Name: İnsan yağı için bir Microphysiologic Platform: beyaz yağ dokusu sandviç (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Keşfedin beyaz yağ dokusunu sekiz hafta boyunca canlı tutan mikrofizyolojik platformu. Bu yöntem, adipoz biyolojisi ve farmakolojik araştırmalar için güvenilir bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar LSU Sağlık Bilimleri proje finanse Merkezi tarafından sağlanan kurumsal destek kabul etmek istiyorum.

Tüm görevler uyum içinde #8759 ve #9189, iletişim kuralları için gerçekleştirilen IRB Office LSUHSC-NO. tarafından onaylanmış Uyum içinde iletişim kuralı # LSUHSC-No IACUC ofiste tarafından onaylanmış 3285 için gerçekleştirilmiş tüm hayvan işleri
1. hücre sayfaları sandviç tohum
Not: Bkz. Şekil 1.
<ol><li>Tohum ADSCs, yaklaşık % 80'i confluency doku kültürü tabak (6 cm veya 6-şey tabak) içinde. 1 geleneksel doku kültürü iyi ve 1 kuyusu doku kültürü poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm) kaplı plastik plaka üzerinde karşılık gelen boyut SWAT istenen her şey için tohum. Not: Buna göre bir 6-şey tabak SWAT hücreleri bir 6-şey standart doku kültürü plaka (temel katman) ve bir doku kültürü 6-şey pNIPAAm kaplı levha (üst katman) tohum gerektirir. pNIPAAm kaplamalı plakalar ticari olarak satın alınabilir veya laboratuvar12,13,14üretilen.</li>
	<li>37 ° C ve % 5 CO2 içinde Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (10 ile desteklenmiş DMEM) ADSCs korumak % FBS ve 1 x penisilin/streptomisin. Medya 2 günde değiştirin.</li>
	<li>Onlar % 100 birleşmesi olmak ve bir çizgili desen (yaklaşık 6-8 gün) almak kadar birleşim hücrelere izin. Not: Bu hücreler batmaz yağ dokusu stabilize etmek için bir tek sağlam hücre sayfası çalışması gerekir. Yeterince konfluent hücreleri WAT ile tohum üzerine parçası.</li>
</ol>2. SWAT malzemeleri hazırlanması
<ol><li>Birkaç 10 mL aliquots, 1 x Hank'in dengeli tuz çözüm (HBSS) hazırlamak; yedek birim ile plakalar için istediğiniz sayıyı yetecek hazırlayın.</li>
	<li>
Dalgıç aparatı SWAT tohum için hazırlayın. Yuvarlak bir diske bağlı bir kök oluşur, basit akrilik plastikler kullanarak pistonu oluşturmak. Doku kültürü wells çevresi içinde sığdığından emin olun (çapı: < için 6 cm çanak, 6 cm < 6-şey plaka için 3,5 cm; yaklaşık kitle: 6 cm yemek, bir 6-şey plaka için 5,1 g için 6,7 g).
	<ol>
<li>Yordamı sorunsuz durumda herhangi bir bireysel pistonu ile ilgili bir sorun çalışır emin olmak için ekstra itici hazırlayın.</li>
		<li>Laboratuvar bant dalgıç diskin kenarında etrafında sarın jelatin çözüm kaçağı önlemek için en az 2 x.</li>
		<li>Biyogüvenlik kabini (BSC) % 70 ile sprey alkol. 15 mL konik tüp raf BSC boş, kapağını 15 mL konik tüpler içinde aşağı sprey; tüpler jelatin itici yerleşimini güvenli yardımcı olacaktır.</li>
		<li>Her bant sarılmış dalgıç iyice %70 alkol ve yer ile raf bir 15 mL konik tüp içine sprey. Metal rondelalar (yaklaşık kitle 6.3 g) sprey ve bir çift çengel forseps ile birlikte rafta koyun; contalar ağırlık-ecek eklemek için itici SWAT tohum sırasında.</li>
		<li>BSC kanat ve UV kurutma ve sterilizasyon kolaylaştırmak ışık. Not: İdeal olarak, bu adım SWAT tohum önce 24 h kuralları. Alternatif olarak, işlem doku toplama/SWAT tohum günde yapmak; Ancak, bu durumda, 15-45 dk UV kurutma/sterilizasyon için izin verir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. jelatin itici hazırlanması — üst hücre sayfalara uygulama
<ol><li>Bir su banyosu ile 75 ° c ısı</li>
	<li>
Jelatin çözüm 1 x HBSS 10 mL hisse senedi için 0.75 g jelatin tozu ekleyerek hazırlayın. Bir duman başlık altında çözüm pH dengelemek için 1 M NaOH 100 µL ekleyin.
	<ol>
