Zenginleştirme ve kurulan subkutan fare tümör tümör bağışıklık ve Non-immün Microenvironments karakterizasyonu

Bu tekniğin genel amacı, katı tümörlerin bağışıklık mikroçevresine katkıda bulunan hem bağışıklık hem de kanser hücresi fraksiyonlarının aynı anda profillenmesi için bir yöntem sağlamaktır. Bu yöntem, belirli bir tedaviyi takiben tümör içinde hangi immün ve immün olmayan seri değişikliklerin meydana geldiği gibi immün onkoloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tümör immün ve immün olmayan bileşenlerin etkili bir şekilde zenginleştirilmesini kolaylaştırması ve tümör immünolojik durumunun kapsamlı bir profilinin çıkarılmasına izin vermesidir.

Bu yöntemin genel amacı, tümör immün mikro çevresinin profilini verimli bir şekilde çıkarmak ve tedaviye bağlı değişiklikleri belirlemektir. Saç kontaminasyonunu önlemek için fareye% 70 etanol püskürttükten sonra, tümörlerin herhangi bir kontamine doku içermediğine dikkat ederek deri altı tümörlerini cerrahi olarak çıkarın. Daha sonra, her bir tümörü, buz üzerinde 24 oyuklu bir plakanın ayrı oyuklarına fetal sığır serumu olmadan 1.8 mililitre baz RPMI 1640 ortamına yerleştirin.

Tüm tümörler toplandığında, numuneleri bir milimetre küpten daha az parçaya kesmek için makas kullanın ve her bir oyuğa bir tane olmak üzere kollajenaz-1, kollajenaz-4 ve DNaz içeren 200 mikrolitre taze hazırlanmış 10X ayrışma kokteyli ekleyin. 37 santigrat derecede bir saat sonra, 60 ila 100 RPM'de bir orbital plaka çalkalayıcıda,% 5 FBS ve iki milimolar EDTA ile desteklenmiş bir mililitre RPMI 1640 ortamı ile reaksiyonu nötralize edin ve her bir tümör bulamaç örneğini ayrı ayrı 40 mikrometre süzgeçlerle doldurulmuş ayrı 50 mililitrelik konik tüplere aktarmak için modifiye edilmiş bir mililitre pipet ucu kullanın. 10 mililitrelik bir şırınga pistonu kullanarak, tümör parçalarını süzgeçlerden mekanik olarak ayırın, süzgeçler tümörden arınana kadar her süzgeci iki mililitre RPMI 1640 orta artı %5 FBS ile periyodik olarak durulayın.

Tüm tümörler ayrıştığında, tüm numuneleri aynı hacme getirmek için her tüpe gerektiği kadar ortam ekleyin ve hücreleri santrifüjleme ile peletleyin. Ardından, peletleri tüp başına iki mililitre FBS takviyeli ortamda yeniden süspanse etmek için beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanın. Bağışıklık ve tümör hücresi fraksiyonlarını ayırmak için, numune başına bir 15 mililitrelik konik tüpün dibine üç mililitre yoğunluk gradyan ortamı ekleyin ve her bir tüpün yanından her gradyan üzerine yavaşça iki mililitre tümör hücresi süspansiyonu katmanlayın.

Tümör hücresi süspansiyonlarının katmanlamadan önce iyice karıştırıldığından, hücre süspansiyonlarının tüplerin kenarından yavaşça pipetlendiğinden ve katmanların karışmasını önlemek için tüplerin dikkatli bir şekilde kullanıldığından emin olun. Hücreleri yoğunluk gradyan santrifüjleme ile ayırın ve üst ortamı ve tümör sızan lökosit katmanlarını numune başına 15 mililitrelik yeni bir tüpe dikkatlice toplayın. Kalan yoğunluk gradyan ortamını atın ve tümör peletlerini tüp başına iki mililitre ortam artı FBS içinde yeniden süspanse edin.

Daha sonra, tüm örnekleri santrifüjleyin ve tümöre sızan lökositleri 200 mikrolitrede ve tümör hücrelerini buz üzerinde tüp başına iki mililitre ortam artı FBS'de yeniden süspanse edin. Hücreleri plakalamak için, her bir immün boyama paneli için bir 96 oyuklu U-alt plakayı ve hücre sayımları için ek bir plakayı etiketleyin ve tek hücre süspansiyonlarını boyama paneli plakalarının her birine ve kireç plakasına ayırın. Hücreleri numune başına 200 mikrolitre Dulbecco'nun PBS'si ile iki kez yıkayın ve hücreleri dört santigrat derecede 20 dakika boyunca oyuk başına 50 mikrolitre FC bloğu ile bloke edin.

Bloke edici inkübasyonun sonunda, karanlıkta 30 dakikalık bir inkübasyon için her bir oyuğa 50 mikrolitre 2X konsantre hücre dışı hedefleme antikoru ve sabitlenebilir canlılık lekesi karışımı ekleyin. Boyama inkübasyonunun sonunda, numuneleri FACS tamponu ile iki kez yıkayın ve peletleri 200 mikrolitre fiksasyon ve geçirgenlik solüsyonunda gece boyunca dört santigrat derecede ışıktan korunarak yeniden süspanse edin. Ertesi gün, hücreleri santrifüjleme ile toplayın, ardından kuyu başına 200 mikrolitre geçirgenlik tamponu ile yıkayın.

Hücreleri, karanlıkta 30 dakikalık bir inkübasyon için geçirgenlik tamponunda 100 mikrolitre hücre içi antikor boyama paneli ile etiketleyin, ardından başka bir geçirgenlik tamponu yıkaması yapın. Daha sonra, hücreleri tekrar FACS tamponu ile yıkayın ve numuneleri akış sitometrisi ile analizleri için 300 mikrolitre taze FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Gösterildiği gibi, yoğunluk gradyan ortamı zenginleştirmesi olsun veya olmasın, tümör sindirimi, akış sitometrisi ile değerlendirildiği gibi yaklaşık% 70 ila 90 oranında canlı bir tüm tümör hücresi popülasyonu ile sonuçlanır.

Yoğunluk gradyan ortamı zenginleştirme, zenginleştirilmemiş tümör sindirimlerine ve ayrıca bağışıklık mikroçevre çalışmalarında yaygın olarak gözlenen çok sayıda bağışıklık hücresi alt kümesine kıyasla, CD45 pozitif tümör infiltre eden lökosit fraksiyonunda iki kattan daha büyük bir artışı destekler. CD45 negatif tümör hücresi fraksiyonu, genel tümör canlılığı veya apoptoz, proliferasyon kapasitesi ve çeşitli immünosüpresif belirteçlerin ekspresyonu gibi çok sayıda tümör özelliği için de profillenebilir. Miyeloid ve lenfosit immünolojik alt kümelerinin tek bir katı tümör boyunca nasıl değiştiğini belirlemek için, tümör, her bölüm yaklaşık olarak eşit intratümöral bölgelerin yanı sıra eşit dermal ve peritoneal bakan bölümler içerecek şekilde dört eşit parçaya bölünebilir.

Her parça daha sonra ayrı ayrı sindirilebilir ve gösterildiği gibi çeşitli bağışıklık hücresi popülasyonlarının varlığı için analiz edilebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, kaç örneğe sahip olduğunuza bağlı olarak dört ila 8 saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, hücre canlılığını korumak için hızlı ama verimli bir şekilde çalışmak önemlidir.

Ayrışma ve ayırma adımları, yalnızca yazılı metinle öğrenilmesi zor olan teknikleri içerdiğinden, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Bu prosedürü takiben, hücresel popülasyonların hem bolluk hem de fenotip açısından bir tümör içinde nasıl değiştiğine dair ek soruları yanıtlamak için akış sitometrisi yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, gösterilen sindirim ve yoğunluk gradyan ayırma tekniklerini kullanarak yerleşik bir deri altı murin tümörünün hem bağışıklık hem de bağışıklık dışı bileşenlerini nasıl ayıracağınızı ve analiz edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.