Name: X-ışını kristalografisi ve biyofiziksel teknikleri immünglobulin katlanmış glikoproteinlerin karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Öğrenin immünglobulin katlanmış glikoproteinlerin biyofiziksel ve yapısal karakterizasyonu için X-ışını kristalografisi, biyolayer interferometri ve izotermal titrasyon kalorimetrisi yöntemlerini. Bu teknikler geniş bir glikoprotein yelpazesi için uygulanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

X-ışını kırınım deneyler Bu yazıda açıklanan gerçekleştirilen beamlines 08-ID ve 08-BM Kanada ışık yenilik, Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi Kanada Kanada Vakfı tarafından desteklenen, kaynakta, kullanma Saskatchewan Üniversitesi, Saskatchewan, Kanada Batı ekonomik çeşitlendirme, Ulusal Araştırma Konseyi Kanada ve Kanada Sağlık araştırma enstitüleri hükümeti. Yapısal ve biyofiziksel çekirdek tesis, hastane hasta çocuklar için erişim ITC ve saçınıza aletler için kabul etmek istiyoruz. J.E.O. tarafından Banting doktora sonrası bursu BPF-144483 Kanada Sağlık araştırma enstitüleri desteklenmiştir. T.S. olduğunu bir alıcı bir Kanada Yüksek Lisans Burs Master'ın ödülü ve Kanada Sağlık araştırma enstitüleri Vanier Kanada Yüksek Lisans Burs. Bu eser hibe Kanada Sağlık araştırma enstitüleri PJT-148811 (J.-P.J.) işletim tarafından desteklenmiştir. Bu araştırma, kısmen, Kanada araştırma sandalye program (J.-P.J.)fon sayesinde yapılmıştır.

Yazarlar hiçbir rakip ilgi bildirin.

Glikoproteinlerin membran bağlantılı hücre işlevi için kritik olan ve çekici tedavi hedefleridir. Burada, biz hem tek başına hem de karmaşık küçük molekül ligandlar ile bir protokol membran glikoproteinlerin, ECD yapısal ve biyofiziksel karakterizasyonu için mevcut ve Fab parçaları. Üç N-terminal-çoğu IG etki alanları insan CD2228, kritik bir eş reseptör B hücreleri humoral bağışıklık onay79' tutmak için ilgili ekstraselüler bölümünün kristal yapısını belirlemek için bu iletişim kuralı başarıyla kullanmıştır. Ayrıca CD22 bağlama site onun doğal ligand α2-6 sialyllactose ile karakterize ve terapötik bir antikor insan CD22 doğru tanıma modu tanımlanır. Bu sonuçlar anahtar ifade B hücreleri ve yeni CD22 hedeflenen küçük molekül ve antikor tabanlı geliştirme doğru moleküler bir yol haritası üzerinde sınırlı sahip Siglecs ailesi üyesi yapısı-işlev ilişki içine anlayışlar sağlar tedavi. Bu iletişim kuralı başarıyla IG içeren B hücre reseptörü için kullanılan iken, bizim yaklaşım herhangi bir membran glikoprotein ayrı etki alanı organizasyon ile yapısal ve biyofiziksel karakterizasyonu için uygulanabilir öneriyorum. Bu gibi durumlarda, tasarım ve kombinatorik glycan N bağlı mutasyonlar (ya Gln veya Ala) bir yapı kristal büyüme ve yüksek çözünürlüklü kırınımı için uygun bulmak için değerlendirilebilir oluşturmak.
Homojen ve saf glikoprotein örnek alma kristal büyüme ve x-ışını kırınım, yanı sıra aşağı akım biyofiziksel karakterizasyonu için kritik önem taşıyor. N bağlı glukanlardir glikoproteinlerin üzerinde mevcut doğal olarak heterojen ve konformasyon ve kimyasal heterojenite kristal oluşumu caydırmak olabilir glikoprotein içinde neden olabilir. Bu mikro-heterojenite azaltmak için nokta mutasyonlar N bağlı glukanlardir veya endoglycosidases (örneğin, EndoH) ile tedavi ardından mutant hücre hatları (örneğin, HEK293S) kullanarak liman tahmin Asn artıkları kaldırmak için tanıtmak stratejileri önemli ölçüde yapabilirsiniz kristalizasyon başarı15,21,22geliştirmek. Bu protokol için biz çözünür glikoproteinlerin ve süpernatant hücreye salgılanan Fabs arıtma tartışıyorlar. Glikoprotein salgı saflık, hücre lizis ihtiyacını veya sert kimyasallar veya deterjanlar ilavesi olmadan doğru nispeten basit bir yol sağlar. Hücre süpernatant olarak elde edilen aşağıdaki hücre hasat daha sonra doğrudan faiz (Örneğin, Ni-NTA glikoproteinlerin O'nun öğesini veya LC benzeşme Fab parçaları için) protein için ilgi olan bir sütun üzerinde çalıştırın. Ancak, kullanım ve hücre süpernatant (Örneğin, pH) koşullarının sütun bağlı olarak protein ilgi sütun bağlama özelliğiyle etkilenip etkilenmedikleri sınanmamıştır. Bu durumda ise, konsantre ve arabellek sütuna bağlama geliştirmek için exchange süpernatant hücre gerekli olabilir. Ayrıca, kalite kontrol adımları arıtma sırasında protein saflık değerlendirmek yardımcı olmak için istihdam edilmelidir önerilir. SDS-sayfa jel veya Western blot (önce sırasında ve sonrasında arıtma adımları) tüm örneklerinin çalışan önerilen arıtma düzeni faiz protein için uygun olup içine anlayışlar yol açabilir. Bulaşıcı bantları SDS-sayfasında görünür durumdaysa veya çeşitli türlerin arıtma sırasında aldıysanız (Örneğin, boyut dışlama üzerinde birkaç tepeler), ek arıtma adımları kabul edilmelidir, Örneğin, İyon Kromatografi elde etmek için saflık ve artış bir şansa aşağı akım kristalizasyon80.
Makromoleküllerin kristalizasyon için uygun kristal bulmak için çok sayıda potansiyel kristalizasyon koşullarında yüksek protein konsantrasyonları tarama için izin ilgi protein yüksek verim elde etmek için önemlidir. Genel olarak, burada ele HEK293 hücre hatları (HEK293F ve HEK293S) güçlü ifade sistemlerdir ve kolayca daha fazla örnek gerekli üretmek için ölçeklendirilebilir. Ancak, faiz protein yeterince bu hücre satırları içinde ifade değil mümkündür. Bu durumda Expi293 hücreleri81,82gibi diğer hücre hatları protein ifade üstün düzeyde göstermek için bulduk ve alternatif olarak düşünülmelidir.
İyi, diffracting kristalleri protein yüksek saflıkta rağmen ilgi çeşitli yapıları, test takip elde değil, kristal oluşumu tanıtmak için kristalizasyon teknikleri genişletmek için gerekli olabilir. Bu antikorlar ve nanobodies Fab parçaları mükemmel kristalizasyon arttırıcılar olması ve iyi sipariş edilen Kristal83,84,85ambalaj teşvik gösterilmiştir. Bu parçaları dile getirdi ve homojenliği için saflaştırılmış ve protein ilgi ile birlikte kristalizasyon tanıtmak için kullanılır. Önemlisi, Bölüm 10'açıklandığı gibi üretilen Fab parçaları işlevsel olmayan LC dimer86oluşturmak için bir eğilim olabilir. Bu dimer kirletici vardır ve arıtma sırasında kaldırılmalıdır. Bizim deneyim, LC dimer kez farklı saklama birimi boyutu dışlama üzerinde veya İyon Kromatografi üzerinde farklı bir zirve olarak elute ve bu her zaman böyle değildir ancak Fab arıtma - böylece kaldırılabilir. Bu teknikler LC dimer Fab arıtma kaldırmak yetersiz ise, Protein G benzeşme arıtma gibi ek arıtma yöntemleri saflık geliştirmek için istihdam edilebilir.
Seçimli-e doğru co-complexation Fab parçaları ile rastgele matrix microseeding gibi iyi belgelenmiş teknikleri iyi kristalleri63,70elde etme şansını artırabilir. Bu yöntem, ezilmiş, suboptimal kristalleri az miktarda ek bir kristal kristal büyümeyi desteklemek için nucleate sağlayan kristalizasyon durum içine içerir. Bu ilgi, ya da olanlar benzer etki alanı mimarisi ve üçüncül yapısı ile protein kristalleri kullanılarak gerçekleştirilebilir. Ayrıca, rasgele matris microseeding yalnız protein kristalize girişimlerini veya karmaşık bir Fab parçası veya ilgi küçük molekül ile gerçekleştirilebilir. Cryo-elektron mikroskobu son gelişmeler de bu tekniği uygun özellikleri87,88moleküller için yüksek çözünürlüklü yapısal bilgi elde etmek için x-ışını kristalografisi için cazip bir alternatif yapmak, 89,90,91.
X-ışını kırınım datasets phasing Bay tarafından başarısız olduğunda, iliklerine kadar HA faz sorunu çözmek için anormal dağılım veya isomorphous yedek tarafından gerekli olabilir. Proteinin amino asit dizisi incelenmesi HA derivatization, bağlama için optimum pH da dahil olmak üzere için strateji hakkında ipuçları sağlar. Özellikle, protein içinde unpaired katıldı özellikle cıva içeren HA bileşikler bağlayabilirsiniz. HA bileşikler ile yerel kristalleri iliklerine kadar en iyi HA bileşik kimliğinin, onun konsantrasyonu ve gerekli kuluçka zamanı belirlemek için yinelemeli bir işlemdir. İlk iliklerine girişimleri iyi diffracting kristalleri HA phasing için uygun içeren pes ediyor musun, amino asit oyuncu değişikliği HA bağlama olasılığı geliştirmek ve anormal sinyal artırmak için tanıtmak için gerekli olabilir. Örnek verilebilir mutasyonlar için kapsamlı bir şekilde anormal phasing için kullanılıyor anormal E. coli seleno-metiyonin desteklenen medyada phasing Hg, Au, Pt veya ifade Pb. proteinlerin verimli bir şekilde bağlamak için ücretsiz sistein kalıntıları içerir ancak bir güvenilir seleno-metionin içerir eşdeğer sistem süspansiyon92,93memeli hücrelerinde için değildir ve gelecekteki gelişme alanıdır.
Faiz glikoprotein unliganded yapısını alındıktan sonra küçük molekül ligandlar kristallerle iliklerine bağışıklık reseptör-ligand kompleks bir yapı elde etmek için gerçekleştirilebilir. Bu veriler bir plan küçük molekül tedavi kullanılabilir yanı sıra yüksek çözünürlüklü anlayışlar glikoprotein biyolojik fonksiyonu sağlar daha belirli ve yüksek-benzeşme ligandlar rasyonel tasarım sağlar. Küçük molekül ligandlar ilgi kristallerle glikoprotein emmek çalışırken, unliganded kristal yapısı incelenmesi iliklerine kadar mümkün olup olmayacağını belirtebilirsiniz. Eğer yakın kristal ambalaj kişiler ligand bağlayıcı sitenin etrafında bulunur veya konformasyon değişiklikleri ligand bağlayıcı üzerine geçmesi beklenen bölgeler muhtemelen iliklerine kadar sorunlu. Bu durumda, eş kristalizasyon protein-ligand kompleks gibi diğer yöntemleri uygulanmalıdır.

Yüzey proteinleri hücresel işlevinde önemli rol oynarlar. Ekstrasellüler etki alanları, bu zar proteinleri hücre-hücre etkileşimleri, adezyon, taşıma ve1,2sinyal modüle. Bu proteinler hücre dışı lokalizasyonu onları hastalıkları, kanser ve otoimmün hastalıklar3,4,5 de dahil olmak üzere geniş bir yelpazede tedavisinde therapeutics gelişimi için çekici hedefler yapar , 6 , 7. insan membran protein ectodomains en yaygın kıvrımları biridir yedi veya daha fazla β-iplikçikleri iki β-sayfa8,9içine düzenlenmiş tarafından kurulan immünglobulin benzeri (Ig) kat. Genellikle, Ig içeren glikoproteinlerin membran proteini10ekstraselüler kısmı üzerinde sırayla düzenlenmiş IG etki alanlarıyla çoklu etki alanı yapılardır. Özellikle N ve O bağlı glikozilasyon, bu hücre yüzeyine proteinlerin translasyonel modifikasyonlar katlama, salgı ve işlev11onların Yönetmelikte gerekli rolleri oynamak için gösterilmiştir. Teknikleri anlayışımız işlevlerine ve onları hedef olabilir daha iyi tasarım tedavi geliştirmek için gerekli olan detaylı onların Moleküler Karakterizasyonu için izin. Burada, Biyofizik için izin teknikleri bir arada mevcut (biolayer Interferometry (BLI) ve izotermal titrasyon Kalorimetre (ITC)) ve yapısal (x-ışını kristalografisi) IG içeren hücre dışı etki karakterizasyonu membran glikoproteinlerin, yalnız ve karmaşık biyolojik ilgili ligandlar ve terapötik molekülleri (Şekil 1).
N bağlı glikozilasyon memeli proteinler üzerinde en yaygın sonrası çeviri değişiklikler biridir ve endoplazmik retikulum ve Golgi12,13içinde protein olgunlaşma sırasında ortaya çıkar. Gibi insan embriyonik böbrek (HEK) 293 hücreleri, hücre hatları glikozile memeli proteinler14,15büyük miktarlarda rekombinant ifade için geliştirilmiştir. Bu hücre kültürünü protein üretim yapisan hücre hatları ile karşılaştırıldığında daha büyük miktarlar için yukarı ölçekleme kolaylığı sağlar bir süspansiyon biçimde geliştirilmiştir. Burada, biz iki HEK293 hücre satır kullanmaktadır: HEK293F ve HEK293 Gnt ben N-acetylglucosaminyl transferaz yokluğunda tarafından ben farklı- / - (HEK293S), (Gnt ben) ikinci. Buna karşılık, karmaşık glukanlardir (olarak görülen HEK293F) üretimi mümkün değildir ve bunun yerine yüksek mannoz tipi glukanlardir (ağırlıklı olarak Man5GlcNAc2) glycan N bağlantılı siteler18,19,,20 ikamet . Bu iki hücre satırları paralel olarak kullanarak glycan boyut ve karmaşıklık etkisi biyolojik fonksiyon ve terapötik hedefleme üzerine eğitim sağlar. Gerçekten, HEK293F hücrelerinde üretilen glikoproteinlerin HEK293S hücrelerinde üretilen aynı glikoprotein kıyasla daha büyük, daha karmaşık glukanlardir olacaktır. HEK293S hücrelerinde üretilen glikoproteinlerin azaltılmış kimyasal ve konformasyon heterojenite onların N bağlı glukanlardir nedeniyle daha kristalizasyon için mükellef bulunmaktadır. Crystallizability daha da geliştirmek için HEK293S (ama değil HEK293F) hücrelerinde üretilen glikoproteinlerin enzim endoglycosidase H (Endo H), yüksek mannoz glukanlardir bir bölünme gibi sonuçları ile tedavi edilebilir sadece bir tek N-peptidoglikan (GlcNAc) yan her N bağlı glikozilasyon sitesi21,22, kalır. Diğer yöntemler de N-glycan işleme glycosyltransferase inhibitörleri eklenmesi sırasında kifunensine23içeren glikoprotein ifadeler gibi hücre içinde sınırlandırmak için kullanılabilir. Alternatif yaklaşımlar (HEK293F hücrelerdeki) yerel glikoproteinlerin ifade peptid N-glycosidase F (PNGaseF) kullanarak tekrar tekrar enzimatik deglycosylation tarafından takip gerektirir. Ancak, deglycosylation PNGaseF ile yerel koşullar ve artar toplama bazı proteinlerde altında daha az etkili olduğu gösterilmiştir; protein kullanımdan sonra çözünür kaldığında durumlarda bu aspartik asit24, deamidation asparagine kalıntısı nedeniyle yüzeyinde negatif ücretleri hangi onun kristalizasyon için zararlı olabilir satın aldı. Tahmin edilen N-glikozilasyon siteler de, en sık alanin veya glutamin artıkları için N bağlı glikozilasyon bu sitelerdeki engellemek ve yüksek homojenliği glikoprotein örnekleri oluşturmak için mutasyona uğramış. Alternatif olarak, glikoproteinlerin mantar, böcek ve bitki sistemlerinde veya Çince hamster yumurtalık (CHO) hücreleri16,17gibi diğer memeli hücre satırları da dahil olmak üzere diğer ökaryotik hücre kültürlerinde üretilebilir.
PHLsec, dahil olmak üzere birçok memeli ifade vektörel çizimler, rekombinant glikoprotein ectodomains salgısı hücre orta25içine sağlar. Hücre lizis için gerek kalmadan hızlı ve kolay arıtma HEK293 hücrelerden glikoproteinlerin salgılanmasını sağlar. Arıtma Etiketler eklenmesi (Örneğin, O'nun etiketi, Strep-etiket, bayrak-etiket, Myc-etiket, HA-etiket) hedef N ve C terminus glikoprotein arıtma tek adım benzeşme Kromatografi tarafından sağlar. Daha sonra boyutu dışlama Kromatografi biyofiziksel ve yapısal karakterizasyon için monodisperse örnek verim için kullanılabilir.
Uygun koşullar altında son derece saf ve homojen glikoprotein örnek iyi diffracting kristaller neden olabilir. Bir kez tam x-ışını kırınım veri kümesi böyle kristalleri elde etti, ilk aşama glikoprotein elektron yoğunluğu hesaplamak için belirlenecek gerekir. Bir artan yapıları Protein veri Bankası (PDB) sayesinde, phasing için en sık kullanılan yöntem tarafından çok ilk aşama26elde etmek için ilgili protein yapısı kullanır moleküler değiştirme (MR), haline gelmiştir. Ancak, zaman zaman multi-IG etki alanı glikoproteinlerin27,28,29için olduğu gibi Bay faz sorunu çözmek başarısız olduğunda alternatif yöntemler gereklidir. Bu makalede, biz CD22 ectodomain28yapısını çözmek için gerekli ağır atomları (HA) kristallerle phasing için emmek için bir yöntem ayrıntı. Sağdaki HA phasing için tanımlayan belirli bir kristal kafes ve kristalizasyon çözüm30,31glikoprotein kullanılabilir atomlar HA reaktivite üzerinde bağlıdır yinelemeli bir işlemdir. Alternatif olarak, doğal kükürt atomlara sistein ve metionin artıkları varsa yeterince yüksek bir oranı, diğer atomlar için glikoprotein ve x-ışını kırınım veri yeterince yüksek artıklık32iletoplanan phasing için kullanılabilir, 33.
Membran glikoproteinlerin biyolojik işlev genellikle protein-protein etkileşimleri veya protein-ligand etkileşimleri, tarafından gibi karbonhidrat ile aracılık ettiği. Ligand glikoprotein bağlamanın sitesine kristal kafes içinde eriyik--dan yaygın küçük olduğunda, deneyler iliklerine ligand tanıma daha iyi anlamak için bir glikoprotein ligand Co kristal yapısı elde etmek için başarılı olabilir.
Burada sunulan iletişim kuralları da sentetik tedavi ligandlar34,35 ve antikor therapeutics36,37ile yüzey glikoproteinlerin etkileşimleri anlamak için ilgili. Yapısal bilgilerle birleştirildiğinde, kinetik ve termodinamik bağlama anlamak ve eylem kendi mekanizmaları geliştirmek için güçlü olabilir. Terapötik antikorlar bir glikoprotein bağlama kinetik analizi için izin veren bir BLI38,39tekniktir. Saçınıza biyosensörler sonuçta denge ayrışma sabiti (KD) belirleyen bir bağlama ortağı ile dernek ve ayrılma kinetik ölçmek için immobilize bir ligand ile kullanır. BLI değil çekici bir yaklaşım çünkü glikoproteinlerin küçük miktarlarda gereklidir (< 100 µg), deney zamanı hızlı (~ 10-15 dk başına), ve o-ebilmek var olmak otomatikleştirmek. ITC glikoproteinlerin ve bağlama ortakları40,41,42,43arasında benzeşim eğitimi için de yararlıdır. ITC daha fazla zaman ve reaktif yoğun olmakla birlikte, etkileşim (ΔG, ΔH, ΔS ve stoichiometry) Termodinamiğin ile ilgili değerli bilgiler elde edilebilir. ITC de çok sık sık ligandlar için yüzey glikoproteinlerin geçici bağlama ile ilişkili zayıf etkileşimler çalışmak için yararlıdır. Ayrıca, bu tekniklerin birlikte bağlama çeşitli yapıları, değerlendirmek ve farklı hücre hatlarında glikoprotein ifade elde farklı N bağlı glycoforms etkisini değerlendirmek için kullanılabilir. HEK293F, HEK293S üretilen ve Endo H ile tedavi glikoproteinlerin ile saçınıza ve ITC performans glukanlardir rolünün ayrıntılı bir görünümünü biyolojik aktivite ve terapötik nişan sağlar.
Biz başarıyla uygulanan ekstrasellüler etki alanı (ECD) özelleştirmek için bu iletişim kuralları insan CD2228, B hücreli homeostazı44 bakımı için önemlidir sialik asit bağlama IG benzeri lektinlerinin (Siglecs) ailesinin bir glikoprotein üye . Kristalizasyon kolaylaştırmak için derinlemesine yapı tasarımı gerçekleştirilen ve Hg ile iliklerine HA X-ray DataSet'in aşamalı. Biz de onun ligand sialik bağışıklık reseptör-ligand kompleks bir yapı elde etmek için asit (α2-6 sialyllactose) kristallerle CD22 batırılmış ve böylece planları glycan mimetics45,46yapısı destekli tasarım için sağlanan. Buna ek olarak, biz anti-CD22 tedavi antikor epratuzumab - terapötik aday Şu anda Faz III klinik denemeler için non-Hodgkin Lenfoma47- parça antijen bağlayıcı (Fab) onun bağlama benzeşme BLI tarafından belirlemek için oluşturulan ve ITC differentially glikozile için CD22 ECD oluşturur. Bu çalışmalar epratuzumab nişan, N bağlı glikozilasyon için kritik bir rol işlevsiz B hücreleri üzerinde CD22 tanıma için potansiyel etkileri ile saptandı.

