Name: Direnç Tirozin kinaz inhibitörleri sinyal iletim yollarının antikor dizileri tarafından bir sorgulama tarafından değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Keşfedin antikor dizileri ile hücresel sinyal iletim yollarındaki değişiklikleri belirleme yöntemini. Bu teknik, kanser biyolojisinde ilaç direnci mekanizmalarını anlamak ve kişiselleştirilmiş tedavi stratejileri geliştirmek için kritik fosforilasyon değişikliklerini hızlıca tespit eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Cömert mali destek, Lawrence J. Ellison dönüştürücü Tıp Enstitüsü USC (David Agus hediye) için sana şükrediyoruz. Sonbahar Beemer ve Lisa Flashner kurşun üretimi için destek ve bu el yazması yayınlanması için teşekkür ederiz. Laura Ng onun yönetim destek için teşekkür ederiz.

1. protein çıkarma
<ol><li>5 x 106 hücre 10 mm doku kültürü plaka (veya cep şişesi) doku kültürü mahallede plaka. Bir otomatik hücre sayaç veya hemasitometre ile kaplama zaman içindeki hücreleri saymak. Alternatif olarak, hücre sayısı tahmin ediyoruz.</li>
	<li>10 mm plaka (veya cep şişesi) yetiştirilen hücrelerin durulama iyice 3 x 10 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) ile (pH 7.4 =). Lizis arabellek eklemeden önce tüm PBS kaldırdığınızdan emin olun. Not: Lizis arabellek genellikle kit ile sağlanır. Eğer değilse, daha sonra bir radioimmunoprecipitation tahlil arabellek (RIPA) veya kokteyl fosfataz ve proteaz inhibitörleri içeren herhangi bir diğer hücre lizis arabellek kullanın.</li>
	<li>1 x 107 hücre/mL hücre lizis arabellek arabellek doğru miktarda hücrelere ekleyerek ve hücreleri hücre sıyırıcı lizis arabelleğine kazıma parçalayıcı. (Örneğin, HeLa hücreleri ve MiaPaCa-2, için kullanın 10 cm tabak başına 600 µL).</li>
	<li>Lysate (yaklaşık 10 x) yukarı ve aşağı pipette ve yeni bir 1,5 mL tüp transferi.</li>
	<li>Lysates tercihen bir rocker/shaker üzerinde 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya. Lysate bir şırınga ile 27 G iğneyle cell membrane(s) uygun bir bozulma emin olmak 10 x için tuşuna basın. Alternatif olarak, lysate solüsyon içeren temizleyicide. Lysates-20 ° C'de depolayın veya onları hemen kullanın.</li>
	<li>Lysate 14.000 x g 15dk için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve süpernatant temiz 1.5 mL tüp aktarın.</li>
	<li>Bicinchoninic asit tahlil (BCA)20 veya eşdeğer Lowry veya Bradford gibi toplam protein miktarı quantitate ve en az 50-400 μg ile devam edin. Hemen proteinler veya aliquot kullanın ve donma/onları-70 ° C'de mağaza (birden çok donma-çözülme döngüsü önlemek).</li>
</ol>2. insan fosfokinaz dizi
<ol><li>Tüm reaktifler (yaklaşık 1 h için) başlamadan önce oda sıcaklığına getirmek. Not: Tüm reaktifler ve plastik aşınma kiti dahildir.</li>
	<li>Üreticinin yönergelerini izleyerek yordamına başlamadan önce tüm reaktifler taze (dizi arabellekleri) hazırlamak (hedefler/diziler seçime bağlı olarak, yönergeler biraz farklı olabilir).</li>
	<li>Deiyonize su 100 μL algılama antikor kokteyller yeniden oluşturmak veya 1,5 mL test sağlanan tüp için farklıdırlar üreticinin yönergeleri izleyin.</li>
	<li>1 yıkama arabellek x 25 x 960 mL deiyonize su yıkama arabellekte 40 mL sulandrarak hazırlamak ve onları ters çevirme ile karıştırın. Not: Oda sıcaklığında kristalleri geçiyoruz. Arabellek zamanla sararma ama yine de işe yarayacaktır.</li>
	<li>8-şey çoklu tepsi (veya 4-şey çoklu Tepsi 2 mL) dizi arabelleğe 1 her şey 1 mL pipet.</li>
	<li>Düz uçlu cımbız ile dizi membranlar koruyucu sayfaları arasına kaldırmak ve kuyu koyun. Zar üzerindeki sayılar yukarı bakacak şekilde emin olun. Not: batma, membran üzerine boya yok olacaktır.</li>
	<li>Tepsiyi bir kapak ile kapak ve oda sıcaklığında 60 dk için sallanan bir platform çalkalayıcı üzerinde kuluçkaya. Not: Membran engelleme adım bu.</li>
	<li>Kuluçka döneminde protein örnekleri hazırlayın. 50-100 μg toplam protein ekleyin. Lysate, son Hacim 1 ml lizis arabelleğe ile 334 μL maksimum hacmi olan sulandırmak. Not: 50-100 μg toplam protein genellikle yeterlidir.</li>
