Name: Zenginleştirme ve kurulan subkutan fare tümör tümör bağışıklık ve Non-immün Microenvironments karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Öğrenin, farelerdeki subkutan tümörlerde immün ve immün olmayan mikroçevre bileşenlerini ayrıştırma ve zenginleştirme yöntemini. Bu teknik, tümör immünolojik durumunun kapsamlı profillenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JMN ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü (T32GM088129) ve Ulusal Enstitüsü Diş ve fasiyal araştırma (F31DE026682) mali desteği Ulusal Sağlık Enstitüleri her ikisi de kabul eder. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor. Bu proje aynı zamanda NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 ve S10 RR024574) ve Joel M. Sederstrom uzman yardımı fon ile Sitometresi ve hücre sıralama özünde Baylor Tıp Fakültesi tarafından desteklenmiştir.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Baylor Tıp Fakültesi tarafından onaylanmıştır.
1. tümör hasat ve sindirim
Not: ~ 3-5 dk hasat için gerekli zamanı geldi/tümör ve işleme için gereken süreyi ~ 1 saat + 2-3 dk/tümör.
<ol><li>Fareler tarafından karbondioksit inhalasyon ötenazi ve her fare aşağı % 70 etanol ile saç kontaminasyonu önlemek için hasat önce sprey. Cerrahi olarak subkutan tümörler fareler kaldırmak ve tümör herhangi bir bulaşıcı dokusunun (Yani, saç, cilt, periton, vb) ücretsiz olduğundan emin olun. Her tümör 1,8 mL fetal Sığır serum (FBS) 24-şey plaka olmadan temel RPMI-1640 medya yerleştirin. Daha büyük hasat için tabak hücresel canlılığı korumak için buza soğuk tutmak. Not: kısırlık gerekiyorsa, bir Biyogüvenlik ile steril cerrahi araçlar (Yani, makas, pens, vb), aynı zamanda herhangi bir daha fazla adım kabine içinde gerçekleştirilecek tüm tümör diseksiyonlarının gerekir. Tümör ile en uzun çapı 0,5 - 1 cm arasında en iyi durumda ve daha büyük veya daha küçük tümörler reaktifler ölçekleme gerektirir.</li>
	<li>Tümör 1 mm'den az3 adet her şey içinde kesmek için makas kullanın.</li>
	<li>Collagenase çözülerek 10 x sindirim kokteyl hazırlamak ben 10 mg/mL, collagenase IV adlı 2.500 U/mL ve DNaz, ben 200 U/mL (olmadan FBS) temel RPMI-1640 medyada. Not: Sindirim kokteyl bir gün önceden hazırlanmış ve -20 ° C'de depolanan; Ancak, enzim aktivitesi bir kez çözünmüş zamanla kaybedersiniz olarak uzun süreli depolama tavsiye edilmez.</li>
	<li>10 içeren collagenase ben, collagenase IV ve DNaz ayrılma kokteyl x 200 µL ekleyin ben 1 mm3 adet ile her şey için.</li>
	<li>60-100 bir yörünge plaka shaker kullanarak rpm'de hafifçe sallayarak süre 37 ° C'de 1 h için sindirimi örnekleri sağlar. Not: 37 ° c sıcaklık yükselmesine enzimatik sindirim sırasında bağışıklık Hücre aktivasyonu neden olabilir.</li>
	<li>1 saat sonra reaksiyon RPMI-1640 medya her şey için %5 FBS ve 2 mM EDTA ile takıma 1 mL ekleyerek etkisiz hale getirin.</li>
	<li>Tümör sindirim ve kalan tümör adet 50 mL santrifüj tüpü üstüne oturmuş bir 40 µm hücre süzgeç içine pipette. Not: tümör sindirimi daha kolay transfer süzgeç için 1 mL pipet ucu kapalı ucu kesilmiş.</li>
	<li>10 mL şırınga lavabo pompası mekanik olarak tümör adet süzgeç aracılığıyla disaggregate için kullanın. Süzgeç 2 mL ilave RPMI-1640 medya ile düzenli olarak yıkayın (%5 içeren FBS) ve hücre süzgeç tümörü temizlenene kadar tekrarlayın. Not: Yaklaşık 4-10 mL Toplam medya yeterince tümör süzgeç durulama için yeterli olmalıdır. Not: tüm örnekleri için hücresel canlılığı korumak bu adımı tamamlanana kadar örnekleri buza koyun.</li>
	<li>Her 50 mL santrifüj tüpü ilave RPMI-1640 medya kullanarak aynı birim için ayarlayın. Not: Ses ayarı santrifüj dengeleme için önemlidir. Bu adım atlama santrifüj hasar veya yaralanmalara neden olabilir.</li>
	<li>Hücre süspansiyonlar (5 dk, 805 x g, 4 ° C) santrifüj kapasitesi, supernatants atmak ve 2 mL ilave RPMI-1640 medya yeniden askıya alma. Not: Bir hücre toplamak resuspend zordur aralıklarla takip oluşabilir. 5 mL serolojik pipet ve mix hızla devam etmeden önce ayrılmak için kullanın.</li>
