Situ Ölçüm ve korelasyon hücre yoğunluğu ve kollarındaki bakterilerin ışık emisyon

Bu yöntem, biyolüminesans alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, biyolüminesan bakterilerin maksimum ışık yoğunluğu için en uygun büyüme koşullarını bulmak ve düzenleyici mekanizmayı belirlemek gibi. Bu tekniğin temel avantajı, çeşitli suşlar ve organizmalar için kullanılabilen kolay kurulumun yanı sıra basit ve hızlı ayarlama olanaklarıdır.

Bu yöntemi takip etmek, lux operon özellikleri hakkında fikir verebilir. Bakteriyel, çevresel, raporlama sistemleri veya sensörler gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Başlamak için, 100 mililitre LB ortamını kanamisin ile, gliserol stoğundan lux operon dönüştürülmüş E.coli BL21 hücreleri ile veya doğrudan bir dönüşüm plakasından aşılayarak bir gece kültürü hazırlayın.

Kültürü gece boyunca 37 santigrat derecede ve 120 RPM'de inkübe edin. Ertesi gün, 800 mililitre LB kanamisin ortamını 8 mililitre gece boyunca kültür ile aşılayın. Hücre yoğunluğu 0,6 ila 0,8 arasında bir OD600'e ulaşana kadar kültürü 37 santigrat derecede ve bir inkübatör çalkalayıcıda 120 RPM'de inkübe edin.

Kuluçka sıcaklığını 28 santigrat dereceye düşürün ve 0.1 milimolar IPTG ekleyerek protein ekspresyonunu indükleyin. Ardından hücreleri parlamaya başlayana kadar gözlemleyin. Besiyerini metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, bakteriyel biyolüminesan suşları yapay deniz suyu ortamı agar plakaları üzerine çizin ve gece boyunca 24 ila 30 santigrat derecede inkübe edin.

100 mililitre yapay deniz suyu ortamını plakadan tek bir koloni ile aşılayarak bir gece kültürü hazırlayın. Daha sonra kültürü gece boyunca 24 ila 30 santigrat derece ve 120 RPM'de inkübe edin. Ertesi gün, 800 mililitre yapay deniz suyu ortamını 8 mililitre gece boyunca kültürle aşılayın.

Bakteri hücrelerini 24 ila 30 santigrat derece ve 120 RPM'de inkübe edin ve hücreleri parlamaya başlayana kadar gözlemleyin. İstenen biyolüminesan bakteri suşunu veya modifiye edilmiş E.coli suşunu bir agar plakası üzerine çizin ve kültürü gece boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Gece boyunca plakadan tek bir koloni ile 3 mililitre ortamı aşılayın ve hücreleri 28 santigrat derecede ve 180 RPM'de yaklaşık bir ila iki saat inkübe edin.

650 nanometrede sıvı kültürün bir ila on seyreltmesinin hücre yoğunluğunu ölçün. Ardından, 0.05'lik bir OD650 ile bir mililitre kültür için oranı ve hacmi hesaplayın. Hesaplanan kültür ve ortam hacmini, cam tabanlı 24 kuyulu siyah duvarlı bir plakaya pipetleyin.

Tüm lux operonunu içeren pET28a vektörünün kaybolmamasını sağlamak için ve bu, modifiye edilmiş E.coli suşu ile ifade edilir, numunelere bir mikrolitre kanamisin ve bir mikrolitre IPTG ekleyin. Ardından, ölçümler sırasında buharlaşmayı önlemek için plakaya bir kapak yerleştirin. Son olarak, veri noktaları arasında sallayarak her 10 dakikada bir absorbans ve biyolüminesans ölçümleri almak için 28 santigrat dereceye ayarlanmış bir plaka okuyucu ve metin protokolünde bulunan bir komut dosyası kullanın.

Bu şekil, E.coli BL21 hücrelerinin OD650 ölçümlerini, boş bir pET21a vektörü içeren BL28 hücrelerini ve lux-rib operon eki ile bir pET28a vektörü içeren BL21 hücrelerini karşılaştırır, ancak indüksiyon olmadan. Işık emisyonu için üç referans ölçümün tümü, gecikmeli, üstel ve durağan büyüme fazlarına sahip sigmoidal bir büyüme eğrisi gösterir, ancak T7 promotörünün sızıntısı nedeniyle 300 dakika sonra ışık emisyonu gösteren ikinci numune dışında ışık emisyonu yoktur. Burada, E.coli'de ifade edilen lux operonunun büyüme eğrileri ve ışık yoğunlukları ve biyolüminesan bakteri suşu, fotobakteri mandapamensis 27561, LB veya yapay deniz suyu ortamında 28 santigrat derecede karşılaştırıldı.

Modifiye edilmiş E.coli suşu ve P.mandapamensis, yapay deniz suyu ortamında ve ayrıca LB ortamında büyür ve her ikisi de ışık emisyonu gösterir. Ancak LB ortamında, P.Mandapamensis hiç ışık yaymaz. Dikkat çekici bir şekilde, modifiye edilmiş E.coli suşu, biyolüminesan bakterilerden daha yüksek bir maksimum ışık yoğunluğu gösterir.

Bu deneyde, E.coli bazlı lux-rib operonunun gen ekspresyonu, uzun ömürlülüğünü analiz etmek için 24 saat boyunca ölçüldü. Işık yayılımı, kademeli bir azalmanın gözlendiği bakteri suşlarından çok daha uzun süre 19 buçuk saat sürdü ve 10 saat sonra çok düşük ışık emisyonu ile sonuçlandı. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, biyolüminesans alanındaki araştırmacıların, E.Coli gibi model organizmalardaki lux operonlarını keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, biyolüminesan bakterilerle nasıl çalışılacağını iyi anlamış olmalısınız.