Kene bağırsaklar tarafından bütün-mount Situ hibridizasyon Microbiota görselleştirme

Bu yöntem, kenede canlı bakterilerin varlığını mekansal ve zamansal olarak değerlendirmek gibi kene entomolojisi ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin başlıca avantajları, kenelerin kesitlendirilmesini veya pahalı ekipmanları gerektirmemesi ve gen transkriptlerinin mekansal ve zamansal olarak görüntülenmesine izin vermesidir. Genel olarak, bu tekniğe yeni olan kişiler, birden fazla adım ve reaktif içerdiğinden mücadele edeceklerdir.

Ancak bu teknik zahmetli değildir. Tamamlanması yaklaşık üç gün sürebilse de, uygulamalı teslimat süresi her gün yalnızca birkaç saattir. Hazırlık olarak, toplanan keneleri bağırsak toplamadan önce 48 ila 72 saat boyunca besleyin.

Bağırsakları keneden ayırmak için temiz bir cam slayta 20 ila 30 mikrolitre MEMFA çözeltisi ekleyin. Ardından keneyi MEMFA'ya yerleştirin ve odağı kenenin kafasına ayarlayın. Şimdi, bir çift steril yüksek karbonlu çelik tıraş bıçağı kullanarak, kenenin gövdesini dokunulmaz halde bırakarak scutumdaki baş bölgesini kesin.

Ardından, bağırsak divertikülünü ve tükürük bezlerini vücut kütikülünden dışarı itmek için vücuda hafifçe bastırın. Daha sonra bağırsaklara zarar vermeden, onları tükürük bezlerinden dikkatlice ayırın ve kesikleri dikkatlice bir tıraş bıçağına alın. Hasat edilen tüm bağırsakları 500 mikrometre MEMFA'da 1,5 mililitrelik bir tüpte toplayın.

Daha sonra tüpü oda sıcaklığında bir saat boyunca hafifçe sallayarak inkübe edin. Ertesi gün, metin protokolünde belirtildiği gibi dokuyu kurutun ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. Bir örgü sepet hazırlamak için, önce iki mililitre veya beş mililitre geçmeli üst santrifüj tüpünün altlarını kesmek için bir neşter üzerinde ısıtılmış tek kenarlı bir bıçak kullanın.

Kesim tamamlanmadan önce bıçağın birkaç kez yeniden ısıtılması gerekebilir. Ardından, yeni açıklıklardan biraz daha büyük olan 110 mikronluk bir naylon ağın karesini kesin. Ardından, iyi bir seel yapılana kadar orta/düşük ısıya ayarlanmış bir ocak gözü üzerindeki tüpü ağa hafifçe bastırarak ağı açıklığa bağlayın.

Soğuduktan sonra fazla ağı kesin ve boşluk olmadığından emin olun. Bu sepetlerden 24 tanesini 24 kuyulu bir plakaya uyacak şekilde yapın. Daha sonra, 24 oyuklu bir plakanın kapağına, numune sepetinin dudağı deliği kavrayacak ve düşmeyecek şekilde delikler açın.

Tamamlandığında, monte edilen numune sepetleri kuyucuklara tamamen oturmalıdır. Şimdi, yerinde hibridizasyon boyunca sepetleri bir plakadan diğerine nispeten kolaylıkla aktarmak için bu takılı sepet tutucuyu kullanın. Bu tür iki plaka kullanın, böylece numune birinde inkübe edilirken diğeri bir sonraki yıkama için hazırlanabilir.

Bu bölüm, yerinde hibridizasyonun belirli adımlarını kapsar. Tam bir açıklama için metin protokolüne bakın. Başlamak için, her sabit doku örneğini etiketli bir örnek sepetine aktarın.

Plakayı deneysel koşullara göre düzenleyin ve koşul başına en az beş bağırsağı boyayın. İlk olarak, numuneleri nazikçe yeniden sulandırın. Her yıkamada PBS-T'nin etanole oranını kademeli olarak artırarak hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının.

İlk gün boyunca, iki saatlik ön hibridizasyon adımından sonra, hibridizasyon tamponunu atmak yerine, tahlil sırasında ileride kullanmak üzere saklayın. Daha sonra, numuneleri prob hibridizasyon çözeltisi ile muamele ederken, çözeltinin buharlaşmasını önlemek için plakayı alüminyum folyo ile sıkıca örtün. İkinci gün, ayrılmış hibridizasyon tamponunu 24 oyuklu plakaya yükleyin ve plakayı 60 santigrat dereceye kadar ısıtın.

O günün ilerleyen saatlerinde, tüm prob ve hibridizasyon tamponu izlerini gidermek için, numuneleri yıkama başına üç dakika boyunca 2x SSC ile iki kez yıkayın. Daha sonra numuneleri 60 santigrat derecede yıkama başına 20 dakika boyunca 2x SSC ile üç kez yıkayın. Daha sonra birincil antikoru bloke edici tamponda hazırlayın.

Bu karışımdan 500 mikrolitre her bir kuyucuğa yükleyin. Engelleme adımından sonra, oda sıcaklığında yaklaşık dört saat veya gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Üçüncü gün, renk reaksiyonunu kromojenik substratta çalıştırın.

Numune plakasını alüminyum folyo ile kaplayın. Ve reaksiyon sırasında, diseksiyon mikroskobu ile periyodik olarak aşırı lekelenme olup olmadığını kontrol edin. Dördüncü günde, bir ışık kutusu üzerinde inkübe etmek ve ağartmak önemlidir, çünkü bu, numunelerdeki herhangi bir pigmentasyonun veya Bouin'in solüsyonundaki renklenmenin giderilmesine izin verir ve net görselleştirme için prob sinyalini geliştirir.

Daha sonra SSC ile yıkadıktan sonra, sepeti ters çevirerek bağırsak örneklerini 24 oyuklu yeni bir plakaya dikkatlice aktarın. Kuyucuklardayken,% 70 etanol kullanarak sepetleri iyice durulayın. Ardından numuneleri görüntülemeden önce gelin.

RNA problarını kullanmadan önce kalitesini tahmin etmek çok önemlidir. Problar bir formaldehit jel üzerinde kontrol edilebilir. Parlak, ayrık bantlar olarak görünüyorlarsa, iyi kalitededirler.

Boyama sırasında, biyolojik kopyalar arasında ve ayrıca bireysel bağırsakların yedi çift divertikülü arasında dağılımda bazı farklılıklar normaldir. Bu nedenle, ortalama boyama modeli hakkında bir fikir edinmek için koşul başına en az beş bağırsağı boyamak en iyisidir. Genel başarı, her bir koşul için duyu ve antisens örneklerinin boyanmasının karşılaştırılmasıyla en iyi şekilde ölçülür.

Her ikisi de aynı süre için geliştirilmelidir. Duyu örnekleri minimum mor renge sahip olmalı veya hiç olmamalıdır, antisens örnekleri ise minimum arka planla sağlam boyama göstermelidir. Kritik olarak, eşit bir maruz kalma için dokuların lekeye tamamen daldırılması gerekir.

Renk reaksiyonunun aşırı gelişmesini önlemek önemlidir. Bu, yüksek miktarda arka plan lekelenmesine neden olabilir ve duyu örnekleri, antisens örnekleri gibi görünmeye başlayabilir. Sonuçları etkileyen bir diğer faktör de kenelerin önceden ne kadar beslendiğidir.

Beslenmeyen veya sadece 24 saat boyunca beslenen kenelerle çalışmak zordur. Bağırsakları daha kolay zarar görür ve iyi lekelenmez. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki buçuk ila üç gün içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, deneyinize başlamadan önce reaktifler ve malzemeler tablosunda listelenen tüm malzemeleri hazır tutmayı unutmamak önemlidir. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.