</ol>2. bağışıklık ve tümör hücresel kesirler ayrılması
Not: 1 h yaklaşık bu adım için gerekli zamanı geldi.
<ol><li>Yoğunluk gradient orta 3 mL 15 mL santrifüj tüpü altýna ekleyin. Hazırlamak ve yeterli tüpler her tümör için etiket.</li>
	<li>Katman tümör hücre süspansiyon iki katmanları karıştırma önlemek için tüp tarafı yavaş yavaş pipetting tarafından yoğunluk gradient orta üzerine 2 mL.</li>
	<li>Dikkatle katmanlı borular santrifüj ve spin vasıl 805 x g, 20 ° C, fren yok ile 20 dk için yer. Not: Uygun Dengeleme doğrulamak ve fren yok Santrifüjü sırasında kullanıldığından emin olmak son derece önemlidir. Bu işlem herhangi bir bozulma katman karıştırma neden olur ve tam örnek kurtarma zor olacak.</li>
	<li>Dikkatle tümör infiltre lökosit (TIL) katmanı ve aktarım pipet kullanarak yeni bir 15 mL tüp top medya katmana aktarmak. Tüm kalan yoğunluk gradient orta atın ve 2 mL ilave RPMI-1640 tümör Pelet tüpün dibinde resuspend. Not: Santrifüjü sonra orada-ecek var olmak üstünde dört görünür katmanlardan yukarıdan aşağıya sırasıyla karşılık gelen: medya, TILs, yoğunluk gradient orta ve tümör hücre Pelet. Şekil 2A çeşitli katmanları örneği için bkz.</li>
	<li>Her iki TIL santrifüj kapasitesi ve tümör örneklerinde tüpler (5 dk, 805 x g, 4 ° C) ayırmak ve süpernatant atın.</li>
	<li>200 µL TIL örnekte ve tümör Pelet 2 ml ilave RPMI-1640 medya resuspend. Canlılığı korumak için buz üzerinde tutun.</li>
</ol>3. kaplama ve boyama
Not: kaplama için gereken süreyi 30 s/tümördür; yüzey boyama için gerekli zamanı 1 h; hücre içi boyama için gerekli 40 dk. zamanı; Akış Sitometresi Analizi 1 - için gereken süreyi 4 dk/tümör.
<ol><li>Hazırlamak ve etiket bir 96-şey U-alt plaka paneli ve hücre için ek bir plaka boyama her bağışıklık için sayar. Not: Genellikle, toplamda üç tabak hazırlanır: lenfosit odaklı panel kaplama, myeloid odaklı panel kaplama ve bir hücre sayısı tabak.</li>
	<li>Aliquot tek hücreli süspansiyonlar her boyama plakaları ve küme bir birim sayısı plaka paneli. Not: Kont plaka hücreleri böylece doğru hücre nüfus sayımları sağlayan her boyama Masası'na eklenen toplam sayısını hesaplamak için kullanılır. 96-şey plaka örnekleme ve hacimsel analiz yetenekleri ile bir akış sitometresi µL her örnek başına hücre sayısı sağlar ve bu nedenle, her boyama Masası'na eklenen hücreleri hesaplamak. Sayısı Tabaklar fiksasyon gecede 4 ° C'de FACs önbellekle durulama, sonra ertesi gün elde edilebilir (fosfat tamponlu tuz (PBS) % 2 ile FBS) ve set hacmi FACs arabellek içinde resuspending.</li>
	<li>Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) 200 µL iki kez hücrelerle örnek (5 dk, 805 x g, 4 ° C) centrifuging ve süpernatant arasında herhangi bir ücretsiz FBS kaldırmak için her durulama atarak yıkayın.</li>
	<li>50 µL Fc blok, bir çok kanallı pipet kullanarak örnekleri mix ve 4 ° C'de 20 dk için kuluçkaya Ekle</li>
	<li>2 x 50 µL ekstraselüler hedefleme antikor konsantre ve tamir edilebilir canlılığı leke karışımı, bir çok kanallı pipet kullanarak mix ve RT veya 4 ° c, karanlıkta 30 dk için kuluçkaya ekleyin Not: Tam boyama koşullar antikor için üreticinin yönergelerini üzerinde bağlıdır. Tüm boyama dilutions tamir edilebilir canlılığı boya doygunluk önlemek için eklenen hiçbir FBS ile DPBS içinde olması gerekir. Bu el yazması kullanılan boyama panelinin en iyi dilutions için Tablo malzemeleri/ekipman bakınız. Antikor ve tamir edilebilir canlılığı çözüm boyama son bir 1 x 100 µL konsantrasyon Fc engellemek için eklendiğinde toplam boyama birimin boyama sağlamak için 2 x konsantrasyon hazırlanmıştır.</li>
	<li>İki kez FACs arabelleği ile örnekleri (5 dk, 805 x g, 4 ° C) centrifuging ve supernatants arasında her durulama atarak yıkayın.</li>
	<li>1 fiksasyon/permeabilization çözüm x 200 µL resuspend ve gecede ışıktan korunan 4 ° C'de kuluçkaya. Not: Deneme gecede bu noktada duraklatılmış: ışıktan korunan 4 ° C'de örnekleri tutmak.</li>
