In Situ Biyoproseslerde Tek Hücreli Morfolojinin Gerçek Zamanlı Tayini İçin Mikroskopi

Bu yöntem, hücrelerin morfolojik değerlendirmesi ile popülasyon heterojenitesinin temel sorularının yanıtlatına yardımcı olabilir. In situ mikroskopi çalışma yetiştirme koşulları, proses verimleri ve ürün kalitesi sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, örnekleme veya kontaminasyon riski getirmeden gerçek zamanlı veri sağlayan yerinde ölçümdür.

Situ mikroskobu otomatik görüntü tanıma ile birleştiğinde hücresel yapılar hakkında ek bilgi sağlayabilir, şekil, ve boyutu ötesinde hücre aglomerasyonu. Hücre konsantrasyonlarını ölçmek de mümkündür. Yöntem güvenilir bir araç olduğu kanıtlanmıştır.

Hiçbir alternatif yöntem bu kadar kısa sürede aynı bilgiyi ve numune hazırlama için düşük çaba yı sağlar. Bu yöntem çeşitli biyoproseslere ve mikroorganizmalara, SEG ipliksi mantarlara, mikro alerjiye ve mayaya uyarlanmıştır. Sonda bir bilgisayarla birlikte kullanılır.

Donanım, yüksek çözünürlüklü CCD kameraya sahip tek bir çubuk sondadan oluşur. Ayarlanabilir bir ölçüm boşluğundan geçen hücreler kamera tarafından görüntülenir. Işık kameranın karşısındaki boşluğa girer, yani aydınlatma iletimle yapılır.

Beklenen aralığı kapsayan hücre konsantrasyonları kullanarak donanım parametrelerini ayarlayın. Çevrimdışı ölçümler için hazırlıklar yapmaya başlayın. Ölçüm boşluğunu ayarlamak için bir kalınlık ölçer kullanın.

Daha sonra ölçüm boşluğunu beklenen maksimum hücre çapının beş veya 10 katına ayarlamak için probu vida somunu çevirin. Bilgisayarda, sonda denetleyici yazılımını açın. Yazılımda, istenen sondayı seçin ve bölüm eylemlerine gidin.

Ardından Bağlan'a basın. Ardından, Sonda Denetimi sekmesine gidin ve açın. Oynat düğmesine basarak video akışını başlatın.

Sondayı bir tripoda sabitle ve her ölçüm için aşağıdaki adımları gerçekleştirin. Ölçüm boşluğunda prob ve sprey etanol ile çalışın. Optik kağıtla toz veya kiri dikkatlice silin.

Bilgisayarda, sensörün cam Parçacıkları ücretsiz olup olmadığını kontrol etmek için canlı görünümü kullanın. Ardından, odaklama için ölçüm boşluğuna kuru bir optik kağıt yerleştirin. Odak noktasını manuel olarak hareket ettirmek için bağlama vidasını çevirin.

Ölçüm boşluğundaki kağıdın tek lifleri açıkça görüldüğünde net bir şekilde net bir şekilde netlemeyi bırakın. Şimdi, kültür suyuyla dolu bir tüp getir. Mikroskobu et suyuna batırın, böylece boşluk hücre süspansiyonuyla tamamen kaplanır.

Hücrelere odaklanmaya ince ayar yapmak için bağlama vidalarını kullanın. Bu odaklama yapıldıktan sonra, deneme sırasında tekrar değiştirmeyin. Deneme için yazılıma geri dönün.

Tetikleyici menüsüne gidin. Tetikleyici menüsünün altında kare hızını ayarlayın. Çevrimdışı ölçümler için bir hertz önerilir.

Buradan, Tetik Başına Kareler alanına gidin ve iyi istatistikler için gerekli olarak ayarlayın. İşte, yaklaşık 200. Ayrıca, Genel menüye gidin.

Burada, görüntülerin kaydedilen dizinini seçin. Görüntü Edinme başlat düğmesiyle görüntü edinimine başlayın. Ölçü boşluğunda akışı sağlamak için tüpü yavaşça hareket ettirin.

Denemenin ilk çalışmasındaki görüntüleri bir eğitim kümesi olarak kullanın. Açık kaynak yazılım Fiji hazır ve penceresinde deneme görüntüleri bırakın. Bittiğinde, Analiz et, ardından Araçlar'ı ve ardından YG Yöneticisi'ni seçin.

Ardından, bir seçim aracı seçin. Resimde, odak ta bir açıklama yapmak için bir parçacık karar verin. Seçim aracıyla etrafında bir daire çizin.

YG Yöneticisi'ne ek açıklama eklemek için Ekle'ye basın. Ardından, bir fırça aracı seçin ve uygun bir piksel boyutu seçin. Seçimi hassaslaştırmak için fırça aracını kullanın.

Yaklaşık 15 görüntüde tüm ilgi çekici nesneleri aynı şekilde işaretlemeye devam edin. Açıklamalı dosyaları kaydedin ve bunları bir eğitim kümesi olarak kullanın. Tanıma algoritması eğitildiğinde ve hazır olduğunda, sonuçları görselleştirmek için kullanın.

Sonuç Çözümleyicisi'nde Dosya'ya gidin ve ardından Dosyayı Aktarın. Burada, istenen sonuç dosyasını seçin. Grafik Oluştur düğmesine basarak devam edin.

Dağıtım Grafiği'ni seçin. Bu kültürün morfolojik dağılımını gösterecektir. Duyarlılık Çizimi'ni seçmek için Grafik Oluştur'a dönün.

Görüntülenen bilgiler, istenen doğruluğu elde etmek için kaç hücrenin analiz edilmesi gerektiğini belirlemeye yardımcı olabilir. Çevrimdışı ölçümleri tamamladıktan sonra çevrimiçi ölçümler gerçekleştirin. Çevrimiçi ölçümler için, sondayı doğrudan bir biyoreaktöre bağlayın.

Bağlandıktan sonra, düzgün montaj sterilize. Panoda İzleme'yi seçin. Görüntü edinimi başlatmak için bir oynatma düğmesi ve bunu sona erdirmek için bir dur düğmesi vardır.

Oynat düğmesine basın. Biyoreaktörde, kültürün aşılanmasına başlayın. Kamera hücrelerin video yakalayacak ve otomatik olarak analiz için bunları tanımlamak.

İzleme, tüm fermantasyon sırasında farklı hücre morfolojilerinin hücre boyutları ve şekillerinin çevrimiçi verilerini sağlar. Gerçek zamanlı sonuçlar çeşitli şekillerde biçimlendirilebilir ve daha fazla analiz için dışa aktarılabilir. S.Cerevisiae hücre çapının kümülatif dağılımlarının bu çizimi bu teknik kullanılarak analiz edilen verilerden oluşturulmuştur.

Bu otomatik hücre tanıma tomurcuklanma ve tomurcuklanmayan hücreleri ayırt edebiliyoruz gösterir. Katı eğri üç saat bir ekim sırasında dağılımıdır. Noktalı eğri yedi saat aynı ekimi dağılımıdır.

Kesikli eğri, 13 saat içinde toplanan verileri temsil eder. Ek açıklama yordamı zaman alıcıdır, ancak hücre tanımlaması için istenen doğruluğu elde etmek için anahtardır. Bu yordam ile, ölçüm süreleri proses dinamikleri daha kısa ise, gerçek zamanlı ölçüm proses kontrolü için kullanılabilir.

Bu teknik, erken proses geliştirme adımlarından üretim ölçeğine kadar mikrobiyal ekimler için bir proses parametresi olarak popülasyon heterojenitesinin ölçülmesinin önünü açmaktadır.