<li>10 mL hisse senetleri için su banyosu ekleyin ve çözüm toz eriyene kadar şiddetle her 5 dk sallamak. Yakında sıcak su banyosu ekledikten sonra toz jelatin boşanmak hedefliyoruz.</li>
		<li>BSC üfleyici açmak, UV ışığı söndür ve kanat yükseltmek. BSC yüzey sprey ve filtre malzemeleri (5 mL radarı-kilit şırınga ve 0.2 µm şırınga filtreler) hazırlamak. Verimli bir şekilde jelatin itici için uygulamak için yeterli miktarda zorlanma için birden çok filtre hazır olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jelatin çözüm homojen bir tutarlılık ulaştığında, çözüm filtre ve itici için uygulayın. Jelatin şırınga yükleyin. Jelatin şırınga filtresi (~2.5 mL 6-şey tabağı, 6 cm yemek için ~4.5 mL) ile plastik itici uygulayın ve (~ 20 dk) kuvvetlendirmek için izin.</li>
	<li>Jelatin katı olduğunda, itici kenarından teyp paketini açmak. Çengel forseps ile jelatin pistonu dış kenarından kaldırmak (Yani, menisküs yükseltilmiş kenarlarını). Pistonu merkezinde kalan jelatin tamamen düzeyde olduğundan emin olun iletişim ADSC levha ile en üst düzeye çıkarmak için.</li>
	<li>Yavaşça bir kez aşırı jelatin kaldırılır, jelatin itici pNIPAAm kaplı ADSC plakaları için geçerlidir. Metal rondelalar pistonu tartmak için kullanın. Hücre sayfaları itici uygulanırken kesme değil.</li>
	<li>
Oda sıcaklığında 1,5 saat için hücre sayfalardaki itici bırakın. Plakalar/itici ayrılma pNIPAAm kaplı plaka yüzeyinden hücre sayfasının tamamlamak 1,5 saat için bir buzlu su banyosunda kuluçkaya.
	<ol>
<li>Buz banyosunda kuluçka sırasında dikkatli olun; Kuluçka sırasında hücre medya kirletmek buz banyosu izin vermez.</li>
		<li>Kuluçka tamamladıktan sonra alt non-steril su kaldırmak için pNIPAAm kaplı plakaların temiz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. beyaz yağ doku işleme
<ol><li>İnsan yağ dokusu işletim odasından toplarken, tüm örnekleri buza SWAT seribaşı kadar olan steril bir kap içinde tutun. Steril bakım medya, fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS), gibi doku istikrar için yağ dokusu kapsayıcı ekleyin.</li>
	<li>1.5 mL microcentrifuge tüpler olmak her şey/yemek için soğuk hücre kültür ortamına seribaşı (6-şey plaka için 100 µL, 6 cm yemek için 200 µL) ekleyin.</li>
	<li>
Yağ dokusu kıyma.
	<ol>
<li>Katı yağ dokusu kesimine yönelik aşağıdaki gibi yapın.<ol>
<li>Yağ dokusu 3 büyük parçalarını yıkayın steril PBS x ve mümkün olduğu kadar PBS kaldırın.</li>
			<li>Kaba doku forseps ve steril ustura ile kıyma ve çok damarlara ve fasya mümkün olduğunca kaldırın (daha fazla ayrıntı için konuya bakın).</li>
			<li>İnce kadar kıyılmış doku üzerinde kalın, sıvı tutarlılık alır ustura ile yağlı kıyma. Not: Bu her zaman mümkün olmasa da ideal doku WAT görünür hiçbir bireysel parçaları ile homojen görünür.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lipoaspirate aşağıdaki gibi işlem.<ol>
<li>BSC altında bir ölçek üst üzerinde steril gazlı bez bant ve bu kabı herhangi bir aşırı sıvı toplamak için daha büyük bir ölçek içinde yer.</li>
			<li>25 mL serolojik pipet kullanarak, fazla lipoaspirate gerektiği gibi çizmek ve steril gazlı bez yüzey için geçerlidir. PBS doğrudan bu yüzey için lipoaspirated yağ yıkamayı ve aşırı kan ve lipid kalıntı kaldırmak için geçerlidir.</li>
			<li>Forseps süzülmüş doku kurtarmak, steril bir kıyma yüzeye aktarmak ve lipoaspirate bin dereden su getirmek için kullanın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Steril bir ustura p1000 pipet ipuçları kıyılmış doku aktarmak için distal ucunu kesmek için kullanın; Bu adipocyte lizis yol açabilir kesme stres en aza indirmek olacaktır. Uygun doku tutarlılık ulaşıldığında kıyılmış doku istenen hacmi her 1,5 mL tüp (300-400 µL 6-şey plaka için 500-600 µL 6 cm yemek için) aktarın. Kıyılmış WAT ve tüpler medyada kısaca karıştırın.</li>