	<li>Dizi arabellek 1 dikkatle Aspire edin ve membranlar üzerinde sallanan bir platform shaker 2-8 ° C'de gecede örnekleri 1 mL ile kuluçkaya. Not: touch/zarı çizik değil.</li>
	<li>Ertesi gün, dizi ile 20 mL 1 x yıkama arabellek dikkatle her dizi kaldırma ve bireysel plastik kaplara (yaklaşık 8 x 11 cm2) yerleştirerek yıkayın. Arabellek oda sıcaklığında yıkama x 1 sallanan bir platformda membranlar 3 x 10 dk yıkayın.</li>
	<li>Sulandırılan antikor kokteyl 20 μL pipet 2.3-1 mL 1 x dizi arabellek 2 adım. Bu çözüm 1 mL her 8-kullanılmak üzere şey için ekleyin.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde membranlar yıkama tepsileri çıkarın. Herhangi bir fazla yıkama arabellek kaldırmak ve geri antikor kokteyller içeren tepsi aktarmak için kağıt havlu üzerine alt kenar leke. Tepsiyi kapak ile kapak ve sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya. İyice dH2O ile kullanılan tepsi durulayın ve kuru onları daha sonra kullanım için.</li>
	<li>Dikkatle her dizi kaldırmak ve yeniden 20 mL 1 x yıkama arabelleği ile temiz bireysel plastik kaplar (yaklaşık 8 x 11 cm2) içine koyun. 3 x 10 min yıkama arabellek ile Oda sıcaklığında sallanan bir platformda yıkar.</li>
	<li>Streptavidin-HRP (kit ile sağlanan) veya streptavidin-floresan boya (daha nicel bir algılama için) 1:1,000 dizi arabellekte 15 mL tüp bebek 2 x 1 oranında seyreltin.</li>
	<li>Membranlar HP çözüm içeren 8-iyi yemekleri dönün ve (floresan, kullanarak sararsan tepsiyi herhangi bir ışık maruz önlemek için alüminyum folyo) onları sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Aşırı arabellek membran arasında 2 adet 5 mm 3 M kağıt koyarak kaldırın. Görüntüleme ile bir x-ışını film/chemiluminescent Imager için 3 dk bir HRP algılama çözüm (mix iki chemiluminescent çözümleri 1:1) ile kurutulmuş membranlar kuluçkaya ve membran şeffaf plastik levha koruyucuya yerleştirmek. Not: Kurutulmuş membrane(s) Floresan sinyali bir floresan Imager içinde yerleştirilebilir; membran görüntüleme önce ışık maruz en aza indirmek. Röntgen film ya da Imager dosyaları bir miktar için dozun kaçının. Çoğu chemiluminescent/floresan görüntüleme cihazları bir doygunluk sinyal önlemek için bir işlevi vardır.</li>
</ol>3. veri analizi
<ol><li>ImageJ, bir görüntü işleme programı21, download ve install belgili tanımlık bilgisayar yazılımı.</li>
	<li>ImageJ 'ImageJ simgesi'çift tıklatarak açın. 'Dosya' menü çubuğu tıklatarak analiz edilecek resmi seçin, ardından 'Açık' aþaðý açýlan menüsünden seçin ve faiz görüntüsünü bilgisayar dosyalara gözatmak. Dosyayı açmak için tıklatın.</li>
	<li>Resim analizi (beyaz arka planda siyah bir arka plan üzerinde beyaz lekeler için siyah noktalar) için 'Düzenle' menü çubuğunu tıklatıp 'Ters çevir' aþaðý açýlan menüsünden seçerek tersine çevirin.</li>
	<li>'Oval simgesi' araç çubuğu (ImageJ araç çubuğundaki ikinci seçenek) seçin. Bir daire/oval resmi (siyah cross)'i tıklatarak ve fareyi hareket ettirerek çizin. Boyutu/nokta leke üzerinde nokta çembere daire/oval şeklini ayarlamak.</li>
	<li>Menü çubuğunda 'Analiz et' düğmesini tıklayın ve 'Ölçü' otomatik olarak seçili alanı (alan, ortalama, en az ve en fazla) değerleri ile yeni bir pencere açmak için aþaðý açýlan menüsünden seçin.</li>
	<li>Dairesel alan daire Merkezi (yerine ok sağ orta noktası) sürükleyerek hareket ve sonraki ölçüm (nokta) çevresini yerleştirin. Tüm spot renkleri faiz, pozitif kontrol, negatif kontrol ve arka plan analizi için ölçmek. Not: PBS negatif denetimidir, arka plan membran (herhangi bir parçası yapacak) herhangi bir nokta olmadan bir parçasıdır ve olumlu denetim üreticisi tarafından sağlanan bir denetimdir.</li>
	<li>PBS negatif kontrol noktaları seçin ve her nokta değerinden çıkarın. Ortalama Yoğunluk her yinelenen noktalar her reseptör Tirozin kinaz (RTK) temsil eden bir çifti için. Her ortalama yoğunluğu kat değişikliği hesaplamak için denetimi ile ilgili.</li>
</ol>

<ol><li>Knauer, D. J., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+biological+activity+of+multiplication-stimulating+activity+by+binding+to+its+carrier+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Inhibition of biological activity of multiplication-stimulating activity by binding to its carrier protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (12), 7252-7256 (1980).</li>
<li>Glossmann, H., Presek, P., Eigenbrodt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quercetin+inhibits+tyrosine+phosphorylation+by+the+cyclic+nucleotide-independent%2C+transforming+protein+kinase%2C+pp60src%5BTitle%5D)+AND+%22Naunyn-Schmiedebergs+Archives+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Quercetin inhibits tyrosine phosphorylation by the cyclic nucleotide-independent, transforming protein kinase, pp60src.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 317 (1), 100-102 (1981).</li>
<li>Di Fiore, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+human+EGF+receptor+confers+an+EGF-dependent+transformed+phenotype+to+NIH+3T3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the human EGF receptor confers an EGF-dependent transformed phenotype to NIH 3T3 cells.</a> Cell. 51 (6), 1063-1070 (1987).</li>
<li>Maguire, H. C., Greene, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neu+%28c-erbB-2%29+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">The neu (c-erbB-2) oncogene.</a> Seminars in Oncology. 16 (2), 148-155 (1989).</li>
<li>Busse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+G%281%29+arrest+induced+by+inhibition+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+requires+up-regulation+of+p27%28KIP1%29+independent+of+MAPK+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reversible G(1) arrest induced by inhibition of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase requires up-regulation of p27(KIP1) independent of MAPK activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (10), 6987-6995 (2000).</li>
<li>Kondapaka, B. S., Reddy, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+kinase+inhibitor+as+a+novel+signal+transduction+and+antiproliferative+agent%3A+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Tyrosine kinase inhibitor as a novel signal transduction and antiproliferative agent: prostate cancer.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 117 (1), 53-58 (1996).</li>
<li>Cao, F., Zhang, L., Wang, S., Zhong, D., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BEffectiveness+of+EGFR-TKIs+versus+chemotherapy+as+first-line+treatment+for+advanced+non-small+cell+lung+cancer%3A+a+meta-analysis%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Zhongguo+Fei+Ai+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">[Effectiveness of EGFR-TKIs versus chemotherapy as first-line treatment for advanced non-small cell lung cancer: a meta-analysis].</a> Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 18 (3), 146-154 (2015).</li>
<li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+turning+point+in+cancer+research%3A+sequencing+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A turning point in cancer research: sequencing the human genome.</a> Science. 231 (4742), 1055-1056 (1986).</li>
<li>Barinaga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DoE+provides+funds+for+human+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DoE provides funds for human genome sequencing.</a> Nature. 331 (6152), 103(1988).</li>
<li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).</li>
<li>McCain, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer+genome+atlas%3A+new+weapon+in+old+war%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Healthcare%22%5BJournal%5D)">The cancer genome atlas: new weapon in old war?</a> Biotechnology Healthcare. 3 (2), 46-51 (2006).</li>
<li>Weinstein, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cancer+Genome+Atlas+Pan-Cancer+analysis+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The Cancer Genome Atlas Pan-Cancer analysis project.</a> Nature Genetics. 45 (10), 1113-1120 (2013).</li>
<li>Carlson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+Generation+Sequencing%3A+The+Next+Iteration+of+Personalized+Medicine%3A+Next+generation+sequencing%2C+along+with+expanding+databases+like+The+Cancer+Genome+Atlas%2C+has+the+potential+to+aid+rational+drug+discovery+and+streamline+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Healthcare%22%5BJournal%5D)">Next Generation Sequencing: The Next Iteration of Personalized Medicine: Next generation sequencing, along with expanding databases like The Cancer Genome Atlas, has the potential to aid rational drug discovery and streamline clinical trials.</a> Biotechnology Healthcare. 9 (2), 21-25 (2012).</li>
<li>Huang, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+antibody+arrays%3A+a+promising+tool+to+identify+molecular+targets+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+Chemistry+%26+High+Throughput+Screening%22%5BJournal%5D)">Cytokine antibody arrays: a promising tool to identify molecular targets for drug discovery.</a> Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 6 (8), 769-775 (2003).</li>
<li>Kopf, E., Zharhary, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+arrays--an+emerging+tool+in+cancer+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39 (7-8), 1305-1317 (2007).</li>
<li>Rani, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+changes+in+phosphorylation+of+receptor+tyrosine+kinases%3A+antibody+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of changes in phosphorylation of receptor tyrosine kinases: antibody arrays.</a> Methods in Molecular Biology. 1233, 15-23 (2015).</li>
<li>Kani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JUN-Mediated+Downregulation+of+EGFR+Signaling+Is+Associated+with+Resistance+to+Gefitinib+in+EGFR-mutant+NSCLC+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">JUN-Mediated Downregulation of EGFR Signaling Is Associated with Resistance to Gefitinib in EGFR-mutant NSCLC Cell Lines.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 16 (8), 1645-1657 (2017).</li>
<li>Brivanlou, A. H., Darnell, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+and+the+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Signal transduction and the control of gene expression.</a> Science. 295 (5556), 813-818 (2002).</li>
<li>Rikova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+survey+of+phosphotyrosine+signaling+identifies+oncogenic+kinases+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer.</a> Cell. 131 (6), 1190-1203 (2007).</li>
<li>Chen, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+stage+and+clinical%2Fprognostic+factors+for+colon+and+rectal+cancer+from+SEER+registries%3A+AJCC+and+collaborative+stage+data+collection+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Analysis of stage and clinical/prognostic factors for colon and rectal cancer from SEER registries: AJCC and collaborative stage data collection system.</a> Cancer. 120, Suppl 23. 3793-3806 (2014).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Ward, J. H. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/01621459.1963.10500845">Hierarchical Grouping to Optimize an Objective Function.</a> Journal of the American Statistical Association. 58 (301), 236-244 (1963).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21376230">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Griffin, J., et al. Array-based quantitative, automated analysis of protein glycosylation. Glycobiology. 14 (11), 1205-1206 (2004).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ubiquitin+target+proteins+using+cell-based+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of ubiquitin target proteins using cell-based arrays.</a> Journal of Proteome Research. 6 (11), 4397-4406 (2007).</li>
<li>McGarry, T., Biniecka, M., Veale, D. J., Fearon, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%2C+oxidative+stress+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hypoxia, oxidative stress and inflammation.</a> Free Radical Biology and Medicine. , In Press (2018).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Birçok biyolojik veriler birleştirmek yaklaşımlar yapılan bir deneyde hücresel makine doğal olarak daha doğru ifadeleridir. Fosfo-antikor diziler gelişiyle değişiklikler daha fazla protein var tek değişiklik durumundan daha bilgilendirici olabilir desen hızlı bir karakterizasyonu sağlar. Genel iş akışı Fosfo-antikor diziler uygulanması için bir değişiklik serin, treonin veya Tirozin temel alır. Bu örnek akciğer kanseri tedavi direnci ile ilişkili değişiklikler karakterize üzerinde duruldu. Bu uygulama için ana mantığı pr...

