Name: Hsp33ın redoks düzenlenir refakatçi etkinlik tanımlama ve Hsp33 konformasyon değişiklikleri hidrojen-döteryum Exchange kütle spektrometresi kullanarak eşleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Öğrenin oksidatif stres altında Hsp33 şaperonunun anti-agregasyon aktivitesini ve konformasyon değişikliklerini HDX-MS kullanarak nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem protein dinamiklerini incelemek için kritik bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar onun yararlı tartışmalar için Meytal Radzinski için müteşekkir ve kritik HDX analiz platformu kurmak onların sınırsız yardım için makale ve Patrick Griffin ve laboratuvar üyeleri için okuma. Yazarlar Almanca-İsrail Vakfı (ı-2332-1149.9/2012), iki uluslu Bilim Vakfı (2015056), Marie-Curie tümleştirme grant (618806), İsrail Bilim Vakfı için minnettar (1765/13 ve 2629/16) ve insan sınır bilim Mali destek programı (CDA00064/2014).

1. tam olarak azaltılmış ve tam okside proteinler hazırlanması
<ol><li>
Tam olarak azaltılmış bir protein hazırlanması Not: Burada, biz bir çinko içeren protein ve Zn dahil, düşük protein durumuna için kullanım ZnCl2 çözüm azalma tarif. ZnCl2 çözüm yerine atılan veya. Not zaman ve sıcaklık azaltma işleminin protein istikrar ve işlev bağlıdır ve böylece başına protein özgüdür.<ol>
<li>Protein örnek buz çözme ve Kaldır toplamları aşağı sıralayacağız. Örnek en az 1,5 saat 37 ° C 5 mM DTT ile ve 20 µM ZnCl2 için kuluçkaya (ilâ protein konsantrasyonu %70). Not: Bu adımda sıcaklığı protein bağımlı ve protein istikrar için ayarlanmalıdır.</li>
		<li>DTT desalting sütunları kullanarak kaldırın. Not: Kullanılabilir sütunlar desalting farklı vardır. İletişim kuralı aşağıdaki yordamı ( Tablo malzemelerigörmek) belirli desalting sütunları kullanarak açıklar. Desalting diğer sütunları kullanmadan önce desalting bazı sütunlar kısmen ilgi protein absorbe beri onların verimliliği DTT kurtarma, kaldırma ve protein inceleyerek öneririz.<ol>
<li>Potasyum fosfat (KPI) arabelleği (40 mM, pH 7.5) ile sütun sütun tamamen arabellek ile doldurma ve arabelleğin dışarı damla icar tarafından equilibrate. Bu tekrarlayın 2 x.</li>
			<li>Beyaz disk filtre sütununda yavaşça cımbız ile iterek ve kaldırma Kaldır; sütun ile KPI tampon dolu iken kaldırmak en kolay yoldur. KPI arabellek sütun doldurma ve 1000 x g 3 dk de santrifüj kapasitesi.</li>
			<li>Sütun temiz bir tüpün içine transfer protein örnek yavaş orta sütun ekleyin ve 1000 x g 2 min için de santrifüj kapasitesi. DTT-Alerjik protein akışı-aracılığıyla artık.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Onun konsantrasyonları kontrol edin (Örneğin, bir UV/Vis Spektrometre kullanın) ve onun absorbans 280 ölçmek nm. Bira'nın hukuk kullanarak protein konsantrasyonu hesaplayın.</li>
		<li>Protein örnekleri yarısı aliquots dağıtmak. (Anaerobik bir odası kullanarakÖrneğin,) anaerobik koşullarda aliquots oksijen tamamen kaldırılması için 20 dk için kuluçkaya. Plastik film ile tüplerin mühür ve örnekleri-20 ° C veya-80 ° C, protein bağlı olarak saklayın. Not: anaerobik odası kullanmak yerine, tüpler de oksijen kaldırmak için argon gazı ile parladı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tam okside protein hazırlanması Not: Bu tam olarak azaltılmış proteinler (daha önce açıklanan) oksitlenmiş protein örnekleri hazırlamak için tavsiye edilir. Bu heterojenlik katıldı durumlarında oksidasyon azaltacaktır. Farklı oksitleyici reaktifler kullanmak mümkündür; burada, hidrojen peroksit (H2O2) üzerinde duruluyor. Dikkat: istenmeyen intramolecular disülfür bağları ve sistein, metiyonin, Tirozin ve diğerleri de dahil olmak üzere farklı amino asitler, geri dönüşü olmayan oksidasyon neden olabilir aşırı oksidasyon önlemek.<ol>
<li>Kalan protein örnek için 5 mM H2O2 (taze seyreltilmiş) ekleyin ve 40 ° C'de 3 h için sallayarak süre kuluçkaya. Not: Bu adımda sıcaklığı protein bağımlı ve protein istikrar için ayarlanmalıdır.</li>
		<li>KPI arabelleği (40 mM, pH 7.5) ile sütun sütun tamamen arabellek ile doldurma ve arabelleğin dışarı damla icar tarafından equilibrate. Bu tekrarlayın 2 x.</li>
		<li>Beyaz disk filtre sütununda yavaşça cımbız ile iterek ve kaldırma Kaldır; sütun ile KPI tampon dolu iken kaldırmak en kolay yoldur.</li>
		<li>KPI arabellek sütun doldurma ve 1000 x g 3 dk de santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Sütun temiz bir tüpün içine aktarmak, oksitlenmiş protein örnek yavaş orta sütun ekleyin ve 1000 x g 2 min için de santrifüj kapasitesi; oksitlenmiş şimdi akış-aracılığıyla proteindir.</li>
		<li>Adım 1.2.5, olduğu gibi protein konsantrasyonları oksitlenmiş proteinler aliquots bölmek ve bunları saklamak-20 ° C veya-80 ° C, protein-bağımlı kontrol edin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ışık toplama tahlil saçılma
Not: Bu tahlil tüm konsantrasyonlarda refakatçi ve substrat özel, vardır ve ayarlanması. Arabellekleri herhangi bir parçacıkların ücretsiz ya da hava kabarcıkları ve temiz ve tozsuz cuvettes son derece önemli olduğu gibi tüm arabellekleri 0,22 µm süzülmüş olması gerekir. Kuvars küvet yerleştirilen bir karıştırıcı kullanmak çok önemlidir. Farklı karıştırıcı boyut ve şekillerde istenmeyen hava kabarcıkları üretmeden karıştırma, verimli bir bütün çözümü sağlamak için kontrol edin. Ayrıca, mevcuttur farklı flouorospectrometers laboratuvarlar ve imkanlar. Burada, belirli bir fluorospectrometer ( Tablo malzemelerigörmek) kullanıldı. Farklı enstrümanlar farklı bir hassasiyet, Ölçüm hızı ve örnekleyici parametreleri vardır. Bu nedenle, kesin ölçüm parametreleri (Örneğin, emisyon ve uyarma bant genişliği, duyarlılık ve diğerleri) bilinen bir toplama eğilimli protein ve onun karşılık gelen koşulları kullanarak optimize edilmelidir. Sitrat sentaz (CS) ve/veya luciferase olarak nanomolar konsantrasyonlarda ilk yüzeylerde kullanılması önerilir.
<ol><li>
Kimyasal toplama tahlil
	<ol>
<li>Kuluçka 12 µM CS 40 mM HEPES (pH 7.5) geceleme denatüre substrat hazırlayın ve 4,5 M GdnCl. PH korumak için 40 mm HEPES (pH 7.5) GdnCl geçiyoruz.</li>
		<li>Fluorospectrometer yazılım açık ve saat ders ölçüm. Parametrelerini ayarlamak: sıcaklık: 25 ° C; Λem: 360; Em bant genişliği: 5 nm; Λex: 360; Bant genişliği Ex: 2.5 nm; ve veri aralığı: 0,5 s.</li>
		<li>Örnek bir kuvars küvet 40 mm HEPES 1.600 µL ekleyerek hazırlayın. Küvet örnek yuvasına takın ve istenilen sıcaklık ulaşmak örnek izin.</li>
		<li>Karıştırma için 600 rpm ayarla ve temel kurulana kadar ölçüm başlar. Tüm ölçüm için karıştırmaya devam et.</li>
		<li>120 bir koruyucuya CS toplama yokluğunda ölçmek için s ölçüm içine ekleyin (yumuşak, ama hızlı bir şekilde) 10 µL denatüre CS (75 son konsantrasyonu nM). Ölçüm için 1.200 devam s.</li>
		<li>Hsp33, huzurunda CS toplama 60 ölçmek için s ölçüm içine eklemek Hsp33 (son konsantrasyonu 300 nM). Sonra ek bir 60 s, denatüre CS 10 µL ekleyin (75 son konsantrasyonu nM). Ölçüm için 1.200 devam s. Not: substrat veya refakatçi, ekleme baloncuklar önlemek için eklerken, 10 µL pipet kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Termal toplama tahlil Not: Sıcaklık termal toplama tahlil için protein istikrarı üzerinde bağlıdır ve her protein bağımsız olarak ayarlanmalıdır.<ol>
<li>Fluorospectrometer yazılım açık ve saat ders ölçüm. Parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: sıcaklık: 43 ° C; Λem: 360; Emisyon bant genişliği: 5 nm; Λex: 360; Uyarma bant genişliği: 2.5 nm; ve veri aralığı: 0,5 s.</li>
		<li>Örnek bir kuvars küvet için önceden ısıtılmış 40 mm HEPES 1.600 µL ekleyerek hazırlayın. Küvet örnek yuvasına takın ve 43 ° C. ulaşmak örnek izin</li>
		<li>Karıştırma için 600 rpm ayarla ve temel kurulana kadar ölçüm başlar. Tüm ölçüm için karıştırmaya devam et.</li>
		<li>120 bir koruyucuya CS toplama yokluğunda ölçmek için s ölçüm içine yavaşça CS ekleyin (son konsantrasyonu 125 nM) ve 1200 ölçme devam s.</li>
		<li>Hsp33, huzurunda CS toplama 60 ölçmek için s ölçüm içine eklemek Hsp33 (son konsantrasyonu 600 nM). Sonra ek bir 60 s, CS eklemek (son konsantrasyonu 125 nM). Ölçüm için 1.200 devam s. Not: substrat veya refakatçi eklerken, kabarcıklar ekleme kaçının.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Veri analizi ve gürültü kaldırma Kfits tarafından Not: Kfits de mevcuttur kullanımı Kfits daha önce Rimon ve ark. içinde tanımlanmıştır 45<ol>
<li>Veri dosyasını karşıya yükle. Not: Işık saçılma ölçüleri metinsel bir virgülle ayrılmış veya sekmeyle ayrılmış biçimde ham sonuçlarından girilir.</li>
		<li>Herhangi bir gürültü kaldırmak için analiz parametrelerini seçin. Kullanım Otomatik en iyi modeli (önerilen), gürültü her zaman sinyaldir bayrak işareti.</li>
		<li>Apaçık aykırı yeşil ve kırmızı ayarlanabilir hatlarını kullanarak el ile kaldırın; Bu adım yeşil hat üstündeki ve altındaki kırmızı çizgi gürültü süzer.</li>
		<li>Taban çizgisi ve uygun eğrisi ayarlayın. Gürültü eşik uygulandıktan sonra işlenen verileri karşıdan yükleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. hidrojen-döteryum Exchange kütle spektrometresi
<ol><li>Arabellekleri ve protein örnekleri (Hsp33 ve Hsp33-CS kompleksi) hazırlanması
	<ol>
<li>Protein örnekleri son konsantrasyonu 1 mg/ml 25 mM Tris-HCl tampon pH 7.5 oranında seyreltin ve 1.5-mL şişe için aktarabilirsiniz.</li>
		<li>1:1.5 43 ° C'de oranında, Hsp33 CS ile kuluçka tarafından karmaşık örnekleri protein-substrat hazırlamak<ol>
<li>CS herhangi bir hızlı toplama önlemek ve Hsp33 ve termal olarak gelişeceğini CS arasında verimli bir bağ emin olmak için step-wise bir şekilde ekleyin.</li>
			<li>En az dört adımları kullanın (yani, her zaman son hacim dörtte eklemek) ve sonra CS koruma Hsp33 ile izin vermek için her ek örnekleri 15dk için kuluçkaya.</li>
		</ol>
</li>
		<li>16.000 x g 4 ° C'de 30-dak Santrifüjü kullanarak herhangi bir toplamları kaldırmak Not: Yeni protein-substrat kompleksleri taze hazırlanmalıdır. Substrat yanı sıra yavaş yavaş yapılmalıdır; Aksi halde, toplama ortaya çıkar. Sıcaklık, substrat ve substrat konsantrasyonu protein özgüdür.</li>
		<li>Bir arabellek deuteration denetimi olarak hizmet veren, H (25 mM Tris-HCl, pH 7.5) ve bir arabellek deuteration arabellek olan D (25 mM Tris-DCl, pH 7,09), hazır olun. Ayrıca taze su verme arabellek (150 mM TCEP, 3 M GdnCl, %0,1 formik asit) hazırlayın. Not: Su verme arabellek için faiz protein pepsin sindirim sonra onun maksimal sıra kapsama almak için optimize edilmelidir.</li>
		<li>Tüm arabellekleri ve örnekleri tüpleri aktarmak ve uygun tepsilerde koyun. Tutun arabellekleri H ve D 25 ° c (tepsi 25 ° C); Öte yandan, örnekleri ve su verme arabellek 0 - 2 ° C (tepsi 0 ° C) basılı tutun. Örnekleri 150-µL cam ekler yer ( Tablo reçetesiilk, görmek) ve o zaman şişe aktarabilirsiniz.</li>
	</ol></li>
	<li>Araç hazırlanması Not: Kütle spektrometre ile iki bilgisayar yazılımı bilgisayar programı ile birlikte gelir: bir pompalar da diğer kütle spektrometre kontrol ( Malzemeler tabloiçin bakınız). Bu iki yazılım programları kullanarak sonraki adımlar açıklanır.<ol>
<li>Tüm soğutma birimleri üzerinde el ile açın. Tüm soğutma sistemleri kendi hedef sıcaklık ulaştığınızda, el ile yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) ve yükleme pompalar üzerinde geçiş. Not: bizim durumda, bunlar iki soğutma banyo ve soğutma bir kutu (hangi tuzak ve analitik sütunlar) oluşur. Diğer 25 ° C'de tepsi süre belgili tanımlık tepsi 0 ° C'de bir soğutma ünitesi soğur; soğutma kutusu sıcaklığı 1-2 ° c.</li>
		<li>Hem pompaları kontrol eden yazılım gibi kütle spektrometre denetleyen yazılım açık; MS beklemekonumuna olduğundan emin olun.</li>
		<li>HPLC çıkış vanası MS kaynağından bağlantısını kesmek ve sistem bir "Çift Kişilik süpürge" Çözüm (%1 formik asit, % 33 Asetonitril, % 33 isopropanol, % 33 metanol) ile ilk, sonra arabellek B ile (% 80 Asetonitril, %0,1 formik asit) yıkama ve son olarak (%0,1 ile tampon Formik asit, pH 2,25) ve sonra sisteme pepsin sütun ekleyin. Arabellekleri değiştirme, devam etmeden önce her iki pompa temizlemek emin olun.</li>
		<li>Her iki pompa için akış hızı 0.1 mL/dk ve basınç stabil emin olun.</li>
		<li>Yıkama sistemi sürekli akış ve sabit basınç ile sonra HPLC çıkış MS kaynak yerleştirin ve MS açın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kütle Spektrometre parametreleri
	<ol>
<li>175 ° c, kılıf gaz akışı 17, aux gaz kızdırma 2 ve sprey voltaj 4.5, peptid iyonlaşma electrospray iyonlaşma (ESI) için ayarla kV (ek Şekil 1).</li>
		<li>Sigara deuterated örnekleri için aşağıdaki gibi parametreleri ayarlayın.<ol>
<li>Küme parametreleri: tarama aralığı m/z 300-1500; Çözünürlük 70.000 için; Otomatik kazanç denetimi hedef (AGC) 106; ve en büyük enjeksiyon zaman (Bu) 100 ms. Not: 5 en yoğun iyonları ile şarj durum + 2 ve + 6 arasında (kendi yoğunluğu 1.3 x 10'dan daha yüksek4) ve 30'u dinamik bir pencere-ecek var olmak izole.</li>
			<li>İyon parçalanma yüksek enerjili collisional ayrılma (PİLGRİM6A) normalleştirilmiş çarpışma enerji (NCE) 28 için eşit ile çoklu-çarpışma hücre yerine getirilir. Tandem MS 10 35.000, AGC hedefinin bir çözünürlükte parçası iyonları saptamak5, en fazla 60 ms ve 2,0 m/z bir yalıtım pencere de.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Deuterated örnekleri için MS1 sadece 140.000 daha yüksek çözünürlüğe sahip ve aksi takdirde benzer parametreler ile istihdam.</li>
	</ol></li>
	<li>Deneme gerçekleştirme
	<ol>
<li>Kasetlerdeki aşağıdaki şekilde ayarlayın.<ol>
<li>Arabellek H ve D yer tepsi 25 ° C, o zaman örnekleri ve su verme arabellek 0 ° C tepsisine yerleştirin.</li>
			<li>Yer X boş şişeleri, her iki tepsilerde hizalı, nerede X = x zaman puan sayısı örnekleri sayısı. Not: 25 ° C tepsisinde boş şişeleri tepki şişeleri hizmet ve içinde belgili tanımlık tepsi 0 ° C, şişeleri Şoklama olarak hizmet vermektedir.</li>
			<li>Boş şişeleri bir boş bardak ekleme içerir; atın ve deneyler arasında adı geçen yuvasını yerine. Not: (ek Şekil 2) en verimli ve en az zaman alıcı şekilde, örnekleri aynı anda çalışmasına izin veren bir yazılım HDX denemeyi çalıştırmak için kullanıldı. Bu yazılımı kullanarak sonraki adımlar açıklanır.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Yazılımını açın. Aşağıdakileri gerçekleştirmek için program parametreleri ayarlayın.<ol>
<li>Her örnek (5 µL) seçili zaman puan bağlı olarak birkaç dakika için arabellek D 45 µL ile kuluçkaya (Örneğin, 1, 3, 18, 40 ve 100 dk) 25 ° C'de Sigara deuterated örnek arabelleği H 45 µL ile bunun yerine kuluçkaya.</li>
			<li>Kuluçka hemen sonra deuterated protein 50 µL buz gibi su verme arabellek 50 µL mix ve onları bir immobilize pepsin sütun (20 mm uzunluğunda, 2.0 mm çapında) içine enjekte.</li>
			<li>Arabellek A 50 oranında 6 dk ile yıkayarak ön sütuna herhangi bir peptidler pepsin sütundan elute µL/dk. tutun arabellek A 0 ° C'de soğutma kutusunda</li>
			<li>Peptidler C18 analitik sütun ön sütuna dışında elute (C18 sütun, 130 Å, 1.7 µm, 2.1 mm x 50 mm 0 ° C'de muhafaza,) veya Asetonitril istimal %100 arabellek B Asetonitril degrade Asetonitril 100 µL/dk. çalışma, doğrusal bir gradyan uygulayarak ayırabilirsiniz : % 2, % 10-30, 30-%90, % 90, 90-%8, 1 dk. için hızlı degrade at 1,5 dk 2.5 min 7 dk. 7 dk ve nihayet 4 dk az %2 için sütun equilibrate.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Çalışan bir sıra oluşturmak (ek Şekil 2bakın): tüm zaman puan, örnek adları ve mekanlar tepsiler yanı sıra arabellek adları ve konumları girin. Not: Yazılımın her farklı çalışan zaman uyum içine çeşitli örnekleri aynı anda, verimli çalışan kez azalan çalışan bir program izin verir.</li>
	</ol></li>
	<li>Veri Analizi Not: Biz Proteom Discoverer ve MaxQuant (özgür yazılım) peptid kimlik ve analiz HDX tezgah, yanı sıra kapsama için de dahil olmak üzere veri analizi sürecinde çeşitli yazılım programları ile çalışma bir proteinlerde döteryum şirketleşme Analizi ve HDX oranları farklı deneyler kümesi arasında bir karşılaştırma sağlayan ücretsiz yazılım. Bu yazılım programlarını kullanarak sonraki adımlar açıklanır.<ol>
<li>Peptid kapsamının örnek yazılım (ek Şekil 3) Sigara deuterated kontrol örnekleri çalıştırarak analiz. Aşağıdaki parametreleri kullanarak yazılımı kurar.<ol>
<li>Bir No-enzim (belirsiz) ile Sequest HT yöntemi kullanın ayırmak. 4-144 amino asit peptidlerin 7 ppm ve 0.5 Da habercisi 's iyon ve parça için toplu bir hoşgörü ile arayın. Dinamik metiyonin oksidasyon için izin.</li>
			<li>Protein, hangi aracılığıyla peptid kapsama yazılımları belirlemek için bir veritabanı oluşturun. Metin biçiminde tanımlanan peptidler verin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>HDX tezgah özgür yazılım58kullanarak deuterated sonuçları çözümleyebilirsiniz.<ol>
<li>Protein Düzenleyicisi'ni açın ve protein protein sırası ve peptid kapsama dosya ekleyerek tanımlayabilirsiniz.</li>
			<li>Ardından, Kur Sihirbazı deneme Düzenleyicisi'ni açın ve istenen tüm girişleri girin. Not: Program örnekleri sayısı, zaman puan sayısı, çoğaltır sayısı, arabellekleri ve sıcaklık pH değerini gerektirir.</li>
			<li>Son olarak, giriş parametreleri sonra algılanan peptidler listesini program oluşturur kullanılan, kütle spektrometre ile ilgili. Not: Yazılımın "HDX" peptidler algılar, izotop kümeleri inceler ve deuteration örneklerde açık bir görselleştirme gösterir.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Veri sunumu
	<ol>
<li>PyMol yazılım veya başka bir görselleştirme yazılımı kullanarak yapısına saygılı deuteration alımını bölgeleriyle etiketleyin.</li>
		<li>Döteryum alımını düzeyleri yerine B faktörü değerleri tanıtmak. Not: Bir temel eğitim https://pymolwiki.org/index.php/Practical_Pymol_for_Beginners bulunabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu yazıda, redoks bağımlı refakatçi etkinlik analizi ve yapısal değişiklikler bir istemci protein bağlama üzerine karakterizasyonu için protokolleri sağladı. Bu potansiyel refakatçi-substrat kompleksleri tanımlamak ve olası etkileşim siteleri çözümlemek için tamamlayıcı yöntemler vardır.
Burada, biz bu protokollerin iyi okudu refakatçi substrat CS ile redoks düzenlenir refakatçi Hsp33 arasında karmaşık bir karakterizasyonu için uygulanır. Biz onların kinetik ve ilk durumda farklı protein topla...

Hücreleri reaktif oksijen türleri (ROS) solunum1,2, protein ve lipit oksidasyon3,4ve ek işlemler5yan üretilen bir birikimi sık karşılaşırsanız, 6,7. ROS yararlı rolü rağmen8,9 ve bağışıklık yanıtı10sinyal cep gibi farklı biyolojik süreçleri, ROS üretim ve onun detoksifikasyon arasında bir dengesizlik, oksidatif için önde gelen ortaya çıkabilir 7stres. Biyolojik ROS, proteinler, lipidler ve nükleik asitler, bunların oksidasyon etkiler onların yapısı ve fonksiyonu hedefleridir. Bu nedenle, hücresel oksidanlar birikimi güçlü patolojiler kanser9,11, iltihap12,13ve yaşlanma14, de dahil olmak üzere çeşitli bir yelpazede bağlı olduğu 15ve başlangıçlı ve nörodejeneratif hastalıklar gibi Alzheimer, Parkinson'ın ilerlemesini ve ALS hastalığı16,17,18dahil olduğu tespit edilmiştir.
Hem yeni sentezlenmiş ve olgun protein oksidasyon protein yapısı ve fonksiyonu19,20şekil onların yan zincirlerinin zararlı olabilecek değişiklikler nedeniyle son derece duyarlıdır. Bu nedenle, oksidatif stres genellikle yaygın protein inactivation, misfolding ve toplama, sonunda hücre ölümüne giden yol açar. Protein oksidasyon olabilecek hasarları ile başa çıkmak için zarif hücresel stratejilerden birini yerine misfolded istemci protein21 ile kararlı kompleksler kurma yaygın protein toplama, inhibe redoks bağımlı chaperones kullanmaktır ,22,23. Bu ilk satır savunma chaperones hızla bunları güçlü anti-toplama molekülleri24dönüştürür bir siteye özgü oksidasyon (genellikle üzerinde sistein kalıntıları) tarafından etkinleştirilir. Oksidatif stres sonuçlar solunum inhibisyonu ve hücresel ATP düzeyleri25düşüşler beri kurallı ATP-bağımlı chaperones oksidatif stres koşulları25,26 sırasında daha az etkili ,27. Bu nedenle, redoks aktif ATP bağımsız chaperones oksidanlar bakteri ve ökaryotlar birikimi üzerine protein homeostazı korumak hayati bir rol oynamaktadır (Örneğin, Hsp3328 ve bakterilerde, Get3 RidA29 30 Maya, peroxiredoxins31 ökaryotlarda içinde). Bu chaperones etkinlik şiddetle hidrofobik bölgeler misfolded istemci proteinler tanıma dahil ortaya çıkaran bir siteye özgü oksidasyon tarafından indüklenen tersine çevrilebilir yapısal konformasyon değişiklikler bağlıdır.
Anti-toplama mekanizması ve istemci proteinler tanınması chaperones tarafından yöneten ilkeleri araştırma refakatçi-substrat etkileşimleri32,33dinamik ve heterogenic yapısı nedeniyle kolay değil, 34,35,36,37. Ancak, stres düzenlenir chaperones anti-toplama işlevi nedeniyle onların yetenek-e doğru bizim anlayışı ilerletmek için bir fırsat var: 1) refakatçi, (oksideÖrneğin,) etkin ve etkin olmayan (Örneğin, iki farklı türde elde giriş veya kolayca (Örneğin, oksidan ve indirgeyici), aralarında 2 geçiş bir stres durumu kaldırılması ile azaltılmış,)) yüzeyler, 3 geniş bir yelpazesi var) tarafından değerlendirilecek istemci proteinler ile son derece kararlı kompleksler oluşturur farklı yapısal metodolojisi ve 4) yalnızca substrat tanıma ve açıklaması, bu chaperones çoğunluğu katlama yeteneği yoksun olarak redoks bağımlı konformasyon değişikliklerden aracılı üzerinde odaklanmak.
Burada, bakteriyel redoks düzenlenir refakatçi Hsp33'ın anti-toplama etkinliği, oksidasyon kaynaklı protein toplama28karşı bakteriyel savunma sisteminin önemli bir bileşeni analiz. Azaltılmış, Hsp33 sıkıca katlanmış bir çinko-bağlayıcı protein hiçbir refakatçi etkinlik ile olur; Ancak, oksidatif strese maruz kaldığında, Hsp33, substrat bağlama bölgeleri38,39maruz kapsamlı konformasyon değişiklikler uğrar. Oksidasyon, C-terminal etki alanı dört son derece korunmuş sistein kalıntıları kuvvetle bağlı çinko iyon yayımlanan40olur. Bu iki disülfür bağları, bir C-terminal etki alanı ve bir istikrarsızlık bitişik bağlayıcı bölge41unfolding oluşumunda sonuçlanır. C-terminal ve bağlayıcı bölgeleri son derece esnektir ve özünde veya kısmen düzensiz olarak tanımlanır. Sigara stres koşulları döndüğünde, katıldı sınırlı olmak ve refakatçi hiçbir anti-toplama etkinlik ile yerel katlanmış durumuna döndürür. Refakatçi refolding daha fazla unfolding için yol açar ve refolding38için kanonik refakatçi sistem, DnaK/J, onun transfer tetikler ilişkili istemci protein destabilization. Onun dolu düzensiz bölgeler hem de hidrofobik bölgeler bağlayıcı ve N-terminal etki alanı yakalamak için Hsp33 kullanan her iki istemci proteinler misfolded ve önlemek onların toplama38, analiz Hsp33'ın etkileşim sitelerin öneriyor 42. katlanmış durumda katlanmış bağlayıcı ve C-terminal etki alanı tarafından bu bölgeler gizlidir. İlginçtir, bağlayıcı bölge "onun bitişik C-terminal etki alanı34katlama durumunu algılama" bir ağ geçidi denetleyicisi Hsp33'ın devletin, katlanmış ve etkin değil hizmet vermektedir. Bir kez mutagenesis (ya bir nokta mutasyon veya tam sırası pertürbasyon) tarafından dengeleri bozdu, Hsp33 bir yapısal etkin refakatçi ne olursa olsun onun redoks duyarlı katıldı43redoks durumunu dönüştürülür.
Burada sunulan iletişim kurallarına izin ver Hsp33'ın redoks bağımlı refakatçi etkinlik, yanı sıra etkinleştirme üzerine eşleme konformasyon değişiklikleri izleme ve istemci proteinlerin bağlama. Bu yöntem diğer refakatçi-müşteri tanıma modelleri yanı sıra refakatçi protein-protein etkileşimleri araştırma için adapte edilebilir. Ayrıca, biz potansiyel rolleri protein oksidasyon protein etkinlikte ortaya çıkarmak için başka redoks-anahtarı proteinlere çalışmalarında kullanılan tam olarak azaltılmış ve okside chaperones hazırlanması için protokolleri mevcut.
Özellikle, refakatçi etkinlik vitro izlemek ve onun substrat özgüllüğü (kimyasal olarak veya termal olarak ışık saçılma (LS) tarafından ölçülen kullanarak indüklenen) protein toplayıcı farklı türleri altında tanımlamak için bir yordam tarif bir fluorospectrometer44. Toplama sırasında hızla artan bulanıklık nedeniyle 360 nm artar, ışık saçılma. Böylece, toplama, bu dalga boyu bir saat-bağımlı şekilde izlenebilir. MU var protein toplama ve böylece bir protein nanomolar konsantrasyonları, protein toplama ile ilgili kinetik parametreleri altında farklı karakterizasyonu etkinleştirme kullanarak ilgi anti-toplama etkinliğini test etmek için hızlı ve hassas bir yöntem koşullar. Ayrıca, burada açıklanan LS Protokolü pahalı araçları gerektirmez ve kolayca herhangi bir laboratuvar olarak kurulabilir.
Yine de, "temiz" Kinetik eğriler elde etmek için ve deneyler, gürültü ve hava kabarcıkları ve büyük toplamları tarafından oluşturulan aykırı çok sayıda nedeniyle saçılma böyle ışık protein kinetik parametrelerin türetmek için oldukça zor. Bu engeli aşmak için biz mevcut bir roman grafik aracı, Kfits45gürültü seviyeleri özellikle protein toplama kinetik verileri için donatılmış farklı kinetik ölçümlerde azaltmak için kullanılan. Bu yazılım ön kinetik parametrelerin sonuçları erken bir değerlendirmesi için sağlar ve kullanıcının veri büyük miktarlarda hızlı bir şekilde kinetik özelliklerini etkilemeden temiz"". Kfits uygulanan Python ve 45açık kaynak mevcuttur.
Alanında zor sorulardan biri etkileşim siteleri chaperones ve onların istemci proteinler arasında eşleme ve nasıl tanımak chaperones misfolded yüzeylerde geniş bir anlama ile ilgilidir. Bu soruyu daha da özünde dahil son derece dinamik protein kompleksleri eğitim chaperones ve toplama eğilimli yüzeylerde düzensiz zaman karmaşık. Neyse ki, yapısal kütle spektrometresi son on yıl içinde önemli ölçüde ilerlemiştir ve başarılı bir şekilde yararlı yaklaşımlar ve yapısal plastisite analiz ve artıkları protein tanıma46, yer alan eşlemek için araçları sağlamıştır 47 , 48 , 49. burada, bir tür tekniği-hidrojen-döteryum Satım kütle spektrometresi (HDX-MS) mevcut-protein ve/veya protein/Ligand bağlayıcı35, üzerine yapısal bir biçimsel kalıntı düzeyinde yapılan değişiklikler eşleme sağlar 50,51,52,53,54,55. HDX-MS tarafından döteryum, hangi oranı kimyasal çevre tarafından erişilebilirlik, etkilenen omurga hidrojen sürekli değişimi kullanır ve kovalent ve Kovalent bağlar56. HDX-MS deuterated solvent, yaygın olarak "ağır su" (D2O) kullanarak bu satım işlemleri izler ve moleküler hidrojen döteryum Exchange'e takip ağırlık değişiklik dayalı ölçüm sağlar. Hidrojen-döteryum değişiminin daha yavaş gore hidrojen hidrojen bağları katılan veya, yerel değişikliklerde sonuçlanırsa yapısı57gösterir sadece, steric engel neden olabilir. Değişiklikleri bir ligand bağlayıcı veya translasyonel modifikasyon üzerine de farklılıklar hidrojen ortamda hidrojen-döteryum exchange (HDX) oranları46,53farklılıkları sonuçlanan bir bağlama ile yol açabilir.
Biz bu teknoloji hızla Hsp33, harekete geçirmek için önde gelen oksidasyon, üzerine açılmak ve 2) tanımlamak Hsp33 olası bağlama arayüzü, tam uzunlukta misfolded substrat, sitrat sentaz (CS)38ile 1) harita Hsp33 bölgelere uygulanır.
Bu el yazması açıklanan yöntemleri proteinler vitroanti-toplama etkinliği ve yapısal değişiklikler rolü (varsa) protein işlevinde tanımlama, redoks-bağımlı işlevler çalışmaya uygulanır. Bu metodolojileri kolayca farklı biyolojik sistemleri için uyarlanmış ve laboratuvar olarak uygulanır.

<table><tbody><tr><td>< güçlü > Kimyasallar, Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Asetonitril HPLC artı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998-2.5L</td><td>çözücü</td></tr><tr><td>Formik asit Optima LC / MS</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A117-50</td><td>çözücü takviyesi</td></tr><tr><td>İzopropil alkol, HPLC sınıfı</td><td>Fisher Chemicals</td><td>P750717</td><td>çözücü</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A456-212</td><td>çözücü</td></tr><tr><td>Tris(hidroksimetil)aminometan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252859</td><td>tamponu</td></tr><tr><td>Trifloroasetik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>76-05-1</td><td>çözücü</td></tr><tr><td>HPLC için su</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270733-2.5L-M</td><td>çözücü</td></tr><tr><td>ZnCl2, Çinko Klorür</td><td>Merck</td><td>B0755416 308</td><td>reaktif</td></tr><tr><td>DTT</td><td>goldbio</td><td>27565-41-9</td><td>indirgeyici ajan</td></tr><tr><td>PD mini tuzak G-25 sütunları GE sağlık</td><td>GE sağlık</td><td>29-9180-07</td><td>tuz giderme sütunu</td></tr><tr><td>Potasyum Fosfat</td><td>Amerika Birleşik Devletleri Biyokimya Şirketi</td><td>20274</td><td>tampon</td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit %30</td> <td>Merck</td><td>K46809910526</td><td>oksitleyici ajan</td></tr><tr><td>sitrat sentaz</td><td>sigma aldrich</td><td>C3260</td><td>substrat</td></tr><tr><td>HEPES asitsiz</td><td>sigma aldrich</td><td>7365-45-9</td><td>tampon</td></tr><tr><td>Gndcl</td><td>sigma aldrich</td><td>G3272-500G</td><td>denatürant</td></tr><tr><td>Döteryum Klorür Çözeltisi</td><td>sigma aldrich</td><td>543047-10G</td><td>tampon</td></tr><tr><td>Döteryum Oksit %99</td> <td>sigma aldrich</td><td>151882-100G</td><td>çözücü</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>bioworld</td><td>42000058-2</td><td>indirgeyici ajan</td></tr><tr><td>150uL Mandrel İç Mekanlı Mikro Uç & Polimer Ayaklar, 29*5mm</td><td>La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5mL Şeffaf Kısa İplik Flakon 9mm Dişli, 11.6*32mm</td><td>La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kuvars küvet</td><td>Hellma 101-QS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jasco FP-8500 Florospektrometre</td><td>Jasco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer Comfort</td><td>Eppendorf</td><td>13058/0</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Megafuge 16R, tezgah üstüSantrifüj</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH metre, PB-11 sartorius</td><td>Sartorius</td><td>13119/0</td><td></td></tr><tr><td>AffiPro İmmobilize Pepsin sütunu (20 mm uzunluk, 2,0 mm çap).</td><td>AffiPro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sular Ön sütun (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 &Aring;, 1.7um, 2.1mmx5mm)</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 analitik kolon (ACQUITY UPLC Peptid BEH c18 Kolon, 130 &Aring;, 1.7um, 2.1mmx50mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vinil Hava kilitli kapılı anaerobik oda</td><td>COY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-exactive-orbitrap kütle spektrometresi</td><td>Thermo-Fischer Bilimsel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAL sistemi LHX - HDX numunelerini işlemek için robotik sistem</td><td>PAL sistemi</td><td>https://www.palsystem.com/index.php?id=840</td><td></td></tr><tr><td>Dionex Ultimate 3000, XRS pompası</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dionex AXP-MS yardımcı pompa</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yazılım, Yazılım Araçları, Veritabanı araması< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kfits: Uygun toplama Verileri</td><td>http://kfits.reichmannlab.com/fitter/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Thermo Scientific Xcalibur yazılımı</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive MS Serisi Ayar Arayüzü (Tune)</td><td>https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chronos yazılımı (Axel Semrau)</td><td>http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteome Discoverer V1.4 yazılımı</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HDX tezgah yazılımı</td><td>http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hsp33'ın redoks düzenlenir refakatçi etkinlik tanımlama ve hsp33 konformasyon değişiklikleri hidrojen-döteryum exchange kütle spektrometresi kullanarak eşleme

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Canlı organizmalar düzenli olarak dalgalanan ortamları ile sıcaklık, pH, reaktif oksijen türleri birikimi, daha fazla ve değişiklikleri de dahil olmak üzere kendi yaşam döngüsü sırasında başa çıkmak gerekir. Bu dalgalanmalar unfolding, bir yaygın protein için toplama, kurşun ve ölüm hücre. Bu nedenle, hücreleri "sağlıklı" Proteom stres koşullarında korumak moleküler chaperones dinamik ve stres özel ağının gelişmiştir. ATP bağımsız chaperones ilk satır savunma molekülleri, bir stres bağlı şekilde protein toplama karşı koruma olarak hizmet moleküler chaperones bir ana sınıfı oluşturur. Bu chaperones ortak olan bir özelliği yeteneğini kendi stres özgü etkinleştirme, tanıma ve misfolded istemci sürümü için yapısal plastisite kullanmak olmasıdır.
Bu yazıda, bir tür özünde düzensiz refakatçi, bakteriyel redoks düzenlenir Hsp33, proteinler oksidatif stres sırasında toplama karşı koruyan fonksiyonel ve yapısal analizi odaklanmak. Burada, kendi faaliyet altında yatan bir araç çeşitli teknikleri redoks düzenlenir refakatçi etkinlik eğitim için hem de refakatçi konformasyon değişiklikleri eşleştirmek için mevcut. Özellikle, biz tam olarak azaltılmış ve tam okside proteinler, ışık saçılım kullanarak, derecesi üzerinde odaklanan refakatçi anti-toplama etkinliği vitro analizine ardından hazırlanması içeren bir iş akışı tarif Anti-toplama etkinliği ve onun kinetik. Sık outliers toplama deneyleri sırasında biriken üstesinden gelmek için Kfits, kinetik ölçümleri kolay işlenmesini sağlayan yeni bir grafik araç kullanımını açıklar. Bu aracı kolayca diğer türleri kinetik ölçümlerin outliers kaldırma ve kinetik parametrelerin montaj için uygulanabilir. Işlev protein yapısı ile ilişkilendirmek için kurulum ve iş akışı bir yapısal kütle spektrometresi tekniği, refakatçi eşleme konformasyon değişikliklerinin sağlayan hidrojen-döteryum Satım kütle spektrometresi, tarif ve Hsp33 faaliyet farklı aşamalarında alt katman. Aynı metodoloji diğer protein-protein ve protein-ligand etkileşimleri için uygulanabilir.

Sunulan iki yöntem kinetik etkinlik ve protein etkileşimleri, substrat arasındaki bir koruyucuya dinamikleri takip olanak sağlar. Ayrıca, oksidasyon azaltma Protokolü redoks bağımlı düzensiz chaperones etkinleştirme mekanizması daha derinlemesine bir anlayış vererek bir tam olarak azaltılmış ve tam okside koruyucuya hazırlanması sağlayan.
İlk olarak, ışık saçılma refakatçi redoks bağımlı etkinliğini incelemek için kullanılır. Iş...

Organizmalar hayatları boyunca karşılaştığınız en zor stres koşulları oksidanlar birikimi içerir. Oksidatif stres sırasında hücreleri moleküler chaperones güveniyorsun. Burada, redoks düzenlenir anti-toplama etkinliği, de araştırmak için refakatçi işlev HDX-MS kullanarak yöneten yapısal değişiklikleri izlemek için kullanılan bir yöntem mevcut.

Hsp33'ın redoks düzenlenir refakatçi etkinlik tanımlama ve Hsp33 konformasyon değişiklikleri hidrojen-döteryum Exchange kütle spektrometresi kullanarak eşleme

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Burada sunulan iş akışı, oksidatif stres koşulları sırasında şaperonların hücresel rolüne ilişkin anlayışımızı genişletmeye yardımcı olabilir. Spesifik olarak, şaperonların açılma koşulları sırasında protein toplanmasını nasıl önlediğini anlamaya yardımcı olabilir. Farklı tekniklerin bu iki arkası için, bayrakla ayrılmış şaperonların faaliyeti hakkında fikir verir.Enzim sosyal etkileşimleri ve protein dinamikleri gibi etkileşim için diğer proteinleri incelemek için de kullanılabilir. Bu yöntemin görsel gösterimi, yeni kullanıcılar için zorlayıcı olabilecek farklı araçların kullanımını içerdiğinden kritik öneme sahiptir. İlk olarak, agregaları çıkarmak için önceden çözülmüş bir protein örneğini döndürün.Daha sonra beş milimolar DTT ve 20 mikromolar çinko klorür ekleyin ve numuneyi 37 santigrat derecede en az 1,5 saat inkübe edin. DTT'yi çıkarmak için, kolonu tamamen tamponla doldurarak ve damlamasına izin vererek, 40 milimolar potasyum fosfat tamponu ile bir tuzdan arındırma kolonunu dengeleyin. Cımbız kullanarak, sütundaki beyaz disk filtresini yavaşça aşağı doğru itin ve çıkarın.Kolonu potasyum fosfat tamponu ile doldurun ve üç dakika boyunca 1000 kez G'de santrifüjleyin. Santrifü

defining-hsp33-s-redox-regulated-chaperone-activity-mapping

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Kaynak: Dahl, J. ve ark. Escherichia coli Chaperone HdeB'nin pH-Bağımlı Aktivitesinin Tespiti In Vitro ve In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)Bu video, asit ve ısı stresi altında bir substrat proteininde çaperon aktivitesini değerlendirmek için floresans spektrofotometre tabanlı bir testi göstermektedir. Işık saçılması yoluyla substratın açılması ve toplanmasının izlenmesi adımlarını, eşlikçi ile ve olmadan koşulları karşılaştırarak açıklar.

Bir Model Proteinin Termal Açılması Yoluyla Bakteriyel Şaperon Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Protein yapı ve dinamikleri protein yapı ve fonksiyon arasındaki ilişkiyi anlamak için anahtardır. Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi ile birlikte hidrojen alış veriş proteinlerin konformasyonel dinamiklerini incelemek ve temas arayüzler ve allosterik etkileri de dahil olmak üzere protein-ligand ve protein-protein etkileşimleri, karakterize için çok yönlü bir yöntemdir.

Hidrojen Değişim Kütle Spektrometre Kullanarak Protein Dinamiği Analizi

Bu çalışma, asidik pH koşulları altında E. coli HdeB bir şaperon aktivitesinin karakterize edilmesi için, biyofiziksel, biyokimyasal ve moleküler teknikler tarif eder. Bu yöntemler, örneğin başarılı bir şekilde HdeA gibi diğer asit koruma şaperonlar için uygulanmış ve diğer şaperonlar ve stres koşullarında çalışmak için modifiye edilebilir.

pH bağımlı aktivitenin tespiti<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; İn Vitro</em&gt; ve<em&gt; İn Vivo</em

Uyumlu esneklik proteini fonksiyonunda önemli bir rol oynamaktadır. Burada, düzenli ve düzensiz protein işlevi sürücü hızlı yapısal değişiklikleri algılama için hidrojen döteryum değişimi bağlanmış zamana bağımlı elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi kullanılmasını tarif eder.

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Burada, üç renkli smFRET veri ve onun analizi ile 3D ensemble gizli Markov modeli elde etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yaklaşım ile bilim adamları Kinetik bilgi cooperativity veya ilişkili etkileşimler de dahil olmak üzere karmaşık protein sistemlerden ayıklayabilirsiniz.

Üç renkli tek molekül FRET Protein etkileşimleri korelasyon çalışma için kullanma

Lanthipeptide sentezleri peptit doğal ürünlerin biyosentezi sırasında katalizör multistep reaksiyonları. Burada, lanteptid sentezlerinin konformasyonel dinamiklerini ve peptit doğal ürün biyosentezinde yer alan diğer benzer enzimleri incelemek için bunların kullanılabileceği sürekli, aşağıdan yukarıya, hidrojen-döteryum değişim kütle spektrometresi (HDX-MS) iş akışını açıklıyoruz.

Peptit Biyosintetik Enzimleri Araştırmak için Hidrojen-Döteryum Değişim Kütle Spektrometresi (HDX-MS) Platformu

Burada, yukarıdan aşağıya kütle spektrometrisi ile birlikte kılcal elektroforez bazlı hidrojen / döteryum değişimi (HDX) yaklaşımı için bir protokol sunulmaktadır. Bu yaklaşım, eşzamanlı diferansiyel HDX ve elektroforetik ayırma gerçekleştirerek, farklı durumlardaki proteinler ve farklı proteoformlar da dahil olmak üzere farklı protein türleri arasındaki yüksek dereceli yapılardaki farkı karakterize eder.

Yukarıdan Aşağıya Kütle Spektrometrisi ile Proteinlerin Konformasyonel Karakterizasyonu için Kapiler Elektroforez Bazlı Hidrojen/Döteryum Değişimi

Bu protokol, GST ile kaynaşmış TPR motifli yardımcı refakatçiler ve Hsp90 türevli peptit ile birleştirilmiş alıcı boncuklar ile glutatyon bağlantılı donör boncuklar kullanarak protein-protein etkileşimlerini yoklama tekniği sunar. Bu tekniği, Hsp90-FKBP51 veya Hsp90-FKBP52 etkileşimlerini bozmak için küçük molekülleri taramak için kullandık ve güçlü ve seçici Hsp90-FKBP51 etkileşim inhibitörlerini belirledik.

Homojen Boncuk Bazlı Test Kullanılarak Chaperone-Cochaperone Etkileşimleri Çalışmaları

Monomerik alfa-sinükleinin yapısal topluluğu fizyolojik fonksiyonunu ve fizikokimyasal özelliklerini etkiler. Mevcut protokol, fizyolojik koşullar altında bu içsel olarak düzensiz proteinin monomeri hakkında konformasyonel bilgileri belirlemek için milisaniye hidrojen / döteryum değişim kütle spektrometrisinin ve müteakip veri analizlerinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır.

Fizyolojik Koşullar Altında Alfa-Sinüklein Yapısal Dinamiğinin İncelenmesi için Milisaniye Hidrojen / Döteryum Değişim Kütle Spektrometresi

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Öğrenin oksidatif stres altında Hsp33 şaperonunun anti-agregasyon aktivitesini ve konformasyon değişikliklerini HDX-MS kullanarak nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem protein dinamiklerini incelemek için kritik bilgiler sunar.

Hsp33ın redoks düzenlenir refakatçi etkinlik tanımlama ve Hsp33 konformasyon değişiklikleri hidrojen-döteryum Exchange kütle spektrometresi kullanarak eşleme (Video) | JoVE Journal

Hsp33'ın redoks düzenlenir refakatçi etkinlik tanımlama ve Hsp33 konformasyon değişiklikleri hidrojen-döteryum Exchange kütle spektrometresi kullanarak eşleme

Daha fazla video keşfet