	<li>Ertesi gün, tabak (5 dk, 805 x g, 4 ° C) santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
	<li>Bir kez 1 permeabilization arabellek, santrifüj (5 dk, 805 x g, 4 ° C), x 200 µL ile durulayın ve süpernatant atın.</li>
	<li>1 x konsantre hücre içi antikor boyama masası 1 x permeabilization arabellekte hazırlanan 100 µL ekleyin ve RT veya 4 ° C (bu üreticinin boyama önerileri bağlıdır) karanlıkta 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Arabellek (5 dk, 805 x g, 4 ° C), 1 x permeabilization ile atmak sonra süpernatant durulama ve durulama FACs arabelleği ile ikinci kez (PBS % 2 ile FBS).</li>
	<li>Örnekleri FACs arabellek 300 µL içinde resuspend (% 2 ile PBS FBS), akış sitometresi tüpler için örnekler aktarmak ve akış sitometresi analizi gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Fouad, Y. A., Aanei, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5446472/">Revisiting the hallmarks of cancer.</a> American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).</li>
<li>Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment.</a> Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).</li>
<li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+and+its+role+in+promoting+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth.</a> Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).</li>
<li>Chiou, V. L., Burotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudoprogression+and+Immune-Related+Response+in+Solid+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors.</a> Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).</li>
<li>Menon, S., Shin, S., Dy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Cancer+Immunotherapy+in+Solid+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors.</a> Cancers. 8 (12), 106(2016).</li>
<li>Denkert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-Associated+Lymphocytes+As+an+Independent+Predictor+of+Response+to+Neoadjuvant+Chemotherapy+in+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+effects+of+ablative+radiation+on+local+tumor+require+CD8%2B+T+cells%3A+changing+strategies+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment.</a> Blood. 114 (3), 589-595 (2009).</li>
<li>Stakheyeva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+immune+component+of+tumor+microenvironment+in+the+efficiency+of+cancer+treatment%3A+perspectives+for+the+personalized+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy.</a> Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).</li>
<li>Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histo-Cytometry%3A+A+Method+for+Highly+Multiplex+Quantitative+Tissue+Imaging+Analysis+Applied+to+Dendritic+Cell+Subset+Microanatomy+in+Lymph+Nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes.</a> Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).</li>
<li>Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cell+Subsets+in+Tumor-Bearing+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).</li>
<li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).</li>
<li>Casadevall, A., Fang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigorous+Science%3A+A+How-To+Guide%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Rigorous Science: A How-To Guide.</a> mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CyTOF+supports+efficient+detection+of+immune+cell+subsets+from+small+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples.</a> Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).</li>
<li>Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Mass+Cytometry+%28CyTOF%29+for+Functional+and+Phenotypic+Analysis+of+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells.</a> Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).</li>
<li>Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Tumor-infiltrating+Leukocyte+Subsets+in+a+Subcutaneous+Tumor+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