Hedeflenen Tirozin kinaz inhibitörleri (TKI) klinik uygulama hekimler etkili araçlar ile spesifik proteinlerin hedef o sürücü neoplastik dönüşüm sağlayarak kanser tedavisi dönüştürdü. Bu bileşiklerin inhibe veya tarafından Tirozin kinaz1,2hedeflenen protein fosforilasyon engeller. Çünkü genetik değişiklikler içinde çeşitli anahtar genlerin sinyal sürücü kanser başlama ve ilerleme [Örneğin, epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR), proto-oncogene protein Tirozin kinaz Src (SRC), yeterli TKIs kısmen geliştirilmiştir BCR-ABL ve insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2)]3,4. Hücre döngüsü5 ve moleküler sinyal yolları6 TKIs etkisi hedefsiz bir dönüşüm tatlı rehberli kanser tedavisi için temsil eder. TKIs karşı kemoterapi önemli avantajı artan yanıt oranları ve toksisite sağlıklı hücreleri7düşük riski var. Sonuç olarak, orada araştırma ve geliştirme roman TKIs dikkat artmaktadır.
Genomik sıralama sonuçlarına erişim insan genom projesi8,9,10 ile başladı ve bugün çeşitli yeni nesil (NextGen) kanser sıralama çabaları ile [Örneğin, kanser genom devam ediyor Atlas (TCGA)11,12]. Bu genler binlerce üzerinde eş zamanlı bilgi sağlar ve/veya tarafsız anlık görüntülerini genleri veya biyolojik tedirginlikler13tarafından modüle proteinler sağlamak birçok deneysel metodolojileri ilham kaynağı olmuştur. Proteinler ve faaliyetlerini, translasyon modifikasyon için genlerin transkripsiyon üzerinden birden çok düzeyinde hücresel fonksiyon Yönetmeliği oluşur bu yana hücresel fonksiyon kontrol olayları tam bir anlayış olacaktır Sonuçta çeşitli biyolojik veriler veri tümleştirme gerektirir. Bir tek hücreli gen çözünürlük ile gen binlerce mesajcı RNA (mRNA) düzeyde izleme olanağı bir bütün-genom ölçekte gen işlev ve etkileşimleri hakkında çıkarımlar yapma yeteneğini artmıştır. Ancak, gen ifade dizi yorumu her zaman doğal olarak yönetmeliğin diğer düzeyleri Integration eksik olacaktır: Yani, protein ifade düzeyleri, protein değişiklik Birleşik ve protein translasyon değişiklikler (fosforilasyon, ubiquitylation, metilasyon, vb). Burada, antikor diziler yardımcı programını bir tek deneme14,15, çeşitli koşullarda bir fonksiyonu olarak önemli sinyal bileşenlerinden translasyonel modifikasyonlar sorgulamak için araç olarak tarif 16.
Fosfo-antikor diziler ayırt etmek ve sinyal iletim yollarının16değişiklikleri analiz etmek için istihdam edilebilir. Bunlar bir genetik değişiklik veya hücre hatları ile kinaz inhibitörleri, chemotherapeutics, glikoz yoksunluğu, hipoksi veya serum açlık tarafından neden stres tedaviler ortaya çıkabilir. Not, ilaç direnci veya belirli bir gen yukarı veya downregülasyon da değişiklikler sinyal iletim yollarının17' neden olabilir.
İlaç direnci, örneğin, hassasiyeti önlemek için uyuşturucu hedefinin mutasyonlar ortaya çıkabilir. EGFR mutasyon render kanser belirli TKIs ettirilecektir ama diğerleri daha duyarlı akciğer kanseri bilinen. Alternatif yollar sinyal mutasyon17etkinleştirilebilir. Sinyal iletim yollarının direnç ve hipoksi, vbdahil tanımlanması için daha geniş bir uygulama olarak Fosfo-antikor diziler daha fazla içgörü sağlamak ve sonuç olarak anlaşılmasını, mekanizmaları dahil.
Çünkü onlar sık sık bir enzim veya proteinler arasındaki fiziksel etkileşim aktivitesinin oransal gibi düzenleyici bir işlevi, hizmet protein değişiklikleri bir değerlendirmesini izin teknolojileri sistemleri biyoloji önemli bir bileşeni temsil eder. Translasyonel modifikasyonlar önemini rolü neredeyse tüm hücre dışı tetikleyen sinyal iletim yollarının18protein fosforilasyon tarafından gösterilmektedir. Özellikle araştırmacı sadece 1-5 hedefleri ilgi ise geleneksel olarak, kimlik kinaz veya protein fosforilasyon durumunu da Western blot analizi ile tespit edilemedi. Ancak, Batı lekesi çok seçici ve ön bilgi doğru önyargılı ve önemli hedefler sonucunda kaçırabilirsiniz. Antikor array(s) katı bir matris (Örneğin, cam veya nitroselüloz) [pan özgü fosforile tyrosine(s), anti-Ubikuitin, vb] çeşitli yakalama antikorlar gömerek birden çok hedef bir orta-den geçerek okuma sağlar. İkincil antikorlar spesifik proteinlerin bir sandviç tabanlı ELISA biçiminde (Şekil 1) hakkında bilgi vermek. Bu tahlil daha fazla hedefleri ilgi veya ön bilgi sınırlı15gibi daha güçlü ve uygun olur. Fosforilasyon yanı sıra genel hedefleri bir denemede daha çok protein miktarda karşılaştırın ve önemli ölçüde geliştirilmiş bir miktar üzerinde kütle spektrometresi sağlamak gibi Fosfo-diziler daha geniş istihdam vardır. Bu teknik yeni veya önceden bilinmeyen fosforilasyon siteleri tanımlanması için geçerli değildir.
Büyük ölçekli kütle spektrometresi tabanlı proteomik proteinler19belirli fosforilasyon siteleri belirlemek için istihdam olabilir. Her ne kadar bu teknik post-translational olaylar binlerce sıralayabilirsiniz, pahalı araçları, adanmış deneysel boru hatları ve ötesinde çoğu araştırmacı olan sayısal bir uzmanlık gerektirir.
Antikor dizileri çeşitli protein dökümanları16tarihinde bir eşzamanlı okuma sağlar. Bunlar protein ubiquitylation (Ubikuitin dizi) veya fosforilasyon değişiklikler olabilir. Bu önemli hücre parametreleri (protein 53 kDa, p53, reseptör Tirozin kinaz ve hücre içi yollar) ile ilişkili çeşitli biyolojik yollar biyolojik durumunu önemli geri bildirim sağlar bu dizi teknoloji önemli avantajı olduğunu aynı anda. Buna ek olarak, bir tahlil (Örneğin, apoptozis ve ubiquitin ve fosforilasyon) penetrasyonu artırmak için çeşitli dizi türlerini birleştirmek mümkündür. Çeşitli örnekleri çeşitli post-translational değişiklikler aynı anda belirli araçları veya uzmanlık gerektirmeyen bir zaman ve cost effective şekilde değerlendirmek için birden çok dizi birleştirmek için bu durumda önemli bir avantaj yeteneğidir antikor dizileri.

