X-ışını kristalografisi ve biyofiziksel teknikleri immünglobulin katlanmış glikoproteinlerin karakterizasyonu

Bu yöntem, glikoprotein alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Proteinin işlevi, N-bağlı glikanların rolü ve glikoproteini hedef alan antibiyotiklerin mekanizması ve etkisi hakkında bilgi sağlamak. Bu tekniğin temel avantajı, ilgilenilen herhangi bir glikoproteine uygulanabilmesidir.

Çok çeşitli glikoprotein hedeflerinin yapısal ve biyofiziksel karakterizasyonunu kolaylaştırmak. Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımızda bir araştırma projesi koordinatörü olan Hong Cui olacaktır. Başlamak için, hücreleri metin protokolünde belirtildiği gibi hazırlayın ve transfekte edin.

Hücreleri 20 dakika boyunca 6, 371 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleme ile hasat edin. Süpernatanı tutun ve ardından filtrelemek için 0,22 mikronluk bir filtre kullanın. Filtrelenmiş süpernatanı dakikada dört mililitre hızla bir tezgah üstü kromatografi sistemindeki bir Ni-NTA kolonuna yükleyin.

Bundan sonra, sütunu üç ila dört hacim yıkama tamponu ile yıkayın. Fraksiyonları toplarken saflaştırılmış glikoproteini bir elüsyon tampon gradyanı kullanarak kolondan seyreltin. Kaçan tepe noktasını içeren fraksiyonları, 10 kilodalton nominal moleküler ağırlık sınırına sahip bir santrifüj filtrasyon cihazında çekin.

Daha sonra 15 dakika boyunca veya numune 500 mikrolitre hacme ulaşana kadar 4.000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyerek konsantre edin. Konsantre glikoproteini 500 mikrolitrelik bir numune döngüsüne enjekte edin. Fraksiyonları toplarken glikoproteini, dört santigrat derecede bir FPLC sisteminde önceden dengelenmiş yüksek performanslı bir boyut dışlama sütununa yükleyin.

Bundan sonra, hangi kaçan fraksiyonların glikoproteini içerdiğini belirlemek için bir SDS-PAGE jeli çalıştırın ve içerenleri çekin. Nominal moleküler ağırlık sınırı 10 kilodalton olan bir santrifüjlü filtrasyon cihazı kullanarak, saf deglikosile ECD'yi istenen konsantrasyon elde edilene kadar 4.000 kez G ve dört santigrat derecede konsantre edin. Protein konsantrasyonunu belirledikten sonra, tozu ve diğer kirleticileri gidermek için numuneyi beş dakika boyunca 12.000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.

Daha sonra, ticari bir kristalizasyon süzgecinden 80 mikrolitre kristalizasyon çözeltisini, 96 kuyulu bir damla kristalizasyon plakasında her bir rezervuar kuyusuna ekleyin. Kristalizasyon plakasının kuyucuklarına protein damlaları dağıtmak için bir kristalizasyon robotu kullanın. Saflaştırılmış proteinin kristalizasyon çözeltisine bire bir oranında toplam 200 nanolitrelik bir damla hacmi kullanarak.

Bundan sonra, plakayı bantla kapatın. Görünür ve ultraviyole ışıkla incelemek için mühürlü plakayı bir plaka Görüntüleyiciye aktarın. İlk glikoprotein kristal kafalarını veren koşulları belirleyin ve bu kristalleri metin protokolünde belirtildiği gibi daha da optimize edin.

Kristalleri, %20 gliserol ile desteklenmiş bir ana likör çözeltisine batırarak kriyoprotektif. Ardından kristalleri CryoLoops'a monte edin. Sıvı nitrojen kullanarak, veri toplamadan önce monte edilen kristalleri hızlı dondurun.

24 kuyulu bir kristalizasyon plakasında iyi kırınışan kristaller ürettikten sonra, 150 milimolar sodyum klorür ile pH 9.0'da 50 milimolar ligand ve 20 milimolar Tris'ten oluşan bir stok çözeltisi hazırlayın. ECD kristallerini içeren önceden hazırlanmış damlaya bu ligand çözeltisinin çeşitli konsantrasyonlarını ekleyin. Beş dakika ile beş gün arasında değişen inkübasyon süreleri için damlayı kapatın.

Bir ışık mikroskobu kullanarak, morfolojideki olası değişiklikleri belirlemek için kristalleri görsel olarak izleyin. İnkübasyondan sonra, kristalleri CryoLoops kullanarak birleştirin ve bunları %20gliserol ile desteklenmiş ana likör solüsyonunda kriyoproteksiyon yapın. Biyo-Katman İnterferometrisine başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi 10X Kinetik Tamponundan 50 milimetre 1X Kinetik Tamponu hazırlayın.

Bu tampondan 200 mikrolitreyi bir ön ıslatma plakasına ekleyin. Altı Ni-NTA biyosensörünü plakaya aktarın ve 10 dakika boyunca tamponda nemlendirmelerine izin verin. Daha sonra, His etiketli ECD'yi bir mililitre 1X Kinetik Tampon içinde mikrolitre başına 25 nanogramlık bir nihai konsantrasyonda seyreltin.

Ve saflaştırılmış FAB'ın seri seyreltmelerini hazırlayın. Şimdi reaktifleri burada görüldüğü gibi 96 oyuklu bir mikro plakada yıkayın. B'nin 1X Kinetik Tamponu temsil ettiği yerde, L, His etiketli glikoprotein yüklemesini temsil eder, sayısal girişler seyreltilmiş FAB konsantrasyonlarını temsil eder ve R, rejenerasyon tamponunu temsil eder.

Hidratlı biyosensörleri, temel almak için 60 saniye boyunca 1X Kinetik Tampon içeren kuyucuklara aktarın. Daha sonra, 1.000 RPM'de 240 saniye boyunca mikrolitre başına 25 nanogram konsantrasyonda glikoprotein yükleyin. Biyosensörleri, ikinci bir taban çizgisi için 60 saniye boyunca 1X Kinetik Tampon içeren kuyucuklara geri yerleştirin.

Sensörleri, 180 saniye boyunca FAB'ın seri seyreltmelerini içeren kuyucuklara aktarın. Bu ilişkilendirme aşamasından sonra, 180 saniyelik bir ayrışma adımı için biyosensörleri tekrar 1X Kinetik Tamponuna aktarın. Ardından, analiz yazılımını açın.

Birinci sekmenin altında, verileri içeri aktarın ve ardından seçin. İkinci sekme altında, birinci adım veri seçimi, sensör seçimini seçin. Referans kutularını vurgulayın, ardından referans kutusunu ayarlamak için sağ tıklayın.

İkinci adımda, çıkarma, referans kuyularını seçin. Bundan sonra, üçüncü adımın altında Y eksenini hizalayın, taban çizgisini seçin ve 0,1 saniye ile 59,8 saniye arasında bir zaman aralığı ayarlayın. Dördüncü adımda, adımlar arası düzeltmeyi seçin ve ayrışmaya hizalayın.

Ardından beşinci adımda Savitzky-Golay Filtreleme'yi işleyin ve verileri işle'ye tıklayın. Üçüncü sekmeye açılan kapı. İkinci adımda, bire bir modelle analiz edin, ilişkilendirme ve ayrıştırmayı seçin, genel uydurma'yı seçin ve renge göre gruplandırın.

Eğrilere sağ tıklayın, renk ayarla'ya tıklayın ve tüm eğrileri istediğiniz renklere ayarlayın. Bundan sonra, eğrileri uygun hale getirin. Veriler iyi yerleştirilmişse, raporu kaydet'e tıklayarak sonucu dışa aktarın.

İstenen tüm koşullar için deneyi tekrarlayın. Bu çalışmada, CD22 hücre dışı alanının çeşitli yapıları, pHL-sec ekspresyon vektörüne başarılı bir şekilde klonlanmıştır. Bu yapılar daha sonra memeli HEK293-F ve HEK293-S hücre hatlarında aşırı eksprese edilir.

Mililitrede yaklaşık bir milyon ve bir buçuk milyon hücre içeren kültürler, çok benzer seviyelerde glikoprotein ifade etti. Mililitrede sadece yarım milyon hücreden oluşan kültürler gözle görülür şekilde daha az ifade edildi. Bundan sonra, kültürler hasat edilir ve ECD glikoproteini, tüm yapıları boyut homojenliğine saflaştırmak için afinite ve boyut dışlama kromatografisi ile izole edilir.

Kristalizasyon ve biyofiziksel çalışmalar için oldukça saf bir numune elde edilmesi. Bu prosedürleri takiben, tam uzunlukta hücre dışı alanın veya protein komplekslerinin üç boyutlu yapısı hakkında ek soruları yanıtlamak için tekil parçacık elektron mikroskobu gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, glikoproteinleri, ligandlarını ve hedefleme antikorlarını nasıl ifade edeceğinizi, saflaştıracağınızı ve yapısal ve biyofiziksel olarak nasıl karakterize edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.