ZAMAN çeşitli ve karmaşık hücresel bileşenleri ve molekülleri oluşmaktadır. Son kanıtlar bu ortamda doğru karakterizasyonu daha iyi anlaşılmasını tedavi başarı veya başarısızlık sağlayabilir ve hatta tedavi direnç mekanizmaları belirlemenize yardımcı olabilir gösteriyor. Örneğin, çeşitli immünsüpresif hücreleri (Yani, MDSCs, düzenleyici T hücreleri, vs) intratumoral düzeylerini artırma efektör bağışıklık yanıtı azaltmak ve immunotherapeutic etkileri iptal etmek. Öte yandan, efektör bağışıklık nüfus (<em...

Baskılayıcı zaman son zamanlarda kanser damgasını kabul edilmiştir ve gelişme, ilerleme ve solid tümör kanser koruma önemli bir rol oynar gibi onların duyarlılık immünoterapi1azaltmak bilinmektedir. ZAMAN çok sayıda hücresel alt kümeleri ve fenotipleri, tüm bunların içine tümör immünolojik durumunu kritik hakkında bilgi sağlayan oluşur. İmmünolojik şu alt kümeleri daha fazla birlikte doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık yanıtı2,3çoğunluğu oluşturan hücrelere lenfosit veya miyeloid kökenli, tabakalı. İmmunotherapeutic stratejileri (Yani, bağışıklık denetim noktası inhibitörleri, chimeric antijen reseptör T-hücreleri, vb) dayanıklı kanser neden potansiyeline sahip kanserli hastalarda alanındaki son gelişmeler göstermiştir regresyonlar; Ancak, bunlar solid tümör kanser4,5' te görece etkisiz kalır. Çok sayıda gruplar en kritik engel kez tedavi başarı6,7üzerinde oynayabilir ve böylece, yeni immunotherapies özellikle odaklanarak önceden klinik ortamda doğru değerlendirmek gerek kalır göstermiştir onların yetenek modüle veya saat8üstesinden gelmek için.
ZAMAN genellikle karakterize etmek için şimdiki çabalar ya mikroskobu kullanmak veya akış sitometresi ile birlikte hücresel bağışıklık alt kümeleri ve onların özellikleri9,10tanımlamak için stratejiler etiketleme antikor. Bu iki stratejileri mikroskobu kayma takdir hücresel alt kümeleri ve yüksek işlem hacmi ve hücresel değişikliklerin daha geniş miktar akış sitometresi sağlar gibi benzersiz olarak farklı bilgiler sağlamanız. Şimdi 7 parametreleri destekler, spektral görüntüleme sistemleri en iyi duruma getirme floresan multiplex immünhistokimya son gelişmeler rağmen sınırlı panel boyutu geniş düzeyde bağışıklık profil oluşturma zor yapar ve bu nedenle bu teknik kez daha fazla bilgi için saklıdır analizleri duruldu. Sonuç olarak, akış sitometresi teknikleri profil oluşturma en çok kullanılan bağışıklık biri olmaya devam etmektedir. ZAMAN karakterizasyonu rağmen yaygın kullanımı, işleme ve boyama için kullanılan yöntemleri oldukça değişkendir. En sık iletişim kurallarını kullanmak bir tümör enzim dissociating (Yani, collagenases, DNaz, vb) ve tek hücreli süspansiyonlar, elde etmek için el ile ayrılma yöntemleri takip antikor boyama ve analiz7tarafından. Her yöntemin faydaları rağmen çok sayıda gruplar bu teknikleri11indüklenen geniş değişkenlik göstermiştir. Bu tümör microenvironment profil oluşturma çapraz-çalışma karşılaştırmalar geçici son derece zor, hatta aynı fare tümör modeli değerlendirirken. Ayrıca, sınırlı potansiyel tümör hücresel değerlendirmek için bu yöntemleri sağlar ve tümör bağışıklık sızmak bileşenleri bağımsız olarak, her iki bileşenin sindirim sonra serpiştirilmiş olan bu yana. Örnek miktar sonra sınırlar paneli çoklu boyama ve analiz, nadir immünolojik alt kümeleri karakterize etmek çalışırken büyük bir sorun olur (Yani, tümör özel T-hücreleri)12. Kitle sitometresi veya sitometresi saat uçuş (CyTOF), tarafından gibi daha yeni teknikler 42 bağımsız parametreleri13den büyük masası tasarımları destekleyen bazı sistemleri ile hücresel alt kümeleri yüksek boyutlu fenotipik analizi sağlar. CyTOF teknoloji bağışıklık profil oluşturma içinde muazzam güç rağmen bu gider, analiz uzmanlık ve ekipman erişim nedeniyle sınırlı kalır. Buna ek olarak, birçok CyTOF protokolleri sinyal-gürültü oranı14geliştirmek için bağışıklık alt kümeleri arıtma tavsiye ve böylece bizim zenginleştirme yöntemi kullanılan olabilir öneririz veri kalitesini artırmak için CyTOF analiz ters yönde.
Burada bir tümör microenvironment sindirim ve tümör bağışıklık birleştirmek yöntemi sızmak ayırma Analizi açıklanmaktadır. Bu yöntemin amacı bağımsız yüksek üretilen iş tümör bağışıklık sızmak ve tümör hücresel bölümler tümör microenvironment daha geniş karakterizasyonu için profil oluşturma izin vermektir. Subkutan solid tümör manken önemli kayma immünolojik heterojenite için bulundu gibi bu yöntemi kullanarak, biz daha fazla bütün tümör çözümlemesini önemini göstermektedir. Bu tümör içinde hücresel bağışıklık alt kümeleri için zenginleştirir ve bağımsız bir tümör bağışıklık kesirler ve tümör hücre profil oluşturma için sağlar çünkü genel olarak, bu yöntem daha doğru ve tutarlı bir şekilde örnekleri arasında karşılaştırabilirsiniz.

