Name: Kapalı çevrim atalet Havacilik kullanarak hasta kaynaklı hava yolu salgı dan etiket içermeyen nötrofil zenginleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Öğrenin, hasta kaynaklı hava yolu salgılarından nötrofil izolasyonu için kapalı çevrim atalet mikroakışkanlık yöntemini. Bu etiketsiz teknik, solunum hastalıkları klinik araştırmalarında fonksiyonel hücre zenginleştirmesi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser NIH U24 örnek tutumlu tahlil programı yanı sıra (U24-AI118656) (R21AI119042) NIH/NIAID tarafından desteklenmiştir.

Örnek koleksiyon Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından (IRB # PRO16060443, PRO10110387) kabul edildi. Tüm deneylerin bir Biyogüvenlik ile uygun kişisel koruyucu ekipman kabin altında gerçekleştirilir.
1. cihaz imalat ve yumuşak litografi
Not: Standart yumuşak litografi teknikleri15,16 polydimethylsiloxane (PDMS) microchannel oluşturmak için kullanılmıştır.
<ol><li>10:1 oranında temel ve kür Aracısı PDMS habercisi karıştırın.</li>
	<li>Mikro-işlenmiş alüminyum kalıp üzerinde 30 g PDMS habercisi karışımı dökün (bkz. Şekil 1 boyutları için) ve 20 gr 100 mm Petri kabına PDMS habercisi karışımı. Not: Petri kabına destek katmanı için PDMS (~ 3 mm) kalın film yapmak için kullanılır. PDMS destekleyen tabakası Havacilik boyunca üniforma fiziksel yüzey özellikleri sağlar. Alternatif olarak, ince bir PDMS film cam slayt üzerinde kullanılabilir. Ana kalıp belirli kanal boyutları ile tasarlanmış ve mikro-freze alüminyum kağıda tarafından imal edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan sarmal bir 8-döngü sarmal microchannel bir ağzı ve verimli boyutlu tabanlı ayrılması için 24 mm için 8 mm artan yarıçapı ile iki çıkışları kanalıdır.</li>
	<li>Hava kabarcığı yok yüzeyi genellikle 5-10 dakika desiccator bir ev vakum kullanıma görünür hale gelene kadar degas için bir vakum desiccator kalıp ve Petri kabına yerleştirin.</li>
	<li>Vakum yayın ve 1 h 90 ° C fırında kalıp ve Petri kabına yerleştirin. Not: Bir ocağın veya diğer Isıtma araçları bir fırın yerine kullanılabilir.</li>
	<li>Kalıp ve Petri kabına Fırından çıkarın ve oda sıcaklığında 10 dakika soğumasını bekleyin.</li>
	<li>Dikkatle anahat kesebilir ve 2 mm zımba kullanarak aygıt üzerinde sıvı erişim delikler. Not: Yumruk büyüklüğünde borulama veya sıvı Kılavuzu boyutuna bağlı olarak değişebilir.</li>
	<li>Bir teyp cihazı kanal tarafında ve PDMS kalın film için uygun ve dikkatle forseps ile toz kaldırmak için soyma.</li>
	<li>Her iki kanal yan aygıt ve düz PDMS hava plazma ile ve bond düz PDMS (Şekil 1A) hazırlanan destekleyen tabakası ile tedavi.</li>
	<li>50 x 70 mm cam slayt üzerinde çip yerleştirin ve bağ gücünü artırmak en az 30 dk. 70 ° C fırında yerleştirin.</li>
</ol>2. trakeal salgı koleksiyonu mekanik havalandırmalı hastalardan
Not: Trakeal salgıları mekanik havalandırmalı hastalar normal rutin havayolu bakım sırasında standart, Yetişkin havalandırılmış hasta karşılamak için geleneksel yöntemler değiştiren bir protokolü kullanarak elde edilebilir. Örnekleri de-tespit ve hemen işleme için gönderdi.
<ol><li>Trakeal aspirasyon belirtilmişse, bir kateter hava yolu salgıları ayıklamak için kullanın.</li>
	<li>Endotrakeal Tüpün içine kateter dikkatli bir şekilde yarı yolda ilerlemek ve 5 mL % 0,9 steril normal salin önceden doldurulmuş 10 mL şırınga üzerinden de aşılamak.</li>
	<li>Kateter tam olarak gelişmiş ya da direnç karşılanır, salgıları Aspire edin ve steril balgam koleksiyonu konteyner içine toplamak.</li>
	<li>10 mL steril balgam kapsayıcısında salgıları trakeal toplamak ve buz üzerinde yerleştirin. Örnekleri işleme için hemen gönderin.</li>
</ol>3. trakeal salgı numune hazırlama
Not: Tüm deneylerin bir Biyogüvenlik ile uygun kişisel koruyucu ekipman kabin altında gerçekleştirilmelidir.
<ol><li>Hava yolu salgı örneklerinde fosfat tamponlu tuz (PBS) plastik 10 mL (için 10 x seyreltme) kullanarak 9 mL 1 mL dağıtmak. Künt bir pipet mukus örnek homojenize için kullanın.</li>
	<li>Eritici büyük boyutta veya blok Havacilik erişim delik veya Kanal kan pıhtıları kaldırmak için bir 40 µm naylon hücre süzgeç ile süzün. Örnek işlendikten sonra buza koyun.</li>
	<li>PBS arabelleğinin, bir 1.000 x seyreltilmiş süspansiyon sonuçlanan bir 100 x birim için her örnek seyreltici dağıtmak. Örnek tüm ayrılma işlemi sırasında buz üzerinde bir yer.</li>
</ol>4. deneysel Kur
Not: Tüm deneylerin bir Biyogüvenlik ile uygun kişisel koruyucu ekipman kabin altında gerçekleştirilmelidir.
<ol><li>Sıvı Kılavuzu Tekdüzen akışı her dört sarmal mikro (Şekil 1B) uygulama için PDMS çip bir araya getirin. Not: Dört kanal iş çıkarma yeteneğini artırmak için parallelization, hem de elde edilen süspansiyon birim ve hücre yoğunluğu duruma getirilmesi tarafından kullanılmıştır. Sıvı Kılavuzu tasarlanmış ve stereolitografi türü 3D yazıcı açık reçine ile yapılır. Giriş ve çıkış bağlantı noktası sıvı Kılavuzu için rahatlık-in bağlantı ve istikrarlı mühürleme işlemi sırasında kadın radarı konektörlerini kullanın.</li>
	<li>1/16-inç erkek radarı bağlayıcı giriş, iç duvar (IW) çıkış ve sıvı Kılavuzu'nun dış duvar (OW) çıkış bağlantı noktasına bağlayın ve silikon tüp örnek süspansiyon bağlayın.</li>
	<li>Künt keyif-e doğru giriş ve çıkışları örnek rezervuar alt ulaşmak için her iki ucuna yerleştirin.</li>
	<li>Peristaltik pompa giriş tüp ile bağlanır.</li>
	<li>Örnek rezervuar giriş boru ve IW çıkış boru sonuna yerleştirin ve atık haznesi (Şekil 1 c, D) OW çıkış boru sonuna yerleştirin.</li>
	<li>Kalsiyum ve magnezyum olmadan filtre uygulanmış PBS 50 mL tüp örnek rezervuar yerleştirin.</li>
	<li>Cihazın hazırlamak için bir düşük debi (~ 1 mL/dk) pompalamaya başlayın. Not: Kanal istikrarsızlaştırmak ve hava kabarcıkları ortadan kaldırmak için cımbız ile üst kabarcıklar kanalda yakalandığında, itin. Cihazın tam arabellek çözüm ile dolduğunda, hava yolu salgı örnek tüp hazırlamak için PBS tüp değiştirin.</li>
	<li>Örnek örnek rezervuar yerleştirildiğinde, peristaltik pompa geçiş ve akış hızı 4 mL/dk (Şekil 1 c, D) ayarlayın.</li>
	<li>Numune hacmi belirlenen birimi (~ 1 mL) ulaştığında, işlemi durdurmak ve silikon tüp bağlantısını kesin. Not: Önerilen yöntem seyreltici büyük miktarda azaltarak daha etkilidir (> 50 mL) içine bir mikro-santrifüj tüpü hacmi (~ 1 mL) (Şekil 2).</li>
</ol>5. Akış Sitometresi Analizi
Not: akış sitometresi ile ayirt ayrılma yöntemleri (havacilik ve lizis) karşılaştırmak için kullanıldı.
<ol><li>Floresein isothiocyanate (FITC) - Konjüge fare anti-insan CD66b monoklonal antikor ve allophycocyanin (APC) - fare anti-insan CD45 monoklonal antikor (200 µL ilk süspansiyonlar (adım 3.3) ve elde edilen süspansiyonlar (adım 4,9) Birleşik Ekle Her antikor), 1:25 oranında v/v.</li>
	<li>Karanlıkta 30 dk 4 ° C'de örnekleri kuluçkaya.</li>
	<li>Her iki PMNs ölçmek için bir akış sitometresi örneği analiz. Not: FITC APC Çift Kişilik pozitif, CD66b pozitif ve CD45 pozitif nüfus nötrofil olarak kabul edildi. Kurtarma giriş ve elde edilen süspansiyon toplam cep numaralarını oranı tarafından hesaplanır.</li>
</ol>6. NE yayın Analizi
Not: izole işlevselliğini karşılaştırmak için nötrofil havacilik ve lizis yöntemi tarafından bir Doğu tahlil kiti kullanıldı.
<ol><li>(4,9 adımda elde edilen) elde edilen her süspansiyon 50 son bir konsantrasyon için PMA (tahlil Seti'nde sağlanan) eklemek nM.</li>
	<li>Örnekleri için 2 h 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Süspansiyonlar vasıl 300 x g 10 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Her süpernatant ile 10 µL (tahlil Seti'nde sağlanan) bir 96-şey plaka aktarın. Not: 96-şey Mikroplaka bir düz dipli ve siyah Polistiren ile de kullanılabilir.</li>
	<li>90 µL seyreltilmiş tahlil arabelleği (tahlil Seti'nde sağlanan) her şey için ekleyin.</li>
	<li>Elastase substrat (Z-Ala-Ala-Ala-Ala 2Rh110, tahlil Seti'nde sağlanan) 10 µL ekleyin.</li>
	<li>37 ° C'de 1,5 saat için kuluçkaya</li>
	<li>485 bir uyarma dalga boyu bir yer kullanarak 96-şey plaka okuma nm ve emisyon dalga boyu 525 nm. Not: NE düzeyde PMN sayısı Akış Sitometresi Analizi tarafından bölünmüştü.</li>
</ol>

<ol><li>Hamid, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+sputum+processing+for+cell+counts%2C+immunocytochemistry+and+in+situ+hybridisation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation.</a> European Respiratory Journal. 20 (Supplement 37), 19S-23S (2002).</li>
<li>van Overveld, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+homogenization+of+induced+sputum+by+dithiothreitol+on+polymorphonuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effects of homogenization of induced sputum by dithiothreitol on polymorphonuclear cells.</a> J Physiol Pharmacol. 56, Suppl 4. 143-154 (2005).</li>
<li>Qiu, D., Tan, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dithiothreitol+has+a+dose-response+effect+on+cell+surface+antigen+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dithiothreitol has a dose-response effect on cell surface antigen expression.</a> J Allergy Clin Immunol. 103 (5 Pt 1), 873-876 (1999).</li>
<li>Usher, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Neutrophil+Apoptosis+by+the+Pseudomonas+aeruginosa+Exotoxin+Pyocyanin%3A+A+Potential+Mechanism+of+Persistent+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Induction of Neutrophil Apoptosis by the Pseudomonas aeruginosa Exotoxin Pyocyanin: A Potential Mechanism of Persistent Infection.</a> The Journal of Immunology. 168 (4), 1861-1868 (2002).</li>
<li>Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Inertial microfluidics.</a> Lab Chip. 9 (21), 3038-3046 (2009).</li>
<li>Martel, J. M., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+focusing+dynamics+in+spiral+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Fluids%22%5BJournal%5D)">Inertial focusing dynamics in spiral microchannels.</a> Phys Fluids. 24 (3), 32001(2012).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+and+applications+of+inertial+microfluidics%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Fundamentals and applications of inertial microfluidics: a review.</a> Lab Chip. 16 (1), 10-34 (2016).</li>
<li>Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+and+drug-resistance+profiling+of+bacteremias+using+inertial+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics.</a> Lab Chip. 15 (10), 2297-2307 (2015).</li>
<li>Warkiani, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-fast%2C+label-free+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+blood+using+spiral+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ultra-fast, label-free isolation of circulating tumor cells from blood using spiral microfluidics.</a> Nat Protoc. 11 (1), 134-148 (2016).</li>
<li>Warkiani, M. E., Tay, A. K., Guan, G., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-less+microfiltration+using+inertial+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Membrane-less microfiltration using inertial microfluidics.</a> Sci Rep. 5, 11018(2015).</li>
<li>Warkiani, M. E., Wu, L., Tay, A. K., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Volume+Microfluidic+Cell+Sorting+for+Biomedical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Large-Volume Microfluidic Cell Sorting for Biomedical Applications.</a> Annu Rev Biomed Eng. 17, 1-34 (2015).</li>
<li>Kwon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Cell+Retention+Device+for+Perfusion+of+Mammalian+Suspension+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Cell Retention Device for Perfusion of Mammalian Suspension Culture.</a> Sci Rep. 7 (1), 6703(2017).</li>
<li>Wu, L., Guan, G., Hou, H. W., Bhagat, A. A., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+leukocytes+from+blood+using+spiral+channel+with+trapezoid+cross-section%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Separation of leukocytes from blood using spiral channel with trapezoid cross-section.</a> Anal Chem. 84 (21), 9324-9331 (2012).</li>