	<li>
Taban ADSC plakaları almak ve medya dikkatle boşaltmak/Aspire edin. WAT/medya karışımı her 1,5 mL tüp ile ortamı değiştirin.
	<ol>
<li>Yavaşça jelatin itici pNIPAAm kaplı plakalar kaldır ve WAT karışıma taban ADSC plakaları üzerinde uygulayabilirsiniz. Hücresel dekolmanı onaylamak için bir mikroskop altında pNIPAAm kaplı plakaların monolayer inceleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yaklaşık olarak 37-40 ° c lisans altında bir ısı blok ayarlayın. Hala yerinde itici ile tabakalar ısı bloğunun yüzeye hareket. 2-3 mL ılık kültür hücreleri kuluçkaya ve jelatin erime kolaylaştırmak için medya ekleyin.</li>
	<li>~ 30 dakika sonra plaka yüzeyinden itici yavaşça çıkarın. Temel doku kültürü tabak kapakları yerine ve bir hücre kültür kuluçka taşıyın. Jelatin tamamen 37 ° C'de sıvılaşmış, Aspire edin ve hücre kültür ortamı değiştirin.</li>
	<li>Fenol red-Alerjik M199 orta 7 µM insülin, 30 µM deksametazon, 1 x 37 ° C ve % 5 CO2 ' de SWAT korumak penisilin/streptomisin. Ortamda yaklaşık 2 mL 6-şey plakaları için ve 3 mL 6 cm yemekler için korumak. Medya 2 günde değiştirin.</li>
</ol>5. SWAT hasat
<ol><li>Collagenase (0,5 mg/mL collagenase, 500 nM Adenozin, PBS) hazırlamak aliquots 15 mL konik tüpler (yaklaşık hacmi 10 mL). Tüpler donma ve onları-20 ° C'de depolayın</li>
	<li>Herhangi bir kültür ortamından hücreleri Aspire edin, 1 x PBS ile yıkayın ve PBS Aspire edin. Collagenase aliquots bir 37 ° C su banyosunda çözdürme tarafından hazırlayın. Not: İdeal olarak, 37 ° C collagenase çözüm ulaşacak; hemen sonra doku ekleyin.</li>
	<li>
Tüm doku SWAT plaka için bireysel aliquots ekleyin. Bir steril hücre kavgacı tip kullanarak SWAT hasat ve collagenase aliquots kesme p1000 pipet ucu ile aktarmak. Doku collagenase solüsyon içeren doğrudan 15 mL konik tüpler için ekleyin.
	<ol>
<li>Alternatif olarak, bir 50 mL konik tüp doku/collagenase karışımı kuluçkaya; artan yüzey alanı daha fazla enzimatik sindirim kolaylaştıracaktır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Örnek tüpler bir inkübe orbital çalkalayıcı 45 ° açıyla yerleştirin. 30-60 dk 37 ° C'de 200 devirde kuluçkaya.</li>
	<li>Yer 250 µm koleksiyonu için yeni 15 mL konik tüp içine filtre kafes. Filtre sindirilmiş adipocyte solüsyonu dökün. Not: Bu tüm hücreleri fibröz doku filtreleme süre geçmesine izin verir.</li>
	<li>Faz ayrılması için izin vermek için oda sıcaklığında 5 min için oturmak akışı aracılığıyla izin. Not: yağ stromal hücreler (ASCs) alt aşamalar halinde razı olacak iken adiposit çözüm dön yüzer olacak. Santrifüjü 500 x g de 5 min için Ayrıca hücre ayırma veya ADSCs Pelet çevreleyen hasat maksimize edebilirsiniz.</li>
	<li>
Bir kesme p1000 pipet ucu kullanarak, adipositler (collagenase çözüm üst yüzen tabaka) 1.5 mL microcentrifuge toplama tüp aktarın. Yavaş yavaş adiposit toplamak için tüp kenarı boyunca pipet ~ 250 µL teker teker alarak.
	<ol>
<li>Tüpü yavaşça içeriye doğru kalarak hücre kurtarma maksimize etmek için adiposit toplarken döndürün. 1.5 mL microcentrifuge tüp dolu olduğu kadar daha fazla hücre çizim tutmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aşırı sıvı bir iğne (~ 21 G) bağlı bir Ģırınga kullanarak izole adiposit kaldırın. İğneyi yüzen adipocyte tabaka altında daldırın. Kısa bir süre için iğne mili kalarak hücreler çıkarmak için iğne kışkırtmak ve sonra dön yüzer yerinden çıkar adiposit bekleyin.</li>
	<li>Yavaş yavaş adiposit istenmeyen kaldırılmasını önlemek için dikkatli olmak aşırı sıvı çizin. Microcentrifuge tüp mezuniyet sürekli örnek birimleri belirlemek için kullanın (Örneğin,. 0.1 mL her örnek için).</li>
	<li>İzole hücre DNA/RNA ayıklama, Glikoz alımı tahlil, lipoliz tahlil, vb için kullanın
</li>
</ol>

<ol><li>Cawley, J., Meyerhoefer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+medical+costs+of+obesity%3A+An+instrumental+variables+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Health+Economics%22%5BJournal%5D)">The medical costs of obesity: An instrumental variables approach.</a> Journal of Health Economics. 31 (1), 219-230 (2012).</li>
<li>Pi-Sunyer, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Medical+Risks+of+Obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Postgraduate+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Medical Risks of Obesity.</a> Postgraduate Medicine. 121 (6), 21-33 (2009).</li>
<li>Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+studies+of+human+subcutaneous+adipose+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Morphologic studies of human subcutaneous adipose tissue in vitro.</a> Anatomical Record. 169 (1), 97-104 (1971).</li>
<li>Sugihara, H., Yonemitsu, N., Miyabara, S., Yun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cultures+of+unilocular+fat+cells%3A+characteristics+of+growth+in+vitro+and+changes+in+differentiation+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Primary cultures of unilocular fat cells: characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties.</a> Differentiation. 31 (1), 42-49 (1986).</li>
<li>Sugihara, H., Yonemitsu, N., Toda, S., Miyabara, S., Funatsumaru, S., Matsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilocular+fat+cells+in+three-dimensional+collagen+gel+matrix+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Unilocular fat cells in three-dimensional collagen gel matrix culture.</a> The Journal of Lipid Research. 29, 691-697 (1988).</li>
<li>Hazen, S. A., Rowe, W. A., Lynch, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+cell+culture+of+freshly+isolated+adipocytes+using+extracellular+basement+membrane+components%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Monolayer cell culture of freshly isolated adipocytes using extracellular basement membrane components.</a> The Journal of Lipid Research. 36, 868-875 (1995).</li>
<li>Fried, S. K., Kral, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+regional+distribution+of+fat+cell+size+and+lipoprotein+lipase+activity+in+morbidly+obese+patients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Obesity%22%5BJournal%5D)">Sex differences in regional distribution of fat cell size and lipoprotein lipase activity in morbidly obese patients.</a> International Journal of Obesity. 11 (2), 129-140 (1987).</li>
<li>Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+National+Institutes+of+Health.+Microphysiological+Systems+Program+focuses+on+a+critical+challenge+in+the+drug+discovery+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">The National Institutes of Health. Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline.</a> Stem Cell Research and Therapy. 4, (2013).</li>
<li>Wikswo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+and+potential+roles+of+microphysiological+systems+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1061-1072 (2014).</li>
<li>National Institutes of Health. NIH-CASIS Coordinated Microphysiological Systems Program for Translational Research in Space (#RFA-TR-18-001). , Available from:
 <a target="_blank" href="https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html">https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html</a> (2017).</li>
<li>Lau, F. H., Vogel, K., Luckett, J. P., Hunt, M., Meyer, A., Rogers, C. L., Tessler, O., Dupin, C. L., St Hilaire, H., Islam, K. N., Frazier, T., Gimble, J. M., Scahill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sandwiched+White+Adipose+Tissue%3A+A+Microphysiological+System+of+Primary+Human+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Sandwiched White Adipose Tissue: A Microphysiological System of Primary Human Adipose Tissue.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (3), (2018).</li>
<li>Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0969806X07000795">Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers.</a> Radiation Physics and Chemistry. 76, 1409-1413 (2007).</li>
<li>Lin, J. B., Isenberg, B. C., Shen, Y., Schorsch, K., Sazonova, O. V., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermo-responsive+poly%28N-isopropylacrylamide%29+grafted+onto+microtextured+poly%28dimethylsiloxane%29+for+aligned+cell+sheet+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).</li>
<li>Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Engineering%3A+Construction+of+a+Multicellular+3D+Scaffold+for+the+Delivery+of+Layered+Cell+Sheets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51044(2014).</li>
<li>Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells%3A+Isolation%2C+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation.</a> Methods. 45 (2), 115-120 (2008).</li>
<li>Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+poly%28N-isopropylacrylamide%29+grafted+layer+on+polystyrene+surfaces+for+cell+adhesion%2Fdetachment+control%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control.</a> Langmuir. 20 (13), 5506-5511 (2004).</li>
<li>Fried, S. K., Russell, C. D., Grauso, N. L., Brolin, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoprotein+lipase+regulation+by+insulin+and+glucocorticoid+in+subcutaneous+and+omental+adipose+tissues+of+obese+women+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lipoprotein lipase regulation by insulin and glucocorticoid in subcutaneous and omental adipose tissues of obese women and men.</a> Journal of Clinical Investigation. 92 (5), 2191-2198 (1993).</li>
<li>Keipert, S., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brite%2Fbeige+fat+and+UCP1+-+is+it+thermogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Brite/beige fat and UCP1 - is it thermogenesis?</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (7), 1075-1082 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı sandviç insan beyaz yağ dokusu ADSCs kullanımına detayları; insan ADSC hücre hatları via köklü protokolleri15ayrılmış olabilir. Ancak, sistem (örneğin sandviç fare WAT hücrelere 3T3L-1 kullanarak) bireyselleştirilmiş araştırma gereksinimleri için adapte edilebilir. Bu işlem birincil insan dokusu işleme içerir. Standart güvenlik önlemlerini istihdam edilmelidir; insan doku (Örneğin, HIV, HepC) BSL-2 patojen işlemek. Sadece doğrudan bir lisans altında doku başa. Kurumsal ...

