Name: Protein hücre altı yerelleştirme yeşil floresans Protein etiketleme ve 4, 6-Diamidino-2-phenylindole Caenorhabditis elegans içinde boyama tarafından tespit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Öğrenin, Caenorhabditis elegans'ta GFP füzyon proteini ve DAPI boyama kullanarak ısı stresi altında protein çekirdek translokasyonunu izleme yöntemini. Bu hızlı protokol, hücre biyolojisi araştırmalarında protein yerelleşme dinamiklerini incelemek için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışmada kullanılan C. elegans suşları Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından - Office of araştırma altyapı programları (P40 OD010440) desteklenen Caenorhabditis genetik Merkezi'nden elde edilmiştir. Bu eser NIH tarafından desteklenmiştir: 1R03AG048578-01 Jun Liang, Jun Liang ve PSC CUNY-CCRG 1501-CUNY 66184-00 44 ve 67248-00 45 Jun Liang için. Cathy Savage-Dunn nazikçe onu laboratuvar alanı paylaşımı için teşekkür ederiz. Tüm floresans görüntüleri Queens Koleji çekirdek tesisinde toplanmıştır. William J. Rice el yazması üzerine onun yorum için teşekkür.

1. çözümler
<ol><li>
NGM plakaları
	<ol>
<li>Bir 2 L Erlenmeyer şişesi, NaCl, 3 g, agar 17 g, pepton 2.5 g ve dH2O. kapak alüminyum folyo ile balonun ağzı 975 mL ekleyin. Otoklav şişesi 50 dk. 20-30 dakika sakin ol.</li>
		<li>Sonra steril çözümleri ekleyin: 1 mL 1 M CaCl2, 5 mg/mL kolesterol etanol içinde 1 mL, 1 M MgSO41 mL ve 1 M KPO4 (pH 6.0) arabelleği 25 mL. Onları iyice karıştırın çözümleri girdap.</li>
		<li>Sıvı Sabunluk kullanarak, 60 mm Petri plakaları NGM çözümü dağıtmak. Ağar kaplamalar 2/3 tam dolgusuna. Onları ileride kullanmak üzere 4 ° C'de hava geçirmez bir kap içinde saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1 M KPO4 arabellek (pH 6.0)
	<ol>
<li>KH2PO4 10.83 g ve 3.56 g K2HPO4 ' te dH2O çalışma geçiyoruz, o zaman 100 ml toplam ses seviyesini. Basınçlı kap 15dk için çözüm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
M9
	<ol>
<li>3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO dağıtılması4ve 5 gram NaCl dH2O, 1 M MgSO41 mL ekleyin ve 1 m'ye toplam ses seviyesini</li>
	</ol>
</li>
	<li>
10 µg/mL DAPI
	<ol>
<li>10 mg/ml DAPI dH2O. 999 µL içine 1 µL Ekle</li>
	</ol>
</li>
	<li>
% 95 alkol (v/v)
	<ol>
<li>95 mL %100 alkol ölçmek ve ses seviyesini 100 ml distile su ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
% 30 aseton (v/v)
	<ol>
<li>30 mL aseton dH2için O ekleyin ve toplam ses seviyesini 100 ml.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ısı stres
<ol><li>Hedef genlerin9,10translasyonel bir yapı ile bir extrachromosomal dizi satırı oluşturmak. Alternatif olarak, bu satırları üzerinden Caenorhabditis genetik Merkezi ( C. elegans araştırma için bir kamu kaynağı olan CGC), veya daha önce yayımlanmış araştırma laboratuvarı alabilirsiniz.</li>
	<li>Extrachromosomal satırları solucanlar 3.800 Rad γ-radyasyon9açarak genom entegre. Sonra her hayvan bir işaretleyici protein GFP veya silindir gibi ifade eder stabil ifade çizgileri seçin.</li>
	<li>Radyasyon sırasında oluşturulan mutasyonlar kaldırmak için çizgiler en az 2 outcross x. Protein ifade deseni değişiklikleri stres altında transgenik bu cümleyi.</li>
	<li>NGM solucan plakaları 1.1. adımda açıklandığı şekilde hazırlayın. Bir OP50 klon çizgi ve sıvı LB suyu bakterilerde gecede kültür. Solucanlar için bir besin kaynağı olarak bir bakteri çim büyümeye sıvı OP50 NGM pilakalar kültür ve 37 ° C kuluçka plakaları kuluçkaya tohum gecede. Plakalar için kullanmadan önce en az 30 dakika oda sıcaklığında sakin.</li>
	<li>20 ° C ısı stres tahlil öncesinde en az 2 nesiller için açlık olmadan transgenik satırında büyümek.</li>
	<li>8-10 genç gravid yetişkin (rahim yumurta ile dolu) bir yeni solucan plaka, sonra onları yumurtlamak için yaklaşık 3-5 h let için almak ve tüm yetişkin plakalar kaldırın.</li>
	<li>Solucanlar eşitlemek için yumurta yumurtadan ve larvaları yaklaşık 48 saat için dördüncü larva (L4) sahne alanı'na büyümeye izin. L4 sahne (Şekil 1, ok)11tanımlamak için onların vulva yapısı (yarım ay yapısı) inceleyin.</li>
	<li>Isı stres ulaşmak 2-5 h için 35 ° C kuluçka L4 larvaları ile solucan tabak koyun. Bir termometre doğru ısısını ölçmek için kuluçka makinesine koyun.</li>
</ol>3. DAPI boyama
<ol><li>
Etanol fiksasyon
	<ol>
<li>10 µL M9 arabelleği bir cam slayt ortasına ekleyin.</li>
		<li>Isı şok solucanlar adım 2.8 toplar ve onları koyardım M9 arabelleğine cam slayt üzerinde.<ol>
<li>Alternatif olarak, M9 ile plaka uzakta yıkama, 1000 x g oda sıcaklığında 1 dk. için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant atmak. Solucanlar için cam slayt ekleyin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Herhangi bir aşırı sıvı boşaltmak için yumuşak bir doku kullanın. Diseksiyon mikroskop altında bu adıma dikkat et.</li>
		<li>10 µL % 95 alkol solucanlar üzerine eklemek ve onları kurutma. Diseksiyon mikroskop altında süreci izlemek ve çok kuru olsun hayvan izin vermeyin. Sonra hemen etanol hayvanlardan buharlaşıp vardır, sonraki adıma geçin. Not: Etanol çok hızlı buharlaşır.</li>
		<li>Adımı yineleyin 3.1.4 iki kez böylece solucanlar sabit. Not: Bu hayvanlar için karanlık ve çarpık bakmak normaldir.</li>
		<li>DAPI 10 µL ekleyin (10 µg/mL) solucanlar için. Hemen onları bir coverslip ile karşılamak ve şeffaf oje jel içeren slaydı mühür.</li>
		<li>Floresan mikroskop üzerinde yaklaşık 10 dakika sonra hayvanlar görüntüleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aseton fiksasyon (alternatif bir yaklaşım)
	<ol>
<li>Adım 2.8 M9 ile ısı şok plaka uzakta yıkama, 1000 x g oda sıcaklığında 1 dk. için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant atmak. Pelet dH2O 1 mL ile yıkayın, Pelet toplamak ve süpernatant atın.</li>
		<li>1000 x g için oda sıcaklığında 1 dk 400 µL % 30 aseton 15 dk. santrifüj ekleyin ve süpernatant atın. Hayvanlar 2 yıkamak için dH2O 500 µL kullanın x. Süpernatant atmak.</li>
		<li>DAPI 200 µL ekleyin (10 µg/mL), veya 4 x tüp 15 dakika içinde toplam solucanlar birim miktarı.</li>
		<li>1000 x g 1 dk. için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Pelet 2 yıkama x 500 µL dH2O. ile solucanlar cam slaytlarda yer, onları coverslips ile karşılamak, şeffaf oje jel içeren slaydı mühür ve floresan mikroskop altında hayvanlar gözlemlemek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. mikroskobik görüntüleme
<ol><li>UV ışık kaynağı ve floresan mikroskop açın. Mikroskop için bağlı olduğu bilgisayarda açın.</li>
	<li>Floresan mikroskop slaytta yükleyin. Solucanlar bulmak, 400 X büyütme gücünü arttırın ve numune üzerinde odaklanmak için bir düşük güç objektif lens (10 X) kullanın.</li>
	<li>Mikroskop ile sağlanan yazılımını açın. "Alma" menüsünde'ı tıklatın; "Kamera" tıklayın ve mikroskop için bağlı kamera seçin; Bu yazılım ile iletişim kurmak seçili kamera sağlar. Not: Farklı mikroskoplar işleminde değişiklik gösterebilir.</li>
	<li>Altında aynı "alma", "Çok boyutlu edinme"'ı tıklatın. Bu yeni bir "Çok boyutlu edinme" gezinti penceresi açar. "Çok kanallı" düğmesini ve tüm kanallar görüntülenir.</li>
	<li>Mavi, yeşil ve numune gözlemlemek için DIC (diferansiyel girişim kontrast) seçin. "Çok boyutlu edinme" Gezinti penceresinde "Mavi-DAPI", "Yeşil-GFP" ve "Gri-DIC", "Nomarski" kanallarda bırakın; "Kırmızı-rodamine" ve "beyaz parlak alan", gibi diğer kanallar sağ tıklayın onları kapatın.</li>
	<li>
İlk olarak, pozlama süresi her kanal için tedbir:
	<ol>
<li>Seçin ve sonra otomatik çekim hızı ile DAPI kanalın altında canlı bir görüntü çekmek için "Ölçü" tıklayın "Mavi-DAPI" kanal sol tıklatın. Canlı bir görüntü ile yeni bir pencere açılacaktır.</li>
		<li>Canlı görüntü penceresinin sol tarafında el ile istediğiniz gibi resim yapmak gerekirse çekim hızı ayarlayın.</li>
		<li>Son olarak "Tamam tıklayın" canlı görüntü penceresinde. Bu çekim hızı DAPI kanalın altında ayarlar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diğer kanallar, "Yeşil-GFP" ve "Gri-pozlama süreleri bu kanallar için ayarlamak için DIC", "Nomarski" için 4,6 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>"Çok boyutlu edinme" Gezinti penceresinde otomatik olarak 3 resim sipariş (bkz. yukarıda) belirtildiği gibi belirli pozlama süreleri ile 3 farklı kanalların altında toplamak için "Başlat" tıklayın.</li>
	<li>Kurtarmak belgili tanımlık eğe için ana menüye gidin, "Dosya" ve sonra "Kaydet"'i tıklatın. Dosya adını ve klasör adını girin. İleride detaylı görüntüleme bilgileri korumak için varsayılan dosya biçimi olarak kaydedin.</li>
	<li>
Diğer biçimlerde dosyasını dışa aktarmak için:
	<ol>
<li>Gitgidmek "Eğe" ve tıkırtı üstünde "ihracat yapmak". Bu bir dışa aktarma ayarı pencere açılacaktır.</li>
		<li>Dosya adı ve klasör ayarlayın. "Bir proje klasörü için daha iyi oluşturmak" verileri düzenlemek kontrol edin. Yazılım aynı zamanda 4 diğer seçenekleri belirtmek kullanıcı sağlar: "Generate birleştirilmiş görüntüler"kanal görüntülerde renk kullanın",", "Kanal adları kullan" ve "Yalnızca birleştirilmiş resim".</li>
		<li>Açılan menüden "TIF", "BMP", "PSD", veya "JPG" ve diğer türleri gibi istediğiniz dosya türünü seçin. O zaman tıkırtı üstünde "ihracat Başlat".</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Essers, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXO+transcription+factor+activation+by+oxidative+stress+mediated+by+the+small+GTPase+Ral+and+JNK%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNK.</a> The EMBO Journal. 23 (24), 4802-4812 (2004).</li>
<li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNK+regulates+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans+by+modulating+nuclear+translocation+of+forkhead+transcription+factor%2FDAF-16%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">JNK regulates lifespan in Caenorhabditis elegans by modulating nuclear translocation of forkhead transcription factor/DAF-16.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (12), 4494-4499 (2005).</li>
<li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+cleaved+BID+targets+mitochondria+and+is+required+for+cytochrome+c+release%2C+while+BCL-XL+prevents+this+release+but+not+tumor+necrosis+factor-R1%2FFas+death%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Caspase cleaved BID targets mitochondria and is required for cytochrome c release, while BCL-XL prevents this release but not tumor necrosis factor-R1/Fas death.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (2), 1156-1163 (1999).</li>
<li>Doerflinger, M., Glab, J. A., Puthalakath, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3-only+proteins%3A+a+20-year+stock-take%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">BH3-only proteins: a 20-year stock-take.</a> The FEBS Journal. 282 (6), 1006-1016 (2015).</li>
<li>Mayorova, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+containing+aragonite+crystals+mediate+responses+to+gravity+in+Trichoplax+adhaerens+%28Placozoa%29%2C+an+animal+lacking+neurons+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cells containing aragonite crystals mediate responses to gravity in Trichoplax adhaerens (Placozoa), an animal lacking neurons and synapses.</a> PLoS One. 13 (1), e0190905(2018).</li>
<li>Terron-Camero, L. C., Molina-Moya, E., Sanz-Fernandez, M., Sandalio, L. M., Romero-Puertas, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+%28ROS%2FRNS%29+during+hypersensitive+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) during hypersensitive cell death.</a> Methods in Molecular Biology. , 97-105 (2018).</li>
<li>Pedrazzini, E., Vitale, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29043678">Protein biosynthesis and maturation in the ER.</a> Methods in Molecular Biology. , 179-189 (2018).</li>