<li>Guan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiral+microchannel+with+rectangular+and+trapezoidal+cross-sections+for+size+based+particle+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Spiral microchannel with rectangular and trapezoidal cross-sections for size based particle separation.</a> Sci Rep. 3, 1475(2013).</li>
<li>Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+Device+Fabrication+and+Surface+Modification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">PDMS Device Fabrication and Surface Modification.</a> J Vis Exp. (8), e319(2007).</li>
<li>Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Prototyping+of+Microfluidic+Systems+in+Poly%28dimethylsiloxane%29%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane).</a> Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).</li>
<li>Ryu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-Derived+Airway+Secretion+Dissociation+Technique+To+Isolate+and+Concentrate+Immune+Cells+Using+Closed-Loop+Inertial+Microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Patient-Derived Airway Secretion Dissociation Technique To Isolate and Concentrate Immune Cells Using Closed-Loop Inertial Microfluidics.</a> Anal Chem. 89 (10), 5549-5556 (2017).</li>
<li>Mach, A. J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+scalable+blood+filtration+device+using+inertial+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics.</a> Biotechnol Bioeng. 107 (2), 302-311 (2010).</li>
<li>Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+inertial+focusing%2C+ordering%2C+and+separation+of+particles+in+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (48), 18892-18897 (2007).</li>
<li>Xiang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+elasto-inertial+particle+focusing+in+curved+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of elasto-inertial particle focusing in curved microfluidic channels.</a> Lab Chip. 16 (14), 2626-2635 (2016).</li>
<li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asthma+endotypes%3A+a+new+approach+to+classification+of+disease+entities+within+the+asthma+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Asthma endotypes: a new approach to classification of disease entities within the asthma syndrome.</a> J Allergy Clin Immunol. 127 (2), 355-360 (2011).</li>
<li>Houston, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sputum+neutrophils+in+cystic+fibrosis+patients+display+a+reduced+respiratory+burst%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Sputum neutrophils in cystic fibrosis patients display a reduced respiratory burst.</a> J Cyst Fibros. 12 (4), 352-362 (2013).</li>
<li>Janoff, A., Scherer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediators+of+inflammation+in+leukocyte+lysosomes.+IX.+Elastinolytic+activity+in+granules+of+human+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Mediators of inflammation in leukocyte lysosomes. IX. Elastinolytic activity in granules of human polymorphonuclear leukocytes.</a> J Exp Med. 128 (5), 1137-1155 (1968).</li>
<li>Kawabata, K., Hagio, T., Matsuoka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neutrophil+elastase+in+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The role of neutrophil elastase in acute lung injury.</a> Eur J Pharmacol. 451 (1), 1-10 (2002).</li>
<li>Rubin, B. K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27514587">Plastic Bronchitis.</a> Clin Chest Med. 37 (3), 405-408 (2016).</li>
<li>Kokot, K., Teschner, M., Schaefer, R. M., Heidland, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+and+inhibition+of+elastase+release+from+human+neutrophils+dependent+on+the+calcium+messenger+system%5BTitle%5D)+AND+%22Miner+Electrolyte+Metab%22%5BJournal%5D)">Stimulation and inhibition of elastase release from human neutrophils dependent on the calcium messenger system.</a> Miner Electrolyte Metab. 13 (2), 133-140 (1987).</li>
</ol>

Yazarlar burada açıklanan teknoloji patent başvurusunda.

Atalet Havacilik içinde bir mikro-kanallı onların boyutu5,18,19,20üzerinde belirli bir lateral pozisyonda, parçacık ve hücre belirle. Dekan Birleşik etkisi nedeniyle kuvvet ve atalet kabiliyeti eğri microchannel, büyük parçacıkları veya nötrofil sürükleyin (> 10 µm) Kanal ve küçük parçacıklar, mukus toplamları ve enkaz içinde 6'dan daha küçük yer alan µm konumlandırılmış belirli akış hızı kanal...

Hücreler mukus hava yolu salgıları içinde büyük miktarda içinde kapsüllü beri bir vitro tahlil tarafından lökositlerin işlevsel değerlendirme engel. Dithiothreitol (DTT) ayırmak ve balgam saytolojik analiz ve izole hücreler1,2tolere edilebilir canlılığı sağlarken arabulucu tespiti için homojenize için en yaygın lizis tampon var. Ancak, DTT hava yolu nötrofil, yüzey bağlı antijenleri ile elastase ve myeloperoxidase (MPO)2,3serbest bırakmak gibi nötrofil fonksiyon bozulma sonucu etkileyebilir. Bu nedenle, insan hava yolu nötrofil fonksiyon kaç çalışmalar pulmoner4fizyolojik özellikleri gösterebilir değil periferik kan nötrofil ile yapılmıştır. Bu arada, atalet Havacilik çeşitli hasta biomatrices5,6hücreleri yalıtmaya gelişmeler yaptı. Dean sürükle ve atalet Asansör güçleri arasında denge parçacık/hücre etiket içermeyen parçacık ayrılık7sağlar onların büyüklüğüne göre hizalar. Bizim grup daha önce dolaşımdaki tümör hücreleri8,9, kan8patojenler, hücreleri bir süspansiyon kültürü10,11, için bir örnek hazırlama yöntemi tanıtıldı 12ve polimorfonükleer lökosit (PMNs) kan13,14.
Burada, bir hastanın solunum yolu salgıları nötrofil elastase (NE) tahlil gibi bir aşağı akım vitro tahlil için kapalı çevrim atalet Havacilik kullanarak bağışıklık hücreleri hazırlamak için bir protokol tanıtmak. Özellikle hücre/olan kaldırılacak, hücre/parçacık-in-ilgi olduğunu klinik örneklerinde yaygın olarak gözlenen parçacık yanal yönünde önemli bir çakışma olduğunda bu yöntem yüksek konsantrasyon ve kurtarma, sağlar. İç duvar (IW) recirculating tarafından-arka plan sıvıları küçük müsin toplamları ile atık su deposu geçmek iken büyük parçacıkları veya giriş örnek tüp, partikül veya özgün depo, faiz hücre konsantreleri geri hücrelere duruldu. Klinik örnekler heterojen Akışkan özellikleri rağmen nötrofil 1000 kat daha fazla sulandırılmış hava yolu salgı örneklerinden % 95'i yukarıda önerilen yöntem tutarlı bir şekilde kurtarır temiz tuz solüsyonu (~ 1 mL). Buna karşılık, lizis Yöntem kurtarma oranları örnek koşula bağlı olarak bir geniş PMNs aralığı sunuyor. Önerilen protokol lökosit klinik olarak minimal invaziv yordamlar ile biyometrik zorlu hassas hücreler hasat imkanı sağlar hiçbir fiziksel veya kimyasal bozulma ile etiket içermeyen bir şekilde yakalar.