Yağ dokusu içinde ABD1147 milyar dolar ve 210 milyar dolar arasında doğrudan yıllık tıbbi maliyeti taşır obezite birincil organıdır. Yağ doku birikimi de önde gelen diğer kalp hastalığı, tip II diyabet ve kanser2belirli türleri gibi ölüm nedenleri katkıda bulunur. Vitro kültür modelleri metabolik çalışmaları ve ilaç geliştirme için gerekli olan, ama yağ dokusu geçerli araştırma modelleri büyük eksiklikleri var. Adiposit kırılgan, neşeli ve ölümcül hücre kültür plastikler için uygun olmaz ve bu nedenle geleneksel hücre kültür yöntemleri kullanarak kültürlü cant hücreleri Ayrıştırılan. Cam coverslips, tavan kültür, süspansiyon kültür ve ekstraselüler matrisler3,4,5, kullanımı da dahil olmak üzere bu engelleri aşmak için girişimleri birkaç yöntem kullanılmıştır 1970'lerden beri 6 , 7. ancak, bu yöntemlerin hücre ölümü ve dedifferentiation tarafından işaretlenmiş ve genellikle en fazla bir iki haftalık çalışma dönemi için kullanılır. Ayrıca, bu modeller yapmak değil kalkışmak gibi sağlam ECM korumak değil, etkileşimleri adiposit arasında ve stromal hücreler destek, ne de contractile kuvvetleri hücrelerin birbirlerine içinde içinde vivo sarfetmek yerli adipose microenvironment özetlemek WAT.
Altın standart birincil adipose kültür yöntemi yokluğunda, öncelikle farklılaştırılmış öncesi adiposit üzerinde (diffAds) yağ araştırma güvendi. DiffAds multilocular, yapışık ve metabolik olarak aktif. Buna karşılık, birincil beyaz adiposit üniloküler, nonadherent ve nispeten düşük metabolizma göstermek. Sağlıklı Olgun yağ dokusu fizyolojisi özetlemek için geçerli adipose kültür modellerin büyük olasılıkla doğrudan hedef adiposit FDA onaylı ilaçlar yokluğunda önemli bir faktör başarısızlıktır. Aslında, fizyolojik vitro organ modelleri büyük bir sorun birçok organ ve hastalık olmaması.
Onun pozisyon kağıt, Microphysiological sistemleri (MPS) programın yaratılması duyurmak Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tüm insan ilaç klinik çalışmalar arasında 2013 başarı oranı sadece %18 için faz II ve Evre III için % 50 olduğunu bildirdi Klinik çalışmalarda8. MPS programı doğrudan vitro Monokültür yetersizlik modeli insan fizyolojisi için karşılayacak şekilde tasarlanmıştır. NIH MPSs insan birincil veya kök hücreler organ işleyen özetlemek çok hücreli 3D yapıları içinde oluşan kültür sistemleri olarak tanımlar. Homojen, ölümsüzleştirdi hücre kültürleri indirgemeci modellerinin MPSs doğru bir şekilde hücre-hücre, hücre içi uyuşturucu, ilaç-ilaç ve organ-ilaç etkileşimleri9modeli. Kısa vadeli birincil kültür yöntemlerinden farklı olarak, NIH standartları 4 haftadan kültür8MPS sürdürülebilirlik dikte. NIH'ın RFAs (#RFA-TR-18-001)10, MPS programının daha fazla bilgi bulunabilir.
Basit, bir roman, uyarlanabilir, geliştirdiğimiz ve ucuz yağ MPS olarak adlandırdığı "beyaz yağ dokusu sandviç" (SWAT)11. "Sandviç" kıyılmış birincil yağ dokusu stromal hücreler (ADSCs) (resim 1) yağ kaynaklı levha arasında tarafından adiposit doğal yüzdürme üstesinden gelmek. Elde edilen 3D yapı hücre-hücre iletişim ve doğal yağ microenvironment bir doğal adipocyte destek hücre popülasyonu içeren olgun adiposit çevreleyen tarafından beyannamedir. SWAT 8 haftalık canlılığı, eksojen sinyal, adipokine salgılanması ve engraftment bir hayvan modeli içine yanıt gösteren tarafından doğrulandı.

<table><tbody><tr><td>10x HBSS</td><td>Thermofisher</td><td>14185052</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A9251</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>M199 Medya</td><td>Thermofisher</td><td>11043023</td><td>Fenol kırmızısı içermez&nbsp;</td></tr><tr><td>250 ve mikro; m Mesh Filtre</td><td>Delme</td><td>87791</td><td></td></tr><tr><td>0.2 & m Şırınga Filtre</td><td>Celltreat</td><td>229747</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Luer-Lok şırıngalar&nbsp;</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Metal Rondelalar</td><td></td><td></td><td>Bunlar basit metal rondelalardır ve herhangi bir hırdavatçıdan satın alınabilir. Stoklanması ve sterilize edilmesi kolay olurken, hücreler ve jelatin arasında eşit teması sağlamak için tıkaçların arkasına on sekiz ağırlık eklerler. Yaklaşık kütle: 6.3 g&nbsp;</td></tr><tr><td>< güçlü > Adı</td><td>Company</td><td> Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td> Isıtmalı Ekipman< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>İnkübe Orbital Çalkalayıcı</td><td>VWR</td><td>10020-988</td><td>Kollajenaz sindirimini kolaylaştırmak için numuneler 45 ° derece açıyla eğimlendirilmelidir.</td></tr><tr><td>Isı Bloğu</td><td></td><td></td><td>37-40 & derece olarak ayarlayın; C ve Biyogüvenlik Kabini altına yerleştirilmiş</td></tr><tr><td>Su Banyosu</td><td></td><td></td><td>~ 75 ° C'ye ayarlanmış; C</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Specialized Plastics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Upcell Yemekler 6cm 6-multiwell</td><td>Nunc</td><td>174902&nbsp; veya 174901</td><td>Bunlar, ADSC'lerin üst tabakasını büyütmek için kullanılabilen, ticari olarak temin edilebilen pNIPAAm kaplı tabaklardır. Alternatif olarak, pNIPAAm kaplı plakalar laboratuvarda üretilebilir. Çapı: < 6 cm'lik tabak için 6 cm, < 6 oyuklu plaka için 3,5 cm; yaklaşık kütle: 6 cm'lik tabak için 6,7 g, 6 oyuklu plaka için 5,1 g</td></tr><tr><td>Plastik Piston Aparatı</td><td></td><td></td><td>Bunlar, istenen pNIPAAm kaplı plastiklere (çok kuyulu plakalar, petri kapları) uyacak şekilde şekillendirilebilir. Dairesel bir diske bağlı basit bir gövdeden oluşurlar. Laboratuarda veya akrilik plastik üretebilen herhangi bir tesis tarafından üretilebilirler</td></tr></tbody></table>

İnsan yağı için bir microphysiologic platform: beyaz yağ dokusu sandviç

A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue

Beyaz Yağ dokusundan (WAT) ağırlık ve her gün sağlık düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Yine de, mevcut birincil kültür modelleri, tüm bunların sadakatle adipose microenvironment özetlemek veya WAT canlılık iki hafta ötesinde genişletmek için başarısız olmuş önemli sınırlamalar vardır. Güvenilir birincil kültür manken eksikliği ciddi araştırma WAT metabolizma ve ilaç geliştirme engellemektedir. Bu amaçla NIH'ın standartları için WAT birincil kültür 'SWAT' (gözükeceksin beyaz yağ dokusu) adı verilen yeni bir platform geliştirmek için bir microphysiologic sisteminin kullanılan. Adiposit doğal yüzdürme kıyılmış WAT kümeleri stromal hücreler yağ kaynaklı levha arasında sandviç tarafından üstesinden gelmek. Bu yapıyı kültür uygun üzerinde sekiz hafta WAT örnekleri var. SWAT sağlam ECM, hücre hücre kişiler ve in vivo WAT koşullardan fiziksel baskılara tutar; Ayrıca, SWAT sağlam bir transkripsiyon profil eksojen kimyasal sinyal ve bütün doku fonksiyon duyarlılık korur. SWAT birincil adipose kültür basit, tekrarlanabilir ve etkili bir yöntem temsil eder. Büyük olasılıkla, WAT fizyolojisi, patofizyolojisi, metabolizma ve ilaç geliştirme araştırmaları genel olarak uygun bir platformdur.

SWAT canlılığı başlangıçta bireysel WAT kümeleri seri aydınlık alan görüntüleme tarafından değerlendirildi (n = 12) yaklaşık 7.6 hafta içinde. Kümeleri güvenli monolayer bu süre boyunca üzerinde yerinde kaldı. Hafif morfolojik değişiklikler ile biraz çözgü veya konumları değişen bireysel adiposit gözlendi. Ancak, adipositler de zamanla dedifferentiation eksikliği gösteren multilocular haline, ne de herhangi bir görünür işaretleri hücresel blebbing, lizis veya parçalanma (<strong class="xf...

Beyaz Yağ dokusundan (WAT) farmakolojik geliştirme ve metabolik çalışmalar engelleyen onun geçerli birincil kültür modelleri içinde önemli eksiklikleri vardır. Burada, bir yağ microphysiological sistem tarafından sandviç WAT levha stromal hücreler arasında üretmek için bir protokol mevcut. Bu yapıyı birincil WAT kültür için istikrarlı ve uyarlanabilir bir platform sağlar.

İnsan yağı için bir Microphysiologic Platform: beyaz yağ dokusu sandviç

White adipose tissue (WAT) plays a crucial role in regulating weight and everyday health.  Still, there are significant limitations to available primary ...

Bu çığır açan yöntem, ilk kez, yağ biyolojisi çalışması için art arda birkaç hafta boyunca yağları canlı ve sağlıklı ex vivo tutmamızı sağlar. Bu tekniğin ana avantajı, çevredeki doğal adipoz stromal destek hücreleri de dahil olmak üzere adipoz mikroçevreyi özetlerken, dokunun kültürde sekiz hafta boyunca stabil kalmasıdır. ASC'yi doku kültürü plakalarında yaklaşık% 80'lik bir birleşimde tohumlayarak başlayın.İstenen her SWAT oyuğu için, bir konvansiyonel doku kültürü kuyusu ve PNIPAAm kaplı bir doku kültürü plastik plakası üzerine karşılık gelen boyutta bir kuyu tohumlayın. ASC'yi tam kültür ortamında 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de altı ila sekiz gün boyunca tutun ve ortamı iki günde bir değiştirin. SWAT tohumlamasından yirmi dört saat önce, jelatin çözeltisinin sızmasını önlemek için SWAT tohumlama aparatı için her bir pistonun piston diskinin kenarını en az iki kez laboratuvar bandı ile sarın.Etanol ile dezenfekte edilmiş bir biyogüvenlik kabininde, boş, kapaksız 15 mililitrelik konik tüplerin yanı sıra% 70 etanol ile bantla sarılmış her bir pistonu içeren 15 mililitrelik bir konik tüp rafına püskürtün ve her bir pistonu dezenfekte edilirken boş bir tüpe yerleştirin. Yaklaşık

a-microphysiologic-platform-for-human-fat-sandwiched-white-adipose

Research

JoVE Journal

Behavior

Davranış

Nedeniyle obezite ve diğer yandaş arasındaki şiddetli ve negatif bağlantı, rol adipoz araştırma hastalığında oynadığı ve genel sağlık garantilidir. Biz izolasyon ve yerinde kullanarak adipoz çalışması için izin yağ depolarında eksizyonu ve in vitro yöntemler bir protokol mevcut.

Yerelleştirme, Kimlik ve Eksizyon Kemirgen Yağ depolarının

Burada sunulan yöntem, 18 F-florodeoksiglikoz kullanır (18 F-FDG) pozitron emisyon tomografisi / bilgisayarlı tomografi (PET-BT) ve yağ-su ayrılmış manyetik rezonans görüntüleme (MRG), her termonötral 2 saat maruz (24 ° C aşağıdaki taranan ) ve yetişkin insan deneklerde kahverengi adipoz doku (BAT) eşleştirmek için, soğuk koşullar (17 ° C).

İnsan Brown Yağ Dokusu Depolar otomatik Pozitron Emisyon Tomografi / Bilgisayarlı Tomografi tarafından Parçalı ve Manyetik Rezonans Görüntüler Kayıtlı

Yüksek lipid içeriği nedeniyle yağ dokusu geleneksel histolojik yöntemlerle görselleştirmek için zor oldu. Adipo-temiz sağlam etiketleme ve yağ dokusu yüksek çözünürlüklü hacimsel floresan görüntüleme sağlayan tekniği temizleyerek bir dokudur. Burada, numune hazırlama, ön, boyama, takas ve montaj için görüntüleme yöntemleri açıklanmaktadır.

Adipo-Clear: Bir doku Yöntem yağ dokusu üç boyutlu görüntüleme için temizlenmesi

Burada, kapalı bir sistem cihazı kullanarak insan yağ dokusu enzimsiz mikro-parçalanma sıyoruz. Bu yeni yöntem, in vivo transplantasyon, in vitro kültür ve daha fazla hücre izolasyonu ve karakterizasyonu için uygun yağ dokusunun milimetre altı kümelerinin elde edilmesine olanak sağlar.

Hücre Fenotimi ve Sekretom Karakterizasyonu için İnsan Yağ Dokusu Mikro-parçalanma

Bu protokol, adipojenik ve fibro-inflamatuar stromal hücre alt popülasyonlarını murin karın içi beyaz yağ dokusu (WAT) depolarından floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması veya immünmanyetik boncuk ayırma yoluyla izole etmek için teknik yaklaşımı açıklar.

Murin İntraabdominal Yağ Depolarından Adipojenik ve Fibroinflamatuar Stromal Hücre Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Burada, kemirgen veya insan yağ dokusundan izole edilen mikrovasküler fragmanların işlevsel, vaskülarize bej yağ dokusunun mühendisliğine basit bir yaklaşım olarak kullanımını özetleyen ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Mikrovasküler Fragmanlardan Vaskülarize Termojenik Yağ Dokusunun Üç Boyutlu Kültürü

Bu protokol, preadipositleri elde etmek ve in vitro adiposit diferansiyasyonunu sağlamak için stromal vasküler fraksiyonun (SVF) murin yağ dokusundan yarı otomatik izolasyonunu tanımlar. Kollajenaz sindirimi için bir doku ayrıştırıcısı kullanmak deneysel varyasyonu azaltır ve tekrarlanabilirliği arttırır.

Bir Doku Dissosiyatör Kullanarak Stromal Vasküler Fraksiyonun Murin Beyaz Yağ Dokusundan Yarı Otomatik İzolasyonu

Burada, insan deri altı yağ dokusundan (hSATMVEC'ler) mikrovasküler endotel hücrelerinin izole edilmesi, kültürlenmesi ve fenotiplendirilmesi için bir protokol tanımlanmıştır. Ek olarak, deneysel bir hSATMVEC-adiposit çapraz konuşma modelini açıklıyoruz.

İnsan Subkutan Yağ Dokusunda Adipoz Endotel Hücresi/Adiposit Çapraz Konuşmasının İncelenmesi

Burada, otolog yağ dokusunu farklı fizikokimyasal özelliklere ve fonksiyonlara sahip çeşitli yağ bileşeni maddelere dönüştürebilen bir protokol sunuyoruz.

Yağları Özel Bileşenlere Dönüştürmek için Yenilikçi Yağ Dokusu Fraksiyonasyonu

Ex vivo explant modeli kullanılarak, yağsız farelerden alınan visseral beyaz yağ dokusunun rostral kısmının küçük parçaları 7–10 gün boyunca kültürlenir; bu da yüksek yağlı diyet sırasında meydana gelen yağ dokusu iltihabının indüksiyonu ve incelenmesini mümkün kılar.

Yüksek Yağlı Diyet Benzeri Yağ Dokusu İltihaplanması için Deneyimli Fare Modeli

Keşfedin beyaz yağ dokusunu sekiz hafta boyunca canlı tutan mikrofizyolojik platformu. Bu yöntem, adipoz biyolojisi ve farmakolojik araştırmalar için güvenilir bir model sunar.

İnsan yağı için bir Microphysiologic Platform: beyaz yağ dokusu sandviç

Daha fazla video keşfet