<table><tbody><tr><td>6 ila 12 haftalık erkek C57BL / 6 fare</td><td>Jackson Laboratuvarı&nbsp;</td><td>Tümör çalışmalarımızda kullanılan N</td> <td>/ A</td></tr><tr><td>Fareler MEER Murin Sinjeneik Kanser Hücre hattı</td><td>İşbirlikçiden elde edildi &nbsp;</td><td>N/A</td><td>E6/E7 HPV antijeni eksprese eden murin, bademcikler epitel kanseri hücre hattı&nbsp;</td></tr><tr><td>% 70 izopropil alkol&nbsp;</td><td>EMD Milipore&nbsp;</td><td>PX1840</td><td></td></tr><tr><td>Murine cerrahi alet kiti</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>MOUSEKIT</td><td>Öncelikle sadece makas, cımbız ve neşter gerekir.</td></tr><tr><td>24 oyuklu plaka&nbsp;</td><td>Denville Bilimsel A.Ş.</td><td>T1024</td><td>Veya herhangi bir 24 oyuklu düz tabanlı plaka.</td></tr><tr><td>RPMI-1640 medya</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz I&nbsp;</td><td>EMD Milipore</td><td>234153</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz IV</td><td>Worthington Biyokimya Şirketi</td><td>LS004189</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Düşük Hızlı Orbital Çalkalayıcı</td><td>BioExpress (tedarikçi: Genemate)&nbsp;</td><td>S-3200-LS</td><td>Veya herhangi bir orbital çalkalayıcı.</td></tr><tr><td>Termoregülasyonlu inkübatör</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-255-27</td><td>Veya başka herhangi bir termo regülasyonlu inkübatör</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8192</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>AMRESCO</td><td>E177</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Pipet ve uçlar</td><td>Eppendorf</td><td>13-690-032</td><td>Veya başka herhangi bir pipet ve uç</td></tr><tr><td>40 um Hücre Süzgeçleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Santrifüj Tüpleri</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Konik Borular</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Luer-Lok İğnesiz Şırınga</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Lenforep Yoğunluk Gradyan Ortamı</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>7811</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipetleri</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>P7212</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu U-alt plakalar</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>D8573</td><td></td></tr><tr><td>FoxP3 Transkripsiyon Faktörü Boyama Tampon Seti&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>00-5523-00</td><td>Sabit/Geçirgenleştirme Tamponu ve Geçirgenleştirme Tamponu</td></tr><tr><td>Termoregüle Santrifüj</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT Akış Sitometresi</td><td>ThermoFisher Scientific N</td><td>/A</td><td>96 oyuklu hücre hacimsel sayımı için&nbsp;</td></tr><tr><td>Saflaştırılmış Sıçan Anti-Fare CD16 / CD32 (Fare BD Fc Bloğu)&nbsp; Klon 2.4G2&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>553141</td><td>Fc Block</td></tr><tr><td>CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Mavi Ölü Hücre Leke Kiti, UV uyarımı için</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34962</td><td>Sabitlenebilir canlılık lekesi</td></tr><tr><td>CD45 Monoklonal Antikor (30-F11), APC-eFluor 780</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>47-0451-80</td><td></td></tr><tr><td>TCR beta Monoklonal Antikor (H57-597), APC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>CD8-&alfa; Antikor (KT15), PE</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-53473&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Monoklonal Antikor (GK1.5), PE-Siyanin5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15-0041-81</td><td></td></tr><tr><td>MHC Sınıf II (I-A/IE) Monoklonal Antikor (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>56-5321-82</td><td></td></tr><tr><td>CD11c Monoklonal Antikor (N418), PE-Cyanine5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 Monoklonal Antikor (BM8), eFluor 450</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>48-4801-80</td><td></td></tr><tr><td>CD11b Monoklonal Antikor (M1/70), APC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6G (Gr-1) Monoklonal Antikor (RB6-8C5), PE</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoklonal Antikor (MIH5), PE-Siyanin7</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25-5982-80</td><td></td></tr><tr><td>CD273 (B7-DC) Monoklonal Antikor (122), PerCP-eFluor 710</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46-9972-82</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 Monoklonal Antikor (B56), BV711</td><td>BD Biosciences</td><td>563755</td><td></td></tr></tbody></table>