<table><tbody><tr><td>PDMS öncüsü</td><td>Dow corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 3.9KG</td><td>10:1 baz ve kürleme maddesi oranı</td></tr><tr><td>VWR yerçekimi konveksiyon fırını VWR</td><td></td><td>414005-128</td><td>PDMS öncüsü 90 derecede kürlenecektir.</td></tr><tr><td>100mm petri kabı</td><td>VWR</td><td>89000-324</td><td>PDMS İmalatı Destek tabakası</td></tr><tr><td>Harris Tek çekirdekli zımba</td><td>Sigma-aldrich</td><td>WHAWB100076</td><td>2mm çap veya boru boyutuna bağlı olarak</td></tr><tr><td>diğer Hava plazma makinesi</td><td>Femto Science</td><td>Sevimli</td><td>PDMS cihazı için alt tabana yüzey plazma işlemi.</td></tr><tr><td>2 "x 3" cam kaydırak</td><td>TED PELLA, INC.</td><td>2195</td><td>PDMS cihazını desteklemek için</td></tr><tr><td>Masterflex makaralı platinle kürlenmiş silikon boru, L/S 14</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96410-14</td><td>Mikroakışkanlar ve peristlatik pompa için boru</td></tr><tr><td>1/16 inç Luer konektörü, erkek</td><td>Harvard cihazı</td><td>PC2 72-1443</td><td>Sıvı kılavuzu için konektör</td></tr><tr><td>50mL Falcon tüpü</td><td>Corning</td><td>21008-940</td><td>numune toplama ve hazırlama</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin, Kalsiyum ve Magnezyum Olmadan 1X</td><td>Corning</td><td>45000-446&nbsp;</td><td>Numuneyi seyreltmek için tampon çözelti</td></tr><tr><td>Halyard Kapalı aspirasyon Kateteri, Dirsek, 14F/ kanal 4.67mm</td><td>HALYARD HEALTH</td><td>22113</td><td>Trakeal seksasyon aspirasyon kateteri</td></tr><tr><td>%0.9 Steril Normal salin, 10 mL önceden doldurulmuş şırınga</td><td>BD PosiFlush</td><td>NHRIC: 8290-306547</td><td>Hastalardan trakeal seceasyon alımı için</td></tr><tr><td>SecurTainer&trade; III Numune Kapları, 20mL</td><td>Simport</td><td>1176R36</td><td>Steril balgam (hava yolu sekresiyonu) toplama kabı</td></tr><tr><td>Luer-Lok Uçlu Şırınga, 10 mL</td><td>BD</td><td>BD309604</td><td>Mukus örneğini pipetlemek, homojenize etmek ve numune tüpünün dibine ulaşmak için</td></tr><tr><td>BD&nbsp; Künt Dolgu İğnesi, BD Luer-Lok&nbsp; İpucu</td>: <td>BD</td><td></td><td>: Mukus örneğini pipetlemek, homojenize etmek ve numune tüpünün 40 ve mikronun dibine ulaşmak için</td></tr><tr><td>; M Naylon Hücre Süzgeci&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>21008-949</td><td>Mikroakışkanların erişim deliğini veya kanalı tıkayabilecek büyük yığın veya kan pıhtılarını çıkarmak için.</td></tr><tr><td>Peristaltik pompa (Masterflex L/S Dijital Sürücü)</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-07522-30</td><td>mikroakışkanların çalışması</td></tr><tr><td>BD LSR II akış sitometresi</td><td>BD Bioscience</td><td>LSR II akış sitometresi</td><td>Hücre geri kazanım oranının ölçülmesi</td></tr><tr><td>Floresein izotiyosiyanat (FITC) konjuge fare anti-insan CD66b monoklonal antikor</td><td>BD Bioscience</td><td>561927</td><td>Flow sitometre analizi için nötrofillerin immün boyaması</td></tr><tr><td>Allofikosiyanin (APC) konjuge fare anti-insan CD45 monoklonal antikoru</td><td>BD Bioscience</td><td>561864</td><td>Akış sitometresi analizi için nötrofillerin immün boyanması</td></tr><tr><td>Plaka okuyucu</td><td>Thermo Fisher bilimsel</td><td>Varioskan</td><td>Nötrofil elastaz testi için plaka okuyucu, ex485 / em525</td></tr><tr><td>Nötrofil elastaz test kiti</td><td>Cayman Chemical</td><td>600610</td><td>Nötrofil işlevsellik değerlendirmesi</td></tr><tr><td>Floresbrit YG Mikro Küreler 10.0 ve mikro; m</td><td>PolyScience, Inc.</td><td>18140-2</td><td>Mikroakışkanlarda beyaz kan hücresi yörüngesini ifade etmek için floresan parçacıklar</td></tr></tbody></table>

kapalı çevrim atalet havacilik kullanarak hasta kaynaklı hava yolu salgı dan etiket içermeyen nötrofil zenginleştirme

Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics

Hava yolu salgıları hücreleri bağışıklık ile ilgili, Örneğin, nötrofiller, makrofajlar ve lenfositler, göğüs hastalıkları, araştırma ve klinik amaçlar için hem de çeşitli değerlendirmek için önemli bir kaynak olarak kullanılan çok sayıda içerir. Ancak, hasta mukus türdeş olmayan ve yapışkan doğası gereği yoktur Şu anda hasta havayolu salgı ana bilgisayar bağışıklık hücreleri zarar vermez hiçbir güvenilir ayrılma yöntemi. Bu araştırmada, hastanın bağışıklık değerlendirmesi için atalet Havacilik kullanan bir örnek hazırlama yöntemi tanıtmak. Klinik örneklerin heterojen Akışkan özellikleri ne olursa olsun, önerilen yöntem nötrofil % 95'den fazla 1000 kat daha fazla sulandırılmış hava yolu salgı örneklerinden kurtarır mililitre temiz salin ile. İlk örnek rezervuar konsantre çıktı akışına sirkülasyon tarafından yüksek konsantrasyon, kurtarma ve bağışıklık hücreleri saflığı sağlanmaktadır; devridaim bir ticaret-off tek tarafından işletilen şırınga tabanlı işleyişi ile atalet Havacilik olarak kabul edilir. Sarmal Havacilik kapalı çevrim işlemi lökosit fiziksel veya kimyasal karışıklık olmadan phorbol 12-myristate 13-asetat tarafından (PMA) gösterildiği gibi sağlar-elastase yayın sıralanmış nötrofil indüklenen.

Biz şeffaf bağışıklık hücreli süspansiyonlar her iki DTT mucolysis ve havacilik ayrılma (Şekil 3A) ile elde. Havacilik ayrılma toplanan 4,40 x 105 PMNs ortalama (2.1 x 104 x 105<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/f...

Bu araştırmada, sarmal atalet Havacilik kapalı çevrim işlemi kullanılarak klinik hava yolu salgıları bir etiket içermeyen nötrofil ayırma yöntemi göstermektedir. Önerilen yöntem çeşitli solunum yolu hastalıkları klinik vitro deneyleri artıracağı.

Kapalı çevrim atalet Havacilik kullanarak hasta kaynaklı hava yolu salgı dan etiket içermeyen nötrofil zenginleştirme

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource ...

Bu yöntem, pnömoni, astım, kistik fibroz ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı gibi akciğer hastalıkları araştırmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en önemli avantajı, hasta nötrofilini hasta hava yolu sekresyonundan dikey kimyasal bozulma olmaksızın izole etmek ve zenginleştirmektir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi olan Kyungyong olacak.Başlangıç olarak, 10'a bir oranını koruyun ve PDMS öncüsünü baz ve sertleştirici madde ile karıştırın. Ardından, mikro makine alüminyum kalıbına 30 gram PDMS karışımı ekleyin. Daha sonra 100 milimetrelik bir Petri kabına 20 gram daha PDMS karışımı ekleyin.Gazdan arındırma amacıyla kalıbı ve Petri kabını vakumlu desikatöre koyun. Gazdan arındırdıktan sonra, vakumu serbest bırakın ve kalıbı ve Petri kabını bir saat boyunca 90 santigrat derecede bir fırına koyun. Bir saat sonra kalıbı ve Petri kabını fırından çıkarın ve oda sıcaklığında 10 dakika soğumaya bırakın.Ardından, taslağı kesmek için bir bıçak kullanın ve cihaz üzerinde iki milimetre biyopsi deliği ile sıvı erişim deliklerini delin. Delikleri deldikten sonra, bir bant sabitleyin ve cihazın kanal tarafına ve kalın PDMS filmine

label-free-neutrophil-enrichment-from-patient-derived-airway

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, düşük yoğunluklu nötrofillerin veya LDN'lerin ameliyat sonrası bir insan hastanın periton lavaj sıvısından izole edilmesi prosedürünü açıklıyoruz. Bu şekilde elde edilen LDN'ler, tümör büyümesi ve ilerlemesindeki rollerini anlamak için daha sonraki aşağı akış deneylerinde kullanılabilir.

Peritoneal Düşük Yoğunluklu Nötrofil İzolasyonu: Manyetik Aktif Hücre Sıralaması Kullanılarak Peritoneal Lavaj Sıvısından Düşük Yoğunluklu Nötrofiller Elde Etme Tekniği

Bu video, spiral kanallara sahip bir mikroakışkan cihaz kullanarak nötrofillerin trakeal sekresyonlardan ayrılmasını göstermektedir. Cihaz, değişen kalınlıklar ve trapez şekilli kanallar kullanarak hücre boyutuna göre verimli bir ayırma sağlar. Kuvvetler arasındaki etkileşim, büyük nötrofillerin iç duvarın yakınında birikmesine neden olurken, eritrositler ve müsin agregatları dış duvarın yakınında kalarak etkili nötrofil ayrışmasını sağlar.

Spiral Mikroakışkan Kanal Kullanılarak Trakeal Sekresyondan Etiketsiz Nötrofil Ayrımı

Bu video, hepsi çip üzerinde bir yöntem kullanılarak nötrofil kemotaksisi testini göstermektedir. Yöntem, immünomanyetik negatif seçim ve ardından bir mikroakışkan çip üzerinde kemotaksis testi ile nötrofillerin tam kandan doğrudan izolasyonuna izin verir.

Tam Kan Kullanılarak Hızlı Nötrofil Kemotaksisi Analizi için Mikroakışkan Çip Tabanlı Bir Yöntem

Bu protokol, sağlam tekrarlanabilirlik ile, bütün haldeki kan, bir damla, insan nötrofil kemotaksisi ölçmek için tasarlanmış bir tahlil göstermektedir. Bu yaklaşım, nötrofil ayrılması için ihtiyaç dışı eden ve deney hazırlama zaman sadece birkaç dakika gerektirir. Mikroakışkan çip bebeklerde veya örnek hacmi sınırlıdır küçük memeliler, zamanla nötrofil kemotaksisinin tekrarlanan ölçü sağlar.

İşlenmemiş kandan Nötrofil Kemotaksis Ölçüm mikroakışkan Platformu

Akciğerin sağlık durumu, akciğer bronşiollerinde bulunan bağışıklık hücrelerinin türüne ve sayısına göre yansıtılır. Farelerin alt solunum yollarından yapışkan olmayan hücrelerin ve çözünür faktörlerin izolasyonunu ve çalışılmasını sağlayan bir bronkoalveolar lavaj tekniğini açıklıyoruz.

İnflamatuvar Hücre İnfiltrasyonunu İncelemek İçin Murin Akciğerlerin Bronkoalveoler Lavajı

Bu makale, tam kandan alınan çipte nötrofil izolasyonunu ve kemotaks testini tek bir mikroakışkan yonga üzerine entegre ederek hızlı bir nötrofıl kemotaksis tahlilini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir yöntem sunmaktadır.

Hızla Nötrofil Kemotaksis Analizinde Doğrudan Bir Damla Kan Alınacak Bütünleşik Çip Yöntemi

Bu iletişim kuralı için üst solunum yolları rahatsız edilmeden Mukozal astar sıvı örnekleme invaziv olmayan bir teknik anlatılmaktadır. Vivo düzeyleri sitokinler ve kemokinler, gibi protein arabulucu miktar her yaştan bireylerde gerçekleştirmek için kullanılabilir.

Mukozal astar sıvı noninvaziv örnekleme için In Vivo üst solunum yolu bağışıklık arabulucu düzeyleri miktar

Bu el yazması burun ve bronş emme teknikleri, özellikle alt ve üst hava yolu Mukozal astar sıvı (MLF) örnek için sentetik dinsel matrisler (SAM) kullanarak açıklar. Bu yöntemleri daha iyi standardizasyon ve tolerabilite mevcut solunum örnekleme teknikleri daha sağlar.

Burun ve bronş sıvıları emilimini: hassas örnekleme insan solunum mukoza ve laboratuvar işleme örnekleri

Bu makalede, insan akciğerinin proksimal ve distal bölgelerinden canlı epitel hücrelerinin zenginleştirilmesine izin veren doku dissosiyasyonu ve hücresel fraksiyonasyon yaklaşımları için ayrıntılı bir metodoloji sunulmaktadır. Bu yaklaşımlar, akciğer epitel progenitör hücrelerinin fonksiyonel analizi için 3D organoid kültür modelleri kullanılarak uygulanmaktadır.

Organoid Kültür için İnsan Akciğer Epitel Progenitör Hücrelerinin İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Bu protokolde, fizyolojik olarak ilgili bir mikrovasküler ortamı yeniden üretebilen ve tüm lökosit adezyon / migrasyon kaskadını yeniden üretebilen bir biyomimetik mikroakışkan testi, inflamatuar hastalıkta lökosit-endotel hücre etkileşimlerini incelemek için kullanılmaktadır.

Enflamasyon Sırasında Lökosit-Endotelyal Hücre Etkileşimini İnceleyen Mikrofizyolojik Bir Sistem

Öğrenin, hasta kaynaklı hava yolu salgılarından nötrofil izolasyonu için kapalı çevrim atalet mikroakışkanlık yöntemini. Bu etiketsiz teknik, solunum hastalıkları klinik araştırmalarında fonksiyonel hücre zenginleştirmesi sağlar.

Kapalı çevrim atalet Havacilik kullanarak hasta kaynaklı hava yolu salgı dan etiket içermeyen nötrofil zenginleştirme

Daha fazla video keşfet