Name: Kene bağırsaklar tarafından bütün-mount Situ hibridizasyon Microbiota görselleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Öğrenin kene bağırsaklarında yaşayabilir mikrobiyota görselleştirmesi için bütün-mount in situ hibridizasyon yöntemini. Bu teknik, pahalı ekipman gerektirmeden mekansal ve zamansal gen transkript analizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz içtenlikle Dr. Mustafa Khokha, Yale Üniversitesi, onun laboratuvar kaynaklarının kullanımını sağlamak için teşekkür ederiz. Mükemmel teknik yardım için Bay Ming-Jie Wu için sana şükrediyoruz. EF HHMI dedektif olduğunu. Bu eser bir hediyesi John Monsky ve Jennifer Weis Monsky Lyme hastalığı araştırma fonu tarafından desteklenmiştir.

1. DNA şablonları hazırlanması
<ol><li>16S rRNA sıra belirli bakteriyel her cins NCBI veritabanını ve tasarım polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) uyumlu ileri download ve cins özel bölgeler (~ 200-250 baz çifti uzun) daha önce anlatıldığı gibi yükseltmek astar ters 19. RNA probları bakteriyel bazı cinsler için ticari olarak olsa da aynı zamanda açık kaynak veritabanlarının SILVA20,probeBase ve21 22 için çevrimiçi kaynaklar rRNA hedefli oligonükleotid sonda ve astarlar, bakın kullanılabilir. Not: Özel-özel cins olan gen bölgeleri seçin ve tasarlanmış astar ilgili bakteriyel cins yükseltmek değil emin olmak önemlidir. Bu gen/cins özel sonda hibridizasyon elde etmek için önemlidir.</li>
	<li>Fareler, 24, 48 veya 72 h kene cesaret teşrih ve RNA ve açıklanan önceki23olarak kene bağırsaklar dan cDNA hazırlamak için keneler besleme. PCR şablonuna yükseltmek gibi bir thermocycler kullanarak cins özel amplicons cDNA kullanın. PCR-ürün/amplicon bir aliquot üzerinde % 1.5 özel jel çalıştırın ve amplicon için beklenen boyut görüntüleme sistemi bir jel kullanarak ultraviyole (UV) ışık altında görselleştirme tarafından karşılık geldiğini onaylayın.</li>
	<li>Bakteriyel 16S ribozomal RNA amplicon ilgi RNA polimeraz Rehberleri bakteriyofaj polimerazlar (SP6, T7 veya T3) uygun içeren bir piyasada bulunan TA vektör içine (Tablo reçetesi) klon. Amplicon kimliğini ve yön ile ilgili her Rehberleri bir klonu onaylamak için klonlar sıra. Buna göre duygusu veya antianlamlı RNA oluşturmak için seçim organizatörü (Şekil 1) probları belirlemek.</li>
	<li>Plazmid 30 µLfor üretici tarafından önerilen sıcaklıklarda 2 h reaksiyon hacmine uygun bir Restriksiyon enzimi ile 1 mg linearize. Enzimleri duygusu veya antianlamlı sonda (Şekil 1) oluşturmak için kullanılması gereken organizatörü göre seçin. 2 µL % 1'özel jel üzerinde Özet tepki görselleştirme tarafından doğrusallaştırma doğrulayın.</li>
	<li>Bir piyasada bulunan PCR ürün sütun arıtma kiti kullanılarak sindirilir DNA'ın kalan 28 µL arındırmak ve DNA toplama spektrofotometre tarafından ölçmek. Not: Arka plan karşılık gelen antianlamlı sonda çok daha yüksek boyama bazı anlamda probları neden olabilir ve diğer seçenekleri keşfedilmeyi gerekebilir. Alternatif negatif denetimleri örneği veya hibridizasyon kendine özgü bir model verir başka bir robot temsil edilmeyen dizileri kodlama plazmid içerir.</li>
</ol>2. Digoxygenin-UTP RNA probları inşaatı
<ol><li>100 mm UTP, 10 mM digoxygenin-UTP 25 µL ve 10 µL her 100 mM ATP, GTP ve CTP 1,5 mL santrifüj tüpü içinde 7,5 µL birleştirerek nükleotit karışımı hazırlayın.</li>
	<li>Vitro transkripsiyon gerçekleştirmek piyasada bulunan T7 veya Sp6 RNA polimeraz kitleri kullanarak, 1 µL nükleotit Mix (adım 2.1) ve 0,25 - kullanarak 1 µg şablonunun DNA. Birim su ile 20 µL kadar getir. Birleştirmek ve spin darbe tüpü hafifçe vur. 2.5-3 h 37 ° C'de kuluçkaya. Not: Sonda inşaat sindirilir plazmid konsantrasyonları 7 ng/µL düşük ama 15-25 ng/µL Bu adım mesafeden tipik konsantrasyonları ile başarılı olmuştur. Transkripsiyon tepki de gecede 37 ° C'de inkübe, ama bu önemli ölçüde RNA verim artırmaz.</li>
	<li>DNaz 1 µL ekleyin (2.000 adet/µL) ve 10 dk 37 ° C'de kuluçkaya. 10 dk fazla olamaz veya enzim RNA aşağılayıcı başlayabilir.</li>
	<li>Buz gibi 7.5-8 M Lityum klorür 30 µL ve 30 µL RNA çökelti nükleaz ücretsiz soğutulmuş su ekleyin. Karıştırmak için tüp fiske. Yağış RNA gecede-20 ° C'de devam etmek için izin</li>
	<li>Santrifüjü 17.000 x g 4 ° C'de 20 dk için de tarafından RNA toplamak Pelet kez 1 mL taze hazırlanmış % 75 etanol dietil pyrocarbonate (DEPC) su ile yıkayın, sonra aralıklarla tekrarlayın.</li>
	<li>Kaldırmak ve süpernatant atmak, tüp temiz kağıt havlu üzerine ters çevir ve 10 dk. Resuspend için Pelet nükleaz ücretsiz su kurumasını sağlar. Pelet kolayca görünür durumdaysa, 25 µL resuspend. Pelet içinde 15-20 µL. çok küçük veya görünür değil, resuspend ise RNA konsantrasyon tahmini spektrofotometre tarafından elde etmek. Not: 200-500 ng/µL tipik RNA konsantrasyonları arasındadır.</li>
</ol>3. görsel olarak RNA RNA saflık değerlendirmek için RNA formaldehit jel elektroforez tarafından probları
Dikkat: Formaldehit bir inhalasyon tehlike teşkil etmektedir; Bu nedenle, RNA jel analiz bir duman Hood için gerekli çözümler üretmek. Etidyum bromür şüpheli bir kanserojen olduğu; özenle hallederim.
<ol><li>% 1 formaldehit özel jel24 daha önce açıklanan ve jel RNases ücretsiz bir jel kutusunda döküm olarak hazırlamak. Serin bir kez, arabellek (1 x bezleri pH 7,0, %5 formaldehit) çalıştıran x 1 jel kutusunu doldurun.</li>
	<li>Örnek arabellek (5 µL 400 mg/mL arasında etidyum bromür, bezleri, 35 µL formaldehit ve 100 µL formamide x 20 µL 10) hazırlayın. RNA inceleyebilirsek (adım 2.6) 2 µL örnek arabellek 8 µL ile birleştirin. 10 dk 70 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>RNA yükleme arabellek 5 mL % 50 gliserol, 1 mL % 10 formaldehit, 40 mg bromophenol mavi, 40 mg ksilen cyanol ve 0,5 M EDTA (pH 7.5) 20 µL birleştirerek hazırlayın. Bu arabellek-20 ° C'de kullandıktan sonra saklamak</li>
	<li>Yükleme arabelleği 3 µL RNA örnek adım 3.2 ekleyip karıştırın. Örnek tüpler buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Bütün numune hacmi adım 3.4 jel yükleyin. Bir aliquot tek iplikçikli RNA merdivenin alongside RNA boyutu doğrulamak için yükleyin. Jel 100 V çalıştırmak veya mavi boya jel aşağı yaklaşık % 75'i geçirir dek indirin. Bir jel görüntüleme sistemi kullanarak UV ışık altında RNA görselleştirin. Not: Kaliteli RNA prob prob (Şekil 2, lane 1) beklenen boyutuna karşılık gelen bir hareketlilik ile ayrı bir grup olarak görünmesi gerekir. Eğer soruşturma bu kullanılmaması gereken bir yaygın ve smeary band (Şekil 2lane 2) görünür.</li>
</ol>4. Gut koleksiyonu ve fiksasyon kene
<ol><li>Zaman ilgi için fareler üzerinde beslenen Ixodes scapularis perileri toplamak. Not: Bu teknik amacı gereği, 48 veya 72 s iş için en iyi keneler beslenir.</li>
	<li>Kene gelen bağırsak MEMFA (Tablo 1) mümkün olduğunca çok organ hasar kaçınarak bir diseksiyon mikroskop altında bir cam slayt üzerinde incelemek. Bir kene MEMFA 20-30 µL içinde temiz mikroskop slayttaki bir yer. Steril yüksek karbon çelik tıraş bıçağı #11 dilim baş bölge çifti kene kene vücut bırakarak kalkan kullanarak. Gut divertikül ve tükürük bezleri vücut kütikül dışarı itmek için vücut hafifçe bastırın. Tükrük bezleri ve gut ayırmak ve cesareti jilet üzerinde oymak.</li>
	<li>Cesaret 500 µL MEMFA içeren bir 1,5 mL tüp içine toplamak. Nazik 1 h için sallanan ile Oda sıcaklığında tüp kuluçkaya veya bir gece 4 ° C'de Not: Kene tükürük bezleri de disseke ve benzer şekilde sabit lekeli ve.</li>
	<li>Doku yavaşça 1 mL buz gibi % 100 etanol ile 3 kez yıkayarak kurutmak. Santrifüjü doku zarar verebilir gibi doğal olarak her yıkama arasında tüp altına lavabo cesaret ver. Uzun süreli depolama için örnekleri-20 ° C'de % 100 etanol içinde tutmak</li>
</ol>5. inşaat kafes örnek sepetleri ve 24-şey sepet tutucu
<ol><li>Dipleri 2 mL veya 5 mL kapalı ısıtmalı tek taraflı jilet bir neşter kullanarak ek alıcı santrifüj tüpleri kesti. Dikkat: Bıçak kesim tamamlamadan önce birkaç kez yeniden isitilan gerekebilir.</li>
	<li>110 µm naylon mesh karelerinin biraz yeni tüp açılış daha büyük kesti. Tüp altına mesh iyi bir mühür yapılana kadar onları birlikte hafifçe sıcak bir tabak orta-düşük ateşte basarak bond. Soğumaya bırakın, mesh ve tüp arasında boşluk olduğundan emin olun ve aşırı kafes kenarları kırpın.</li>
	<li>Öyle ki adım 5,2 yapılan örnek sepet dudak Hole'da oturmak ve aracılığıyla, nerede örnek sepetleri dipleri oturup ta wells içinde konulduğunda bir set-up verimli değil düşmek bir 24-şey plaka kapak delik kesme kapak delik.</li>
	<li>Bu monte sepet tutucu sepetleri bir tabak içinde in situ hibridizasyon Protokolü tamamı için göreli kolaylıkla diğerine aktarmak için kullanın. Bir kuluçka meydana gelen iken, diğer plaka için sonraki yıkama hazırlanan iki 24-şey tabak kullanın.</li>
</ol>6. in Situ hibridizasyon: 1. gün (zamanlama: 4-5 h)
<ol><li>Transfer cesareti için örnek sepetleri etiketli, deneysel koşulla ayrılmış ve RNA sonda amaçlanan. Not: koşul çoğaltır arasında doğal varyasyon için hesap başına en az 5 cesaret leke.</li>
	<li>Yavaşça hava kabarcıkları dokusu içine yavaş yavaş serum fosfat tamponlu %0.1 non-iyonik yüzey aktif (PTw; oranını artırarak tanıtımı önlemek için örnekleri suyla temasa Tablo 1) etanol için yıkar. Not: Komple tüm 24-şey sepet sahibi nazik ajitasyon ile ortam sıcaklığı, aksi belirtilmediği sürece yıkar. Aliquot 500-600 µL yıkama çözümler içine cesaret her sepette tamamen batık her tür sahibinin. RNA yıkımı önlemek için su DEPC tedavi ile tüm çözümleri hazırlayın.<ol>
<li>Örnekleri 5 min için 500 µL % 100 etanol içinde yıkayın.</li>
		<li>% 75'i örnek sepet başına en az 500 µL hazırlamak, % 50 ve % 25 etanol içinde PTw. örnekleri 5 dakika içinde en yüksek etanol konsantrasyon en düşük hareket her etanol çözüm yıkanmasında tarafından suyla temasa.</li>
		<li>4 kere 5 min için örnekleri PTw içinde yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Örnekleri İndinavir K ile permeabilize (10 µg/mL) PTw 5 dk içinde.</li>
	<li>Doku hibridizasyon için RNA probları ile hazırlayın.<ol>
<li>İki kez 6.2 500 µL trietanolamin tampon (0.1 M, pH 7,0-8.0) her 5 min için nazik ajitasyon ile ortam sıcaklığında 24-şey sepet tutucu (örnekleri Amin-Alerjik bir ortamda korumak için,Tablo 1) açıklandığı gibi örnekleri yıkayın.</li>
		<li>Trietanolamin tampon (0.1 M, pH 7,0-8.0) 5 min için örnekleri iki kez 500 µL % 0,25 asetik anhidrit ile tedavi, sonra örnekleri PTw 5 min için iki kez yıkayın. Not: Non-spesifik elektrostatik etkileşimler önlemek ve mRNA için sondanın özel bağlayıcı emin olmak çok önemlidir olumlu şarj etkisiz hale getirmek için ücretsiz aminler asetik anhidrit acetylates.</li>
		<li>PTw 500 µL % 4 paraformaldehyde ile 20 dk için cesaret düzeltmek, daha sonra 5 kere 5 dk her PTw içinde yıkayın.</li>
		<li>500 µL hibridizasyon arabellek /in titreyen bir su banyosu içinde nazik ajitasyon ile 24-şey sepet sahibi için 1,5-2,5 h 60 ° C'de 24 iyi plaka (Tablo 1) örneklerinde kuluçka tarafından prehybridize. Gün 2 Protokolü (adım 7.1) yeniden kullanmak için prehybridization adım hibridizasyon arabelleği kaydedin.</li>
		<li>Sonda hibridizasyon çözümleri RNA sondalar son konsantrasyonu 1 µg/ml hibridizasyon arabellekte sulandrarak hazırlayın.  Kuluçkaya gecede, titreyen bir su banyosu (Tablo 2) nazik ajitasyon ile 60 ° C'de 24-şey sepet tutucu prob hibridizasyon çözümleri ile örnekleri. Hibridizasyon çözüm buharlaşma önlemek için sepet tutucu alüminyum folyo ile rahatça taşıyan plaka kapak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. in Situ hibridizasyon: 2. gün (zamanlama: 4.5-5.5 h)
<ol><li>Örnekleri sonda hibridizasyon çözümlerinden kaldırmak ve önceki gün ayrılmış hibridizasyon arabelleğinden içine koyun. 3 min için nazik ajitasyon ile 60 ° C'de kuluçkaya. Not: Sonda hibridizasyon çözümleri-20 ° c yeniden kullanım için ilâ 3 kere depolanabilir.</li>
	<li>Serum sodyum sitrat arabellek (SSC) x 2 sulandrarak 20 tarafından hazırlamak x SSC DEPC tedavi su (Tablo 1). Örnekleri 3 dk ile 2 x SSC için iki kez, o zaman 2 ile 20 dk için 3 kez yıkayın x SSC 60 ° C'de sonda ve hibridizasyon arabelleği tüm izlerini silmek için.</li>
	<li>Bir (20 µg/mL) ve RNase T RNase ile tedavi1 (10 µg/mL) 2 x SSC 37 ° C'de 30 dk için tek kaldırmak için zor durumda RNA prob ücretsiz temsil eden sigara-melezleşmiştir RNA.</li>
	<li>2 ile bir kez yıkama x SSC oda sıcaklığında 10 dakika için. 0,2 hazırlamak sulandrarak 2 tarafından x SSC suda DEPC tedavi x SSC sonra iki kez 0,2 ile yıkayın aşırı RNases kaldırmak için x SSC 60 ° C'de 30 dk için.</li>
	<li>Maleik asit tampon (MAB; 500 µL ile iki kez yıkamak Tablo 1) 10 dakikadır her.</li>
	<li>1.5-2 h için çözüm (MAB % 2 engelleme reaktif) engelleme ile örnekleri kuluçkaya. Not: Engelleme reaktif çözülmeye zor olabilir; nazik Isıtma dağılmasına yardımcı olur.</li>
	<li>Anti-digoxigenin alkalin fosfataz Birleşik 500 µL çözüm engelleme 1:3,000 seyreltme, antikor, engelleme çözüm yerine ve yaklaşık 4 h için oda sıcaklığında veya 4 ° C'de gecede kuluçkaya.</li>
</ol>8. in Situ hibridizasyon: 3. gün (zamanlama: bir gecede 6 h)
<ol><li>Örnekleri ile 500 µL MAB aşırı antikor kaldırmak için her 30 dk için en az 5 kez yıkayın. Not: Bu yıkama esnektir ve 1-2 h için uzatılabilir veya 3-4 yıkama etkinliği en az düzeyde etkisi ile 4 ° C'de bir gecede yıkama için yerine olabilir.</li>
	<li>Alkalen fosfataz arabelleği, pH 9,5 (AP arabellek; ile 5 min için iki kez yıkamak Tablo 1).</li>
	<li>Son yıkama chromogenic substrat alkalen fosfataz (Tablo reçetesi) için 500 µL değiştirerek renk reaksiyon başlar. Alüminyum folyo ile örnek plaka kapak ve 3 - 5 s veya 4 ° C'de gece için oda sıcaklığında devam boyama izin Boyama reaksiyonu belirli aralıklarla overstaining önlemek için diseksiyon mikroskop altında doku görüntüleyerek izlemek. Not: boyama tamamlandığında, bir mor renk tonu gözlerinin içine mikroskop altında antisens probed örnekleri tarafından algılanabilir ama doku çok karanlık olmak için izin verilmemelidir. Boyama 4 ° C'de çok yavaş devam eder ve en fazla 20-24 saat sürebilir.</li>
	<li>5 dakika içinde 500 µL MAB yıkanmasında tarafından renk reaksiyonu ve ardından doku gecede Bouin'ın çözümde düzeltmek. Dikkat: Bouin'ın çözüm bir duman başlıklı işlemek; aşındırıcı bir kanserojen olduğu.</li>
</ol>9. in Situ hibridizasyon: 4 gün (zamanlama: 3-3.5 h)
<ol><li>1 örnek sepet başına en az 7 mL hazırlamak sulandrarak 20 x SSC su DEPC tedavi x SSC. Bouin'ın çözüm 1'örnekleri 4-6 kez % 70 etanol ile yıkayarak çıkarın doku artık sarı olana x SSC.</li>
	<li>%1 75, % 50 ve % 25 etanol çözümlerinde örnek sepet başına 500 µL hazırlamak x SSC. Örnekleri 5 min için en yüksek etanol konsantrasyon en düşük için doku rehydrate hareketli her çözümde yıkayın. İki kez 5 dk içinde her 1 yıkama x SSC.</li>
	<li>Çamaşır suyu çözüm (Tablo 1) örneklerinde bir duman başlıklı bir lightbox üzerinde 90 dk için kuluçkaya. Not: Bu adım herhangi bir pigmentasyon örnekleri veya Bouins eriyik-e doğru var olmak çıkarmak--dan renklendirme sağlar ve sonda sinyal açık görselleştirme için geliştirir.</li>
	<li>1 500 µL iki kez örnekleriyle yıkama x SSC 5 min için.</li>
	<li>Çok az hasar bağırsaklarıyla örnek sepet yeni bir 24-şey plaka bir kuyunun içine ters çevirme tarafından yeniden konumlandırmak ve % 70 etanol transfer pipet kullanarak kafes alt aracılığıyla ile yıkayın. -20 ° C'de gerekirse depolar.</li>
	<li>Şekil 3' te, gösterildiği gibi birden fazla örnekleri boyama şekillerinin genel bir bakış elde etmek için herhangi bir alan parlak mikroskopla % 70 etanol 24 iyi-plaka ve görünüm cesaret korumak. Şekil 4, Şekil 5' de gösterildiği gibi bireysel cesaret alan parlak mikroskop altında incelemek için, ve Şekil 6, %100 gliserol coverslips altında cesaret dağ. Bir plastik spatula yavaşça en az hasarla doku işlemek için kullanın. Not: Gliserol yüksek viskozite doku sıkıştırma tarafından neden olduğu zararlara karşı korunmasına yardımcı olur ve doku daha yüksek büyütme oranlarında en iyi şekilde görüntülenebilir öyle ki divertikül dikkatli konumlandırma sağlar.</li>
	<li>Esir alma imge üstünde mikroskop mikroskop belirli görüntü yakalama yazılımı (Tablo reçetesi) kullanarak ve genel bir resim düzenleme yazılımı için TIFF görüntü olarak dışa aktarın. Deneysel tedaviler göreli Boyama farklılıkları ölçmek için genel görüntü analiz yazılımı (Tablo reçetesi) yükleyin. Görüntüyü analiz yazılımı içinde açın ve boyama piksel yoğunluğu ölçümü ve boyama çubuk grafik araziler hesaplamak için belgili tanımlık öğretim içinde belgili tanımlık bilgisayar yazılımı kullanın.</li>
</ol>

<ol><li>Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arthropod+Vectors+and+Disease+Transmission%3A+Translational+Aspects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107(2015).</li>
<li>Hooper, L. V., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+host-bacterial+relationships+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Commensal host-bacterial relationships in the gut.</a> Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).</li>
<li>Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worlds+within+worlds%3A+evolution+of+the+vertebrate+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota.</a> Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).</li>
<li>Narasimhan, S., Fikrig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick+microbiome%3A+the+force+within%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Tick microbiome: the force within.</a> Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).</li>
<li>Weiss, B., Aksoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiome+influences+on+insect+host+vector+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitoly%22%5BJournal%5D)">Microbiome influences on insect host vector competence.</a> Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).</li>
<li>Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+microbiome+of+arthropods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The functional microbiome of arthropods.</a> PLoS One. 12 (5), e0176573(2017).</li>
<li>Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+ticks%2C+mice+and+men%3A+understanding+the+dual-host+lifestyle+of+Lyme+disease+spirochaetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).</li>
<li>Sojka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+machinery+of+blood+digestion+by+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">New insights into the machinery of blood digestion by ticks.</a> Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).</li>
<li>Grigor'eva, L. A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1134/S0013873810030073">Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle.</a> Entomological Review. 90, 405-409 (2010).</li>
<li>Goodrich, J. K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25036628">Conducting a microbiome study.</a> Cell. 158 (2), 250-262 (2014).</li>
<li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biology. 12, 87(2014).</li>
<li>Hemmati-Brivanlou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110 (2), 325-330 (1990).</li>
<li>Frank, D., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+of+XMyoD+in+non-somitic+mesoderm+of+Xenopus+gastrulae%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae.</a> Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Kernohan, K. D., Berube, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+dimensional+dual+labelled+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+analysis+in+fixed+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections.</a> MethodsX. 1, 30-35 (2014).</li>
<li>Sonenshine, D. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSonenshine%2C+DE+%22Biology+of+ticks%22">Biology of ticks</a>. , Oxford University Press. (1991).</li>
<li>Narasimhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+of+the+tick+vector+Ixodes+scapularis+modulate+colonization+of+the+lyme+disease+spirochete%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete.</a> Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).</li>
<li>Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Borrelia+burgdorferi+sensu+lato+by+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+on+whole-body+sections+of+Ixodes+ricinus+ticks+and+gerbil+skin+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies.</a> Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).</li>
<li>Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+set+of+16S+rRNA-based+probes+for+detection+of+bacteria+in+human+feces%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces.</a> Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).</li>
<li>Quast, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SILVA+ribosomal+RNA+gene+database+project%3A+improved+data+processing+and+web-based+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools.</a> Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).</li>
<li>Yilmaz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SILVA+and+%26%2334%3BAll-species+Living+Tree+Project+%28LTP%29%26%2334%3B+taxonomic+frameworks%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The SILVA and &#34;All-species Living Tree Project (LTP)&#34; taxonomic frameworks.</a> Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).</li>
<li>Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((probeBase--an+online+resource+for+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes+and+primers%3A+new+features+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016.</a> Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).</li>
<li>Narasimhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+tick+gut+milieu+by+a+secreted+tick+protein+favors+Borrelia+burgdorferi+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization.</a> Nature Communication. 8 (1), 184(2017).</li>
<li>Bryant, S., Manning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+gel+electrophoresis+of+total+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Bioliogy%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA.</a> Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).</li>
<li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li>
<li>Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+ribosomopathy+genes+during+Xenopus+tropicalis+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Development+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis.</a> BMC Development Biology. 16 (1), 38(2016).</li>
<li>Khokha, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+and+probes+for+the+study+of+Xenopus+tropicalis+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development.</a> Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).</li>
<li>Jowett, T., Lettice, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridizations+on+zebrafish+embryos+using+a+mixture+of+digoxigenin-+and+fluorescein-labelled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes.</a> Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).</li>
<li>Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+straightforward+DOPE+%28double+labeling+of+oligonucleotide+probes%29-FISH+%28fluorescence+in+situ+hybridization%29+method+for+simultaneous+multicolor+detection+of+six+microbial+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations.</a> Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).</li>
<li>Pai, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCN4+ion+channel+function+is+required+for+early+events+that+regulate+anatomical+left-right+patterning+in+a+nodal+and+lefty+asymmetric+gene+expression-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner.</a> Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).</li>
<li>Legendre, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos.</a> JoVE. (71), e50057(2013).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Bu bir eklem bacaklılar vektör patojenlerin microbiota çalışmaya bir bütün-mount situ hibridizasyon (WMISH) tekniği ilk kullanmaktır. Bizim iletişim kuralı bir geliştirme Drosophila ve kurbağa embriyosu25,26çalışırdım adapte oldu. Bütün Dağı RNA in situ hibridizasyon gen transkript dağınık şekilde yerelleştirmek için rutin olarak kullanılmıştır ve geçici27 ve transkript görselleştirme parlak alana göre veya flore...

İnsan ve hayvan patojenler eklem bacaklılar vektörel çizimler tarafından aktarılan dünya çapında bulunur ve bulaşıcı hastalıklar yaklaşık % 20 genel olarak1, ama etkili hesap ve çoğu bu patojenlerin karşı güvenli aşı mevcut değildir. Oransal ve hemen hemen tüm metazoans3 sağlık şekillendirme ve microbiome2, topluca bilinen komensal, simbiyotik ve patojen mikroorganizmaların önemli rol anlayışımızı genişletiyor. Şimdi eklem bacaklılar vektörel çizimler patojenlerin Ayrıca gut microbiota liman ve çeşitli vektör kaynaklı patojenler4,5etkilemek için bu vektör ilişkili microbiota gösterilmiştir açıkça anlaşılmaktadır. Eklem bacaklılar microbiome eubacteria, Arkeler, virüsler, ökaryotik mikroplar gibi tek hücreli, nematodlar ve mantarlar6oluşur. Ancak, baskın araştırma odak eubacteria üzerinde nedeniyle, kısmen, işaretleyici genler ve belirli bakteriyel üyelerini tanımlamak için başvuru veritabanları kullanılabilirliğini olmuştur.
Ixodes scapularis, kene vektör Borrelia burgdorferi7, de dahil olmak üzere birden çok insan patojenlerin ile bir odak hastalığının Lyme hastalığı, bir mikrobiyal görselleştirme teknik optimizasyonu amaçlı yapıldı. kene gut microbiota vektör-patojen etkileşimleri bağlamında anlayışımızı geliştirmek. Kene microbiome alanında cevaplanması gereken birkaç soru kalır. Gut kene ve yatay olarak aktarılan patojenler bağlamında gelen patojen arasındaki ilk genişletilmiş karşılaşma sitesidir; Bu nedenle, vektör vektör-patojen etkileşimleri oransal olarak gut microbiota rolünün anlaşılması anlamlı yorumlara ortaya çıkaracaktır. Kene kan yemek sindirim, burada kan yemek bileşenleri alır işlenmesi intracellularly8yer benzersiz bir moduna sahip. Gut lümen görünüşte kene beslemeleri kan yemek içerecek bir gemi olarak hizmet vermektedir ve besin sindirim ve asimilasyon besleme birkaç gün doğmak ve sonrası repletion devam etmek. Kene tarafından besleme sırasında alınan patojenler gut lümen bloodmeal ile birlikte girin ve böylece lümen kene, patojen ve ikamet microbiota arasındaki etkileşimlerin birincil bir site olur. Sindirim repletion ve deri değiştirme iksodid kene ile devam ederken, gut yapısal ve işlevsel değişiklikler9uğrar. Kompozisyon ve gut bakteri mekansal organizasyonu değişen gut çevre ile uyum içinde değişebilir olasılığı mevcuttur. Bu, bu nedenle, yerleşik bakteri tamamen kene, patojen ve gut microbiota etkileşimi anlamak için kene gut mimarisini anlamak önemlidir.
Ana bilgisayar ilişkili microbiota rutin olarak açıklamak için moleküler teknikleri yükseltmek ve bakteriyel 16S ribozomal DNA (rDNA) sıra ile yüksek-den geçerek paralel sıralama stratejileri10 kullanmaktadır. Bu sıralama stratejileri aşmak gerek axenic belirli bakteri kültürleri elde etmek ve tüm bakteriyel Üyeler örnek temsil ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Yine de, bu stratejileri bona fide sakinleri çevre contaminations ayırt etmek için yetersizlik tarafından şaşırmış. Ayrıca, örnekleri, keneler, küçük içinde büyüklük ve bu nedenle düşük microbiota özgü DNA içeren gibi değerlendirmek verir, çevre kirletici amplifikasyon olasılığı artan11 olduğunu ve belirsiz yorumlanmasında sonuçları microbiome kompozisyon. Bu nedenle, belirli uygun bakteri görselleştirme ile birlikte işlev karakterizasyonu tanımlamak ve kene microbiome geçici ve dağınık şekilde ayırt için önemli olacaktır. Bu hedef doğrultusunda, biz bütün Dağı RNA in situ hibridizasyon kullandı. Bu teknik gen ifade desenleri, organ ve embriyo12,13,-14 değerlendirmek için rutin olarak kullanılan ve ilgi tüm örnek ifade semiquantitative analiz sağlar. Bu doku bölümleri kullanmak ve genellikle kesitli malzeme tüm organları15ifadede tahmin etmek için sayısal bir derleme ile geniş Analizi gerektirir geleneksel in situ hibridizasyon teknikleri farklıdır. Burada bütün Dağı genelde bütün organizmalar12' ye anlamına gelir iken, Bütün Dağı bütün cesaret veya organları belirtir. Kene gut microbiota mimarisini değerlendirmek için bütün Dağı RNA in situ hibridizasyon yaklaşımı kullanmanın yararları kesişmeyi. Kene gut boyutu16' değişen her çifti, divertikül, 7 çiftlerinden oluşur. Eğer bu divertikül arasında herhangi bir kene biyoloji, bağlamında anladım değil işlevsel farklılıklar microbiota veya kene-patojen etkileşimleri kene. Gut divertikül rüptürü manipülasyonlar, gut microbiota gut lümen veya gevşek gut microbiota kayma lokalizasyonu yanlış yorumlanmasına sonucu ile ilişkili mevcut yerinden. RNA in situ hibridizasyon floresans etiketli daha önce kene gut transkript17 sabitleme ve bireysel gut divertikül sonda hibridizasyon, B. burgdorferi yerelleştirmek üzere açma incelemek için kullanıldığında vardır transkript parafin gömülü tüm keneler18kesit tarafından. Bu her iki yaklaşımın gut microbiota mimari etkilerdi hibridizasyon önce kene dokuların manipülasyon gerektirir.
Bu raporda, Bütün-mount situ hibridizasyon (WMISH) kullanarak uygun kene gut microbiota incelemek için iletişim kuralı biz ayrıntılı olarak tarif. Bütün Dağı RNA in situ hibridizasyon varlığı küresel bir anlayış ve belirli gut bakteri gut değişik bölgelerinde bolluk sağlar ve kene gut biyoloji patojen kolonizasyon bağlamında yeni görüşler teşvik ve iletim. Ayrıca, algılama kene gut uygun bakterilerin RNA probları karşı belirli bakteriyel RNA yönetmen kullanımına izin verir.

<table><tbody><tr><td>Sefar NITEX Naylon Mesh, 110 mikron</td><td>Amazon</td><td>03-110/47</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T Kolay Vektör Sistemi</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>Digoxygenin-11-UTP</td><td>Roche</td><td>1209256910</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I(RNAsesız)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe SP6 RNA sentez kiti</td><td>New England Biolabs</td><td>E2070S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 Yüksek Verimli RNA Sentez Kiti</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>Su, RNaz içermez, DEPC ile tedavi edilmiş</td><td>Amerikan Biyoanalitik</td><td>AB02128-00500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5M, pH 8.0</td><td>Amerikan Biyoanalitik</td><td>AB00502-01000</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit, %37</td> <td>JT Baker</td><td>2106-01</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Amerikan Biyoanalitik</td><td>AB00600-00500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 10X</td><td>Gibco</td><td>14300-075</td><td></td></tr><tr><td>Ara-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Trietanolamin HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1502-100G</td><td></td></tr><tr><td>Asetik anhidrit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>ThermoScientific/Pierce</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>SSC, 20X</td><td>Amerikan Biyoanalitik</td><td>AB13156-01000</td><td></td></tr><tr><td>Torula mayasından</td> <td>RNASigma Aldrich</td><td>R3629-5G</td><td></td></tr><tr><td>Heparin, sodyum tuzu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Denhardt Çözeltisi, 50X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2532-5ML</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS hidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3023-1G</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>RNase T1</td><td>ThermoScientific&nbsp;</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>Maleik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0375-100G</td><td></td></tr><tr><td>Bloke edici reaktif</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab parçaları</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol hidroklorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31742-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Alkalin fosfataz Sigma Aldrich için kromojenik substrat</td><td></td><td></td><td></td>11442074001</tr><tr><td>Bouin'in çözümü</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT10132-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit</td><td>Mallinkrodt Baker, Inc</td><td>2186-01</td><td></td></tr><tr><td>Tek telli RNA merdiveni</td><td>Ambion -Millenium</td><td>AM7151</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;#11 Yüksek Karbonlu çelik bıçaklar&nbsp;</td><td>C ve Bilimsel Bir Prömiyer</td> <td># 11-9411</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>BioRad, CA</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td>ThermoScientific&nbsp;</td><td>NanoDrop 2000C</td><td></td></tr><tr><td>Orbital çalkalayıcı</td><td>VWR</td><td>DS-500E Dijital Orbital çalkalayıcı</td><td></td></tr><tr><td>Sallanan su banyosu</td><td>BELLCO Glass, Inc</td><td>Hot Shaker-7746-12110</td><td></td></tr><tr><td>Jel ve nbsp; dokümantasyon sistemi</td><td>BioRad</td><td>Gel Doc XR + Jel dokümantasyon sistemi</td><td></td></tr><tr><td>Parlak Alan Mikroskobu&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>NikonSM2745T</td><td></td></tr><tr><td>Parlak Alan Mikroskobu&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>AXIO Scope.A1</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>STEMI 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Işık kutusu</td><td>VWR</td><td>102097-658</td><td></td></tr><tr><td>PCR arıtma kiti ve nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü yakalama yazılımı</td><td>Zeiss</td><td>Zen lite</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü düzenleme yazılımı&nbsp;</td><td>Adobe&nbsp;</td><td>Adobe Photoshop CS4 sürüm 11.0</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü analiz yazılımı</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>Otomasyon uyumlu enstrümantasyon</td><td>Intavis Bioanalytical Instruments, Tübingen, Almanya).&nbsp;</td><td>Intavis, Biolane HT1.16v</td><td></td></tr></tbody></table>

kene bağırsaklar tarafından bütün-mount situ hibridizasyon microbiota görselleştirme

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Bulaşıcı hastalıklar eklem bacaklılar vektörel çizimler tarafından iletilen insan sağlığı dünya çapında önemli bir tehdit devam. Bu hastalıklar neden patojenleri yok yalıtım modunda vektör kolonize zaman; Bunun yerine, onlar büyük olasılıkla etkileşimleri gut lümen içinde ikamet mikroorganizmalar ile meşgul. Vektör microbiota patojen iletim birkaç vektör kaynaklı hastalıklar için önemli bir rol oynamak için kanıtlanmıştır. Ixodes scapularis kene, Borrelia burgdorferi, dahil olmak üzere birçok insan patojenleri vektör gut yerleşik bakteri kene iletim patojenlerin etkisi olup olmadığını tespit değil. Biz yöntemleri olası türler arası etkileşimler kene gut daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırmak için kene gut ile ilişkili bakteriler bileşimi karakterize için gerektirir. Bütün Dağı in situ kullanarak özellikle bakteriyel tür ile ilişkili RNA transkript görselleştirmek için hibridizasyon bereket ile ilgili nitel veri toplama ve sağlam doku microbiota dağıtımını sağlar. Bu teknik değişiklikler gut microbiota ortamında besleme kene boyunca incelemek için kullanılan ve kene genlerin ifade analiz etmek için de uygulanabilir. Bütün kene boyama hedef RNA dokusunda üç boyutlu yeniden yapılandırma için gerek kalmadan brüt mekansal dağılımı hakkında verim bilgi cesaret ve kez sıralama tabanlı zihnimi karıştıran çevresel kirlenme tarafından daha az etkilenir karmaşık mikrobiyal topluluklar çalışma için sık kullanılan bir yöntem. Genel olarak, bu tekniği daha iyi kullanılabilmesi için değerli bir araç vektör-patojen-microbiota etkileşimleri ve hastalık iletim içindeki rolü anlamak olduğunu.

Ölçüm ve RNA probları kalitesinin tahmini boyama başlamadan önce kritik öneme sahiptir. Vitro transkripsiyon verimliliği yüksek miktar ve kalite meydana bağlıdır. Biz düzenli olarak RNA probları saflık ve sonda transkripsiyon reaksiyonlar tarafından oluşturulan miktarı doğrulamak için bir formaldehit jel üzerinde görüntülenir. Sondalar parlak, ayrı gruplar (Şekil 2) görünmesi gerekir. RNA konsantrasyon spektrofotometrik ölçümler jel bands görünümü il...

Burada, dağınık şekilde ve geçici kene cesaret bir değiştirilmiş bütün-mount In situ hibridizasyon yaklaşım kullanarak uygun microbiota varlığı değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Kene bağırsaklar tarafından bütün-mount Situ hibridizasyon Microbiota görselleştirme

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Bu yöntem, kenede canlı bakterilerin varlığını mekansal ve zamansal olarak değerlendirmek gibi kene entomolojisi ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin başlıca avantajları, kenelerin kesitlendirilmesini veya pahalı ekipmanları gerektirmemesi ve gen transkriptlerinin mekansal ve zamansal olarak görüntülenmesine izin vermesidir. Genel olarak, bu tekniğe yeni olan kişiler, birden fazla adım ve reaktif içerdiğinden mücadele edeceklerdir.Ancak bu teknik zahmetli değildir. Tamamlanması yaklaşık üç gün sürebilse de, uygulamalı teslimat süresi her gün yalnızca birkaç saattir. Hazırlık olarak, toplanan keneleri bağırsak toplamadan önce 48 ila 72 saat boyunca besleyin.Bağırsakları keneden ayırmak için temiz bir cam slayta 20 ila 30 mikrolitre MEMFA çözeltisi ekleyin. Ardından keneyi MEMFA'ya yerleştirin ve odağı kenenin kafasına ayarlayın. Şimdi, bir çift steril yüksek karbonlu çelik tıraş bıçağı kullanarak, kenenin gövdesini dokunulmaz halde bırakarak scutumdaki baş bölgesini kesin.Ardından, bağırsak divertikülünü ve tükürük bezlerini vücut kütikülünden dışarı itmek için vücuda hafifçe bastırın. Daha sonra bağırsaklara zarar vermeden, onları tükürük bezlerinden dikkatlice ayırın ve kesikleri dikkatlice bir tıraş bıçağına alın. Hasat edilen tüm bağırsakları 500 mikrometre MEMFA'da 1,5 mililitrelik bir tüpte toplayın.Daha sonra tüpü oda sıcaklığında bir saat boyunca hafifçe sallayarak inkübe edin. Ertesi gün, metin protokolünde belirtildiği gibi dokuyu kurutun ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. Bir örgü sepet hazırlamak için, önce iki mililitre veya beş mililitre geçmeli üst santrifüj tüpünün altlarını kesmek için bir neşter üzerinde ısıtılmış tek kenarlı bir bıçak kullanın.Kesim tamamlanmadan önce bıçağın birkaç kez yeniden ısıtılması gerekebilir. Ardından, yeni açıklıklardan biraz daha büyük olan 110 mikronluk bir naylon ağın karesini kesin. Ardından, iyi bir seel yapılana kadar orta/düşük ısıya ayarlanmış bir ocak gözü üzerindeki tüpü ağa hafifçe bastırarak ağı açıklığa bağlayın.Soğuduktan sonra fazla ağı kesin ve boşluk olmadığından emin olun. Bu sepetlerden 24 tanesini 24 kuyulu bir plakaya uyacak şekilde yapın. Daha sonra, 24 oyuklu bir plakanın kapağına, numune sepetinin dudağı deliği kavrayacak ve düşmeyecek şekilde delikler açın.Tamamlandığında, monte edilen numune sepetleri kuyucuklara tamamen oturmalıdır. Şimdi, yerinde hibridizasyon boyunca sepetleri bir plakadan diğerine nispeten kolaylıkla aktarmak için bu takılı sepet tutucuyu kullanın. Bu tür iki plaka kullanın, böylece numune birinde inkübe edilirken diğeri bir sonraki yıkama için hazırlanabilir.Bu bölüm, yerinde hibridizasyonun belirli adımlarını kapsar. Tam bir açıklama için metin protokolüne bakın. Başlamak için, her sabit doku örneğini etiketli bir örnek sepetine aktarın.Plakayı deneysel koşullara göre düzenleyin ve koşul başına en az beş bağırsağı boyayın. İlk olarak, numuneleri nazikçe yeniden sulandırın. Her yıkamada PBS-T'nin etanole oranını kademeli olarak artırarak hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının.İlk gün boyunca, iki saatlik ön hibridizasyon adımından sonra, hibridizasyon tamponunu atmak yerine, tahlil sırasında ileride kullanmak üzere saklayın. Daha sonra, numuneleri prob hibridizasyon çözeltisi ile muamele ederken, çözeltinin buharlaşmasını önlemek için plakayı alüminyum folyo ile sıkıca örtün. İkinci gün, ayrılmış hibridizasyon tamponunu 24 oyuklu plakaya yükleyin ve plakayı 60 santigrat dereceye kadar ısıtın.O günün ilerleyen saatlerinde, tüm prob ve hibridizasyon tamponu izlerini gidermek için, numuneleri yıkama başına üç dakika boyunca 2x SSC ile iki kez yıkayın. Daha sonra numuneleri 60 santigrat derecede yıkama başına 20 dakika boyunca 2x SSC ile üç kez yıkayın. Daha sonra birincil antikoru bloke edici tamponda hazırlayın.Bu karışımdan 500 mikrolitre her bir kuyucuğa yükleyin. Engelleme adımından sonra, oda sıcaklığında yaklaşık dört saat veya gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Üçüncü gün, renk reaksiyonunu kromojenik substratta çalıştırın.Numune plakasını alüminyum folyo ile kaplayın. Ve reaksiyon sırasında, diseksiyon mikroskobu ile periyodik olarak aşırı lekelenme olup olmadığını kontrol edin. Dördüncü günde, bir ışık kutusu üzerinde inkübe etmek ve ağartmak önemlidir, çünkü bu, numunelerdeki herhangi bir pigmentasyonun veya Bouin'in solüsyonundaki renklenmenin giderilmesine izin verir ve net görselleştirme için prob sinyalini geliştirir.Daha sonra SSC ile yıkadıktan sonra, sepeti ters çevirerek bağırsak örneklerini 24 oyuklu yeni bir plakaya dikkatlice aktarın. Kuyucuklardayken,% 70 etanol kullanarak sepetleri iyice durulayın. Ardından numuneleri görüntülemeden önce gelin.RNA problarını kullanmadan önce kalitesini tahmin etmek çok önemlidir. Problar bir formaldehit jel üzerinde kontrol edilebilir. Parlak, ayrık bantlar olarak görünüyorlarsa, iyi kalitededirler.Boyama sırasında, biyolojik kopyalar arasında ve ayrıca bireysel bağırsakların yedi çift divertikülü arasında dağılımda bazı farklılıklar normaldir. Bu nedenle, ortalama boyama modeli hakkında bir fikir edinmek için koşul başına en az beş bağırsağı boyamak en iyisidir. Genel başarı, her bir koşul için duyu ve antisens örneklerinin boyanmasının karşılaştırılmasıyla en iyi şekilde ölçülür.Her ikisi de aynı süre için geliştirilmelidir. Duyu örnekleri minimum mor renge sahip olmalı veya hiç olmamalıdır, antisens örnekleri ise minimum arka planla sağlam boyama göstermelidir. Kritik olarak, eşit bir maruz kalma için dokuların lekeye tamamen daldırılması gerekir.Renk reaksiyonunun aşırı gelişmesini önlemek önemlidir. Bu, yüksek miktarda arka plan lekelenmesine neden olabilir ve duyu örnekleri, antisens örnekleri gibi görünmeye başlayabilir. Sonuçları etkileyen bir diğer faktör de kenelerin önceden ne kadar beslendiğidir.Beslenmeyen veya sadece 24 saat boyunca beslenen kenelerle çalışmak zordur. Bağırsakları daha kolay zarar görür ve iyi lekelenmez. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki buçuk ila üç gün içinde yapılabilir.Bu prosedürü denerken, deneyinize başlamadan önce reaktifler ve malzemeler tablosunda listelenen tüm malzemeleri hazır tutmayı unutmamak önemlidir. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.

visualization-microbiota-tick-guts-whole-mount-situ

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Lyme hastalığı araştırma çalışmaları, genellikle bir süreç genellikle birkaç hafta sürer patojen Borrelia burgdorferi ile enfekte kenelerin nesil gerektirir. Burada saat içinde yapılabilir mikroenjeksiyon tabanlı bir kene enfeksiyonu prosedürü göstermektedir. Ayrıca keneler içinde B. burgdorferi in situ lokalizasyonu için immünofloresan yöntemi göstermektedir.

Hızlı Aktarım ve Lyme Hastalığı Patojenler lokalizasyonu için işaretleyin Gut içinde Yöntemleri

Floresan Mikroskobu kullanılarak Nematodlar Bakteriler görselleştirme

Kaynak: Ng, K. M., Tropini, C. Bağırsak mikrobiyota-konak etkileşimlerinin Floresans Yerinde Hibrizleşme, Lektin Boyanması ve Görüntüleme Yoluyla Görselleştirilmesi. J. Vis. Exp. (2021).Bu video, fare bağırsak dokusunda bağırsak mikrobiyotasını boyandırmak için floresan probları bakteriyel rRNA'ya (ribozomal ribonüklein asit) hibritize ederek ve mikroskobik analiz için konak yapılarını karşı boyama yoluyla fare bağırsak dokusunda bağırsak mikrobiyotasını boyama prosedürünü göstermektedir.

Fare bağırsak bakterilerinin fare bağırsak kesitlerinde yerinde floresans hibridizasyonu

Bu video, idrar yolu ile enfekte olmuş bir hastadan alınan deparafinlenmiş mesane dokusundaki bakterilerin görselleştirilmesini göstermektedir. Bakteriyel 16s ribozomal RNA'lar ile hibritlenmiş floresan etiketli prob, dokuyla ilişkili bakterileri ve dağılımlarını ortaya çıkararak, numune içindeki yoğunlukları hakkında değerli uzamsal bilgiler sağlar.

Mesane Biyopsi Kesitlerinde Bakterilerin Floresan In Situ Hibridizasyon ile Görüntülenmesi

Lyme hastalığı Kuzey Amerika'daki en sık bildirilen vektör kaynaklı bir hastalıktır. Etkeni, Borrelia burgdorferi keneler kene ile bulaşan bir spioket bakteridir. Hayvan modellerinde enfeksiyonun İletim ve saptama burada açıklandığı kene besleme, kullanılmasıyla optimize edilir.

Lyme Hastalığı Araştırma İletim ve Xenodiagnosis için Hayvanlar Keneler besleme

Burada bir nesil sıralama iletişim kuralı kimliği ve mikrobiyal topluluklar vektörel çizimler içinde karakterizasyonu sağlayan 16S rRNA sıralama için mevcut. Bu yöntem, DNA ekstraksiyon, amplifikasyon ve barkodlama filogenetik bilgi için sıra verileri eşleştirmek için bir akış-hücre ve Biyoinformatik üzerinde sıralama PCR aracılığıyla örnekleri içerir.

Kene Microbiome karakterizasyonu tarafından yeni nesil 16S rRNA Amplicon sıralama

Bu protokolün amacı Memeli gastrointestinal sistemde Candida albicans hücre şekli ve lokalizasyonu görselleştirmektir.

Situ Hibridizasyonfloresan Kullanarak Murine Gastrointestinal Sistemde Candida albicans Görselleştirilmesi

Bu kolaylaştırılmış protokol, karmaşık doku örneklerindeki bakterileri tespit etmek ve görüntülemek için, dokuyu sabitlemekten floresan in situ hibridizasyonlu mikropları boyamaya kadar bir iş akışını detaylandırıyor.

Floresan In Situ Hibridizasyon, Lectin Boyama ve Görüntüleme Yoluyla Gut Mikrobiyota-konak Etkileşimlerinin Görselleştirilmesi

Hücre dışı bakteriler ve Orsay virüsü ve mikrosporidia (mantarlar) gibi hücre içi patojenler de dahil olmak üzere bağırsak mikropları genellikle vahşi Caenorhabditis nematodları ile ilişkilidir. Bu makalede, C. elegans nematodlarını kolonize eden ve/veya enfekte eden mikropların tespiti ve nicelleştirilmesi ve laboratuvarda kontrollü enfeksiyonlardan sonra patojen yükünün ölçülmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Caenorhabditis elegans Bağırsaklarında Mikrobiyal Kolonizasyon ve Enfeksiyonu Görselleştirmek için RNA Floresan in situ Hibridizasyon (FISH)

Burada, enfeksiyon sırasında patojenik bakterilerin organ çapında tespit edilmesini ve floresan raportör aktivitelerinin miktarını belirlemeyi sağlayan bir prosedürü açıklıyoruz.

Mikrobiyal enfeksiyonların yüksek çözünürlüklü üç boyutlu tüm organ tomografisi

Burada, vektör yeterliliği ve patojen-mikrobiyom etkileşimlerinin anlaşılmasını ilerletmek için kene kaynaklı patojenlerin dokuya özgü lokalizasyonunu incelemek için, beslenen bir kenenin diseksiyonunu takiben tükürük, hemolenf, tükürük bezleri ve orta bağırsak toplamak için bir protokol sunuyoruz.

Bireysel Kenelerden Tükürük, Hemolenf, Tükürük Bezleri ve Orta Bağırsağın Ekstraksiyonu (Acari: Ixodidae)

Öğrenin kene bağırsaklarında yaşayabilir mikrobiyota görselleştirmesi için bütün-mount in situ hibridizasyon yöntemini. Bu teknik, pahalı ekipman gerektirmeden mekansal ve zamansal gen transkript analizi sağlar.

Kene bağırsaklar tarafından bütün-mount Situ hibridizasyon Microbiota görselleştirme

Daha fazla video keşfet