zenginleştirme ve kurulan subkutan fare tümör tümör bağışıklık ve non-immün microenvironments karakterizasyonu

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Tümör bağışıklık microenvironment (zaman) son zamanlarda özellikle immunotherapies için solid tümör tedavi yanıtının kritik bir aracı olarak kabul edilmiştir. Klinik gelişmeler son immünoterapi tümör ve onun ilişkili bağışıklık infiltrat doğru ve iyice ayırdetmek tekrarlanabilir yöntemleri ihtiyacını vurgulamak. Tümör enzimatik sindirim ve akış sitometrik çözümlemesi çok sayıda bağışıklık hücre alt kümeleri ve fenotipleri geniş karakterizasyonu izin; Ancak, derinlik analizi kez panel tasarım ve büyük tümör örnekleri elde etmek için gereken nadir bağışıklık nüfus ilgi gözlemlemek için fluorophore kısıtlamalar ile sınırlıdır. Böylece, ayıran ve tümör bağışıklık infiltrat non-immün tümör bileşenlerinden zenginleştirici bir etkili ve yüksek üretilen iş yöntem geliştirdik. Açıklanan tümör sindirim ve santrifüj yoğunluğu tabanlı ayırma tekniği tümör ve tümör ayrı karakterizasyonu bağışıklık infiltrat kesirler ve hücresel canlılığı korur ve böylece, tümörün geniş bir karakterizasyonu sağlar immünolojik durumu. Bu yöntemi daha da tutarlı bütün tümör immünolojik profil oluşturma teknikleri gerek gösteren geniş kayma bağışıklık heterojenite solid tümör olarak karakterize etmek için kullanıldı. Genel olarak, bu yöntem bir etkili ve uyarlanabilir teknik subkutan solid fare tümör immünolojik karakterizasyonu için sağlar; Bu nedenle, bu aracı tumoral immünolojik özellikleri daha iyi tanımlamak için kullanılabilir ve Roman immunotherapeutic stratejileri preklinik değerlendirilmesi.

Bizim sonuçlar non-immün tümör bileşenlerinden ayırma TIL önemli yararı iletişim kuralında açıklandığı gibi gösterilmektedir. Ayrıca, açıklanan yöntemi kullanarak biz kurulan solid tümör önemli immünolojik heterojen göstermek.
Birçok tümör ayrışma teknikleri ile önemli bir sorun en sık sert sindirim koşulları (Yani, yüksek sıcaklıklarda, yetersiz besin kaynağı, vb) bir sonucu olarak örnek canlılığı kayıptır. İl...

