Li-Fraumeni sendromu hasta kaynaklı indüklenmiş Pluripotent kök hücreler kullanılarak osteosarkom modelleme

Bu Li-Fraumeni sendromu iPSC tabanlı osteosarkom modeli, osteosarkom araştırma alanındaki kanser modellemesinde hasta iP hücrelerinin kullanımıyla ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu modelin temel avantajı, mekanik çalışmalar, biyobelirteç tanımlama ve ilaç taraması için osteosarkom gelişiminin tüm aşamalarında sınırsız hücre üretilmesine izin vermesidir. Ruoji hücre kültürü prosedürünü gösterecek ve ben de hayvan prosedürünü göstereceğim.

İki haftalık fare embriyonik fibroblastından veya MEF'den sonra, ko-kültür% 80 ila 90 birleşik iPS hücre kültürünü beş mililitre DPBS ile yıkayın ve ardından oda sıcaklığında üç dakikalık bir inkübasyon için hücrelere bir mililitre hücre ayırma çözeltisi ilave edin. Hücrelerin mezenkimal kök hücrelere farklılaşmaları için jelatin kaplı bir plakaya bağlanabilmeleri için iPS hücrelerinin MEF'lerde en az 14 gün boyunca iyi koşullarda tutulması kritik öneme sahiptir. Hücreler plakanın altından ayrıldığında, hücre ayırma çözeltisini nötralize etmek için hücrelere dokuz mililitre MEF / MSC kültür ortamı ekleyin ve hücre süspansiyonunu kaplanmamış 100 milimetrelik bir doku kültürü plakasına aktarın.

MEF'lerin plakaya yapışmasını sağlamak için hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin ve bağlanmamış iPS hücresi içeren süpernatantı dikkatlice toplayın. iPS hücre çözeltisini santrifüjleyin ve peleti altı mililitre MSE farklılaşma ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, altı oyuklu bir kültür plakasının% 0.1 jelatin kaplı üç oyuğunun her birine iki mililitre hücre tohumlayın ve plakayı 28 gün boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin, hücrelere bağlanmamış veya ölü hücreleri çıkarmak için her iki günde bir taze ortamla besleyin.

28. günde, kümelerin kenarlarında gözlenen fibroblast benzeri MSC'ler ile büyük farklılaşmış hücre kitleleri görünür olacaktır. Hücre kültürlerini oyuk başına bir mililitre DPBS ile yıkayın, ardından oda sıcaklığında oyuk başına 0.5 mililitre% 0.25 Tripsin-EDTA ile ayrılmasını sağlayın. Üç dakika sonra, Tyrypsin'i oyuk başına 1.5 mililitre MEF / MSE kültür ortamı ile nötralize edin ve ayrılan MSE'leri santrifüjlemeleri için tek bir 15 mililitre konik tüpe koyun.

Peletleri üç mililitre MEF / MSE kültür ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri% 0.1 jelatin kaplı 60 milimetrelik bir plakaya tohumlayın ve hücreler% 100 birleşime ulaşana kadar ortamı iki günde bir değiştirin. % 100 birleşen kültürü bir ila üç oranında böldükten sonra, MSC'ler hızla çoğalacak, fibroblast benzeri bir morfoloji gösterecek ve kültür yüksek bir yoğunluğa ulaştığında girdap benzeri bir kültür modeli oluşturacaktır. iPS hücresinden türetilen MSC'ler, farklılaşmaları sırasında herhangi bir noktada mezenkimal kök hücre belirteçleri için bir immünofloresan boyama ile de incelenebilir.

MSE'yi osteoblastlara ayırmak için,% 95 birleşik hücre kültüründen uygun sayıda MSE'yi 24 saat boyunca uygun MEF / MSC kültür ortamı hacminde bir hücre kültürü plakasına plakalayın. Daha sonra süpernatanı ertesi gün ve kültür periyodunun sonuna kadar her iki günde bir uygun hacimde osteoblast farklılaşma ortamı ile değiştirmeye başlayın. Preosteoblastlar tarafından üretilen kemikle ilişkili alkalin fosfatazı ve olgun osteoblastlar tarafından üretilen mineral birikimini tespit etmek için, uygun deneysel zaman noktalarında üreticinin protokolüne göre sırasıyla alkalin fosfataz ve Alizarin Red S boyaması gerçekleştirin.

Farklılaşmış osteoblastlarla bir in vivo tümör oluşumu modeli oluşturmak için, osteoblastik farklılaşmayı başlatmak için uygun sayıda MSC'yi beş adet 100 milimetrelik tabağa tohumlayın. Osteoblastik farklılaşmanın 14. gününde, beş mililitre DPBS ile beş osteoblast kültür plakasını yıkayın ve hücreleri tabak başına 1.5 mililitre osteoblast dekolmanı çözeltisi ile tedavi edin. 37 santigrat derecede 30 dakikalık bir inkübasyondan sonra, hücrelerin ışık mikroskobu ile ayrıldığını doğrulayın ve dekolman çözeltisini taze osteoblast farklılaşma ortamı ile nötralize edin.

Hücreleri santrifüjleme için 50 mililitrelik konik bir tüpte toplayın ve peleti 25 mililitre taze osteoblast farklılaşma ortamında yeniden süspanse edin. Saymadan önce toplanmış hücreleri çıkarmak için hücre çözeltisini 70 mikron süzgecinden süzün ve deri altı enjeksiyon başına 1 X 10 ila 7 hücre ayırın. Hücreleri santrifüjleme ile peletleyin ve hücreleri 50 mikrolitre buz gibi soğuk DPBS konsantrasyonu başına 1 X 10 ila 7 osteoblastta sulandırın.

Osteoblastları eşit hacimde fenol-kırmızı içermeyen bazal membran matrisi ile karıştırın ve hücreleri enjeksiyonlarına kadar buzun üzerine yerleştirin. Sekiz haftalık bir dişi bağışıklığı baskılanmış çıplak farede ayak parmağının kıstırılmasına yanıt verilmediğini doğruladıktan sonra, hücreleri 27 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik şırıngaya yükleyin ve deri altından 100 mikrolitre hücreyi dezenfekte edilmiş kanadına enjekte edin. Daha sonra, deri altı nodüler yoğunlukların büyümesi için enjeksiyon bölgesinde haftalık çarpıntı ile fareleri izleyin.

Enjeksiyondan altı ila 10 hafta sonra tümör oluşumu gözlenmelidir. Yerleşik LFS iPS hücre klonları, tipik bir insan embriyonik kök hücre morfolojisi sergilemeli ve pozitif bir alkalin fosfataz aktivitesi göstermelidir. LFS iPS hücreleri ayrıca, insan embriyonik kök hücre dizileriyle karşılaştırılabilir ve ebeveyn fibroblastlarında gözlenen seviyelerden çok daha yüksek olan pluripotens faktör mRNA'larını yüksek oranda eksprese eder.

Başarılı bir şekilde farklılaşmış LFS MSC'ler, immünofloresan boyama ile değerlendirildiği gibi CD44, CD73, CD105 ve CD166 dahil olmak üzere tipik MSC belirteçlerini de eksprese eder. MSC'ler osteojenik farklılaşma sinyallerine maruz kaldığında, farklılaşmış hücreler dokuzuncu günde pozitif alkalin fosfataz aktivitesi ve 21. günde mineral birikimi sergilemeye başlar. Farklılaşan osteoblastlar ayrıca, farklılaşma süreçleri boyunca pre-osteoblast ve olgun osteoblast genlerinin yukarı regüle edilmiş bir ekspresyonunu gösterir.

Osteoblast enjeksiyonundan altı ila 10 hafta sonra LFS osteoblast türevi tümörler, pozitif alkalin fosfataz aktivitesi, pozitif kollajen matris birikimi ve negatif mineralizasyon dahil olmak üzere olgunlaşmamış osteoblast özellikleri gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, Li-Fraumeni Sendromu iPS Hücrelerini osteoblastlara nasıl ayırt edeceğinizi ve hastadan türetilen osteoblastları kullanarak in vivo bir osteosarkom modeli oluşturacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Osteosarkoma ek olarak, bu Li-Fraumeni Sendromu iPS hücre bazlı hastalık modeli, yumuşak doku sarkomu, meme kanseri ve beyin tümörleri gibi Li-Fraumeni Sendromu ile ilişkili diğer malignitelere de uygulanabilir.