Küçük moleküllere steril koşullarda bitki yanıt-e doğru değerlendirmek için Hydroponic sistemi esnek bir düşük maliyetli

Basit, çok yönlü ve düşük maliyetli bir in vitro hidroponik sistem başarıyla optimize edildi ve steril koşullar altında büyük ölçekli deneylere olanak sağladı. Bu sistem, moleküler, biyokimyasal ve fizyolojik çalışmalar için kimyasalların çözelti içinde uygulanmasını ve kökler tarafından verimli bir şekilde emilmesini kolaylaştırır. Bu sistemin, ilk gelişim boyunca homojen fideler elde etmenin yanı sıra, arabidopsis thaliana tohumlarını kullanarak kökleri ve sürgünleri ayırmada oldukça verimli olduğunu gösterdik.

Hidroponik sistemi oluşturmak ve bitkileri steril, kontrollü koşullar altında yetiştirmek için aşağıdaki öğeler gereklidir. % 7 etanol,% 10 ağartma çözeltisi, polisorbat 20, vitaminler dahil MS ortamı. MES monohidrat, agar, potasyum hidroksit.

Laminer akış başlığı, sıcak plaka, büyüme odası. Tek kullanımlık plastik kutular, steril cam Petri kapları, yapışkan bant, steril 200 ve 300 mikrolitre pipet uçları, makas, 300 mikrolitre çok kanallı pipet, 200 mikrolitre pipet, neşter bıçağı, cımbız ve 200 mikrolitre pipet ucu rafları. Pipet ucunun düz bir şekilde katı ortamla doldurulacak bir alana sahip olması çok önemlidir.

Otoklavda mini tank olarak kullanılacak kapaksız pipet ucu raflarını 121 derecede 20 dakika sterilize edin. Kontaminasyonu önlemek için, daha önce bahsedilen tüm malzemeler otoklavda sterilize edildi. Bu mümkün olmadığında, tek kullanımlık plastik kutularda olduğu gibi, malzemeler laminer akış başlığına girmeden önce %7 etanol ile temizlendi.

Davlumbaz izin veriyorsa, hidroponik sistemin montajından önce UV ışığı 10 dakika boyunca açılabilir. Pipet ucunun üst yüzeyini yapışkan bantla düz bir şekilde kapatın. Mümkünse 10 dakika UV ışığı altında bekletin.

Ardından, çok kanallı bir pipet kullanarak her bir oyuğa 108 mikrolitre erimiş katı ortam ekleyin. Çok sayıda tank hazırlıyorsanız, MS ortamının katılaşmasını önlemek için bir sıcak plaka kullanın. Ortamın yaklaşık 30 dakika tamamen katılaşmasına izin verin.

Katılaşma döneminde UV ışığı açılabilir. Uç kutusunu tamamen sıvı kültür ortamı ile doldurun. Katı ve sıvı ortamlar arasındaki yakın kompaktlığı garanti edin.

Pipet ucunun üst yüzeyindeki yapışkan bantları düz bir şekilde çıkarın ve dikkatlice rafa yerleştirin. Hidroponik sistem artık sterilize edilmiş tohumları almaya hazırdır. Burada açıklanan sıvı ağartıcı sterilizasyonu, tohumları sterilize etmek için pratik bir yöntemdir.

Yumruk, 500 arabidopsis tohumunu 1.5 ml'lik bir mikro tüpe yerleştirin. Deney için gerekli bitki sayısına göre gerektiği kadar mikro tüp kullanın. Tohumları% 7 etanol ile iki dakika çalkalayarak yıkayın.

Etanolü dikkatlice çıkarın. İki mikrolitre polisorbat 20 deterjan içeren bir ml% 10 ağartma çözeltisi ekleyin. Beş dakika çalkalayın.

Çözeltiyi dikkatlice çıkarın. Son olarak, tohumları sterilize edilmiş damıtılmış su ile tüm çamaşır suyu kalıntıları tamamen çıkana kadar yaklaşık beş kez durulayın. Bu protokol arabidopsis için uygundur, ancak bu sistem diğer bitki türleri için de kullanılabilir.

Bu amaçla, söz konusu sterilizasyon prosedürü tür ihtiyacına göre değiştirilmelidir. Yüzey sterilizasyonundan sonra, tohumlar steril damıtılmış suya daldırıldı ve çimlenmeyi senkronize etmek için beş gün boyunca karanlıkta dört derecede tabakalandırıldı. Steril bir neşter yardımıyla 200 mikrolitre pipet ucunun ekstremitesini hafifçe kesin.

Arabidopsis tohumlarını pipet ucunun üst yüzeyindeki katı kültür ortamına düz bir şekilde pipetleyin. Ortamın düzlükten gevşememesine dikkat edin, aksi takdirde tohumlar gölgelenir ve fideler düzgün büyümez. Yüksek nem ve mikroorganizmalardan arındırılmış ortamı korumak için tek kullanımlık bir plastik kutu içinde mümkün olduğunca çok sayıda mini tank saklayın.

Tek kullanımlık plastik kutuyu yapışkan bant kullanarak kapatın. Hidroponik sistemler artık büyüme odasına girmeye hazırdır. Bu hidroponik sistem başlangıçta, genel olarak büyük ölçekli deneylerde uygulanması çok pahalı olan izotop etiketli bileşikler gibi kimyasalların bitkilere uygulanmasını kolaylaştırmak için geliştirilmiştir.

Kavramın bir kanıtı olarak, özellikle hedef rapamisin protein kinazın ATP bağlanma bölgesini hedef alan ATP rekabetçi inhibitörü AZD8055'yi kullandık. TOR kinaz, hücre çoğalmasını ve büyümesini teşvik etmek için besin algılama ve enerji sinyalizasyonunu entegre eden önemli bir düzenleyicidir. AZD'nin aracılık ettiği TOR inhibisyonunun primer yanıtlarını değerlendirmek için, arabidopsis tohumları 12 saatlik foto periyodu altında istenen gelişim aşamasına kadar hidroponik olarak büyütüldü.

Kontrol olarak iki mikromolar AZD veya% 0.05 DMSO içeren taze besiyeri, gecenin sonunda hidroponik tanklarda değiştirildi. Fideler, işlemden sonra farklı zaman noktalarında hasat edildi, sıvı nitrojen içinde donmuş köklere ve sürgünlere ayrıldı, ince bir toz haline getirildi ve kullanıma kadar eksi 80 derecede saklandı. Ribozomal protein S6 kinaz, RPS6'nın fosforilasyon paterni, TOR yolağının iyi bilinen hedeflerinden biridir.

İmmünoblotlama, köklerde, grafik A'da ve sürgünlerde toplam ve fosforile RPS6 miktarını gösterir, grafik B.ADZ855 varlığında fosforilasyonun baskılanması, hem köklerde hem de sürgünlerde ilaç tedavisinden 30 dakika sonra meydana geldi ve kullanılan deneysel koşullar altında, ADZ'nin kinaz aktivitesini hızla baskılayan güçlü bir TOR inhibitörü olduğunu göstermiştir. TOR geninin veya TOR kompleksinin bileşenlerinin ekspresyonunun azaldığı transgenik arabidopsis hatları, berrak bir nişasta fazlalığı fenotipi sunar. Lugol çözeltisi kullanılarak nişastanın kalitatif analizi, döngü sırasında beklenen nişasta birikimi ve bozunma modelini ortaya koymaktadır.

MSO veya AZD855 uygulaması almayan fideler, gecenin sonunda yapraklarında daha fazla nişasta birikimi göstermedi ve kontrol bitkileri olan MSO'daki nişasta birikimi literatürle tutarlıydı. Ayrıca, AZD ile muamele edilen bitkiler, kontrol fidelerine kıyasla gecenin sonunda daha fazla miktarda nişasta kalmıştır. Bu sonuçlar, önerilen hidroponik sistemin fizyolojik koşulları taklit eden fide yetiştirmede kullanışlılığını göstermektedir.

Nişasta gün boyunca yapraklarda birikir ve metabolik aktiviteleri sürdürmek için gece boyunca yeniden harekete geçirilir. Normal şartlar altında, nişastanın sadece küçük bir kısmı, gün bitiminden sonra toplam miktarın %5 ila %10'u arasında kalır. Bu sonuçlar, TOR baskısı altında gözlenen nişasta fenotipinin tüm döngü boyunca meydana geldiği test edilmiştir.

Hidroponik olarak yetiştirilen bitkiler, şekil 5-A'da gösterilen duyarlı element bağlama faktörü üç, ABF3 genine sahip absisik asidin ekspresyon seviyesi ile ilgili çok benzer iklim koşulları altında bahçecilik substratı yetiştiren fidanlarla karşılaştırıldı. ABF3'ün ekspresyonu, çoklu abiyotik stres tepkilerindeki rolü nedeniyle yaygın olarak bir belirteç olarak bilinen bir hormon sınıfı olan iç ABA seviyeleri ile doğrudan ilişkilidir. Hidroponik olarak yetiştirilen bitkiler, toprakta yetişen bitkilerle karşılaştırıldığında ABF3 ekspresyonunda önemli bir artış gösterse de, ASN1 olan asparagin sentetazın ekspresyon seviyeleri, şekil 5-B'de gösterilen MSO veya AZD işlemlerinden etkilenmemiştir.

Bununla birlikte, trehaloz fosfat sentaz beş, TPS5'in ekspresyonu ve sekiz saatlik TOR baskısından sonra önemli bir artış. ASN1 ve TPS5, sırasıyla düşük ve yüksek şeker seviyelerine yanıt verir, bu da bu bitkilerin genetik streste yaşanmadığını düşündürür. Bitkilerde küçük moleküllerin uygulamasını değerlendirmek için bu sistemi kullanmayı başardık.

Özetle, bu hidroponik sistem birçok avantaja sahiptir, çünkü montajı çok hızlı ve kolaydır ve ana bileşenler ucuz olduğu ve kapsamlı bir şekilde yeniden kullanılabildiği için düşük bir maliyete sahiptir. Ayrıca, bu sistem çok yönlüdür, bitki gelişimi boyunca bozulmamış fidelerin veya ayrımların incelenmesini sağlar ve çok küçük bir alanda çok sayıda bitkinin yetiştirilmesine izin vererek oldukça ölçeklenebilirdir.