Kanserle ilgili yorgunluk mitokondriyal işlev rolünün değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, kanser hastalarında yorgunluk ile ilişkili mitokondriyal disfonksiyonu değerlendirmektir. Bu yöntem, radyasyon tedavisi aldıktan sonra kanserli hastalarda mitokondriyal disfonksiyonun yorgunlukla ilişkili olup olmadığı gibi destekleyici kanser bakımı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, daha az invaziv olması ve klinikte kanser tedavisinden kaynaklanan toksisite riski taşıyan hastaları belirlemek için kolayca kullanılabilmesidir.

Bu teknik sadece kansere bağlı yorgunluk bitinde mitokondriyal disfonksiyonun rolüne ilişkin anlayışımızı ilerletmekle kalmaz, aynı zamanda değerlendirmeyi iyileştirebilir ve yönetimini optimize edebilir. Bu yöntem, kansere bağlı yorgunluğun altında yatan mekanizmalar hakkında fikir verebilse de, metabolik ve üri inflamatuar durumlar gibi diğer yorucu hastalık durumlarına da uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler için, önceden görsel gösterim yapmadan sensör kartuşunun her bir portuna solunum inhibitörlerini düzgün bir şekilde enjekte etmek zor olabilir.

Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan bir postbac araştırmacısı olan Bay Quang Nguyen olacaktır. Sensör kartuşunu nemlendirmek için önce paketinden çıkarın. Ardından, yardımcı plakanın her bir oyuğuna 200 mikrolitre kalibrant çözeltisi ekleyin.

Ayrıca her hendeği 400 mikrolitre kalibant çözeltisi ile doldurun. Ardından, sensör plakasını yardımcı plakaya geri koyun ve kartuşu gece boyunca 37 santigrat derecede karbondioksit olmayan bir inkübatörde nemlendirmeye başlayın. Kronik hastalık tedavisinin 13 maddelik fonksiyonel değerlendirmesine dayanarak yorgunluk seviyesini ölçün.

Başlangıçta, orta noktada, EBRT'nin tamamlanmasında ve EBRT'den bir yıl sonra yorgunluk. İlk olarak, mitokondriyal fonksiyon ölçümü için tahlil ortamını hazırlayın. Ortamı hazırladıktan sonra 37 santigrat dereceye kadar ısıtın ve pH'ı 7.4'e ayarlayın.

PH'ı 7.4'e ayarlamadan önce tahlil ortamının deney günü hazırlandığından ve 37 dereceye kadar ısıtıldığından emin olmak önemlidir. Daha sonra, yüzde 80 ila 90 birleşme elde etmek için PBMC'leri her bir kuyucuğa tohumlayın. Daha sonra, hücrelerin kuyucukların dibine yapışması için plakayı 2 dakika boyunca 200 kez g döndürün.

Sıkma işleminden sonra, ortamı her bir kuyucuktan çıkarın ve kuyuları bir kez tahlil ortamı ile durulayın. Arka plan kuyuları da dahil olmak üzere her oyuğa 180 mikrolitre tahlil ortamı ekleyin. Daha sonra plakayı 37 santigrat derecede karbondioksit olmayan bir inkübatörde 45 ila 60 dakika inkübe edin.

İlaçları sulandırmak için, 50 mikromolar stok oligomisin çözeltisi oluşturmak için ilaca 252 mikrolitre tahlil ortamı ekleyin. FCCP'nin 50 mikromolar stok çözeltisi oluşturmak için ilaca 288 mikrolitre tahlil ortamı ekleyin. Son olarak, 25 mikromolar antimisin a / rotenon stok çözeltisi oluşturmak için 216 mikrolitre tahlil ortamı ekleyin.

Sulandırıldıktan sonra, her üç ilaç da ilaç süspansiyonunu bir dakika boyunca girdap haline getirin ve ardından çalışma solüsyonlarını seyreltin. Daha sonra, A portunda 20 mikrolitre 10 mikromolar oligomisini, her bir oyukta bir mikromolar nihai konsantrasyona pipetleyin. Daha sonra, B portunda 22 mikrolitre 10 mikromolar FCCP'yi her oyukta bir mikromolar nihai konsantrasyona pipetleyin.

Son olarak, C portunda 25 mikrolitre 5 mikromolar antimisin a / rotenon pipetleyin, her bir oyukta 0.5 mikromolar nihai konsantrasyona kadar pipetleyin. Ardından hücre dışı akı cihazında Mito Stres Testini seçin. Ardından, cihaz uyarısını izleyerek sensör kartuşunu takın.

Cihaz, sensör kalibrasyonunu otomatik olarak gerçekleştirecektir. Kalibrasyon tamamlandıktan sonra, testin geri kalanını bitirmek için cihazın hücre plakasını yerleştirin. Hücre proliferasyon tahlil çözeltisini hazırlamak için, 1.405 mililitre fosfat tamponlu saline 5.76 mikrolitre nükleik asit boyası ve 28.8 mikrolitre arka plan baskılayıcı ekleyin.

Mito Stres Testi bittikten sonra, her bir oyukta doğrudan ortama 180 mikrolitre 2x çalışma solüsyonu ekleyin. Daha sonra hücreleri, hücre proliferasyon tahlil çözeltisi ile 37 santigrat derecede 45 ila 60 dakika inkübe edin. 508 nanometre uyarma ve 527 nanometre emisyonda bir plaka okuyucudaki canlı hücrelerin sayısını ölçün ve ardından OCR verilerini normalleştirin.

FCCP titrasyonu gerçekleştirilirken, bir mikromolar, PBMC mitokondriyal fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılan optimal ilaç konsantrasyonudur. Mitokondriyal solunum ve yeni izole edilmiş PBMC'lerin araştırılması, OCR'nin üç saatte azalmaya başladığını ve sekiz saate kadar devam ettiğini göstermektedir. Bununla birlikte, FCCP enjeksiyonu ile ortaya çıkan maksimum solunum da bazal OCR seviyesini aşmaz.

Burada, hücrelerin iki sağlıklı bireyden izole edildiği mitokondriyal fonksiyonun normalleşmesi gösterilmiştir. Aslında, yeşil floresan DNA bağlayıcı boya ile temsil edilen canlı hücrelere normalize edilmiş OCR, her iki sağlıklı bireyde de benzerdir. Aslında, sağlıklı ve yorgun bir denek arasında bazal OCR'de anlamlı bir fark gözlenmemiştir.

Bununla birlikte, yorgun denek, kontrole kıyasla azalmış maksimum oksijen tüketimi ve yedek solunum kapasitesi gösterir. Mitokondriyal olmayan ve ATP ile ilişkili oksijen tüketiminde veya sağlıklı ve yorgun denekler arasında birleştirme verimliliğinde hiçbir fark bulunmamıştır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa dört saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü denerken, önce optimal hücre yoğunluğunu ve FCCP konsantrasyonlarını belirlemeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, belirli hücre tiplerine odaklanan gelecekteki mekanik araştırmalara rehberlik etmek için farklı hücre popülasyonlarını izole etmek gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, destekleyici bakım alanındaki araştırmacıların yorgun kanser hastalarında mitokondriyal disfonksiyonun rolünü keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, mitokondriyal fonksiyonun nasıl ölçüleceğini ve yorgunluk da dahil olmak üzere kanser tedavisiyle ilgili toksisiteler geliştirme riski taşıyan hastaları proaktif olarak belirlemek için kullanılabilecek klinik örnekleri iyi anlamış olmalısınız. Oligomisin ve rotenon gibi solunum inhibitörleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu işlem yapılırken kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemler her zaman alınmalıdır.