Burada ayırmak ve kurulan subkutan tümörler tümör bağışıklık ve non-immün microenvironment bileşenlerinin zenginleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik tümör bağışıklık sızmak ve tümör bağışıklık microenvironment kapsamlı karakterizasyonu izin verebilir non-immün tümör kesirler ayrı analiz için sağlar.

Zenginleştirme ve kurulan subkutan fare tümör tümör bağışıklık ve Non-immün Microenvironments karakterizasyonu

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Bu tekniğin genel amacı, katı tümörlerin bağışıklık mikroçevresine katkıda bulunan hem bağışıklık hem de kanser hücresi fraksiyonlarının aynı anda profillenmesi için bir yöntem sağlamaktır. Bu yöntem, belirli bir tedaviyi takiben tümör içinde hangi immün ve immün olmayan seri değişikliklerin meydana geldiği gibi immün onkoloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tümör immün ve immün olmayan bileşenlerin etkili bir şekilde zenginleştirilmesini kolaylaştırması ve tümör immünolojik durumunun kapsamlı bir profilinin çıkarılmasına izin vermesidir.Bu yöntemin genel amacı, tümör immün mikro çevresinin profilini verimli bir şekilde çıkarmak ve tedaviye bağlı değişiklikleri belirlemektir. Saç kontaminasyonunu önlemek için fareye% 70 etanol püskürttükten sonra, tümörlerin herhangi bir kontamine doku içermediğine dikkat ederek deri altı tümörlerini cerrahi olarak çıkarın. Daha sonra, her bir tümörü, buz üzerinde 24 oyuklu bir plakanın ayrı oyuklarına fetal sığır serumu olmadan 1.8 mililitre baz RPMI 1640 ortamına yerleştirin.Tüm tümörler toplandığında, numuneleri bir milimetre küpten daha az parçaya kesmek için makas kullanın ve her bir

enrichment-characterization-tumor-immune-non-immune-microenvironments

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu yazıda, tümör infiltre lökositlerin oldukça saflaştırılmış nüfusu izole edilmesi için bir protokol tanımlamaktadır. Bu protokol, karmaşık tümör doku hücreleri izole edilmesi için, verim ve saflıkta geliştirmek için Miltenyi Biotech protokolü uyarlanmıştır.

Primer Tümörler gelen Bağışıklık Hücre İzolasyonu

Bu video, tam olarak rezeke edilmemiş deri altı tümörleri olan bir fare modelinde adjuvan veya ek tedavinin test edilmesini göstermektedir. Kısmen tümör rezeke edilen fare, T düzenleyici hücrelerin anti-sitotoksik proteinini hedef alan, potansiyel olarak tümör büyümesini azaltan ve etkili adjuvan tedavi öneren bir antikor ile tedavi edilir.

Tam Rezeke Edilmemiş Subkutan Tümörü Olan Bir Fare Modelinde Adjuvan Tedavi

Bu protokol, bir fare tümör modelinde tümör mikroçevresi içindeki lökosit alt kümelerinin ayrıntılı değerlendirmesi için bir yöntemi açıklar. Chemerin eksprese eden B16 melanom hücreleri, sinjeneik farelere deri altından implante edildi. Tümör mikroçevresinden alınan hücreler daha sonra boyandı ve akış sitometrisi ile analiz edildi, bu da ayrıntılı lökosit alt küme analizlerine izin verdi.

Bir deri altı tümör modelinde tümör-süzücü lökosit subsetleri Değerlendirilmesi

Tümör mikroçevresini (TME) taklit etmek için geçirgen bir mikro gözenekli membran ekini uyarladık. Model, karışık bir hücre kültüründen oluşur, floresan etiketleme veya hücre sıralama kullanmadan yüksek oranda zenginleştirilmiş bireysel hücre popülasyonlarının basitleştirilmiş üretimine izin verir ve normal veya stres koşulları altında TME içinde hücreler arası iletişimin incelenmesine izin verir.

Tümör mikroçevresinin A Mimik: Hücreler arası İletişim Zenginleştirilmiş hücre popülasyonları oluşturma ve incelenmesi için Basit Bir Yöntem

Burada bir orthotopic fare modeli baş ve boyun Skuamöz Hücre Karsinomu geliştirmek için tekrarlanabilir bir yöntem mevcut. Tümör nekroz, zavallı farklılaşma, nodal metastaz ve bağışıklık infiltrasyon gibi hastalığın klinik histopatolojik özellikler göstermektedir. Tümörü taşıyan fareler disfaji, çene deplasman ve kilo kaybı gibi klinik belirtiler geliştirmek.

Skuamöz Hücre Karsinomu Hücre Tümörü bağışıklık profil oluşturma için fareler ve tedaviye yanıt değerlendirme intramucosal aşı

Bu protokol ortotopik pankreas tümörlerinin cerrahi nesil ve taze izole mürin pankreas tümörlerinin hızlı sindirim açıklar. Sindirimden sonra, canlı bağışıklık hücresi popülasyonları daha fazla downstream analizi için kullanılabilir, akış sitometri ile hücre içi sitokin tespiti için T hücrelerinin ex vivo stimülasyon dahil.

Ortotopik Pankreas Tümörlerinin Üretimi ve Tümör Efiltrasyonu T Hücre Sitotoksisitesinin Ex vivo Karakterizasyonu

Burada, bir fare tümörü modelinde tümöre özgü ve periferi kaynaklı tümör kaynaklı lenfositlerin karakterizasyonu için bir tümör transplantasyon protokolü sunulmaktadır. Alıcı kaynaklı immün hücrelerin akışının akım sitometrisi ile spesifik olarak izlenmesi, antitümör immün yanıtlar sırasında bu hücrelerin fenotipik ve fonksiyonel değişikliklerinin dinamiklerini ortaya koymaktadır.

Farelerde Tümör Sızan CD8 + T Hücrelerinin Dinamiğini Değerlendirmek için Tümör Transplantasyonu

HNSCC'nin sinjenik fare modelinde IL-1α'nın antitümör aktivitesini ve ilişkili toksisitesini incelemek için standart bir protokol tanımlanmıştır.

Polianhidrit IL-1α Nanopartiküllerinin In vivo Antitümör Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Protokol, Flt3L eksprese eden B16-F10 melanomu ile hücre bazlı tümör aşılamasını kullanan bir kanser immünoterapi modeli sunmaktadır. Bu protokol, kültürlenmiş tümör hücrelerinin hazırlanması, tümör implantasyonu, hücre ışınlaması, tümör büyümesinin ölçülmesi, intratümöral immün hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrisi analizi dahil olmak üzere prosedürleri göstermektedir.

Hematopoetik Sitokin ile Tümör Aşılaması Kullanılarak Deneysel Melanom İmmünoterapi Modeli

Bu protokol, immüno-onkoloji çalışmaları için insan bağışıklık sistemi (HIS) farelerinin neslini özetlemektedir. Bu modelde implante edilen insan tümörleri üzerinde insan immünoterapötiklerini test etmek için bu modelin kullanımındaki talimatlar ve hususlar, insan bağışıklık sisteminin tümöre tepkisini karakterize etmeye vurgu yapılarak sunulmuştur.

İnsan Tümörleri Taşıyan İnsanlaştırılmış Bir Fare Modelinde Kanser İmmünoterapötiklerinin Test Edilmesi

Tümör içi immünoterapiye artan ilgi nedeniyle, erişilebilir ve pratik tümör modelleri seçmek çok önemlidir. Deri altı tümörleri oluşturmak kolaydır ancak görselleştirmek ve manipüle etmek zordur. Bu protokolte, daha iyi görünürlük ve erişilebilirlik sağlayan deri içi tümörlerin oluşumu için yöntemleri tanımlıyoruz.

İntradermal Tümör İmperasyonu Olarak Mısır Kanseri İçin Sağlam Bir Model Olarak İntümörlü İmmünoterapi Çalışmaları

Öğrenin, farelerdeki subkutan tümörlerde immün ve immün olmayan mikroçevre bileşenlerini ayrıştırma ve zenginleştirme yöntemini. Bu teknik, tümör immünolojik durumunun kapsamlı profillenmesini sağlar.

Zenginleştirme ve kurulan subkutan fare tümör tümör bağışıklık ve Non-immün Microenvironments karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet