İnsan yağı için bir Microphysiologic Platform: beyaz yağ dokusu sandviç

Bu çığır açan yöntem, ilk kez, yağ biyolojisi çalışması için art arda birkaç hafta boyunca yağları canlı ve sağlıklı ex vivo tutmamızı sağlar. Bu tekniğin ana avantajı, çevredeki doğal adipoz stromal destek hücreleri de dahil olmak üzere adipoz mikroçevreyi özetlerken, dokunun kültürde sekiz hafta boyunca stabil kalmasıdır. ASC'yi doku kültürü plakalarında yaklaşık% 80'lik bir birleşimde tohumlayarak başlayın.

İstenen her SWAT oyuğu için, bir konvansiyonel doku kültürü kuyusu ve PNIPAAm kaplı bir doku kültürü plastik plakası üzerine karşılık gelen boyutta bir kuyu tohumlayın. ASC'yi tam kültür ortamında 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de altı ila sekiz gün boyunca tutun ve ortamı iki günde bir değiştirin. SWAT tohumlamasından yirmi dört saat önce, jelatin çözeltisinin sızmasını önlemek için SWAT tohumlama aparatı için her bir pistonun piston diskinin kenarını en az iki kez laboratuvar bandı ile sarın.

Etanol ile dezenfekte edilmiş bir biyogüvenlik kabininde, boş, kapaksız 15 mililitrelik konik tüplerin yanı sıra% 70 etanol ile bantla sarılmış her bir pistonu içeren 15 mililitrelik bir konik tüp rafına püskürtün ve her bir pistonu dezenfekte edilirken boş bir tüpe yerleştirin. Yaklaşık 6,3 gram metal rondela püskürtün ve bunları bir çift kancalı forseps ile birlikte rafa yerleştirin. Ardından kabin kanadını kapatın ve tohumlama aparatı malzemelerinin gece boyunca kurutulmasını ve sterilizasyonunu kolaylaştırmak için UV ışığını açın.

Hücreler% 100 birleşmeye ulaştığında ve çizgili bir desen gösterdiğinde, 10 mililitre HBSS'ye 0.75 gram jelatin tozu ekleyin. Ve çözeltinin pH'ını 100 mikrolitre sodyum hidroksit ile dengeleyin. Jelatini 75 derecelik bir su banyosuna ekleyin ve toz çözelti içinde eriyene kadar tüpü her beş dakikada bir kuvvetlice çalkalayın.

Homojen jelatin çözeltisini bir şırınga filtresinden süzün ve jelatini pistonlara uygulayın. Pistonların bantlanmış kenarları, jelatin katılaşırken bir kalıp görevi görecektir. Jelatin katılaştığında, bandı açın ve ASC tabakası ile teması en üst düzeye çıkarmak için pistonun merkezinde kalan jelatinin tamamen düz olmasına dikkat ederek, jelatini pistonun dış kenarından çıkarmak için kancalı forsepsleri kullanın.

Jelatin tüm pistonlardan çıkarıldıktan sonra, pistonları tartmak için metal rondelaları kullanarak her bir pistonu PNIPAAm kaplı bir ASC plakasına nazikçe uygulayın. Oda sıcaklığında 1,5 saatlik bir inkübasyondan sonra, hücre tabakasının PNIPAAm kaplı plaka yüzeyinden ayrılmasını tamamlamak için plakaları 1,5 saat daha buzlu su banyosuna aktarın. Ardından, steril olmayan suyu çıkarmak için PNIPAAm kaplı plakaların altını temizleyin.

İnsan yağ dokusunu aldıktan sonra, tohumlanacak kültür başına bir adet 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne soğuk hücre kültürü ortamı ekleyin. Ve yağ dokusunun büyük segmentlerini steril PBS'de üç kez yıkayın ve yıkamalar arasında mümkün olduğunca fazla PBS'yi çıkarın. Son yıkamadan sonra, dokuyu kaba bir şekilde kıymak için forseps ve steril bir tıraş bıçağı kullanın, çözelti mümkün olduğunca az sayıda görünür beyaz yağ dokusu segmenti ile kalın sıvı kıvamına gelene kadar mümkün olduğunca fazla damar ve fasyayı çıkarın.

Uygun bir doku kıvamına ulaşıldığında, önceden hazırlanmış her 1,5 mililitrelik tüpe uygun hacimde kıyma dokusunu aktarmak için modifiye edilmiş bir P1000 mikro pipet ucu kullanın ve kıyılmış dokuyu tüplerin içindeki ortamla kısaca karıştırın. Daha sonra, her ASC kültüründeki ortamı bir hacim beyaz yağ dokusu çözeltisi ile değiştirin ve jelatin pistonları yavaşça taban ASC plakaları üzerindeki beyaz yağ dokusu karışımına aktarın. Hücresel ayrılmayı doğrulamak için PNIPAAm kaplı plakalardaki tek katmanları mikroskop altında inceleyin ve plakaları biyogüvenlik kabinindeki 37 ila 40 santigrat derece ısı bloğunun yüzeyine taşıyın.

Daha sonra hücreleri inkübe etmek ve jelatin erimesini kolaylaştırmak için iki ila üç mililitre ısıtılmış kültür ortamı ekleyin. 30 dakika sonra pistonları plaka yüzeyinden nazikçe çıkarın, kültürleri uygun plaka kapaklarıyla kapatın ve plakaları hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Jelatin tamamen sıvılaştığında, hücre kültürü ortamını aspire edin ve insülin, deksametazon ve antibiyotiklerle desteklenmiş uygun hacimde fenol kırmızısı içermeyen M199 ortamı ile değiştirin.

7.5 haftalık kültürden fazla bir süredir, SWAT kümeleri, tek tek adipositlerde gözlenen sadece hafif morfolojik değişikliklerle tek tabaka üzerinde yerinde sabit kalır. İki haftalık kültürde uniloküler adiposit kümelerinin berrak Nil kırmızısı boyanması, hücrelerin gerçekten artefakt, kistler veya ölü adipositler yerine sağlam zarlara sahip adipositler olduğunu gösterir. 53 günlük SWAT'ın propidyum iyodür boyaması ve 51 günlük SWAT kültürlerinin Yağ Kırmızısı O boyaması, adipositlerin ileri zaman noktalarında bile canlılığını koruduğunu doğrulamaktadır.

İmmünositokimya, SWAT içinde uygun beklenen protein ekspresyonunu ve olgun adiposit belirteçlerinin lokalizasyonunu gösterir ve kantitatif PCR, transkripsiyonel düzeyde anahtar adiposit genlerinin ekspresyonunu gösterir. Fesleğen endokrin fonksiyonunun değerlendirilmesi, ELISA tarafından tespit edilen SWAT kültürlerinden fesleğen leptin sekresyonunu gösterir ve kimyasal stimülasyona yanıt olarak gliserol salınımı da indüklenebilir. SWAT ile kültürlenmiş adipositlerin ksenotransplantasyonu, nakilden 10 gün sonra, insan için lekelenen, ancak fare adiposit belirteçleri için lekelenmeyen, açıkça görülebilen ve kolayca geri kazanılan yağ birikintilerini ortaya çıkarır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa yaklaşık beş saat içinde tamamlanabilir. Hücre ölümünü en aza indirmek için birincil dokuyu hızlı bir şekilde işlemeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, adipositlerin çeşitli ilaçlara veya toksinlere nasıl tepki verdiğiyle ilgili ek soruları yanıtlamak için gerçek zamanlı kantitatif PCR, immün boyama veya fonksiyonel testler gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, yağ araştırmanız için istikrarlı ve güvenilir bir platform olarak SWAT kültürünü nasıl uygulayacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Birincil insan dokusu ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun KKD'nin giyilmesi ve dokuların biyogüvenlik kabinleri altında kullanılması gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.