Name: Li-Fraumeni sendromu hasta kaynaklı indüklenmiş Pluripotent kök hücreler kullanılarak osteosarkom modelleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Keşfedin Li-Fraumeni sendromu hastalarından elde edilen iPS hücrelerini osteoblastlara farklılaştırma ve osteosarkom modelleme yöntemlerini. Bu protokol mekanistik çalışmalar, biyobelirteç tanımlama ve ilaç taraması için sınırsız hücre üretimi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R. Z. UTHealth yenilik tarafından kanser önleme araştırma eğitim programı Pre-Doctoral bursu için (kanser önleme ve RP160015 vermek Texas Araştırma Enstitüsü) desteklenir. J.T. ilk bağlı hastane, Sun Yat-sen üniversite Ke Lin Program tarafından desteklenir. Ö-Tayback kanser araştırma'CPRIT uzman ve NIH için yol bağımsızlık Ödülü R00 CA181496 ve CPRIT Ödülü RR160019 tarafından desteklenir.

Bu eser Texas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Houston (UTHealth) hayvan refahı Komitesi tarafından kabul edildi. Deneyler ile laboratuvar hayvan Tıp & bakım (hangi Amerikan Derneği tarafından akredite olmuştur laboratuvar (AAALAC International) için hayvan bakım CLAMC) için UTHealth Merkezi tarafından belirlenmiş standartlara sıkı uygun olarak gerçekleştirilir. Bu çalışmanın insan denekler bir ("Hayır insan konularda araştırma") senaryosunda NIH SF424 belgeleri tarafından tanımlandığı gibi düşmek. Bu nedenle, UTHealth insan Araştırma Etik Komitesi tarafından herhangi bir onay gerektirmez.
1. nesil LFS iPSCs (Şekil 1A)
<ol><li>-2 günde 2 x 104 LFS hasta fibroblastlar 6-şey plaka bir kuyunun içine plaka ve fibroblast Orta (Tablo 1) içeren hücreleri oksijen %5 37 ° C'de kültür CO2 kuluçka makinesi. Fibroblastlar iletim (0 gün) günde % 50-60 izdiham ulaşmak emin olun.</li>
	<li>Sendai virüs iletim gün 0 gerçekleştirin. Bunu yapmak için önceden ısıtılmış fibroblast orta ile harcanan orta yerine. Virüs yeniden programlama kiti ( Tablo malzemelerigörmek) buz üzerinde ticari Sendai çözülme. LFS fibroblastlar üretici yönergelerine göre karışık Sendai virüs ile enfekte.</li>
	<li>Bakım transduced hücre fibroblast Orta (gün 1-6):<ol>
<li>Günde 1, 24 h iletimi sonra kalan Sendai virüs içeren fibroblast orta kaldırın ve 2 mL taze fibroblast orta ile değiştirin. Oksijen %5 37 ° C'de transduced fibroblastlar kültür CO2 kuluçka makinesi.</li>
		<li>Fibroblast orta ile Orta 2-6 günden beri her gün değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bakım transduced hücre besleyici kültür koşulu (7-28 gün):<ol>
<li>Radyasyonlu CF1 fare embriyonik fibroblast (MEF) kültür yemekleri gün 6 hazırlamak. Bu kat yapmak kaplama sonra % 0,1 jelatin altı 100 mm doku kültürü yemekleri her plaka, oda sıcaklığında 30 dakika süreyle 5 mL %0,1 jelatin ekleyerek Aspire edin.</li>
		<li>MEFs sıvı azot kapsayıcıdan kaldır. Üreticinin yönergelerini izleyerek ticari olarak mevcut çözülme sistemi kullanarak MEFs çözülme. Hücreleri jelatin kaplı plakalar üzerinde bir tohumlama yoğunluğu 6.7 x 100 mm doku kültürü çanak başına 105 hücre çevresinde, MEF/MSC kültür orta (Tablo 1) plaka.</li>
		<li>MEF plakaları (7 gün) transduced hücreleri aşılamak: 1 mL % 0.25 kullanarak transduced hücre Trypsinize tripsin-EDTA 100 mm çanak için oda sıcaklığında 2-4 dakika başına. Tripsin fibroblast orta 9 mL ile etkisiz hale getirin. Konik tüpler hücrelere transfer ve santrifüj hücreleri vasıl 230 x g 4 dk. 37 ° C'de gün 6 tarihinde hazırlanan altı MEF yemekleri transduced fibroblastlar plaka ve onları fibroblast orta çanağı başına 8 ml kültür. Not: MEFs confluency % 20 transduced hücre MEF plakalar üzerinde tohum önce civarındadır.</li>
		<li>Günde 8, fibroblast orta atmak ve hESC Orta (Tablo 1) ile değiştirin.</li>
		<li>Gün 9-28 IP'leri klonlar (Şekil 1C) ortaya çıkması için bekleyin. İzlenme hESC orta her gün değiştirin ve IPS klonlar mikroskop altında ortaya çıkması izlemek. İPSCs klonlar çıplak gözle uyması gereken büyük gözlemek ve IPS klonlar besleyici-Alerjik kültür durumda genişletmeye devam edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ortaya IP'leri genişlemesi klonlar besleyici-Alerjik kültür durumda (gün 29-79 ~ 99):<ol>
<li>Matris kaplı plaka hazırlamak için çözümün membran matris kaplama (Tablo 1) iyi başına 120 µL 48-şey plakalı kat. Membran matris kaplama çözüm de kapsar ve kültür çanak yüzeyi kat emin olun. Kaplama çözüm kullanımdan hemen önce oda sıcaklığında 1 h. aspiratı için bırakın ve hESC Orta 2 µM ROCK inhibitörü Thiazovivin iyi başına 250 µL ekleyin.</li>
		<li>Gün 28 izlenme hESC orta Aspire edin ve IPS klonlar 1 x DPBS ile yıkayın. 1 mL pipet ucu ve tedavi 48-şey plaka (adım 1.4.1) bir kuyuya transferi ile görünür IP'leri klonlar almak. 48-şey plaka kuyu başına tohum bir koloni.</li>
		<li>Plaka vasıl 230 x g hücre eki kolaylaştırmak 4 dakika santrifüj kapasitesi. Kültür IP'leri klonlar oksijen %5 37 ° C'de CO2 kuluçka makinesi.</li>
		<li>Ertesi gün (gün 29), harcanan hESC orta kaldırın ve ticari olarak mevcut IPSC orta 250 µL her kuyuya ekleyin.</li>
		<li>IPS klonlar oksijen %5 37 ° C'de korumak CO2 kuluçka ve değişim IPSC orta her geçen gün.</li>
		<li>IPS klonlar % 85 izdiham ulaştığınızda, bir 1:10 at alt kültür hücreleri kültür alanına göre oranı. 60 µL hücreleri ayırmak ve 3 dk 37 ° C'de kuluçkaya ticari passaging çözüm ekleyin.</li>
		<li>Bir membran matris kaplı 12-şey plaka hESC Orta 2 µM ROCK inhibitörü Thiazovivin ile 1 ml üzerinde müstakil iPSCs yarısı tohum. Kültür IP'leri klonlar bir 12-şey plaka ile piyasada bulunan IPSC orta iyi ve alt kültür iPSCs başına 1 mL 1:10, geçit 10 ulaşana kadar oranı. Not: iPSCs 5-7 günde bir 1:10 kültürlü alt vardır oranı. IPS klonlar geçit 10 ulaşmak 10 haftaya kadar sürer. IPSC karakterizasyonu hücre morfolojisi, alkalen fosfataz (AP) aktivite ve pluripotency faktörler ve hESC işaretleri, ifadesi de dahil olmak üzere (genellikle yaklaşık 10'dan sonra gösterdi iPSCs Sendai virüs kaldırılması onayladıktan sonra incelenebilir pasajlar) (Şekil 1B-E). Antikor ve astar bilgi IPSC karakterizasyonu için Tablo 2 ve 4' de dahil edilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. farklılaşma LFS iPSCs için mezenkimal kök hücre (MSCs) (Şekil 2A)
<ol><li>Kültür IPSC klonlar MEF tabaklarda en az 2 hafta (gün ~ -14-0): daha önce açıklandığı gibi MEF yemekleri (100 mm doku kültürü yemekleri) hazırlamak (1.3.1 - 1.3.2). İPSCs hESC ortamda korumak ve orta her gün değiştirin. Ne zaman iPSCs ulaşmak % 90 izdiham, alt kültür iPSCs 1:10 seyreltme.</li>
	<li>İPSCs (0 gün) MEFs kaldırılması:<ol>
<li>İPSCs MEFs üzerinde 2 hafta sonra sürdürmek, kültür iPSCs 100 mm doku kültürü yemekleri kadar hücreleri % 80-90 izdiham ulaşmak. İzlenme hESC orta kaldırmak ve iPSCs 1 x DPBS 5 mL ile yıkayın. 1 mL hücreleri ayırmak ve 3 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya hücre dekolmanı çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>MEF/MSC kültür ortamının 9 mL hücre dekolmanı çözüm etkinliği etkisiz hale getirmek ve herhangi bir kaplama olmadan yeni bir 100 mm doku kültürü tabak müstakil hücreleri aktarmak için plaka ekleyin.</li>
		<li>Hücreleri plakasına eklemek MEFs izin vermek 30 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>Dikkatle bekâr iPSCs ve 4 dk için 230 x g 4 ° c de santrifüj içeren süpernatant toplamak. Not: Dikkatsizce plaka alt reçeteye göre sarf MEFs dekolmanı yol açar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MSCs (gün 0 - 28) doğru iPSCs farklılaşma:<ol>
<li>6-şey plaka üç wells ile 1 mL %0.1 jelatin iyi, oda sıcaklığında 30 dakika başına kat.</li>
		<li>Toplanan iPSCs süpernatant 2.2.4 kaldırın.</li>
		<li>(Gün 0) başına 2 mL ile MSC farklılaşma Orta (Tablo 1) ve tohum hücrelerinin üç kaplamalı Wells 6 ml iPSCs resuspend.</li>
		<li>MSC farklılaşma orta iki günde bekâr ve/veya ölü hücreleri (gün 1 - 28) kaldırmak için değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Olgunlaşma IPSC kaynaklı MSCs (gün 28-45):<ol>
<li>Harcanan MSC farklılaşma orta kaldırmak ve 1 mL 1 x DPBS hücrelerle yıkayın.</li>
		<li>MSCs %0.25 0.5 mL ile trypsinize tripsin-EDTA iyi 3 dakika oda sıcaklığında başına.</li>
		<li>Tripsin tarafından 1.5 mL MEF/MSC kültür ortamının nötralize ve MSCs Üç kuyusundan bir 15 mL konik tüp içine toplamak. 230 x g 4 ° c de santrifüj 4 dk için.</li>
		<li>Süpernatant kaldırmak ve MSCs MEF/MSC kültür orta ve plaka üzerinde bir 60 mm % 0,1 jelatin kaplı levha (28 gün) 3 ml resuspend.</li>
		<li>MSCs MEF/MSC kültür ortamda kültür ve orta iki günde değiştirin. Ne zaman hücreleri ulaşmak % 100 izdiham, alt kültür MSCs kullanarak %0.25 1:3 oranında tripsin-EDTA. Not: MSCs fibroblast benzeri morfoloji (Şekil 2B) görüntüler. MSCs bir yüksek yoğunluklu büyüdüğünde, uzamış MSCs bir girdap benzeri desen (Şekil 2B) oluşabilir.</li>
		<li>MSC yüzey işaretleyicileri CD44, CD73, CD105 ve CD166 inceleyerek IPSC kaynaklı MSCs değerlendirmek için immünfloresan boyama gerçekleştirmek (Şekil 2C). Not: Antikor seyreltme Tablo 2' de gösterilmiştir. Canlı hücrelerin immünfloresan boyama üretici yönergelerine göre gerçekleştirilir.</li>
		<li>Onay alındıktan sonra 100 mm doku kültürü yemekleri 1:3 oranında MSCs genişletin. Şişeleri (100 mm doku kültürü çanak başına 3 şişe) aşağı dondurma dondurucu orta % 10 DMSO ve % 90'ı içeren kullanarak FBS. Not: MSC nüfus zenginleştirmek için MSCs CD105 kullanarak sıralayabilirsiniz+, CD24-ölçüt akış sitometresi9,17. Ayrıştırılan IPSC kaynaklı MSCs PDGF AB-tabanlı yöntemi yaygın olarak kullanarak 2-3 ay kültür MSC kimlik9kaybı olmadan sürdürülebilir. MSCs MSC özellikleri onayladıktan sonra erken bir geçit numarasından dondur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. farklılaşma LFS MSCs dokusunu (Şekil 3A) için
<ol><li>Osteojenik farklılaşma (gün -1) için MSCs hazırlanması<ol>
<li>Hücre Osteojenik farklılaşma Protokolü tamamlamak için yeterli bir miktar emin olmak için 100 mm doku kültürü yemekleri için % 95 izdiham kültürlü MSCs başlar. Harcanan kültür orta kaldırmak ve MSCs 1 x DPBS 5 mL ile yıkayın.</li>
		<li>MSCs % 0.25 tripsin-EDTA başına 100 mm çanak 3 dakika oda sıcaklığında 1 mL ile trypsinize. Hücreleri değil üzerinde trypsinized emin olmak için hücre dekolmanı % 50'si mikroskop altında görülmektedir trypsinization durdurur.</li>
		<li>Tripsin tarafından 9 mL MEF/MSC kültür ortamının nötralize ve MSCs 3 kuyulardan bir 15 mL konik tüp içine toplamak. 230 x g 4 ° c de santrifüj 4 dk için.</li>
		<li>Süpernatant Aspire edin, MSCs 5 mL MSC orta resuspend ve bir hemasitometre tarafından hücreleri saydırmak.</li>
		<li>Plaka uygun sayıda MSCs kültür plaka üzerinde. Not: Hücre sayıları 12-şey plaka, 6 iyi-plaka ve 100 mm doku kültürü yemekleri detayını Tablo 3' te özetlenmiştir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İndüksiyon Osteojenik farklılaşma osteoblast farklılaşma Orta (ODM) (Tablo 1) (gün 0 - 24):<ol>
<li>MEF/MSC kültür orta Aspire edin ve ODM uygun hacmi ile değiştirin (1 mL, 2 mL ve 8 mL 12-şey plaka her şey, her şey 6-şey plaka ve 100 mm doku kültürü için çanak, sırasıyla) MSCs dokusunu (0 gün) ayırt etmek için.</li>
		<li>Harcanan ODM Aspire edin ve Osteojenik farklılaşma işlemi sırasında her iki günde ODM uygun hacmi ile değiştirin.</li>
		<li>Alkalen fosfataz (AP) gerçekleştirmek ve alkalen fosfataz kemik ilişkili preosteoblasts tarafından üretilen ve mineral ifade tarafından üretilen algılamak için boyama Alizarin Red S (ARS) dokusunu, sırasıyla, günde 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 ve 24 ( Olgun Şekil 3B). Not: AP boyama ve ARS boyama üretici protokol sonrası ticari olarak mevcut kit kullanılarak gerçekleştirilir.</li>
		<li>Preosteoblast ve olgun osteoblast işaretleri (ALPL ve COL1A1 preosteoblasts için; ifade düzeyde incelemek PTH1R ve BGLAP için olgun dokusunu) qRT-PCR (Şekil 3 c) tarafından. Not: Gün 9'dan sonra Osteojenik farklılaşma beklenen olumlu AP boyama ve olumlu ARS boyama Osteojenik farklılaşma 21 gün sonra beklenebilir. MEF/MSC kültür ortamında büyüyen MSCs AP boyama ve ARS boyama negatif bir kontrol servis edilebilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. LFS MSC kaynaklı dokusunu (Şekil 4A) in vivo Tumorigenesis çalışmaya Xenograft modeli
<ol><li>LFS MSCs farklılaşma dokusunu için:<ol>
<li>Tohum 3-4.5 x 100 mm doku kültürü tabak içinde 105 MSCs. Beş yemekleri bir Subkutan Enjeksiyon için hazırlamak.</li>
		<li>Kültür MSCs ODM 3.2 gün 14 kadar açıklandığı gibi dokusunu için MSCs ayırt etmek içinde.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Subkutan Enjeksiyon için farklılaştırılmış dokusunu hazırlanması:<ol>
<li>Osteoblast dekolmanı çözüm (Tablo 1) hazırlamak için 1 g tip II collagenase αMEM orta collagenase II çözüm (1 mg/mL) yapmak için 1000 ml geçiyoruz. -20 ° C'de collagenase II çözüm tutmak Mix % 0.25 tripsin-EDTA ve collagenase II çözüm 1:1 oranında dokusunu yapmak müfrezesi eriyik için.</li>
		<li>Harcanan ODM kaldırmak ve farklılaştırılmış dokusunu 1 x DPBS 5 mL ile 100 mm çanak yıkayın.</li>
		<li>Osteoblast dekolmanı çözüm 100 mm çanak başına 1,5 mL ekleyin ve yemekleri 30 dk. incelemek için 37 ° C'de kuluçkaya ve osteoblast dekolmanı mikroskobu tarafından olun.</li>
		<li>Dokusunu dekolmanı çözüm ODM tarafından etkisiz hale getirmek ve 50 mL konik tüp içinde müstakil dokusunu toplamak. 5 min için 230 x g 4 ° c de santrifüj.</li>
		<li>Süpernatant kaldırmak ve ODM orta 25 mL hücrelerde resuspend. Hücreleri toplanan hücre kaldırmak için bir 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçmek. Bir hemasitometre kullanarak hücre sayıları saymak.</li>
		<li>1 x 107 dokusunu Subkutan Enjeksiyon ve santrifüj hücreleri 230 x g 4 ° c de başına 4 min için hazırlayın.</li>
		<li>1 x 107 dokusunu 50 µL buz gibi 1 resuspend x DPBS. Mix dokusunu fenol kırmızısı ücretsiz membran Matrix (süspansiyon ve membran matris bir 1:1 oranında karışık dokusunu) 50 µL ile Ayrıştırılan ve enjeksiyon önce buzda dokusunu korumak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LFS MSC kaynaklı dokusunu in vivo xenograft tümör modeli:<ol>
<li>8-hafta-yaşlı kadın immün NU/NU fareler inhale %5 (v/v) isoflurane 1 L/min (CLAMC tarafından sağlanan) oksijen sağlayan bir odasında anestezi. Hayvan yaslanmış olduktan sonra anestezik iletim sistemi %2 (v/v) inhale isoflurane 200 mL/dak (CLAMC tarafından sağlanan) oksijen sağlayan burun konisi geçin. Anestezi derinliği fareler yapmak için kornea ve pedal refleksleri yeterince anestezi ve rahatsızlık işlem sırasında acı değil kontrol ederek izlemek.</li>
		<li>Klorheksidin ve % 70 isopropanol alternatif temizleme bezi ile enjekte edilir bölgeyi dezenfekte. 26 G iğne membran matris karışık LFS dokusunu Subkutan Enjeksiyon 8 haftalık immün NU/NU fare (Şekil 4A) arka ayakları bir tarafı içine gerçekleştirmek için kullanın.</li>
		<li>Fareler subkutan Nodüler yoğunlukları büyümesi için enjeksiyon sitelerdeki haftalık palpasyonla gerçekleştirerek izlemek. Tümör oluşumu yaklaşık 6-10 hafta sonra enjeksiyon (Şekil 4B) görülebilir.</li>
		<li>Servikal çıkığı tarafından takip karbon dioksit boğulma yöntemi tarafından fareler ötenazi. Gelişmiş tümör incelemek. Tümör sınıf ve farklılaşma Dizin, preosteoblasts ve olgun dokusunu tarafından çeşitli boyama yöntemleri (Örneğin Hematoksilen ve eozin (H & E) boyama, boyama Picro Sirius kırmızı ve von Kossa sırasıyla boyama) belirleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li>
<li>Yagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+familial+Alzheimer%27s+disease+with+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells.</a> Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).</li>
<li>Dimos, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321 (5893), 1218-1221 (2008).</li>
<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li>
<li>Itzhaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+the+long+QT+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).</li>
<li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).</li>
<li>Lee, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+familial+cancer+with+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling familial cancer with induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 161 (2), 240-254 (2015).</li>
<li>Mulero-Navarro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+Dysregulation+in+a+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Model+of+PTPN11-Associated+Juvenile+Myelomonocytic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Myeloid Dysregulation in a Human Induced Pluripotent Stem Cell Model of PTPN11-Associated Juvenile Myelomonocytic Leukemia.</a> Cell Rep. 13 (3), 504-515 (2015).</li>
<li>Kotini, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+a+chromosomal+deletion+associated+with+myelodysplastic+syndromes+using+isogenic+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).</li>
<li>Kotini, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-Specific+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Map+the+Progression+of+Myeloid+Transformation+to+Transplantable+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stage-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Map the Progression of Myeloid Transformation to Transplantable Leukemia.</a> Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).</li>
<li>Crespo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonic+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+colorectal+cancer+and+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing.</a> Nat Med. 23 (7), 878-884 (2017).</li>
<li>Gingold, J., Zhou, R., Lemischka, I. R., Lee, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Cancer+with+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modeling Cancer with Pluripotent Stem Cells.</a> Trends Cancer. 2 (9), 485-494 (2016).</li>
<li>Lin, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma%3A+Molecular+Pathogenesis+and+iPSC+Modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma: Molecular Pathogenesis and iPSC Modeling.</a> Trends Mol Med. 23 (8), 737-755 (2017).</li>
<li>Zhou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Li-Fraumeni+Syndrome+Disease+Model%3A+A+Platform+to+Develop+Precision+Cancer+Therapy+Targeting+Oncogenic+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Li-Fraumeni Syndrome Disease Model: A Platform to Develop Precision Cancer Therapy Targeting Oncogenic p53.</a> Trends Pharmacol Sci. 38 (10), 908-927 (2017).</li>
<li>Lian, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+clinically+compliant+MSCs+from+CD105%2B%2C+CD24-+differentiated+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation of clinically compliant MSCs from CD105+, CD24- differentiated human ESCs.</a> Stem Cells. 25 (2), 425-436 (2007).</li>
<li>Zhou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homozygous+p53+R282W+mutant+human+embryonic+stem+cell+line+generated+using+TALEN-mediated+precise+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A homozygous p53 R282W mutant human embryonic stem cell line generated using TALEN-mediated precise gene editing.</a> Stem Cell Res. 27, 131-135 (2018).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Daha yüksek MSC farklılaşma verim elde etmek için çeşitli yönleri önemlidir. Bir kültür iPSCs MSC ayırt etme işlemini başlatmadan önce bir durumdur. El yazması sunulan Protokolü önceki çalışmalar 9,17at dayanır. iPSCs en az 2 hafta MEFs üzerinde kültürlü olmanız gerekiyor. İPSCs iyi bakımı MEFs koşullara hücreler MSC farklılaşma için jelatin kaplı tabakta iliştirmek için kritik öneme sahiptir. Bir başka önemli yönü farklılaşma önce MEFs üzerinde iPSCs yoğunluğudu...

2006 ve 2007 arasında laboratuvarları Drs. Shinya Yamanaka ve James A. Thomson birkaç atılım bulgular indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs)1,2,3gelişmesine yol açtı. Somatik hücre formu iPSCs için tanımlanmış transkripsiyon faktörleri ile yeniden programlama tarafından araştırmacılar yani anahtar özelliklere sahip hücreleri elde edebilecektir, Nanog ve daha önce sadece için düşünüldü kendini yenileme, insan embriyonik kök hücre var (hESCs). iPSCs herhangi bir birey ya da hasta oluşturulabilir ve embriyo, büyük ölçüde elde edilebilir hastalıklar ve arka planlar çalışma için repertuar genişleyen türetilen gerek yoktu. O zamandan beri iPSCs hasta kaynaklı çeşitli insan hastalıkları, Alzheimer hastalığı4 ve amyotrofik lateral skleroz5 uzun QT sendromu6,7, fenotip özetlemek için kullanılmıştır 8.
Bu gelişmeler IPSC araştırma Ayrıca kanser araştırmaları için yeni yollar açtı. Çeşitli gruplar son zamanlarda bugüne osteosarkom9gösterdiği başarılı uygulama modeli kanser geliştirme altında bir duyarlı genetik arka plan9,10,11, hasta iPSCs kullanmış, Lösemi10,11,12ve kolorektal kanser13. IPSC kaynaklı kanser modelleri hala onların bebeklik olmakla birlikte, patolojik mekanizmalar elucidating ve terapötik bileşiklerin14tanımlayan phenocopying maligniteler, hastalık ilişkili büyük potansiyel göstermiştir.
Li-Fraumeni sendromu (LFS) TP53 germline mutasyon15tarafından neden olduğu bir otozomal dominant kalitsal kanser hastalıktır. LFS hastalarda osteosarkom, dahil olmak üzere maligniteler çeşitli bir tür LFS iPSCs ve türetilmiş hücrelerine özellikle iyi bu malignite16eğitimi için uygun hale yatkındır. LFS hasta kaynaklı iPSCs9 daha sonra kullanarak Ayrıştırılan mezenkimal kök hücre (MSCs) ve sonra kaynaklanan dokusunu için hücreleri bir IPSC tabanlı osteosarkom modeli ilk 2015 yılında kuruldu osteosarkom. Bu LFS dokusunu Osteojenik farklılaşma osteosarkom ilişkili kusurlar ve oncogenic özellikleri, bir "bir tabak içinde kemik tümörü" platform olarak potansiyel modeli gösteren özetlemek. İlginçtir, genom-wide transcriptome analizleri bir osteosarkom gen İmzada LFS dokusunu yönlerini açığa vurmak ve bu şekil-in bu LFS gen ifade profil osteosarkom9, kötü prognoz ile ilişkili gösteren LFS iPSCs hastalık modelleri potansiyelini klinik özellikleri ortaya çıkarmak için.
Bu el yazması LFS hasta kaynaklı iPSCs modeli osteosarkom için kullanmak hakkında ayrıntılı bir açıklama sağlar. LFS iPSCs, iPSCs MSCs ve dokusunu için sonra farklılaşma ve LFS dokusunu kullanarak bir in vivo xenograft modeli kullanımı nesil ayrıntıları. LFS hastalık modeli birçok avantajı, özellikle mekanik çalışmaları, biyomarker teşhis ve ilaç9,14eleme için her aşamasında osteosarkom gelişme sınırsız hücreler oluşturma yeteneği oluşur, 16.
Özetle, LFS osteosarkom IPSC tabanlı modeli osteosarkom araştırma ilerlemek için çekici bir tamamlayıcı sistem sunar. Bu platform da bir kanıtı-of-concept hasta kaynaklı iPSCs kullanarak kanser modelleme için sağlar. Aşağıda açıklanan bu strateji modeli maligniteler kanser eğilimlerin ile diğer genetik bozuklukları ile ilişkili için kolayca genişletilebilir.

<table><tbody><tr><td>< > Plastik eşya< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm Çanak</td><td>Corning</td><td>430107</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Çanak</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>6 Kuyulu Plaka</td><td>Şahini</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>12 Kuyulu</td><td>Plaka Şahini</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>48 Kuyulu</td><td>Plaka Şahini</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Pipet Ucu</td>, <td>USA Scientific</td><td>1111-2721</td><td></td></tr>, <tr><td>200 & L Pipet Ucu</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0706</td><td></td></tr><tr><td>10 & L Pipet Ucu</td><td>USA Scientific</td><td>1111-3700</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Serolojik Pipet</td><td>SARSTEDT</td><td>86.1253.001</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Serolojik Pipet</td><td>SARSTEDT</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Serolojik Pipet</td><td>SARSTEDT</td><td>86.1685.001</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tüp, PP</td><td>SARSTEDT</td><td>62.547.100</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tüp, PP</td><td>SARSTEDT</td><td>62.554.100</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Kültür malzemeleri ve Reaktifleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CytoTune- iPS 2.0 Sendai Yeniden Programlama Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>A16517</td><td>Ticari Sendai virüsü yeniden programlama kiti</td></tr><tr><td>Corning hESC Nitelikli Matris</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Bazal membran matrisi</td></tr><tr><td>CF1 MEF'ler, ışınlanmış</td><td>ThermoFisher</td><td>A34180</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Corning</td><td>10-090-CV</td><td></td></tr> <tr><td>ve alfa; MEM</td><td>Corning</td><td>10-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>StemMACS iPS-Brew XF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-368</td><td>Ticari iPSC ortamı</td></tr><tr><td>Nakavt DMEM/F-12</td><td>ThermoFisher</td><td>12660012</td><td></td></tr><tr><td>FBS Opti-Gold</td><td>GenDEPOT</td><td>F0900-050</td><td></td></tr><tr><td>Nakavt Serum Değiştirme</td><td>ThermoFisher</td><td>A3181502</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin Çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>İnsan FGF-temel (bFGF)</td><td>PEPROTECH</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan PDGF-AB</td><td>PEPROTECH</td><td>100-00AB</td><td></td></tr><tr><td>beta;-Gliserofosfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4902</td><td></td></tr><tr><td>Askorbik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin, 1x (DPBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>StemMACS Pasaj Çözümü XF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-688</td><td>Ticari pasaj çözeltisi</td></tr><tr><td>Accutatse Hücre Ayırma Çözeltisi</td><td>Corning</td><td>25-058-CI</td><td>Hücre ayırma çözeltisi</td></tr><tr><td>Tiazovavivin (ROCK İnhibitörü)</td> <td>Calbiochem</td><td>420220</td><td></td></tr><tr><td>%0.25 Tripsin-EDTA Çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz, Tip II&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>İnsan NANOG Antikoru</td><td>R& D Sistemi</td><td>AF1997</td><td></td></tr><tr><td>OCT4 Antikoru (H-134)</td> <td>Santa Cruz</td><td>sc-9081</td><td></td></tr><tr><td>İnsan / Fare SSEA-4 PE konjuge Antikor</td><td>R& D Sistemi</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Fare Anti-İnsan TRA-1-81 Antijen</td><td>DB Biosciences</td><td>560123</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Eşek Anti-Keçi IgG (H + L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-545-003</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-545-144</td><td></td></tr><tr><td>PE Fare Anti-İnsan CD105</td><td>eBioscience</td><td>12-1057-42</td><td></td></tr><tr><td>FITC Fare Anti-İnsan CD44</td><td>DB Biyolojik Bilimler</td><td>555478</td><td></td></tr><tr><td>PE Fare Anti-İnsan CD73</td><td>DB Biyolojik Bilimler</td><td>550257</td><td></td></tr><tr><td>PE Fare Anti-İnsan CD166</td><td>DB Biyolojik Bilimler</td><td>560903</td><td></td></tr><tr><td>FITC Fare Anti-İnsan CD24</td><td>DB Biyolojik Bilimler</td><td>555427</td><td></td></tr><tr><td>Eşek Serumu</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Serumu</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Alkalin Fosfataz Boyama Kiti II</td><td>Stemgent</td><td>00-0055</td><td></td></tr><tr><td>Alizarin Kırmızı S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reaktifi</td><td>ThermoFisher</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>ThermoFisher</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>ThermoFisher</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, Mutlak, Moleküler Biyoloji Sınıfı</td><td>ThermoFisher</td><td>BP28184</td><td></td></tr><tr><td>DNaz I, RNaz içermez (1 U/&mikro; L)</td> <td>ThermoFisher</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Sentez Kiti</td><td>BioRad</td><td>1708891BUN</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Yeşil</td><td>Supermix BioRad</td><td>1708884</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrisi Yüksek Konsantrasyon (HC), Fenol-Kırmızı İçermeyen</td><td>Corning</td><td>354262</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Kayma Uçlu Şırınga, 26 Gauge x 5/8 İnç</td><td>DB Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr></tbody></table>

li-fraumeni sendromu hasta kaynaklı indüklenmiş pluripotent kök hücreler kullanılarak osteosarkom modelleme

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Li-Fraumeni sendromu (LFS) bir otozomal dominant kalitsal kanser hastalıktır. LFS hastalarda tümör, osteosarkom--en sık birincil olmayan hematolojik maligniteler çocukluk ve ergenlik de dahil olmak üzere çeşitli tür yatkındır. Bu nedenle, LFS bu malignite eğitim için ideal bir model sağlar. IPSC yöntemlerden yararlanarak osteosarkom LFS ilişkili başarılı bir şekilde örnek alınarak LFS hasta iPSCs mezenkimal kök hücre (MSCs) ve ardından dokusunu--menşei osteosarkom hücreleri ayırt tarafından. Bu LFS dokusunu osteosarkom, osteosarkom patogenezinde operasyona için bir çekici model sistemi sağlayan oncogenic özelliklerini özetlemek. Bu el yazması bir protokol LFS hasta fibroblastlar, farklılaşma MSCs, MSCs farklılaşma dokusunu ve LFS dokusunu kullanarak vivo içinde tumorigenesis için iPSCs dan iPSCs üretimi için gösterir. Bu IPSC hastalık modeli potansiyel biyolojik veya LFS ilişkili osteosarkom için tedavi hedefleri tanımlamak için genişletilebilir.

Bu iletişim kuralı LFS IPSC üretimi, MSC farklılaşma, osteoblast farklılaşma ve in vivo tumorigenesis tahlil LFS MSC kaynaklı dokusunu kullanarak da dahil olmak üzere yordamları sunar.
LFS iPSCs piyasada bulunan Sendai virüs seti yeniden programlama kullanarak fibroblastlar gelen nesil için şeması Şekil 1Aile gösterilir. Sendai virüs alan teslim Yamanaka dört faktörlerin bir sigara entegre ...

Burada, bir protokol indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) üretimi için Li-Fraumeni sendromu (LFS) hasta türetilmiş fibroblastlar, iPSCs mezenkimal kök hücre (MSCs) yoluyla farklılaşma üzerinden dokusunu ve modelleme içinde vivo mevcut LFS hasta kaynaklı dokusunu kullanarak tumorigenesis.

Li-Fraumeni sendromu hasta kaynaklı indüklenmiş Pluripotent kök hücreler kullanılarak osteosarkom modelleme

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Bu Li-Fraumeni sendromu iPSC tabanlı osteosarkom modeli, osteosarkom araştırma alanındaki kanser modellemesinde hasta iP hücrelerinin kullanımıyla ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu modelin temel avantajı, mekanik çalışmalar, biyobelirteç tanımlama ve ilaç taraması için osteosarkom gelişiminin tüm aşamalarında sınırsız hücre üretilmesine izin vermesidir. Ruoji hücre kültürü prosedürünü gösterecek ve ben de hayvan prosedürünü göstereceğim.İki haftalık fare embriyonik fibroblastından veya MEF'den sonra, ko-kültür% 80 ila 90 birleşik iPS hücre kültürünü beş mililitre DPBS ile yıkayın ve ardından oda sıcaklığında üç dakikalık bir inkübasyon için hücrelere bir mililitre hücre ayırma çözeltisi ilave edin. Hücrelerin mezenkimal kök hücrelere farklılaşmaları için jelatin kaplı bir plakaya bağlanabilmeleri için iPS hücrelerinin MEF'lerde en az 14 gün boyunca iyi koşullarda tutulması kritik öneme sahiptir. Hücreler plakanın altından ayrıldığında, hücre ayırma çözeltisini nötralize etmek için hücrelere dokuz mililitre MEF / MSC kültür ortamı ekleyin ve hücre süspansiyonunu kaplanmamış 100 milimetrelik bir doku kültürü plakasına aktarın.MEF'lerin plakaya yapışmasını sağlamak için hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin ve bağlanmamış iPS hücresi içeren süpernatantı dikkatlice toplayın. iPS hücre çözeltisini santrifüjleyin ve peleti altı mililitre MSE farklılaşma ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, altı oyuklu bir kültür plakasının% 0.1 jelatin kaplı üç oyuğunun her birine iki mililitre hücre tohumlayın ve plakayı 28 gün boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin, hücrelere bağlanmamış veya ölü hücreleri çıkarmak için her iki günde bir taze ortamla besleyin.28. günde, kümelerin kenarlarında gözlenen fibroblast benzeri MSC'ler ile büyük farklılaşmış hücre kitleleri görünür olacaktır. Hücre kültürlerini oyuk başına bir mililitre DPBS ile yıkayın, ardından oda sıcaklığında oyuk başına 0.5 mililitre% 0.25 Tripsin-EDTA ile ayrılmasını sağlayın. Üç dakika sonra, Tyrypsin'i oyuk başına 1.5 mililitre MEF / MSE kültür ortamı ile nötralize edin ve ayrılan MSE'leri santrifüjlemeleri için tek bir 15 mililitre konik tüpe koyun.Peletleri üç mililitre MEF / MSE kültür ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri% 0.1 jelatin kaplı 60 milimetrelik bir plakaya tohumlayın ve hücreler% 100 birleşime ulaşana kadar ortamı iki günde bir değiştirin. % 100 birleşen kültürü bir ila üç oranında böldükten sonra, MSC'ler hızla çoğalacak, fibroblast benzeri bir morfoloji gösterecek ve kültür yüksek bir yoğunluğa ulaştığında girdap benzeri bir kültür modeli oluşturacaktır. iPS hücresinden türetilen MSC'ler, farklılaşmaları sırasında herhangi bir noktada mezenkimal kök hücre belirteçleri için bir immünofloresan boyama ile de incelenebilir.MSE'yi osteoblastlara ayırmak için,% 95 birleşik hücre kültüründen uygun sayıda MSE'yi 24 saat boyunca uygun MEF / MSC kültür ortamı hacminde bir hücre kültürü plakasına plakalayın. Daha sonra süpernatanı ertesi gün ve kültür periyodunun sonuna kadar her iki günde bir uygun hacimde osteoblast farklılaşma ortamı ile değiştirmeye başlayın. Preosteoblastlar tarafından üretilen kemikle ilişkili alkalin fosfatazı ve olgun osteoblastlar tarafından üretilen mineral birikimini tespit etmek için, uygun deneysel zaman noktalarında üreticinin protokolüne göre sırasıyla alkalin fosfataz ve Alizarin Red S boyaması gerçekleştirin.Farklılaşmış osteoblastlarla bir in vivo tümör oluşumu modeli oluşturmak için, osteoblastik farklılaşmayı başlatmak için uygun sayıda MSC'yi beş adet 100 milimetrelik tabağa tohumlayın. Osteoblastik farklılaşmanın 14. gününde, beş mililitre DPBS ile beş osteoblast kültür plakasını yıkayın ve hücreleri tabak başına 1.5 mililitre osteoblast dekolmanı çözeltisi ile tedavi edin. 37 santigrat derecede 30 dakikalık bir inkübasyondan sonra, hücrelerin ışık mikroskobu ile ayrıldığını doğrulayın ve dekolman çözeltisini taze osteoblast farklılaşma ortamı ile nötralize edin.Hücreleri santrifüjleme için 50 mililitrelik konik bir tüpte toplayın ve peleti 25 mililitre taze osteoblast farklılaşma ortamında yeniden süspanse edin. Saymadan önce toplanmış hücreleri çıkarmak için hücre çözeltisini 70 mikron süzgecinden süzün ve deri altı enjeksiyon başına 1 X 10 ila 7 hücre ayırın. Hücreleri santrifüjleme ile peletleyin ve hücreleri 50 mikrolitre buz gibi soğuk DPBS konsantrasyonu başına 1 X 10 ila 7 osteoblastta sulandırın.Osteoblastları eşit hacimde fenol-kırmızı içermeyen bazal membran matrisi ile karıştırın ve hücreleri enjeksiyonlarına kadar buzun üzerine yerleştirin. Sekiz haftalık bir dişi bağışıklığı baskılanmış çıplak farede ayak parmağının kıstırılmasına yanıt verilmediğini doğruladıktan sonra, hücreleri 27 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik şırıngaya yükleyin ve deri altından 100 mikrolitre hücreyi dezenfekte edilmiş kanadına enjekte edin. Daha sonra, deri altı nodüler yoğunlukların büyümesi için enjeksiyon bölgesinde haftalık çarpıntı ile fareleri izleyin.Enjeksiyondan altı ila 10 hafta sonra tümör oluşumu gözlenmelidir. Yerleşik LFS iPS hücre klonları, tipik bir insan embriyonik kök hücre morfolojisi sergilemeli ve pozitif bir alkalin fosfataz aktivitesi göstermelidir. LFS iPS hücreleri ayrıca, insan embriyonik kök hücre dizileriyle karşılaştırılabilir ve ebeveyn fibroblastlarında gözlenen seviyelerden çok daha yüksek olan pluripotens faktör mRNA'larını yüksek oranda eksprese eder.Başarılı bir şekilde farklılaşmış LFS MSC'ler, immünofloresan boyama ile değerlendirildiği gibi CD44, CD73, CD105 ve CD166 dahil olmak üzere tipik MSC belirteçlerini de eksprese eder. MSC'ler osteojenik farklılaşma sinyallerine maruz kaldığında, farklılaşmış hücreler dokuzuncu günde pozitif alkalin fosfataz aktivitesi ve 21. günde mineral birikimi sergilemeye başlar. Farklılaşan osteoblastlar ayrıca, farklılaşma süreçleri boyunca pre-osteoblast ve olgun osteoblast genlerinin yukarı regüle edilmiş bir ekspresyonunu gösterir.Osteoblast enjeksiyonundan altı ila 10 hafta sonra LFS osteoblast türevi tümörler, pozitif alkalin fosfataz aktivitesi, pozitif kollajen matris birikimi ve negatif mineralizasyon dahil olmak üzere olgunlaşmamış osteoblast özellikleri gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, Li-Fraumeni Sendromu iPS Hücrelerini osteoblastlara nasıl ayırt edeceğinizi ve hastadan türetilen osteoblastları kullanarak in vivo bir osteosarkom modeli oluşturacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Osteosarkoma ek olarak, bu Li-Fraumeni Sendromu iPS hücre bazlı hastalık modeli, yumuşak doku sarkomu, meme kanseri ve beyin tümörleri gibi Li-Fraumeni Sendromu ile ilişkili diğer malignitelere de uygulanabilir.

modeling-osteosarcoma-using-li-fraumeni-syndrome-patient-derived

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Kemik sarkomlarda kanser kök hücrelerinin varlığı (rulmanları) son zamanlarda onların patogenezi ile bağlantılı olmuştur. Bu makalede, yapışmayan koşullarda büyümeye CSCS yeteneğini kullanılarak geleneksel osteosarkoma (OS) insan biyopsilerinden elde edilen birincil hücre kültürlerinden CSCS izole sunulmuştur.

Kanser kurulması İnsan Konvansiyonel Osteosarkom Hücre Kültürleri Kök

Hücre dışı veziküller (EVs) kanser kaynaklı direkt enjeksiyon kemik iliği tümör ilerleme destekleyen yeniden programlama için yol açar; Ancak, bu etkinin hangi hücrelerin aracılık belli değildir. Burada, biz EV-aracılı tümör Mezenkimal Kök hücre (MSC) etkileşimleri vivo içindearaştırmak için adım adım bir protokol için EV eğitimli MSCs metastaz içinde çok önemli bir rol açığa tanımlamak.

Tümör ve Mezenkimal Kök hücreler arasında ekstrasellüler vezikül aracılı iletişim tanımlamak için osteosarkom preklinik fare modeli

Tümör Başlatan hücrelerin insan sarkomu hasta türevi xenograflarından floresan-aktif hücre sıralama ile yalıtılması için ayrıntılı bir protokol tanımlayarak, insan lökosit antijen-1 (HLA-1) ' i negatif bir işaret olarak kullanarak ve daha fazla doğrulama ve Bu HLA-1-negatif tümör başlatma hücrelerinin karakterizasyonu.

Sarkom hasta türevi xenografts tümör-başlatma hücrelerinin yalıtım ve karakterizasyonu

Kemik hücre dışı Matriks (BEM) modeli osteosarkom (OS) için de kurulan ve gösterilen işte. Bu uygun bir iskele birincil tümör büyüme vitro taklit ve OS histolojik ve cytogenic heterojenlik eğitim için ideal bir model sağlamak için kullanılabilir.

Üç boyutlu kemik hücre dışı matriks modeli osteosarkom için

Bu protokol, fare rabdomiyosarkom primer hücrelerinin izolasyonu, tümörsphere oluşumu ve tedavisi ve tümörküre kültürlerinden başlayan allograft transplantasyonu için tekrarlanabilir bir yöntemi tanımlar.

Mouse Rhabdomiyosarkomlardan İzole Edilen Primer Tümör Hücrelerinden Tümörfer Türevve Tedavisi

Kemik metastazı modellerinde metastaz düzgün bir şekilde veya %100 insidansla gelişmez. Doğrudan intraosseöz tümör hücresi enjeksiyonu akciğerin embolizasyonu ile sonuçlanabilir. Primer kemik tümörlerini ve kemik metastazlarını, kemik içine solid tümör grefti implantasyonu kullanılarak modelleyen, tekrarlanabilir engraftman ve büyümeye yol açan tekniğimizi sunuyoruz.

Primer Kemik Tümörleri ve Kemik Metastazlarının Solid Tümör Grefti İmplantasyonu ile Modellenmesi

Burada, metastaz biyolojisinin preklinik araştırılması ve yeni terapötiklerin gelişimi için kullanılabilecek spontan pulmoner metastaz ile osteosarkomun amputasyon prosedürünün ardından singeneik ortotopik implantasyon tanımlanmıştır.

Metastaz Oranını Kontrol Etmek için Amputasyonlu Syngeneic Ortotopik Osteosarkom Sprague Dawley Sıçan Modeli

Bu protokol, ortopik osteosarkom ve pulmoner metastaz lezyonlarını taşıyan fare modelleri oluşturmak için intratibia osteosarkom hücre enjeksiyonunu tanımlamaktadır.

Ortotopik Osteosarkom ve Akciğer Metastazı Fare Modelleri Oluşturmak için İntratibiyal Osteosarkom Hücre Enjeksiyonu

Mevcut protokol, insan osteosarkom dokusu kullanılarak hasta kaynaklı bir ksenogreft (PDX) fare modeli oluşturma yöntemini açıklamaktadır.

İnsan Osteosarkom Dokuları ile Hasta Kaynaklı Ksenogreft Fare Modelinin Kurulması

Biz aynı anda ifade birincil akut myeloid lösemi hücreleri üzerinde lösemi kök hücre işaretlerinin Akış Sitometresi tarafından tespit etmek için bir protokol anahat. Biz üç yaratıcı nüfus ve artan olgunlaşma derecesi ile sözde bir LSC nüfus ölçmek için nasıl gösterir. Biz bu nüfus içinde karşılık gelen hasta-türetilen-xenografts varlığını doğruladı.

Akış Sitometresi lösemi kök hücre birincil Akut Miyeloid Lösemi ve hasta-türetilen-xenografts, tanı ve takip yukarı tahmin etmek için

Keşfedin Li-Fraumeni sendromu hastalarından elde edilen iPS hücrelerini osteoblastlara farklılaştırma ve osteosarkom modelleme yöntemlerini. Bu protokol mekanistik çalışmalar, biyobelirteç tanımlama ve ilaç taraması için sınırsız hücre üretimi sağlar.

Li-Fraumeni sendromu hasta kaynaklı indüklenmiş Pluripotent kök hücreler kullanılarak osteosarkom modelleme

Daha fazla video keşfet