek onarım faktörlerinin yanlış lokalizasyonunu gecikmiş işe alımdan nasıl ayırt edeceğinizi de öğreneceksiniz.