<li>Liang, J., Shaulov, Y., Savage-Dunn, C., Boissinot, S., Hoque, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+intracellular+channel+proteins+respond+to+heat+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chloride intracellular channel proteins respond to heat stress in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 12 (9), e0184308(2017).</li>
<li>Evans, T. C. Transformation and microinjection. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">Wormbook</a>. , edited by The C. elegans Research Community (2006).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Yochem, J. Nomarski images for learning the anatomy, with tips for mosaic analysis. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">Wormbook</a>. , edited by The C. elegans Research Community (2006).</li>
<li>Dulhunty, A., Gage, P., Curtis, S., Chelvanayagam, G., Board, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glutathione+transferase+structural+family+includes+a+nuclear+chloride+channel+and+a+ryanodine+receptor+calcium+release+channel+modulator%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The glutathione transferase structural family includes a nuclear chloride channel and a ryanodine receptor calcium release channel modulator.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (5), 3319-3323 (2001).</li>
<li>Suh, K. S., Malik, M., Shukla, A., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIC4%2C+skin+homeostasis+and+cutaneous+cancer%3A+surprising+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">CLIC4, skin homeostasis and cutaneous cancer: surprising connections.</a> Molecular Carcinogenesis. 46 (8), 599-604 (2007).</li>
<li>Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M., Kong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIC4+mediates+TGF-beta1-induced+fibroblast-to-myofibroblast+transdifferentiation+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">CLIC4 mediates TGF-beta1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer.</a> Oncology Reports. 22 (3), 541-548 (2009).</li>
<li>Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Edwards, J. C., Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+a+chloride+intracellular+channel+gene%2C+CLIC4%2C+in+transforming+growth+factor-beta1-mediated+conversion+of+fibroblasts+to+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Differential expression of a chloride intracellular channel gene, CLIC4, in transforming growth factor-beta1-mediated conversion of fibroblasts to myofibroblasts.</a> The American Journal of Pathology. 161 (2), 471-480 (2002).</li>
<li>He, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+CLIC4+in+the+host+innate+responses+to+bacterial+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Role of CLIC4 in the host innate responses to bacterial lipopolysaccharide.</a> European Journal of Immunology. 41 (5), 1221-1230 (2011).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+CLIC4+enhances+autophagy+and+triggers+mitochondrial+and+ER+stress-induced+apoptosis+in+human+glioma+U251+cells+under+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inhibition of CLIC4 enhances autophagy and triggers mitochondrial and ER stress-induced apoptosis in human glioma U251 cells under starvation.</a> PLoS One. 7 (6), e39378(2012).</li>
<li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+schnurri+homolog+sma-9+mediates+stage-+and+cell+type-specific+responses+to+DBL-1+BMP-related+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling.</a> Development. 130 (26), 6453-6464 (2003).</li>
<li>Leopold, L. E., Heestand, B. N., Seong, S., Shtessel, L., Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+pairing+during+meiosis+triggers+multigenerational+transgene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lack of pairing during meiosis triggers multigenerational transgene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), E2667-E2676 (2015).</li>
