Name: Eşleme metabolizma: doğrudan dokusunda laktat dehidrogenaz etkinliğini izleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Öğrenin, laktat dehidrogenaz aktivitesini doğrudan doku örneklerinde haritalamak için bu biyokimya yöntemini. Fare derisi ve embriyonik kök hücrelerde NAD(P)H üreten enzimlerin uzamsal dağılımını inceleyerek metabolik süreçleri anlayın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

HAC Milton E. Cassel bilgin Rita Allen Vakfı (http://www.ritaallenfoundation.org) yapıldı. Bu eser HAC için Ulusal Enstitüsü, genel tıbbi Bilimler R01 GM081686, R01 AR070245, Ulusal Enstitüsü () genel tıbbi Bilimler R01 GM0866465, Eli ve Edythe rejeneratif tıp geniş merkezi ve kök hücre araştırma hibe tarafından finanse edildi Rose Hills ve Hal Gaba Ödülleri), Iris Cantor kadın Sağlık Merkezi/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, lösemi lenfoma Derneği etkisi Jonsson kapsamlı kanser Merkezi'nden ödül WEL ve HAC için. Bu yayında bildirilen araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası P50CA092131 altında Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu. HAC Eli & Edythe rejeneratif tıp geniş merkezi & kök hücre araştırmaları, UCLA Moleküler Biyoloji Enstitüsü ve UCLA Biyoinformatik bölümler arası Programı üyesidir.

Açıklanan tüm deneylerin hayvan bakımı Komitesi Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles tarafından kabul edildi.
1. dondurulmuş fare deri slaytlar oluşturmak
<ol><li>Fareler kurum politikası doğrultusunda ötenazi. Not: koruyucu giysiler için kurumsal ilke uygulayın. Tüm iletişim kuralları hayvanları içeren kurumsal hayvan bakımı Komitesi tarafından onaylanmış olması gerekir.</li>
	<li>Fare ile bir hayvan kılı düzeltici tüylerden.</li>
	<li>İnsizyon deri makas kullanarak olun. Forseps kullanarak, uzak fare cilt kaldırın. Makas kullanarak, cilt Bölüm Kes gitsin.</li>
	<li>Cryomold reaktif bileşik dondurma ile doldurun ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Cilt iğne burunlu bölümlere dolu cryomolds kullanarak forseps yerleştirin. Cilt dokusu dilimlerin bir kesit derinin epidermis dermis, hypodermis ve kas (Şekil 2) oluşturur gelecek şekilde yönlendirin. Not: Eğer mümkünse, deneysel bağlayabilir ve böylece aynı slayt kesitli ve birlikte işlenen fareler birlikte aynı cryomold kontrol. Kabarcıklar oluşturmak değil için dikkat ediniz.</li>
	<li>Cryomold bir buz kovası Kuru buz kalıbı düz yüzeye yerleştirin ve dondurma izin. Cilt yönünü izlemeye devam edin. Gerekirse ayarlayın. Not: Kuru buz işlerken kriyojenik eldiven giymek.</li>
	<li>Cryomolds-80 ° C dondurucu depolama içine aktarın. Örnekleri dondurucuda yaklaşık 3 ay enzimatik aktivite, önemli kaybı olmadan sürdürülebilir. Donmuş bölümleri kurumasına izin vermeyin.</li>
	<li>-20 ° c, 7-10 µm en iyi cilt morfoloji21için kalın bölümler oluşturmak için dilim doku bir cryostat kullanarak.</li>
</ol>2. slayt boyama için hazırlanması
<ol><li>Test edilmesi için slaytlar kümesi oluşturun. Bir denetim slayt üzerinde NAD tevkif içerir ve başka bir denetime slayt üzerinde belgili tanımlık substrate, laktat, tevkif edilecektir. Daha önce soruşturma bir donmuş doku blok olumlu denetim slayttan içerir.</li>
	<li>Kısaca 5 min için % 4 formalin ile cilt bölümü içeren slaytlar ya pipetting 1 mL % 4 formalin bir slayda veya birden çok slayt, slayt %4 formalin içeren bir konteyner içine daldırma tarafından işlenmesi sırasında düzelt. Not: Cilt slaytlardan aşağıdaki yordamlar ve korunağı cilt morfoloji sırasında soyulmak değil fiksasyonun sağlayacaktır. Dikkat: Formalin kanserojen ve tehlikeli olduğunu; eldiven giymek, senin cilde temas ve kimyasal duman mahallede bu adımı gerçekleştirin izin vermeyin.</li>
	<li>En az 1 mL fosfat ile yıkama slaytlar arabelleğe alınmış serum, pH 7.4, slayt pipetting veya daldırma.</li>
</ol>3. çözüm boyama hazırlanması
<ol><li>Laktat dehidrogenaz aktivitesi boyama için girdap birlikte reaktifler (50 mM Tris pH 7.4, 750 µM NADP, 80 µM phenazine methosulfate (PMS), 600 µM nitrotetrazolium mavi klorür ve 30 mM laktat) boyama miktarına bağlı olarak uygun ölçekli bir tüp Çözüm gerekli. Not: 1 mL tamamen bir slayt karşılamak için yeterli olur.</li>
	<li>Tüm reaktifler NAD dışında mevcut olan ikinci bir çözüm hazırlamak. Tüm reaktifler laktat dışında mevcut olan üçüncü bir çözüm hazırlamak.</li>
</ol>4. kuluçkaya slaytlar çözüm boyama
<ol><li>Yavaşça damlalıklı boyama çözüm veya bölümün tamamını kapsayan hazırlanan slaytlar üzerine kontrol çözümleri (1 mL bir slayt için yeterli). Birden çok slayt birlikte işlenen eğer boyama çözüm tüm slaytlara aynı anda daldırma (kapsayıcı tamamen doku bölümü karşılamak için yeterli bir çözüm olduğundan emin olun).</li>
	<li>Karanlıkta 37 ° C'de oksijen bir ortamda slaytlar kuluçkaya. Çözüm boyama slayt üstünde ise, slayt buharlaşma önlemek için oksijen bir ortamda yerleştirin.</li>
</ol>5. monitör slaytları
<ol><li>Boyama çözüm dönüşümden görsel denetim tarafından mavi için Sil izlemek. Örnekleri mavilik istenen seviyeye ulaşmış, reaksiyon boyama çözüm kaldırarak durdurur. Not: cilt için 10 dakika yeterlidir. Zaman organ ve enzimatik aktivite bağlı olacaktır.</li>
	<li>Pipetting tarafından slaytlar fosfat tamponlu tuz ile yıkayın (1 mL her slayt için yeterli) veya daldırma. Not: birbirine Karşılaştırılacak herhangi bir örnekleri boyama çözümde aynı süre için muhafaza edilmelidir.</li>
</ol>6. counterstain ve mount
<ol><li>Damlalıklı slayta slaytları mavilik uygun düzeyine ulaştığında counterstain. Not: çekirdeklerin açmak kırmızı veya yeşil Counterstains formazan tarafından precipitant oluşturulan mavi ile iyi kontrast sağlar.</li>
	<li>Sulu ya da sulu olmayan orta22montaj ile bağlayın. 1-3 damla (40-50 µL) montaj orta kapak notu boyutuna bağlı olarak yeterli.</li>
</ol>7. resim slayt ve ölçmek
<ol><li>Resim slaytları ışık mikroskop altında. Deneysel fotoğraflarını ve kontrol örnekleri ve 10 X, 20 X ve 40 X büyütme, tüm negatif kontrolleri al.</li>
	<li>Mavi leke görüntü analiz yazılımı ile farklı bölgelerdeki yoğunluğunu belirlemek.</li>
</ol>

<ol><li>Boonacker, E., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+cytochemical+techniques+for+metabolic+mapping+in+living+cells%2C+with+special+reference+to+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).</li>
<li>Seidler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tetrazolium-formazan+system%3A+Design+and+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry.</a> Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).</li>
<li>Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVan+Noorden%2C+CJF+%22Enzyme+Histochemistry%3A+A+Laboratory+Manual+of+Current+Methods%22">Enzyme Histochemistry: A Laboratory Manual of Current Methods</a>. , Bios. (1992).</li>
<li>Winzer, K., Van Noorden, C. J., Kohler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+cytochemical+analysis+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+living+isolated+hepatocytes+of+European+flounder+for+rapid+analysis+of+xenobiotic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Quantitative cytochemical analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in living isolated hepatocytes of European flounder for rapid analysis of xenobiotic effects.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1025-1032 (2001).</li>
<li>Negi, D. S., Stephens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+the+histochemical+localization+of+glucose-6-phoshate+dehydrogenase+in+animal+and+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An improved method for the histochemical localization of glucose-6-phoshate dehydrogenase in animal and plant tissues.</a> J Histochem Cytochem. 25, 149-154 (1977).</li>
<li>Boren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+localization+of+transketolase+activity+in+epithelial+cells+of+different+rat+tissues+and+subcellularly+in+liver+parenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">In situ localization of transketolase activity in epithelial cells of different rat tissues and subcellularly in liver parenchymal cells.</a> J Histochem Cytochem. 54, 191-199 (2006).</li>
<li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+metabolic+configurations+of+single+cells+within+complex+tissue+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Exploring metabolic configurations of single cells within complex tissue microenvironments.</a> Cell Metab. , (2017).</li>
<li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+serum+lactate+dehydrogenase+in+renal+cell+carcinoma%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of serum lactate dehydrogenase in renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis.</a> PLoS One. 11, e0166482(2016).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+serum+LDH+in+small+cell+lung+cancer%3A+A+systematic+review+with+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biomark%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of serum LDH in small cell lung cancer: A systematic review with meta-analysis.</a> Cancer Biomark. 16, 415-423 (2016).</li>
<li>Petrelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+role+of+lactate+dehydrogenase+in+solid+tumors%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+76+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oncol%22%5BJournal%5D)">Prognostic role of lactate dehydrogenase in solid tumors: a systematic review and meta-analysis of 76 studies.</a> Acta Oncol. 54, 961-970 (2015).</li>
<li>Valvona, C. J., Fillmore, H. L., Nunn, P. B., Pilkington, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+and+function+of+lactate+dehydrogenase+A%3A+Therapeutic+potential+in+brain+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">The regulation and function of lactate dehydrogenase A: Therapeutic potential in brain tumor.</a> Brain Pathol. 26, 3-17 (2016).</li>
<li>Markert, C. L., Shaklee, J. B., Whitt, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+a+gene%3A+Multiple+genes+for+LDH+isozymes+provide+a+model+of+the+evolution+of+gene+structure%2C+function+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evolution of a gene: Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure, function and regulation.</a> Science. 189, 102-114 (1975).</li>
<li>Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+altered+activity+of+M-+and+H-isozyme+forms+of+human+lactate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase.</a> Proteins. 43, 175-185 (2001).</li>
<li>Holness, M. J., Sugden, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+pyruvate+dehydrogenase+complex+activity+by+reversible+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation.</a> Biochem Soc Trans. 31, 1143-1151 (2003).</li>
<li>Yi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphofructokinase+1+glycosylation+regulates+cell+growth+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism.</a> Science. 337, 975-980 (2012).</li>
<li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation+of+lactate+dehydrogenase+A+is+important+for+NADH%2FNAD%28%2B%29+redox+homeostasis+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation of lactate dehydrogenase A is important for NADH/NAD(+) redox homeostasis in cancer cells.</a> Mol Cell Biol. 31, 4938-4950 (2011).</li>
<li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine-5+acetylation+negatively+regulates+lactate+dehydrogenase+A+and+is+decreased+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Lysine-5 acetylation negatively regulates lactate dehydrogenase A and is decreased in pancreatic cancer.</a> Cancer Cell. 23, 464-476 (2013).</li>
<li>Vanderlinde, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+total+lactate+dehydrogenase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Lab+Sci%22%5BJournal%5D)">Measurement of total lactate dehydrogenase activity.</a> Ann Clin Lab Sci. 15, 13-31 (1985).</li>
<li>Nelson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+imaging+of+patients+with+prostate+cancer+using+hyperpolarized+%5B1-%281%29%283%29C%5Dpyruvate%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate.</a> Sci Transl Med. 5, 198ra108(2013).</li>
<li>Flores, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactate+dehydrogenase+activity+drives+hair+follicle+stem+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation.</a> Nat Cell Biol. , (2017).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning tissues.</a> CSH Protoc. 2008, pdb prot4991 (2008).</li>
<li>Espada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-aqueous+permanent+mounting+for+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy.</a> Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).</li>
<li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate.+A+photochemically+stable+electron+mediator+between+NADH+and+various+electron+acceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors.</a> J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa etmek rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip.

Burada anlatılan yöntem laktat dehidrogenaz veya NADH ya da NADPH, farklı hücre tipleri bir doku veya bir doku zaman içinde farklı bölümlerini içinde oluşturmak diğer metabolik enzimler etkinliğini izlemek için kullanılabilir. Laktat dehidrogenaz kök hücreler ve tümör biyolojisi anlamak için önemli bir enzimdir ve tek tek hücreler laktat dehidrogenaz etkinliğini izlemek için yeteneği önemli anlayışlar bu enzim fonksiyonu sağlamak olasıdır.
Bir önemli avantaj bu protokolün diğer yöntemleri ile ...

Mekanlar enzimleri yüksek veya düşük aktivite olan dokularda anlamak anlayış geliştirme ve Fizyoloji için esastır. Transkript veya protein düzeyleri kez enzimatik aktivite için vekilleri olarak kullanılır. Bu tür çalışmalar bilgilendirici olabilir, onlar translasyonel modifikasyon, protein kompleksleri veya enzim hücre altı yerelleştirme varlığı gibi bir enzim aktivite belirlemek için kritik olabilir bilgi vermeyin. Enzimatik etkinliğini doğrudan ölçülen zaman, artık bir doku içinde yüksek veya düşük aktivite ile karışım veya kayma dağıtım hücrelerin içindeki tek tek hücreler hakkında bilgi içeren homojenize protein lysates içinde sık sık izlenir.
Biz burada bir doku örneği içinde enzimatik aktivite kayma dağılımını eşlemek için detaylı bir protokol sağlar. Metodoloji önceki çalışmalar tetrazolium tuzları dehydrogenases, redüktaz ve oxidases dondurulmuş doku1aktivite yerelleştirmek için kullanılabileceğini gösteren temel alır. Proton bir tetrazolium tuz2,3' e transfer edildiğinde bu yöntemler ile bir su çözünmez formazan oluşur. Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz NADPH ve bir proton oluşturur ve tetrazolium aktivite ile tespit edilmiştir. Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz içinde Avrupa dere pisisi tetkikine4, alveoler tip 2 hücrelerinde5 akciğer ve böbrek5ın takip. Tetrazolium tuzları da donmuş doku6transketolase etkinliğini izlemek için kullanılmaktadır. Benzer bir yaklaşım son zamanlarda bitişik slayt7aynı doku içinde birden çok dehydrogenases etkinliğini izlemek için kullanıldı.
Biz burada tetrazolium tuzları laktat dehidrogenaz aktivitesi (Şekil 1) kayma dağılımını izlemek için kullanılacak bir yöntem açıklanmaktadır. Laktat dehidrogenaz glikoliz laktat ve ters tepki tarafından oluşturulan pyruvate dönüştürebilirsiniz. Laktat dehidrogenaz sonuç olarak pyruvate'nın giriş tricarboxylic asit çevrimi laktat onun salgısı karşı önemli bir belirleyici bir faaliyettir. Kan laktat seviyeleri kez hastalıklar, hastalık veya yaralanma hücreler zarar vermişse ve enzim piyasaya sinyal çünkü kanser8,9,10, dahil olmak üzere bir dizi teşhis etmek için kullanılır.
Dört laktat dehidrogenaz genler vardır: LDHA, LDHB, LDHC ve LDHD11. LDHA ve LDHB bir erken LDHA gen12tekrarını ortaya çıktığı düşünülmektedir. Karaciğer bir tetramer etkindir ve LDHA ve LDHB homotetramers ve heterotetramers birbirleri ile oluşabilir. LDHA LDHB daha yüksek laktat benzeşim ve tercihen laktat pyruvate13için dönüştürmek için rapor ederken pyruvate için daha yüksek ilgi var bildirilmektedir. LDHA organizatörü bağlayıcı siteleri HIF1α, cMYC ve FOXM1 transkripsiyon faktörleri11içerir. Buna ek olarak, birçok diğer glycolytic enzimler14,15gibi karaciğer post-translational modifications tarafından değiştirilebilir. Fibroblast büyüme faktörü reseptörü 1 LDHA tetramer oluşumu teşvik, Y10 veya NADH substrat bağlama16teşvik Y83 fazdan. LDHA-ebilmek da var olmak acetylated17. Bu nedenlerden dolayı sadece karaciğer protein düzeyleri, ama enzim aktivitesi de izleme karaciğer etkinlik tam bir anlayış gerektirir.
Burada mevcut yöntemi yanı sıra diğer yaklaşımlar laktat dehidrogenaz etkinliğini izlemek için kullanılmaktadır. Laktat dehidrogenaz aktivitesi spectrophotometrically homojenize protein lysate izlenebilir. Gibi laktat pyruvate için dönüştürülür NADH nesil 340 absorbans temel alarak ölçülebilir nm, süre gibi pyruvate laktat18için dönüştürülür NADH kaybolması izlenebilir. Laktat dehidrogenaz aktivitesi manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ile de izlenir. 13 C-pyruvate idare ve laktat pyruvate dönüşüm oranı olarak izlenebilir [1 -13C] laktat / [1 -13C] pyruvate. Yüksek oranları [1 -13C] laktat / [1 -13C] pyruvate kanser dokusu19' gözlemlenmiştir. MRI tabanlı yaklaşımlar laktat dehidrogenaz aktivitesi normal ve hastalık doku üzerinde bilgi sağlayabilir iken, metodolojiler belirli hücrelerdeki faaliyet düzeyi belirlemek için gereken çözünürlük var mı. Burada sağlanan metodoloji laktat dehidrogenaz aktivitesi tek hücre doku alanları ve hatta ilgili bilgi sağlar.
Situ etkinlik testleri kullanarak, laktat dehidrogenaz aktivitesinin fare cilt20saç kökü kök hücrelerde yüksek olduğunu fark ettik. Biz de laktat dehidrogenaz kültürlü embriyonik kök hücre içinde etkinliğini izlemek ve faaliyetin besleyici katman kök hücre içinde daha yüksek olması kurmak için kullanılan yöntem. Son olarak, taze fare aort laktat dehidrogenaz aktivitesinin izlenmeli ve düz kas hücrelerinde boyama görülmektedir. Biz burada donmuş fare cilt laktat dehidrogenaz etkinliğini izleme için detaylı bir protokol tanımlamak.

<table><tbody><tr><td>Cerrahi aletler</td><td></td><td></td><td>Ötenazi uygulanmış farelerden deri toplamak için</td></tr><tr><td>Tissue-tek kriyokalıp 25 mm x 20 mm x 5 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9511236</td><td>Fare derisini dondurmak için</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. bileşiği</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9638938</td><td>Kriyokalıpları monte etmek için</td></tr><tr><td>Buz kovası</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-106</td><td></td></tr><tr><td>Kuru Buz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polisin Yapışma Slaytı</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-78</td><td></td></tr><tr><td>%4 formalin</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245-684</td><td>Su</td></tr><tr><td>fosfat tamponlu tuzlu suda seyreltilmiş, pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>girdap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris bazlı</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245-684</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7004</td><td></td></tr><tr><td>Fenazin metosülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>Nitrotetrazolyum mavi klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Lityum L-laktat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2250</td><td>Yüzey</td></tr><tr><td>37 derece; C inkübatörü (veya doku kültürü inkübatörü)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brezilyalı! Sayaç lekesi</td><td>Anatech</td><td>861</td><td>Sayaç lekesi</td></tr><tr><td>Montaj ortamı</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-5000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Slaytlar için kapak fişleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544D</td><td></td></tr><tr><td>Işık mikroskobu</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

eşleme metabolizma: doğrudan dokusunda laktat dehidrogenaz etkinliğini izleme

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Uzay ve zamanın enzimatik aktivite haritalama normal doku ve hastalık hücre davranışı moleküler temeli anlamak için önemlidir. Situ metabolik aktivite deneyleri bir doku içinde metabolik aktivite kayma dağıtımı hakkında bilgi sağlar. Biz burada enzim laktat dehidrogenaz doku örnekleri içinde doğrudan etkinliğini izlemeye yönelik detaylı bir protokol sağlar. Laktat dehidrogenaz olup tüketilen glikoz enerji aerobik veya anaerobik glikoliz yoluyla dönüştürülür önemli bir belirleyici olduğunu. Laktat ve NAD içeren bir çözüm bir donmuş doku bölümüne sağlanır. Nikotinamid adenin dinükleotit (NAD) NADH ve tespit edilebilir bir proton azaltılmasına dayanan sağlanan aynı anda dönüştürme sırasında hücreleri yüksek laktat dehidrogenaz aktivitesi pyruvate için sağlanan laktat dönüştürme nitrotetrazolium mavi formazan, mavi bir çökelti görüntülenir. Biz fare cilt laktat dehidrogenaz etkinliğini izleme için detaylı bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı uygulamak, laktat dehidrogenaz aktivitesi yüksek deneniyor saç kökü kök hücreleri cilt içinde olduğunu fark ettik. Protokol kültür fare embriyonik kök hücre için uygulama daha yüksek kültürlü embriyonik kök hücre boyama fare embriyonik fibroblastlar ortaya koydu. Çözümleme taze izole fare aort düz kas hücrelerinde aort için dikey boyama ortaya. Sağlanan metodoloji dağınık şekilde bir proton dondurulmuş ya da taze doku oluşturmak enzim aktivitesinin eşlemek için kullanılabilir.

Biz daha önce fare cilt20 in situ faaliyet deneyleri için sonuçlar bildirdin. Şekil 3' te gösterildiği gibi saç kökü kök hücre yukarıdaki yordamları tarif ederken Folliküler temelini laktat dehidrogenaz aktivitesinin yüksek seviyeleri takip edildi gözlenen. Bu bulgular deri saç kökü kök hücre için sıralama ve yüksek laktat dehidrogenaz aktivitesi kök hücre yerde sıralanmış hücreleri üzerinde etkinlik deneyleri ile teyit flores...

Biz nicotinatmide adenin dinükleotit fosfat (NAD(P)H) + H + doğrudan doku örnekleri '. oluşturmak enzimler için enzimatik aktivite kayma dağıtım eşleştirmek için bir protokol tarif

Eşleme metabolizma: doğrudan dokusunda laktat dehidrogenaz etkinliğini izleme

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Bu yöntem, dokular içindeki farklı yerlerdeki enzimlerin aktivitesi gibi biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacının doku örneklerinde doğrudan enzimatik aktiviteyi tespit etmesine izin vermesidir. Bu işleme başlamak için, farenin tüyünü bir hayvan kılı düzeltici ile çıkarın.Makas kullanarak sırt derisi üzerinde bir kesi yapın. Ardından cildi yukarı kaldırın ve kesin. Ardından, Cryomold'u dondurucu reaktif bileşiği ile doldurun.İğne burun forsepsleri kullanarak, cilt bölümlerini alanın Cryomold'una yerleştirin. Cilt bölümlerini, cildin epidermisten dermise, hipodermise ve kaslara kadar olan kesiti görünecek şekilde yönlendirin. Mümkünse, deney ve kontrol farelerini aynı Cryomold'a monte edin, böylece aynı slayta bölümlere ayrılabilir ve birlikte işlenebilirler.Baloncuk oluşturmamaya dikkat edin. Cryomold'u bir buz kovasındaki bir kuru buz bloğunun düz bir yüzeyine yerleştirin. Depolama için Cryomold'u eksi 80 santigrat derece dondurucuya aktarın.Numuneler, önemli ölçüde enzimatik aktivite kaybı olmadan dondurucuda yaklaşık üç ay saklanabilir. Kesit almak için, negatif 20 santigrat dereceye ayarlanmış bir kriyostat kullanarak, en iyi cilt morfolojisi için yedi ila 10 mikrometre kalınlığında bölümler oluşturmak üzere dokuyu dilimleyin. Bu prosedürde, NAD'nin kesileceği bir kontrol lamını, substrat laktatının kesileceği başka bir kontrol lamını ve daha önce araştırılan donmuş bir doku bloğundan pozitif bir kontrol lamını içeren test edilecek slaytlar setini oluşturun.Cilt bölümlerini içeren slaytları beş dakika boyunca% 4 formalin ile kısaca sabitleyin. Ardından slaytları PBS ile yıkayın. Daha sonra, uygun boyutta bir tüpte laktat dehidrojenaz aktivitesi boyaması için NADP, PMS, nitrotetrazolyum mavi klorür ve laktat dahil olmak üzere reaktifleri birlikte vorteksleyin.Ardından, NAD hariç tüm reaktiflerin bulunduğu ikinci bir çözelti hazırlayın. Daha sonra, laktat hariç tüm reaktiflerin bulunduğu üçüncü bir çözelti hazırlayın. Slaytları ve boyama solüsyonunu veya kontrol solüsyonlarını inkübe etmek için aynı anda solüsyona batırın.Ardından, karanlıkta 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir ortamda kuluçkaya yatırın. Boyama çözeltisinin berraktan maviye dönüşümünü izleyin. Numuneler istenen mavilik seviyesine ulaştığında, boyama solüsyonunu çıkararak ve PBS ile durulayarak reaksiyonu durdurun.Daha sonra, slaytlar uygun bir mavilik seviyesine ulaştığında slaytlara bir karşı leke yapın. Nükleer kırmızıya veya yeşile çeviren karşı lekeler, Formosan çökeltici tarafından oluşturulan mavi ile iyi bir kontrast sağlayacaktır. Ardından, kızakları sulu veya susuz montaj ortamı ile monte edin.Kapak kızağının boyutuna bağlı olarak bir ila üç damla montaj ortamı yeterlidir. Ardından, slaytları bir ışık mikroskobu altında görüntüleyin. Deney ve kontrol örneklerinin ve tüm negatif kontrollerin 10X, 20X ve 40X büyütmede fotoğraflarını çekin.Lekelenme çözeltisi ile inkübe edildiğinden, lekelenmenin yoğunluğu zamanla artacaktır. Burada gösterildiği gibi, saç folikülünün tabanındaki saç folikülü kök hücrelerinde yüksek seviyelerde laktat dehidrojenaz aktivitesi gözlenmiştir. Laktat substratını almayan kontrol numuneleri lekelenme göstermedi.Bu bulgular, saç folikülü kök hücreleri için cildin floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırması ve sıralanmış hücreler üzerinde aktivite ile kök hücre bölmesinde yüksek laktat dehidrojenaz aktivitesinin doğrulanması ile doğrulandı. Kıl folikülü kök hücrelerinin yüksek laktat dehidrogenaz aktivitesine sahip olduğu bulgularına dayanarak, kültürlenmiş embriyonik kök hücreler test edildi. Besleyici tabaka olarak görev yapan fare embriyonik fibroblastları, embriyonik kök hücrelerin varlığında veya tek başına analiz edildi.Embriyonik kök hücrelerde, farklı zaman noktalarında gösterildiği gibi fare embriyonik fibroblastı ile karşılaştırıldığında yüksek laktat dehidrojenaz aktivitesi gözlenmiştir. Boyama protokolü yeni izole edilmiş dokuya da uygulandı. Fare aortları diseke edildi.Örnekler, Hank'in %0.5 Triton X içeren dengeli tuz çözeltisi ile 10 dakika inkübe edildi. Daha sonra, laktat dehidrojenaz boyama çözeltisi ile 10 dakika. Buradaki resimler, laktatlı ve laktatsız laktat dehidrojenaz çözeltisini göstermektedir.Bu prosedürü denerken, bozulmamış enzimatik aktiviteye sahip donmuş doku dilimleri kullanmayı unutmamak önemlidir ve donmuş bloklar çok eski olmamalıdır. Hazırlanan bölümler saklanıyorsa, bölümlerin kurumasına izin verilmemelidir. Bu videoyu izledikten sonra, fare derisindeki laktat dehidrojenaz aktivitesini nasıl görselleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

mapping-metabolism-monitoring-lactate-dehydrogenase-activity-directly

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu videoda, laktat dehidrojenaz enzimi kullanılarak hücre lizatlarında laktat ölçümü için bir kolorimetrik test açıklanmaktadır. Bu enzim, NAD'nin tetrazolyum boyalarla reaksiyona giren NADH'ye dönüştürülmesiyle birlikte laktatı piruvata dönüştürür ve laktatı kantitatlamak için spektrofotometrik olarak ölçülebilen renkli bir ürün verir.

Test Numunelerinde Laktat Miktarının Belirlenmesi için Kolorimetrik Test

Bu video, bir test maddesinin sitotoksik etkisini ve bunun insan hassas kesilmiş akciğer dilimlerinde zar bütünlüğü üzerindeki etkisini ölçmek için laktat dehidrojenaz, LDH testini göstermektedir. Tahlil, numunedeki hücre ölümünün veya hasarının kantitatif bir ölçüsünü sağlar.

Laktat Dehidrojenaz Testi ile Akciğer Dilimlerinde Sitotoksisite ve Membran Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Dinamik nükleer polarizasyon ve ardından numune çözünmesi, biyolojik sistemlerde gerçek zamanlı metabolizma çalışmalarını mümkün kılmıştır. Hiperpolarize [1-13C] piruvat, in vitro bir prostat karsinomu hücre hattında laktat dehidrojenaz aktivitesini incelemek için kullanıldı.

hyperpolarized 13 C Metabolik Manyetik Rezonans Spektroskopisi ve Görüntüleme

Burada, mikroskobik görselleştirmek ve dehydrogenases hücre ve dokulara ve onun kinetik, işlev ve hücre altı yerelleştirme etkinliğini ölçmek için kullanılan bir iletişim kuralı mevcut.

Metabolik eşleme: Nicel enzim Cytochemistry ve Histochemistry Dehydrogenases hücre ve dokulara etkinliğini belirlemek için

Memeli hücreleri toplu autophagic tutma etkinliği ölçmek için basit ve iyi doğrulanmış bir iletişim kuralı burada açıklanmıştır. Bu yöntem laktat dehidrogenaz (karaciğer) oranı miktarının toplam hücresel karaciğer düzeylere göre sedimentable hücre kesirler dayanır.

Laktat dehidrogenaz haciz tahlil — Toplu Autophagic haciz etkinliğini memeli hücreleri belirlemek için basit ve güvenilir Yöntem

Burada, mitokondrial oksijen tüketimi, beslenme enerji bilimi ve proton sızıntı, verimsizlik birincil nedeni mitokondriyal ATP nesil belirleyici bir kavram ölçme yöntemleri paylaşmak. Bu sonuçlar besin kullanımı mitokondriyal işlev değerlendirmek yardımcı olmak için kayıp enerjinin % 30 için hesap.

Karaciğer mitokondrial oksijen tüketimi ve Proton sızıntı kinetik Holstein süt sığır mitokondrial solunum tahmin etmek için ölçme

Burada, memeli hücrelerinde moleküler oksijen tüketme yeteneklerinden bağımsız olarak mitokondriyal fonksiyonu doğrudan ölçmek için bir tahlil derlemesi sunuyoruz.

Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

Burada, ex-vivo Drosophila larva beyin preparatında genetik olarak kodlanmış Förster rezonans enerji transferi tabanlı sensörler kullanarak glial hücrelerde ve nöronlarda monokarboksilatların, glikozun ve ATP'nin taşınmasını görselleştirmek için bir protokol sunuyoruz.

Ex vivo Drosophila larva beynindeki monokarboksilatların ve diğer ilgili metabolitlerin genetik olarak kodlanmış sensörler kullanılarak görselleştirilmesi

Burada, kemik iliği, dalak ve enfarktüslü kalpten makrofajların çıkarılması ve ardından canlı hücrelerdeki metabolik akışın değerlendirilmesi için yöntemleri ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Dalak ve Kardiyak Makrofajlarda ve Kemik İliği Monositlerinde Ex Vivo Metabolik Akının Analizi

Bu protokol, canlı hücrelerde gerçek zamanlı piruvat metabolizmasını ölçmek için özel olarak oluşturulmuş bir biyoreaktör sistemini hiperpolarize ¹³C NMR spektroskopisi ile entegre ederek metabolik çalışmalar ve ilaç tarama uygulamaları için tekrarlanabilirliği ve kinetik doğruluğu artırır.

Hiperpolarize 13C NMR kullanarak canlı hücrelerde gerçek zamanlı metabolik tespit

Öğrenin, laktat dehidrogenaz aktivitesini doğrudan doku örneklerinde haritalamak için bu biyokimya yöntemini. Fare derisi ve embriyonik kök hücrelerde NAD(P)H üreten enzimlerin uzamsal dağılımını inceleyerek metabolik süreçleri anlayın.

Eşleme metabolizma: doğrudan dokusunda laktat dehidrogenaz etkinliğini izleme

Daha fazla video keşfet