<table><tbody><tr><td>Odysee SA Görüntüleyici</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td></td><td>Floresan Görüntüleyici</td></tr><tr><td>1.5 mL tüp</td><td>Eppendorf</td><td>22363212</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Sıyırıcı</td><td>Falkon (Corning)</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco'nun Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td> <td>Protein ekstraksiyonu için</td> <td>Corning</td><td>21-031-CV</td> yıkama tamponu</tr><tr><td>Doku Kültürü kabı 100 mm</td><td>TRP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>ICC İnsülin şırıngası U100</td><td>Becton Dickinson</td><td>329412</td><td>27 G5 / 8,&nbsp; Protein örneklerinin iğne tedavisi için 1 mL</td></tr><tr><td>Protein Profiler ARRAY&nbsp;</td><td>Ar-Ge D</td><td>ARY003B</td><td>İnsan fosfo MAPK dizisi</td></tr><tr><td>Protein Profiler DİZİSİ&nbsp;</td><td>Ar-Ge D</td><td>ARY002B</td><td>İnsan fosfo kinaz dizisi</td></tr><tr><td>Santrifüj Eppendorf 5430R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Masa üstü santrifüj</td></tr><tr><td>Pierce BCA protein tahlil kiti</td><td>Thermo Fisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMAX M2</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td>Protein ölçümü için absorbans okuyucu</td></tr><tr><td>IRDye 800CW Streptavidin</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>925-32230</td><td>Floresan tespiti için streptavidin konjugatı</td></tr><tr><td>LabGard ES Sınıf II, Tip A2 biyogüvenlik kabini</td><td>NuAire</td><td>NU-425-400</td><td>Doku kültürü başlığı</td></tr><tr><td>TC20 otomatik hücre sayacı</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td>Hücre sayacı</td></tr><tr><td>Halt Proteaz & Fosfataz İnhibitör Kokteyli (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>78446</td><td></td></tr><tr><td>RIPA tamponu</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>F60</td><td>sonikatör</td></tr><tr><td>Sallanan platform çalkalayıcı</td><td>VWR</td><td>10860-780</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH açık kaynak</td><td></td><td>https://imagej.net/Welcome</td></tr><tr><td>SAS Institutie JMP & reg; 12.1.0 (64 bit)</td><td>Microsoft Bilişim Sistemleri</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