<table><tbody><tr><td>0.22 &mu; m Steritop filtre</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPS02RE</td><td></td></tr><tr><td>10 kuyulu %4-15 gradyan SDS-PAGE jel</td><td>Bio-Rad</td><td>4561084</td><td></td></tr><tr><td>10x glikotampon 3</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702S</td><td>Endo H reaktifi ile birlikte gelir</td></tr><tr><td>10x Kinetik Tampon</td><td>PALL Fort & eacute; Bio</td><td>18-1092</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glisin/SDS Tamponu</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>1 mL yuvarlak tabanlı 96 kuyulu blok</td><td>ThermoFisher</td><td>260251</td><td></td></tr><tr><td>22 mm lamel</td><td>Hampton araştırması</td><td>HR3-231</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Numune Tamponu</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>96-3 kuyulu INTELLIPLATE&nbsp; düşük hacimli rezervuar</td><td>Art Robbins Aletler</td><td>102-0001-03</td><td></td></tr><tr><td>AgeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0552S</td><td></td></tr> <tr><td>& AUML; KTA Saf</td><td>GE Sağlık</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Hizmetleri & AUML; KTA Başlangıç&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 santrifüj filtrasyon cihazı 10KDa MWCO</td><td>Millipore UFC901008</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4 santrifüj filtrasyon cihazı 10KDa MWCO</td><td>Millipore UFC801008</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Auto-iTC200</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axygen MaxyClear Snaplock 1.5 mL mikrotüpler</td><td>Fisher Scientific</td><td>MCT150C</td><td></td></tr><tr><td>Kontes Hücre Sayma Odası Slaytları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 x 0,05-0,1 mm</td><td>Hampton araştırması</td><td>HR4-945</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 x 0,1-0,2 mm</td><td>Hampton araştırması</td><td>HR4-947</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 x 0,2-0,3 mm</td><td>Hampton araştırması</td><td>HR4-970</td><td></td></tr><tr><td>Dijital Kuru Banyo</td><td>Bio-Rad</td><td>1660562EDU</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH5 ve alfa;</td><td>Invitrogen</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>Endo H</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702S</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer şişesi (şaşkın taban), polikarbonat, steril, 500 mL, DuoCAP</td><td>TriForest Labware</td><td>FBC05000S</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer şişesi 125 mL (şaşkın taban), polikarbonat, steril, 125 mL havalandırmalı</td><td>kapaklı VWR</td><td>89095-258</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tek kullanımlık steril serolojik pipet, pirojenik olmayan, 10 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tek kullanımlık steril serolojik pipet, pirojenik olmayan, 25 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tek kullanımlık steril serolojik pipet, pirojenik olmayan, 5 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tek kullanımlık steril serolojik pipet, pirojenik olmayan, 50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>768180</td><td></td></tr><tr><td>FectoPRO DNA Transfeksiyon Reaktifi, Polyplus</td><td>VWR</td><td>10118-842</td><td></td></tr><tr><td>Serbest Stil 293F hücreler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R79007</td><td></td></tr><tr><td>Serbest Stil İfade ortamı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12338001</td><td></td></tr><tr><td>Ağır Atom Ekranları Au</td><td>Hampton araştırması</td><td>HR2-444</td><td></td></tr><tr><td>Ağır Atom Ekranları Hg</td><td>Hampton araştırması</td><td>HR2-446</td><td></td></tr><tr><td>Ağır Atom Elekleri M1</td><td>Hampton araştırması</td><td>HR2-448</td><td></td></tr><tr><td>Ağır Atom Elekleri M2</td><td>Hampton araştırması</td><td>HR2-450</td><td></td></tr><tr><td>Ağır Atom Elekleri Pt</td><td>Hampton araştırması</td><td>HR2-442</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293S</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap Yakınlık Sütunu</td><td>GE Sağlık</td><td>17525501</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap KappaSelect Yakınlık Sütunları</td><td>GE Healthcare</td><td>17545811</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap LambdaSelect Yakınlık Sütunları</td><td>GE Healthcare</td><td>17548211</td><td></td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-1 Kristal Ekran 1,7 mL blok</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-1</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-2 Kristal Ekran 1,7 mL blok</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-2</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-3 Kristal Ekran 1,7 mL blok</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-3</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-4 Kristal Ekran 1.7 mL blok</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-4</td><td></td></tr><tr><td>Mercuric chloride</td><td>Sigma</td><td>1044170100</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka, 96 kuyulu, polipropilen, düz dipli, siyah ve nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655209</td><td></td></tr><tr><td>Minstrel DT UV</td><td>Formulatrix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro çalkalayıcı</td><td>Infors HT</td><td>MP25-TA-CO2HB</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000/2000c Spektrofotometre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep 3K Omega santrifüj cihazı</td><td>PALL Yaşam Bilimleri</td><td>OD003C33</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA biyosensörler</td><td>PALL Kale ve eacute; Bio</td><td>18-5102</td><td></td></tr><tr><td>Sekizli RED96</td><td>PALL ForteBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oryx 4 kristalize robotu</td><td>Douglas Enstrüman</td><td>ORY-4/1</td><td></td></tr><tr><td>Platin klorür</td><td>Sigma</td><td>520632-1g</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Standardı</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plazmid Maxiprep Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>K210006</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Coomassie Leke Protein</td><td>Ark</td><td>GEN-QC-STAIN-1L</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip Steril 50 mL Tek Kullanımlık Vakum Filtrasyon Sistemi 0.22 & mikro; m Millipore Express</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 Artış 10/300</td><td>GL GE Sağlık</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Sağlık</td><td>17517201</td><td></td></tr><tr><td>Tantal bromür kümesi</td><td>Jena bioscience</td><td>PK-103</td><td></td></tr><tr><td>Top96 Kristalizasyon</td><td>Ekranı Rigaku Reaktifleri</td><td>1009846</td><td></td></tr><tr><td>Triphan Mavisi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>VDX 24 kuyulu sızdırmazlık maddesi ile</td><td>Hampton research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; 2-6 sialillaktoz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8556-1mg</td><td></td></tr></tbody></table>

x-ışını kristalografisi ve biyofiziksel teknikleri immünglobulin katlanmış glikoproteinlerin karakterizasyonu

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Hücre yüzeyinde glikoproteinlerin hücresel işlevde, sinyalizasyon, yapışma ve ulaşım dahil olmak üzere önemli rol oynarlar. Lökosit üzerinde bu glikoproteinlerin çeşitli immünglobulin (Ig) kıvrımlar sahip ve bağışıklık tanıma ve düzenleme için merkezi. Burada, tasarım, ifade ve insan B hücre reseptörü CD22 ekstrasellüler etki alanının biyofiziksel karakterizasyonu için bir platform mevcut. Önerdiğimiz bu yaklaşımlar geniş IG etki alanları içeren memeli glikoprotein ectodomains karakterizasyonu için geçerlidir. İki süspansiyon insan embriyonik böbrek (HEK) hücre hatları, HEK293F ve HEK293S, glukanlardir, karmaşık ve yüksek-mannoz sırasıyla barındırmaktan glikoproteinlerin ifade etmek için kullanılır. Bu rekombinant glikoproteinlerin farklı glycoforms ile glycan boyut ve ligand taşıması kompozisyona etkisini araştıran izin. Biz kinetik ve termodinamik glikoprotein bağlamanın biyolojik ilgili ligandlar ve terapötik antikor adayları için eğitim için protokol tartışıyorlar. Rekombinant glikoproteinlerin HEK293S hücrelerinde üretilen kristalizasyon glycan homojenizasyon, azaltılmış esneklik ve endoglycosidase H tedavi duyarlılık nedeniyle mükellef bulunmaktadır. Biz ağır atomlar ve faz belirlenmesi ve ligand taşıması, analizi için küçük moleküller glikoprotein kristallerle sırasıyla iliklerine için yöntemler mevcut. Tartışılan deneysel protokoller burada sözü işlevlerine fikir vermek ve tedavi hareket mekanizması araştırmak memeli glikoproteinlerin karakterizasyonu için tutun.

CD22 ECD olan birkaç yapılar başarılı bir şekilde pHLsec ifade vektör klonlanmış ve memeli HEK293F ve HEK293S hücre hatlarında (Şekil 2 ve 3A) overexpressed. Tüm yapıları boyutu homojenliği için boyut dışlama Kromatografi tarafından saf ve kristalizasyon çalışmalar (Şekil 3B ve 3 C) için son derece saf bir örnek vermiştir. HEK293S hücreleri, böyle sadece beş altı öngörülen N bağlı glikozilasyon sitelerin Asn Ala (N67A, N112A, N135A, N164A ve N231A), mutasyona uğramış d1-d3 kesme (artıkları 20-330), üretilen iyi diffracting kristal liderliğindeki CD22 yapısı yapıldı Glikozilasyon sitesi konumunda N101 muhafaza (bu yapıyı CD22 adlı20-330, 5A). Kristalleri MCSG-1 seyrek matris ekran çeşitli koşullarda elde edildi, ama en iyi kristaller bir durum içeren 0 (w/v) Polietilen glikol 4000, 0.2 M Lityum klorür ve 0.1 M Tris pH 8,5 vardı. Bu doğal kristaller 2.1 Å çözünürlük için diffracted; ilgili Siglec proteinlerin IG etki alanlarının bilinen yapıları kullanarak herhangi bir çözüm Bay aramalarında vermemiştir.
Aşamalı bilgi almak için yerel bir panel ha bileşik bir kuluçka süresi 5 dk dan 1 d (Şekil 4) için 1-20 mM arasında değişen konsantrasyonlarda Hg, Pt, işletim sistemi, Ta ve Br dahil HA bileşiklerin kristallerle batırılmış. Biz kristalleri morfoloji değişimler için izlenen ve bulundu kristalleri ile HA 20 mM bileşik batırılmış hızlı çatlama ve kristal eriterek sonuçlandı. Tantal bromür küme, platin klorür, cıva asetat ve Merkuris klorür ile sırılsıklam set kuluçka kez takip onların şekil muhafaza 63 kristalleri toplam dondu. Kristalleri Merkuris klorür 30 dk (Saskatoon, Kanada) Kanadalı ışık kaynağı (CLS) 08-BM beamline adlı bir floresan taramasında anormal sinyal gösterdi için 7 mM ile ıslatılmış ve çoklu dalga boyu anormal dağılımı tek bir x-ışını veri toplama için izin Kristal. Bu veri kümeleri bize CD22 Merkür altyapı çözmek izin ücretsiz bir sistein pozisyonda C308 bağlı ve sonuçta bize CD22 yapısını oluşturmak için izin tek Merkür atom ortaya20-330, 5A,20-330, 5A aşamalı içine AutoBuild78elektron yoğunluğu eşlem'i kullanma.
Unliganded yapısı çözüldü sonra biz onun ligand α2-6 siallylactose bağlı CD22 yapısını çözmek için ilgi vardı. Biz ilk CD22 benzeşme α2-6 sialyllactose ITC etkileşim bağlama termodinamik karakterize etmek için kullanarak doğru hesaplanır. ~ 280 µM bir ilgi gözlenen ve bu bilgileri bir başlangıç konsantrasyonu tanımlamak için kullanılan (~ 100 KDx) ligand yerel bizim CD2220-330, 5A kristalleri iliklerine için kullanmak için bir. Biz 25 mM siallylactose 5 dk, 2 h, 14 h, 40 h ve 5 d için CD2220-330, 5A kristallerle batırılmış ve kristal morfoloji değişimler için izlenir. ~ 75 kristalleri toplam çeşitli zaman puan donmuş ve CLS sinkrotron beamline 08-ID (Saskatoon, Kanada) uzaktan veri toplama için gönderdi. Toplam altı X-ray veri kümeleri iyi diffracting kristalleri toplanan. Her x-ışını veri kümesi yapısından bir ilk arama model olarak unliganded CD2220-330, 5A yapısı kullanarak MR tarafından çözüldü. Tüm veri kümeleri için elde edilen elektron yoğunluğu sonra olumlu yoğunluk α2-6 sialyllactose CD22 sitenin bağlama bağlı karşılık gelen Fo-Fc harita için kontrole tabi tutuldu. Dikkat çekici, tüm veri kümeleri toplanan, hatta sadece 5 dk kuluçka süresi, içerdiği sonra olumlu yoğunluğu ligand bağlayıcı sitedeki karşılık gelen batırılmış kristalleri dan. Unliganded ve liganded CD22 genel yapıları α2-6 sialyllactose ile iliklerine deneyler başarısını açıklayabilir en az konformasyon değişiklikleri ile çok benzer.
Biz sonraki terapötik antikor epratuzumab saçınıza ve ITC deneylerde (Şekil 5) tarafından tanınan CD22 antijenik yüzey ile karakterize. CD22 yapıları farklı glycoforms ile epratuzumab Fab bağlama kinetik ve Termodinamik profilleri ile azaltılmış N bağlı glycan büyüklük, CD22 için artan bir ilgi ile daha küçük glukanlardir (327 nM vs 24 nM için ilgi 14-fold bir düzelme kadar ortaya BLI; 188 nM vs 58 nM ITC içinde). Erişimi kısıtlama CD22 N bağlı glycan onun epitope için antikor, tek-noktaya mutantlar CD22, kullanarak saçınıza ve epratuzumab Fab-CD22 d1-d3 Co kristal yapısı28çözme tarafından tespit edilmiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig1.jpg"> Resim 1 . Biyofiziksel ve yapısal karakterizasyon için yapı tasarım glikoprotein karakterizasyonu bakış. (1) temsilcisi glikoprotein birincil dizi analizi. Grey, ekstrasellüler etki alanı (ECD); yeşil transmembran (TM) kesimi; ve mavi, glikoprotein sitozolik etki. Tahmin edilen glukanlardir N bağlı olarak etiketlenmiştir. ECD yapıları, (2) klonlama. (3) ifade ECD memeli hücrelerinde oluşturur. (4) glikoprotein arıtma. Proteinlerin HEK293F içinde karmaşık glukanlardir içerirken, proteinlerin HEK293S içinde-ecek-si olmak yüksek mannoz glukanlardir. Enzimatik glikoproteinlerin tedavisinde HEK293S hücrelerde glikoproteinlerin ile sadece bir GlcNAc yan N bağlı glikozilasyon sitelerdeki sonuçlarında Endo H ile üretilen. (5a) glikoproteinlerin antikorlar için kendi bağlama için biolayer Interferometry (BLI) ve izotermal titrasyon Kalorimetre (ITC) tarafından test edilir. Küçük ligandlar benzeşimi da ITC tarafından ölçülebilir. (5b) kristalizasyon denemelerin glikoproteinlerin olanlar HEK293S ve deglycosylated bazı durumlarda, Endo H. (6) ile ifade gibi homojen N bağlı glukanlardir ile mutasyon N bağlı glikozilasyon sitelerin kristalleri elde etmek gereklidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig2.jpg"> Resim 2 . DNA yapıları ifade memeli hücrelerinde CD22 ectodomain tasarımını. A) CD22 ECD yapıları, geçici transfection için kullanılan pHLsec plazmid gösterimi. AgeI ve KpnI siteleri klonlama için kullanılan kırmızı kutuları ile gösterilir. B) CD22 ECD yedi IG etki alanları (d1-d7) ve 12 öngörülen N bağlı glikozilasyon siteleri (mavili) içerir. Dört yapıları CD22 ECD tasarlanmıştır. C) % 1'özel jel CD22 ECD PCR amplicons gösterilen oluşturur pHLsec memeli ifade vektör klonlama için. İlk lane 1 kb DNA işareti içerir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig3.jpg"> Şekil 3 . İfade ve glikoproteinlerin saflaştırılması. A) hücre yoğunluğu ifade verim üzerine etkisi. Küçük ölçekli 25 mL kültür glikoprotein ifadede HEK293F süspansiyon hücre hücre (0.5 x 106 hücre mL-1, 106 hücre mL-1x 1.0 ve 1.5 x 106 hücre mL üç farklı başlangıç yoğunlukları kullanarak transfected -1). Miktar sol panelinde SDS-sayfasından Dansitometresi ve nicel BLI içinde doğru kapı aynası tarafından gerçekleştirilen. Bir glikoprotein hazırlık temsilcisi değerlerdir. B) için ilk arıtma adımının kromatografik inşa CD2220-330, 5A Ni-NTA benzeşme sütun kullanarak süpernatant 600 mL üzerinden. Glikoprotein % 100 500 mM imidazole içerir elüsyon arabelleğin kaynakçalara imidazole (gri hat), bir degrade kullanarak eluted. Havuza alınan kesirler dikey çizgiler ile tasvir edilir. C) boyutu-dışlama kromatografik için inşa CD22 yüksek performanslı kullanarak20-330, 5A jel filtrasyon sütun. Havuza alınan kesirler elüsyon pik üzerinden dikey çizgiler ile tasvir edilir. İç metin: glikoprotein saflığı gösterilen Coomassie lekeli SDS-sayfa jel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig4.jpg"> Şekil 4 . Kristal ile Ağır atomları iliklerine. A) örnek iş istasyonu yerel HA bileşikler kristallerle iliklerine için. Gerekli tüm araçları olarak etiketlenmiştir. B) adımları kristalleri emmek için takip inşa CD2220-330, 5A HA bileşikler ile. 1. adımda, aç de kristaller ve öyle ki HA son konsantrasyonu 1-10 mM arasında değişmektedir kristalizasyon durumda seyreltilmiş HA solüsyon içeren bir kapak notu üzerindeki bir 0.2 µL damla için bir döngü kullanarak transfer kristaller. 2. adımda, kristalizasyon plaka içinde belgili tanımlık damla mühür ve farklı süreler için bileşik HA kristallerle kuluçkaya. Adım 3, döngü sırılsıklam kristal dağ ve arka-emmek için 30 üç ardışık 0.2 µl damla bir kapak fişinde reçete (v/v) gliserol ile takıma anne içki solüsyon içeren s. 4. adımda, flaş sıvı azot ile beraber bir döngü monte kristal dondurma ve sinkrotron beamline için sevkıyatın Pak yerleştirebilirsiniz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig5.jpg"> Şekil 5 . Biolayer Interferometry ve İzotermik titrasyon Kalorimetre ölçümleri. A) temsilcisi BLI deney. Üst panel: plaka kurulum nerede şu etiketlenir bir kinetik deney örneği: 1 x kinetik tampon (B), onun6 x-tagged glikoprotein (L) yükleme, temsilcisi Fab konsantrasyonları (500, 250, 125, 62.5 nM), PBS + 500 mM rejenerasyon tampon (B) arabellek (R) ve kinetik nötralizasyon x 1. Her şey 200 µL çözüm içerir. Adım numarası kinetik deney için plaka üst kısmında gösterilir. Orta paneli: Ni-NTA biyosensörler kullanılarak gerçekleştirilen BLI deney ve üst paneldeki açıklanan plaka temsilcisi ham veri. Adım sayılar temel (1),6 x glikoprotein (2) yükleme, temel (3), seri seyreltme Derneği Fab (4) ve ayrılma (5) için karşılık gelir. Yeniden oluşturma işlemi adımlar değildir (adım 6-7) temsil. Alt paneli: Temsilcisi analiz veri ham Derneği ve buna karşılık gelen ile ayrılma (mavi çizgi) gösterilen 1:1 (kırmızı çizgi) uygun. B) üst panel: temsilcisi plaka Kur'u tek bir ITC için otomatik bir ITC cihazda bir 96-kuyu alt blok yuvarlak yedi deneyler ile. Her deney üç kuyu oluşur. İlk kuyu (kırmızı) karşılık gelen hücre (400 µL) için örnek, örnek şırınga (120 µL) için ikinci iyi (yeşil) karşılık gelir. Üçüncü de boş bırakılır ve karma örnekleri için de deney tamamlanmasının ardından iade edilecektir. Deneyler 1, 2 ve 7 arabellek arabellek denetimlere uygulanır. Deney 3-5 onaylatılacak deneyler glikoprotein (P) ile hücre ve Fab veya ligand (L) içinde belgili tanımlık tenkıye temsil eder. Deney 6 bir ligand ısı seyreltme denetiminin temsil eder ve 3-5 deneylerden veri çözümlemesi sırasında düşülen. Alt paneli: Temsilcisi ham (üst) ve CD22 ECD için bağlama Fab (epratuzumab) gösterilen işlenmiş (alt) ITC verileri HEK293F hücrelerinde üretilen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Biz glikoproteinlerin biyofiziksel ve yapısal karakterizasyonu için yaklaşımlar ile immünglobulin kat biolayer Interferometry, izotermal titrasyon Kalorimetre ve x-ışını kristalografisi tarafından mevcut.

X-ışını kristalografisi ve biyofiziksel teknikleri immünglobulin katlanmış glikoproteinlerin karakterizasyonu

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Bu yöntem, glikoprotein alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Proteinin işlevi, N-bağlı glikanların rolü ve glikoproteini hedef alan antibiyotiklerin mekanizması ve etkisi hakkında bilgi sağlamak. Bu tekniğin temel avantajı, ilgilenilen herhangi bir glikoproteine uygulanabilmesidir.Çok çeşitli glikoprotein hedeflerinin yapısal ve biyofiziksel karakterizasyonunu kolaylaştırmak. Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımızda bir araştırma projesi koordinatörü olan Hong Cui olacaktır. Başlamak için, hücreleri metin protokolünde belirtildiği gibi hazırlayın ve transfekte edin.Hücreleri 20 dakika boyunca 6, 371 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleme ile hasat edin. Süpernatanı tutun ve ardından filtrelemek için 0,22 mikronluk bir filtre kullanın. Filtrelenmiş süpernatanı dakikada dört mililitre hızla bir tezgah üstü kromatografi sistemindeki bir Ni-NTA kolonuna yükleyin.Bundan sonra, sütunu üç ila dört hacim yıkama tamponu ile yıkayın. Fraksiyonları toplarken saflaştırılmış glikoproteini bir elüsyon tampon gradyanı kullanarak kolondan seyreltin. Kaçan tepe noktasını içeren fraksiyonları, 10 kilodalton nominal moleküler ağırlık sınırına sahip bir santrifüj filtrasyon cihazında çekin.Daha sonra 15 dakika boyunca veya numune 500 mikrolitre hacme ulaşana kadar 4.000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyerek konsantre edin. Konsantre glikoproteini 500 mikrolitrelik bir numune döngüsüne enjekte edin. Fraksiyonları toplarken glikoproteini, dört santigrat derecede bir FPLC sisteminde önceden dengelenmiş yüksek performanslı bir boyut dışlama sütununa yükleyin.Bundan sonra, hangi kaçan fraksiyonların glikoproteini içerdiğini belirlemek için bir SDS-PAGE jeli çalıştırın ve içerenleri çekin. Nominal moleküler ağırlık sınırı 10 kilodalton olan bir santrifüjlü filtrasyon cihazı kullanarak, saf deglikosile ECD'yi istenen konsantrasyon elde edilene kadar 4.000 kez G ve dört santigrat derecede konsantre edin. Protein konsantrasyonunu belirledikten sonra, tozu ve diğer kirleticileri gidermek için numuneyi beş dakika boyunca 12.000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.Daha sonra, ticari bir kristalizasyon süzgecinden 80 mikrolitre kristalizasyon çözeltisini, 96 kuyulu bir damla kristalizasyon plakasında her bir rezervuar kuyusuna ekleyin. Kristalizasyon plakasının kuyucuklarına protein damlaları dağıtmak için bir kristalizasyon robotu kullanın. Saflaştırılmış proteinin kristalizasyon çözeltisine bire bir oranında toplam 200 nanolitrelik bir damla hacmi kullanarak.Bundan sonra, plakayı bantla kapatın. Görünür ve ultraviyole ışıkla incelemek için mühürlü plakayı bir plaka Görüntüleyiciye aktarın. İlk glikoprotein kristal kafalarını veren koşulları belirleyin ve bu kristalleri metin protokolünde belirtildiği gibi daha da optimize edin.Kristalleri, %20 gliserol ile desteklenmiş bir ana likör çözeltisine batırarak kriyoprotektif. Ardından kristalleri CryoLoops'a monte edin. Sıvı nitrojen kullanarak, veri toplamadan önce monte edilen kristalleri hızlı dondurun.24 kuyulu bir kristalizasyon plakasında iyi kırınışan kristaller ürettikten sonra, 150 milimolar sodyum klorür ile pH 9.0'da 50 milimolar ligand ve 20 milimolar Tris'ten oluşan bir stok çözeltisi hazırlayın. ECD kristallerini içeren önceden hazırlanmış damlaya bu ligand çözeltisinin çeşitli konsantrasyonlarını ekleyin. Beş dakika ile beş gün arasında değişen inkübasyon süreleri için damlayı kapatın.Bir ışık mikroskobu kullanarak, morfolojideki olası değişiklikleri belirlemek için kristalleri görsel olarak izleyin. İnkübasyondan sonra, kristalleri CryoLoops kullanarak birleştirin ve bunları %20gliserol ile desteklenmiş ana likör solüsyonunda kriyoproteksiyon yapın. Biyo-Katman İnterferometrisine başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi 10X Kinetik Tamponundan 50 milimetre 1X Kinetik Tamponu hazırlayın.Bu tampondan 200 mikrolitreyi bir ön ıslatma plakasına ekleyin. Altı Ni-NTA biyosensörünü plakaya aktarın ve 10 dakika boyunca tamponda nemlendirmelerine izin verin. Daha sonra, His etiketli ECD'yi bir mililitre 1X Kinetik Tampon içinde mikrolitre başına 25 nanogramlık bir nihai konsantrasyonda seyreltin.Ve saflaştırılmış FAB'ın seri seyreltmelerini hazırlayın. Şimdi reaktifleri burada görüldüğü gibi 96 oyuklu bir mikro plakada yıkayın. B'nin 1X Kinetik Tamponu temsil ettiği yerde, L, His etiketli glikoprotein yüklemesini temsil eder, sayısal girişler seyreltilmiş FAB konsantrasyonlarını temsil eder ve R, rejenerasyon tamponunu temsil eder.Hidratlı biyosensörleri, temel almak için 60 saniye boyunca 1X Kinetik Tampon içeren kuyucuklara aktarın. Daha sonra, 1.000 RPM'de 240 saniye boyunca mikrolitre başına 25 nanogram konsantrasyonda glikoprotein yükleyin. Biyosensörleri, ikinci bir taban çizgisi için 60 saniye boyunca 1X Kinetik Tampon içeren kuyucuklara geri yerleştirin.Sensörleri, 180 saniye boyunca FAB'ın seri seyreltmelerini içeren kuyucuklara aktarın. Bu ilişkilendirme aşamasından sonra, 180 saniyelik bir ayrışma adımı için biyosensörleri tekrar 1X Kinetik Tamponuna aktarın. Ardından, analiz yazılımını açın.Birinci sekmenin altında, verileri içeri aktarın ve ardından seçin. İkinci sekme altında, birinci adım veri seçimi, sensör seçimini seçin. Referans kutularını vurgulayın, ardından referans kutusunu ayarlamak için sağ tıklayın.İkinci adımda, çıkarma, referans kuyularını seçin. Bundan sonra, üçüncü adımın altında Y eksenini hizalayın, taban çizgisini seçin ve 0,1 saniye ile 59,8 saniye arasında bir zaman aralığı ayarlayın. Dördüncü adımda, adımlar arası düzeltmeyi seçin ve ayrışmaya hizalayın.Ardından beşinci adımda Savitzky-Golay Filtreleme'yi işleyin ve verileri işle'ye tıklayın. Üçüncü sekmeye açılan kapı. İkinci adımda, bire bir modelle analiz edin, ilişkilendirme ve ayrıştırmayı seçin, genel uydurma'yı seçin ve renge göre gruplandırın.Eğrilere sağ tıklayın, renk ayarla'ya tıklayın ve tüm eğrileri istediğiniz renklere ayarlayın. Bundan sonra, eğrileri uygun hale getirin. Veriler iyi yerleştirilmişse, raporu kaydet'e tıklayarak sonucu dışa aktarın.İstenen tüm koşullar için deneyi tekrarlayın. Bu çalışmada, CD22 hücre dışı alanının çeşitli yapıları, pHL-sec ekspresyon vektörüne başarılı bir şekilde klonlanmıştır. Bu yapılar daha sonra memeli HEK293-F ve HEK293-S hücre hatlarında aşırı eksprese edilir.Mililitrede yaklaşık bir milyon ve bir buçuk milyon hücre içeren kültürler, çok benzer seviyelerde glikoprotein ifade etti. Mililitrede sadece yarım milyon hücreden oluşan kültürler gözle görülür şekilde daha az ifade edildi. Bundan sonra, kültürler hasat edilir ve ECD glikoproteini, tüm yapıları boyut homojenliğine saflaştırmak için afinite ve boyut dışlama kromatografisi ile izole edilir.Kristalizasyon ve biyofiziksel çalışmalar için oldukça saf bir numune elde edilmesi. Bu prosedürleri takiben, tam uzunlukta hücre dışı alanın veya protein komplekslerinin üç boyutlu yapısı hakkında ek soruları yanıtlamak için tekil parçacık elektron mikroskobu gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, glikoproteinleri, ligandlarını ve hedefleme antikorlarını nasıl ifade edeceğinizi, saflaştıracağınızı ve yapısal ve biyofiziksel olarak nasıl karakterize edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

characterization-glycoproteins-with-immunoglobulin-fold-x-ray

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

3-D bir molekül yapısı molekül fonksiyonları nasıl eşsiz bir anlayış sağlar. Yakın atomik çözünürlükte yapı tespiti için temel yöntem, X-ışını kristalografisi. Burada, X-ışını kristalografisi yapı tayini için uygun olan herhangi bir makromolekül üç boyutlu kristaller elde etmek için mevcut yöntemler göstermektedir.

X-ray Kristalografi Protein Kristalizasyon

Daha fazla protein yarısından elektron mikroskobu görüntüleme ve üç boyutlu rekonstrüksiyon hem de zor küçük proteinler (moleküler kütle &lt;200 kDa) 'dir. Optimize negatif boyama, yüksek kontrast ve nispeten yüksek çözünürlük (~ 1 nm) farklı fizyolojik koşullar altında, küçük, asimetrik proteinlerin ya da komplekslerin görüntüleri elde etmek için güçlü ve yüksek verimli bir protokoldür.

Optimize Negatif Boyama: Elektron Mikroskobu ile Küçük ve Asimetrik Protein Yapısı incelenmesi için Yüksek verim Protokolü

β namlulu dış zar proteinleri (OMP'ler), Gram-negatif bakterilerin, mitokondrilerin ve kloroplastların dış zarları içinde birçok işleve hizmet eder. Burada, X-ışını kristalografisi veya NMR spektroskopisi ile yapı belirleme için yeterli miktarlarda β namlulu OMP'lerin üretimi için protokoller sunarak yapısal çalışmalarda bilinen bir darboğazı hafifletmeyi umuyoruz.

β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

Büyük sarmal bobin alanlarının karakterizasyonuna ve kristalizasyonuna rehberlik etmek için basit biyokimyasal ve hesaplamalı analizi içeren bir çerçeve tanımlıyoruz. Bu çerçeve, küresel proteinler için uyarlanabilir veya çeşitli yüksek verimli teknikleri içerecek şekilde genişletilebilir.

Islak ve kuru Lab Teknikleri birleştiren Büyük Spiral-coil İçeren Proteinler kristalleşmesini Kılavuzu

Burada, insan lökosit antijenleri tarafından sunulan T hücresi reseptörü ve tümör antijenleri arasındaki etkileşimin doğasının T hücresi işlevselliğini nasıl yönettiğini belirlemek için laboratuvarda yaygın olarak kullandığımız yöntemleri açıklıyoruz; bu yöntemler arasında protein üretimi, X-ışını kristalografisi, biyofizik ve fonksiyonel T-hücresi deneyleri yer alır.

X-ışını kristalografisi, biyofizik ve fonksiyonel tahliller kullanılarak mekanizmalar Yönetim T hücresi kanser antijenleri Reseptör tanıma belirlemek için

Karbonhidrat substrat bağlayıcı protein geniş bir biyokimyasal ve yapısal karakterizasyon Streptococcus pneumoniae gerçekleştirmek için akıcı bir protokol sunulmuştur.

Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

Burada, nasıl küçük açı X-Ray saçılma (SAXS) düşük çözünürlüklü zarflar makromoleküllerin yapıları temsil eden hakkında bilgi edinmek için kullanılması gereken mevcut. X-ışını kristalografisi ve nükleer manyetik rezonans gibi yüksek çözünürlüklü yapısal teknikleri ile birlikte kullanıldığında, SAXS detaylı yorumlara çok etki alanlı proteinler ve makromoleküllerin kompleksleri çözüm sağlayabilir.

Küçük açı x-ışını saçılması kullanarak çözüm yapısal oluştururlar çalışmaları

Bu makalede, diyaliz yöntemi ve yerinde X-ışını kırınım deneyleri ile çip üzerinde protein kristalizasyonu için geliştirilen mikroakışkan çiplerin imalat protokolü ayrıntılı olarak açıklenmektedir. Mikrofabrikasyon işlemi, yarı geçirilebilir yenilenmiş selüloz diyaliz membranın, çipin iki katmanı arasında herhangi bir moleküler ağırlık kesme ile entegre olmasını mümkün kılar.

In Situ X-ışını Kırınım Çalışmaları için Mikrodiyaliz ile Çip Üzerindeki Proteinlerin Kristalizasyonu

Bu NMR tabanlı protokol, siyanovirin-N ve D-mannoz kullanarak zayıf protein-glikan etkileşimlerini araştırır. Ligand ve protein tarafından tespit edilen yöntemleri birleştirerek, bağlanma bölgelerini haritalandırır, allosterik etkileri tespit eder ve karşılaşma komplekslerini tanımlar. Yaklaşım, glikana özgü teşhis ve tanıma mekanizmaları için değerli yapısal ve dinamik bilgiler sunarak numune hazırlama ve veri analizini ana hatlarıyla belirtir.

Protein-Glikan Etkileşimlerini Keşfetmek: Nükleer Manyetik Rezonanstaki Gelişmeler

X-ışını serbest elektron lazerlerinde ve senkrotron kaynaklarında seri kristalografi için lipidik kübik fazda membran protein mikro kristallerinin hazırlanması ve verilmesi için prosedürleri açıklıyoruz. Bu protokoller aynı zamanda çözünür protein mikro kristallerinin dahil edilmesi ve verilmesi için de uygulanabilir, bu da sıvı enjeksiyona kıyasla numune tüketiminin önemli ölçüde azalmasına yol açar.

Hazırlık ve Seri Femtosecond Kristalografi için lipidik Cubic Faz Protein mikro kristallerinin teslimi

Öğrenin immünglobulin katlanmış glikoproteinlerin biyofiziksel ve yapısal karakterizasyonu için X-ışını kristalografisi, biyolayer interferometri ve izotermal titrasyon kalorimetrisi yöntemlerini. Bu teknikler geniş bir glikoprotein yelpazesi için uygulanabilir.

X-ışını kristalografisi ve biyofiziksel teknikleri immünglobulin katlanmış glikoproteinlerin karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet