Hsp33'ın redoks düzenlenir refakatçi etkinlik tanımlama ve Hsp33 konformasyon değişiklikleri hidrojen-döteryum Exchange kütle spektrometresi kullanarak eşleme

Burada sunulan iş akışı, oksidatif stres koşulları sırasında şaperonların hücresel rolüne ilişkin anlayışımızı genişletmeye yardımcı olabilir. Spesifik olarak, şaperonların açılma koşulları sırasında protein toplanmasını nasıl önlediğini anlamaya yardımcı olabilir. Farklı tekniklerin bu iki arkası için, bayrakla ayrılmış şaperonların faaliyeti hakkında fikir verir.

Enzim sosyal etkileşimleri ve protein dinamikleri gibi etkileşim için diğer proteinleri incelemek için de kullanılabilir. Bu yöntemin görsel gösterimi, yeni kullanıcılar için zorlayıcı olabilecek farklı araçların kullanımını içerdiğinden kritik öneme sahiptir. İlk olarak, agregaları çıkarmak için önceden çözülmüş bir protein örneğini döndürün.

Daha sonra beş milimolar DTT ve 20 mikromolar çinko klorür ekleyin ve numuneyi 37 santigrat derecede en az 1,5 saat inkübe edin. DTT'yi çıkarmak için, kolonu tamamen tamponla doldurarak ve damlamasına izin vererek, 40 milimolar potasyum fosfat tamponu ile bir tuzdan arındırma kolonunu dengeleyin. Cımbız kullanarak, sütundaki beyaz disk filtresini yavaşça aşağı doğru itin ve çıkarın.

Kolonu potasyum fosfat tamponu ile doldurun ve üç dakika boyunca 1000 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, kolonu temiz bir tüpe aktarın ve protein örneğini kolonun ortasına yavaşça ekleyin. Sütunu iki dakika boyunca 1000 kez G'de santrifüjleyin, böylece DTT içermeyen protein akışta olur.

Şimdi protein konsantrasyonunu kontrol edin ve emilimini 280 nanometrede ölçün. Protein örneklerinin yarısını alikotlara dağıtın. Oksijenin tamamen uzaklaştırılması için alikotları anaerobik koşullar altında 20 dakika inkübe edin.

Daha sonra tüpleri plastik film ile kapatın ve numuneleri soğuk koşullarda saklayın. Daha sonra, kalan protein örneğine taze hazırlanmış beş milimolar hidrojen peroksit ekleyin ve çalkalarken 40 santigrat derecede üç saat inkübe edin. Santrifüjlemeyi takiben, protein konsantrasyonunu kontrol edin, ardından oksitlenmiş proteinleri alikotlara bölün ve soğuk koşullar altında saklayın.

12 mikromolar sitrat sentazı gece boyunca 40 milimolar HEPES ve 4.5 molar guanidinyum klorür içinde inkübe ederek denatüre substratı hazırlayın. Ertesi gün, florospektrometre yazılımını açın ve zaman seyri ölçümüne gidin. Uyarma bant genişliğini 2,5 nanometre olarak ayarlayın.

Uyarma dalga boyu 360 nanometreye. 360 nanometreye kadar emisyon dalga boyu. Beş nanometreye kadar emisyon bant genişliği.

Ve veri aralığı 0,5 saniyedir. Sıcaklığı 25 santigrat dereceye ayarlayın. Bir kuvars küvete 1600 mikrolitre 40 milimolar HEPES ekleyerek numuneyi hazırlayın.

Küveti, numunenin istenen sıcaklığa ulaşmasını sağlamak için bir florospektrometrenin numune tutucusuna yerleştirin. Karıştırmayı 600 rpm'ye ayarladıktan sonra, taban çizgisi oluşturulana kadar ölçüme başlayın. Bir şaperon yokluğunda sitrat sentaz agregasyonunu ölçmek için, ölçüme 120 saniye içinde 10 mikrolitre denatüre sitrat sentetaz ekleyin.

Ardından ölçüme 1200 saniye devam edin. Hsp33 varlığında sitrat sentaz agregasyonunu ölçmek için, ölçüme 60 saniye Hsp33 ekleyin. 60 saniye daha sonra 10 mikrolitre denatüre sitrat sentetaz ekleyin ve ölçüme 1200 saniye devam edin.

Ardından, Kfits tarafından veri analizi ve gürültü giderme gerçekleştirmek için veri dosyasını yükleyin. Herhangi bir gürültüyü gidermek için analiz parametrelerini seçin, otomatik en iyi modeli kullanın ve gürültü her zaman sinyalin üzerinde olduğunu seçin. Yeşil çizginin üzerindeki ve kırmızı çizginin altındaki gürültüleri filtreleyecek olan yeşil ve kırmızı ayarlanabilir çizgileri kullanarak bariz aykırı değerleri manuel olarak kaldırın.

Bunu takiben, taban çizgisini ve uyum eğrisini ayarlayın. Gürültü eşiğini uyguladıktan sonra, işlenen verileri indirin. 43 santigrat derecede 1 ila 1.5 oranında Hsp33'e sitrat sentetaz ekleyerek protein substrat kompleksi numuneleri hazırlayın.

En az dört adım kullanın ve karmaşık oluşuma izin vermek için her eklemeden sonra numuneleri 43 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Herhangi bir agregayı çıkarmak için numuneleri 16000 kez G'de dört santigrat derecede 30 dakika santrifüjleyin. Daha sonra numuneleri 150 mikrolitrelik cam eklere yerleştirin ve bunları şişelere aktarın.

Ardından uygun tepsilere yerleştirin. H ve D tamponlarını 25 santigrat derecede tutun ve numuneleri ve söndürme tamponunu sıfır ila iki santigrat derece arasında tutun. Ardından, kütle spektrometresinin tüm soğutma ünitelerini manuel olarak açın.

Tüm soğutma sistemleri hedef sıcaklıklarına ulaştığında, hem HPLC'yi hem de yükleme pompalarını manuel olarak açın. Her iki pompayı da kontrol eden yazılımı ve kütle spektrometresini kontrol eden yazılımı açın ve MS'nin bekleme modunda olduğundan emin olun. Bunu takiben, HPLC çıkış vanasını MS kaynağından ayırın.

Sistemi önce üçlü temizleyici solüsyonla yıkayın. Daha sonra B tamponu ile ve son olarak A tamponu ile pepsin kolonunu sisteme yerleştirin. Sistemi sabit bir akış ve sabit basınçla yıkadıktan sonra, HPLC çıkış valfini MS kaynağına takın ve MS'i açın.

Şimdi yazılımı açın. Çalışan bir sıra oluşturun ve tepsilerdeki tüm zaman noktalarını, numune adlarını ve konumlarını, ayrıca arabellek adlarını ve konumlarını girin. Çalışma tamamlandıktan sonra, döteryumsuz kontrol örneklerini yazılım aracılığıyla çalıştırarak numunenin peptit kapsamını analiz edin.

Verileri HDX Workbench yazılımına aktarın ve yazılımı kullanarak sonuçları analiz edin. Seçilen peptitleri kaydedin ve döteryum alımının analizi için daha fazla devam edin. Kimyasal denatürasyon, elverişsiz tampon koşullarında tamamen denatüre edilmiş bir proteinin yeniden katlanmasıyla indüklenen hızlı bir sitrat sentetaz agregasyonuna yol açar.

Öte yandan, termal kaynaklı toplama, doğal olarak katlanmış alt tabakanın nispeten yavaş bir şekilde açılmasından kaynaklanır. Her iki denatürasyon biçiminde, oksitlenmiş Hsp33 ilavesi, agregasyonu tamamen ortadan kaldırarak 360 nanometre okumalarını ihmal edilebilir değerlere düşürdü. İndirgenmiş bir Hsp33'ün varlığının sitrat sentetaz stabilitesi üzerinde hiçbir etkisi yoktu ve bir şaperon yokluğunda tespit edilene benzer bir agregasyon eğrisi verdi.

Bağlı ve bağlanmamış şaperon Hsp33 ile substrat sitrat sentetaz arasındaki döterasyon modeli, şaperonun C-terminal redoks anahtar alanı içinde bir istemci etkileşim bölgesini ortaya çıkarır. İndirgenmiş Hsp33 tamamen düzenli bir yapıya sahiptir ancak oksidatif stresi algıladığında işlevsel hale gelir. İndirgenmiş bağlı ve bağlanmamış Hsp33 benzer peptit eğrileri üretirken, oksitlenmiş Hsp33, bağlı proteinin belirli alanları allosterik bir engeli gösteren bağlı ve bağlanmamış şaperon arasında% 30'luk bir döterasyon farkı gösterir.

Bir kez kurulduktan sonra, saçılma testi birkaç saat içinde tamamlanabilirken, DHEX metodolojisi uygun şekilde yapılırsa iki ila dört gün içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, önceden plan yapmak önemlidir. Sıcaklık, inkübasyon süreleri ve tampon çözeltileri gibi açıklanan koşulların proteine özgü olduğunu ve her protein için optimize edilmesi gerektiğini unutmayın.

Bu prosedürü takiben, şaperon substrat etkileşimlerinin çalışmalarını tamamlamak için çapraz bağlama veya çökeltme gibi diğer metodolojiler gerçekleştirilebilir. Sonuç olarak, bu teknik, yapısal biyoloji alanındaki araştırmacıların moleküler şaperonlarda protein plastisitesini keşfetmelerinin yolunu açmıştır.