direnç tirozin kinaz inhibitörleri sinyal iletim yollarının antikor dizileri tarafından bir sorgulama tarafından değerlendirilmesi

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Kanserli hastalarda anormal bir protein fosforilasyon ağları Yönetmeliği ile sık sık Tirozin kinaz inhibitörleri ile tedavi edilir. Yanıt oranları % 85 yaklaşan yaygındır. Ne yazık ki, hastalar sık sık onların sinyal iletim yollarının değiştirerek tedaviye refrakter hale. İfade ile microarrays profil uygulaması genel olarak mRNA düzeyinde yapılan değişiklikler belirleyebilir ve proteomik protein düzeyleri genel değişiklikleri belirleyebilir veya proteinler yer ama sinyal iletimi etkinliğini belirleyebilirsiniz yollar yalnızca proteinlerin translasyonel modifikasyonlar sorguya tarafından kurulmuş. Sonuç olarak, uyuşturucu tedavisi başarılı olup veya direnç ortaya çıktı olup olmadığını tanımlama yeteneği veya sinyal yolları, herhangi bir değişiklik karakterize yeteneği bir önemli klinik mücadeledir. Burada, sistem genelinde değişiklikler çeşitli post-translational değişiklikleri (Örneğin, fosforilasyon) tanımlayabilirsiniz bir araç olarak antikor diziler ayrıntılı bir açıklama sağlamak. Bir antikor dizileri kullanma avantajları onların Erişilebilirlik (bir dizi proteomik bir uzman ya da pahalı ekipman gerektirmez) da içerir. Dizilerin birleşimi translasyonel modifikasyonlar hedefleme birincil sınırlama olduğunu. Buna ek olarak, antikor diziler en çok karakterize hedefler için idealdir, ancak tarafsız yaklaşımlar (phosphoproteomics) yeni keşif için daha uygun olabilir.

TKI direnci sinyal iletim yollarının hücre hatlarında üzerinde etkisini araştırmak için dört örnekleri analiz edildi. Bir denetimi örneğini (H3255r1) ve 3 TKI dayanıklı hücre hatları (H3255r2-4) (Şekil 2) spot antikor şablonu (Şekil 3) ile ilgili. Bu iletişim kuralını kullanan tüm 4 örnekleri hazırlanmıştır. Altı phosphoproteins fark aktivite ile antikor diziler (Şekil 4) analizini gösteri için seçil...

Burada, bir protokol sinyal yolları çeşitli hücresel modellerinde değişiklikler tanımlamak antikor diziler için mevcut. Uyuşturucu/hipoksi/ultra-violet ışık/radyasyon, veya overexpression/downregülasyon/altını gizleme, neden bu değişiklikleri çeşitli hastalık modelleri için önemlidir ve bir tedavi etkili olacak veya mekanizmaları ilaçların belirleyebilirsiniz olup olmadığını gösterir direnç.

Direnç Tirozin kinaz inhibitörleri sinyal iletim yollarının antikor dizileri tarafından bir sorgulama tarafından değerlendirilmesi

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Bu yöntem, kanser büyümesine veya belirli tedavilere karşı direnç gelişimine neden olabilecek sinyal ağlarındaki tedirginliklerle ilgili anahtar soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, kanserde sıklıkla deregüle olan birden fazla anın fosforilasyon durumu hakkında hızlı ve güvenilir geri bildirim sağlayabilmektir. Bu tekniğin anlamı, değişikliklerin ve çeviri sonrası değişikliklerin tanımlanması sinyal transdüksiyon yolu aktivitesindeki değişiklikleri açıklığa kavuşturabileceğinden, ilaca dirençli kanserlerin tedavisine kadar uzanır.Bu teknik fosforilasyonda kullanılırken, glikozilasyon ve ubiquitylation gibi diğer çeviri sonrası modifikasyonlara bakmak için de kullanılabilir. Son yıkamadan sonra tüm PBS kaldırmak için özen pbs 10 mililitre ile gecede kültürlü hücreleri üç kez iyice durulama ile başlayın. Daha sonra, protein tsay kitinden uygun lysis tampon hacmini ekleyin ve hücreleri ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.Ortaya çıkan hücre çözeltisini, en az bir kez 10 kez yedinci hücrelere 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarmadan önce yaklaşık 10 kez triturate. Hücreleri sallayarak 4 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra lysate'yi 27 kali

assessment-resistance-to-tyrosine-kinase-inhibitors-an-interrogation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

RPPA floresan etiketli antikorlar kullanılarak, aynı anda sorgulanmak üzere nitroselüloz slaytlar basılı örnekleri yüzlerce, protein ekspresyonu sağlar. Bu teknik, şeffaf hücreli böbrek karsinomu olan ilaç tedavisi heterojenliğin etkisini araştırmak için uygulanmıştır.

Bireysel Renal Hücreli Kanserlerde içinde Protein Ekspresyonu Varyasyon kaynakları için Ters Faz Protein Diziler (RPPA) ve Kullanımı

Reseptör tirozin kinazlar, ektopik bir çok kanser olarak ifade edilmiştir ve akut lösemi terapötik hedefler olarak tespit edilmiştir. Bu makale, akut lösemi tedavisinde tirosin kinaz inhibitörlerinin klinik öncesi değerlendirilmesi için etkin bir strateji tarif etmektedir.

Akut lösemi tedavisi için Tirosin Kinaz İnhibitörleri klinik öncesi değerlendirilmesi

Kinaz inhibitörü tedavisi karşı genetik direnç ortaya çıkması etkili kanser tedavisi için önemli bir sorun teşkil etmektedir. Yeni geliştirilen ilacın karşı tanımlanması ve dirençli mutasyonların karakterizasyonu daha iyi klinik yönetim ve yeni nesil ilaç tasarımında yardımcı olur. Burada, in vitro tarama ve dirençli mutasyonların doğrulama için bizim protokol açıklar.

Kinaz İnhibitörleri Karşı Dayanıklı Mutasyonlarının Tarama ve Doğrulama için Bir Yöntem

Peptit dizisi taraması, protein-protein etkileşim bölgelerini tanımlamak için yüksek verimli bir testtir. Bu, bir hedef proteinin çoklu etkileşimlerinin haritalanmasına izin verir ve bir proteini hedef alan inhibitörler için bölgeleri belirlemek için bir yöntem olarak hizmet edebilir. Burada peptit dizilerini taramak ve analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz.

Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi

Klinik başlangıcından önce aşağıdaki ya da - - hedefli tedavilerin ilaç direnci yaygın ve direniş mekanizmaları tanımlamak için ihtiyaç alternatif klinik yönetim stratejileri rehberlik için kritik öneme sahiptir. Burada, bu mekanizmaların keşfini hızlandırmak için sıralama ile in vitro ilaca dirençli hatların çift türetme bir protokol mevcut.

Uygulanması<em&gt; İn Vitro</em&gt; İlaç Direnci Tahliller: Klinik İlgili Direnç Mekanizmaları ortaya çıkararak yönelik Potansiyeli maksimize

Bu kanser yönetimi yüksek karşılanmamış bir tıbbi ihtiyaç olduğu hedeflenen terapötik ajanlar, Edinsel direnç mekanizmaları araştıran bir zaman ve cost effective vitro protokoldür.

Sürücü yolları için seyir elde hedefe yönelik tedavi direnci: ilaca dirençli Subclone üretimi ve duyarlılık Gene Knock-down tarafından geri yükleme

Burada, c-Fos ve Dusp1 genetik ve kimyasal doğrulama uyuşturucu hedef olarak tüp bebek ve içinde vivo genetik ve insanlaşmış fare modelleri kullanarak lösemi için iletişim kuralları açıklar. Bu yöntem, herhangi bir hedef için genetik doğrulama ve terapötik geliştirme için uygulanabilir.

C-Fos rolü ve Dusp1 onkogen bağımlılığı değerlendirme yöntemleri

Bu kağıt akış sitometresi-tabanlı bir tahlil kimyasal inhibitörleri ekran kitaplıklarına inhibitörleri ve T hücre reseptör sinyal etkileyen hedefleri tanımlaması için kullanır. Yöntem tanımlamak burada da yüksek üretilen iş gösterimleri için genişletilebilir.

T-hücre reseptör üzerinden tarama kimyasal inhibitörü kütüphanelerin sinyal arabulucu tanımlaması

Kiaz inhibitörlerinin taranması için kendi kendine biraraya getirilen insan proteinmikrodizilerinin üretimi için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur.

Kendi kendine monte Edilen İnsan Protein Mikrodizilerinde Kiaz Inhibitörü Taraması

Burada bir tümörün genomik yapısına dayalı olarak seçilen hedefe yönelik tedavilerin etkinliğini test etmek için bir protokol sayılacağız. Protokol, yapısal DNA düzenlemelerinin tanımlanması ve doğrulanması, hastaların tümörlerinin farelere engraftasyonu ve ilgili ilaçlara verilen yanıtların test edilmesi olarak tanımlanmaktadır.

Yapısal DNA Alterasyon Analizi ve Hasta Kaynaklı Ksenogreftler Kullanılarak Kanserde Hedefli Tedavilerin Test Edilmesi

Zaman çözümlü Förster rezonans enerji transfer hücresi tabanlı tahlil protokolleri, endojen fosforile sinyal dönüştürücüsünün ve transkripsiyon aktivatörü (STAT) 1/3/4/5/6 proteinlerinin 384 kuyucuklu bir formatta basit, spesifik, hassas ve sağlam bir şekilde ölçülmesi için tanımlanmıştır.

İnsan Hücrelerinde Endojen Fosforile STAT Proteinlerinin Ölçümü için Zaman Çözülmüş Förster Rezonans Enerji Transfer Testleri

Keşfedin antikor dizileri ile hücresel sinyal iletim yollarındaki değişiklikleri belirleme yöntemini. Bu teknik, kanser biyolojisinde ilaç direnci mekanizmalarını anlamak ve kişiselleştirilmiş tedavi stratejileri geliştirmek için kritik fosforilasyon değişikliklerini hızlıca tespit eder.

Direnç Tirozin kinaz inhibitörleri sinyal iletim yollarının antikor dizileri tarafından bir sorgulama tarafından değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal

Direnç Tirozin kinaz inhibitörleri sinyal iletim yollarının antikor dizileri tarafından bir sorgulama tarafından değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet