Kapalı çevrim atalet Havacilik kullanarak hasta kaynaklı hava yolu salgı dan etiket içermeyen nötrofil zenginleştirme

Bu yöntem, pnömoni, astım, kistik fibroz ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı gibi akciğer hastalıkları araştırmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en önemli avantajı, hasta nötrofilini hasta hava yolu sekresyonundan dikey kimyasal bozulma olmaksızın izole etmek ve zenginleştirmektir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi olan Kyungyong olacak.

Başlangıç olarak, 10'a bir oranını koruyun ve PDMS öncüsünü baz ve sertleştirici madde ile karıştırın. Ardından, mikro makine alüminyum kalıbına 30 gram PDMS karışımı ekleyin. Daha sonra 100 milimetrelik bir Petri kabına 20 gram daha PDMS karışımı ekleyin.

Gazdan arındırma amacıyla kalıbı ve Petri kabını vakumlu desikatöre koyun. Gazdan arındırdıktan sonra, vakumu serbest bırakın ve kalıbı ve Petri kabını bir saat boyunca 90 santigrat derecede bir fırına koyun. Bir saat sonra kalıbı ve Petri kabını fırından çıkarın ve oda sıcaklığında 10 dakika soğumaya bırakın.

Ardından, taslağı kesmek için bir bıçak kullanın ve cihaz üzerinde iki milimetre biyopsi deliği ile sıvı erişim deliklerini delin. Delikleri deldikten sonra, bir bant sabitleyin ve cihazın kanal tarafına ve kalın PDMS filmine yapıştırın. Tozu temizlemek için bandı dikkatlice soymak için forseps kullanın.

Ardından cihazın kanal tarafını ve düz PDMS'yi hava plazması ile tedavi etmeye başlayın. Ardından hem kanal tarafını hem de düz PDMS'yi hazırlanan düz PDMS destek tabakası ile yapıştırın. Ardından, çipi 102 x 76 milimetre boyutlarında bir cam slayt üzerinde bırakın.

Yapışma mukavemetini artırmak için cam sürgüyü en az 30 dakika boyunca 70 derecelik bir fırına koyun. Dokuz mililitre fosfat tamponlu salin içinde bir mililitre hava yolu sekresyon örneği toplamak için 10 mililitrelik bir şırınga kullanın. Daha sonra künt bir pipet yardımıyla mukus örneğini homojenize edin.

Ardından, seyrelticiyi süzmek ve büyük doku parçalarını veya kan pıhtılarını çıkarmak için 40 mikrometrelik bir naylon hücre süzgeci kullanın. Süzme tamamlandıktan sonra numuneyi buzun üzerine koyun. Daha sonra, 1.000 kez seyreltilmiş numunenin nihai konsantrasyonunu elde etmek için 0.5 mililitrelik numune seyrelticisine 50 mililitre fosfat tamponlu salin ekleyin.

Dört spiral mikro kanalın her birine eşit akış uygulamak için PDMS çipini monte etmek için sıvı kılavuzunu kullanın. Ardından, sıvı kılavuzunun girişine, iç duvar çıkışına ve dış duvar çıkış portlarına bağlamak için 1/16 inç çapında bir erkek Luer konektörü kullanın. Ardından silikon boruyu numune süspansiyonuna bağlayın.

Ardından, peristaltik pompayı giriş borusuna bağlayın. Dış duvar çıkış borusunu atık haznesine yerleştirin. Ardından giriş borusunun ucunu ve iç duvar çıkış borusunu numune haznesine yerleştirin.

Boruyu yerleştirdikten sonra, numune haznesinde kalsiyum ve magnezyum içermeyen beş mililitre fosfat tamponlu salin ile doldurulmuş 50 mililitrelik bir tüp bırakın. Ardından, cihazı doldurmak için dakikada yaklaşık bir mililitre akış hızında pompalamaya başlayın. Numuneyi numune haznesine yerleştirdikten sonra peristaltik pompayı çalıştırın ve akış hızını dakikada dört mililitre olarak ayarlayın.

Numune hacmi yaklaşık bir ila iki mililitre olan istenen hacme ulaştıktan sonra, işlemi durdurun ve hortumun bağlantısını kesin. Hasta trakeal sekresyonundan oluşan klinik örnek, PMN'den zengin hücre popülasyonunu elde etmek için mikroakışkan dissosiyasyon yöntemi için kullanılır. Mikroakışkan ayrışma yöntemine tabi tutulduğunda, yüksek oranda saflaştırılmış CD45, CD66B artı zengin PMN hücre popülasyonu elde edilir.

Burada, birinci ve ikinci durum olarak temsil edilen iki farklı hastadan elde edilen örnekler, elde edilen hücre süspansiyonunu elde etmek için mikroakışkan ayrışmaya tabi tutulur. Daha sonra, hasta hava yolu sekresyon numunesi mikroakışkanlara tabi tutulduğunda, PMN'nin% 94'ü altı numunenin hepsinden tutarlı bir şekilde geri kazanılır. Öte yandan, hasta örneğinin DTT mukoliz yöntemine tabi tutulması, örnekler arasında geniş farklılıklar gösteren PMN'lerin sadece %53.5'inin geri kazanılması ile sonuçlanmıştır.

Mikroakışkanlar ve DTT mukolitik yöntemleri ile izole edilen nötrofiller, nötrofil elastaz salınımını tetiklemek için PMA ile muamele edilir. İlginç bir şekilde, mikroakışkanlara maruz kalan hasta örnekleri, PMA stimülasyonu ile artan elastaz salınımı ile bozulmamış fonksiyonel hücreler gösterir. Mukolitik ayrışmadan sonra elde edilen hücreler, incelenen altı farklı hasta örneğinden elastaz salınımında önemli bir artış göstermez.

Bu, kimyasal olarak bozulmuş bir nötrofil yüzeyinden kaynaklanmaktadır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 50 dakika içinde yapılabilir. Bu çalışmada sunulan yöntemin, klinik hava yolu sekresyonlarından nötrofilleri yakalamak için bir ayrışma protokolü sağlayarak, pnömoni, astım, kistik fibroz ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı gibi solunum yolu hastalıkları ile ilgili klinik araştırmaların kapsamını genişletmesi beklenmektedir.

Bu tekniğin etkileri, astım ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı gibi immün ile ilişkili akciğer hastalıklarının tedavisine kadar uzanır, çünkü önerilen yöntemler hasta bağışıklık hücresini noninvaziv ve etiketsiz bir şekilde yakalamanın bir yolunu sağlar. Bu yöntem solunum araştırmaları hakkında fikir verebilse de, burun sıvısı, servikal sıvı ve bağırsak sıvısı gibi zorlu biyometriye sahip diğer hasta biyosıvılarına da uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, kapalı döngülü spiral atalet mikroakışkanları kullanılarak nötrofilleri hasta hava yolu sekresyonundan nasıl ayıracağınızı iyi anlamış olmalısınız.

Klinik örneklerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Tüm deneyler kişisel koruyucu donanımlarla birlikte bir biyogüvenlik kabini altında yapılmalıdır.