<li>Schultz, R. D., Bennett, E. E., Ellis, E. A., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+extracellular+matrix+organization+by+BMP+signaling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Regulation of extracellular matrix organization by BMP signaling in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 9 (7), e101929(2014).</li>
<li>Matus, D. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+cell+fate+requires+G1+cell-cycle+arrest+and+histone+deacetylase-mediated+changes+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Invasive cell fate requires G1 cell-cycle arrest and histone deacetylase-mediated changes in gene expression.</a> Developmental Cell. 35 (2), 162-174 (2015).</li>
<li>Reddy, K. C., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+HIM-17+links+chromatin+modification+and+competence+for+initiation+of+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">C. elegans HIM-17 links chromatin modification and competence for initiation of meiotic recombination.</a> Cell. 118 (4), 439-452 (2004).</li>
<li>Ames, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-cell-autonomous+role+of+BEC-1%2FBECN1%2FBeclin1+in+coordinating+cell-cycle+progression+and+stem+cell+proliferation+during+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A non-cell-autonomous role of BEC-1/BECN1/Beclin1 in coordinating cell-cycle progression and stem cell proliferation during germline development.</a> Current Biology. 27 (6), 905-913 (2017).</li>
<li>Pekar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+the+environment%2C+DAF-7%2FTGFbeta+signaling+and+LAG-2%2FDSL+ligand+expression+in+the+germline+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Linking the environment, DAF-7/TGFbeta signaling and LAG-2/DSL ligand expression in the germline stem cell niche.</a> Development. 144 (16), 2896-2906 (2017).</li>
<li>Schvarzstein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+helicase+HIM-6%2FBLM+both+promotes+MutSgamma-dependent+crossovers+and+antagonizes+MutSgamma-independent+interhomolog+associations+during+caenorhabditis+elegans+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">DNA helicase HIM-6/BLM both promotes MutSgamma-dependent crossovers and antagonizes MutSgamma-independent interhomolog associations during caenorhabditis elegans meiosis.</a> Genetics. 198 (1), 193-207 (2014).</li>
<li>Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+polyploidization+and+cellular+proliferation+drive+body+size+evolution+in+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).</li>
<li>Nagamatsu, Y., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+the+control+of+body+size+by+a+G-kinase+and+a+downstream+TGFbeta+signal+pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for the control of body size by a G-kinase and a downstream TGFbeta signal pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Genes to Cells. 9 (1), 39-47 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar bildirmek için bir şey yok.

Bu makale için çekirdek sitoplazma protein hücre altı değişiklikleri doğrulamak için hızlı ve etkili bir yöntem mevcuttur. Çekirdek yapı (Şekil 3) boyama DAPI tarafından doğrulandı ise protein ifade GFP füzyon tarafından gösterildi. İmmunostaining C. elegans proteinler zor olduğundan, çoğu C. elegans protein hücre altı yerelleştirmeler GFP, Laz, mCherry ve diğerleri gibi işaret proteinler ile etiketleyerek karakterizedir18,<sup class="xref...

Protein hücre altı yerelleştirme değişikliği yanıt olarak dahili veya harici sinyaller ısı stres, açlık, oksidatif stres, apoptozis, protein fosforilasyon ve diğerleri gibi ortak bir mekanizmadır. Örneğin, ısı stres FOXO üye DAF-16 nükleer translocation1,2ve3,4sinyal alıcı ölümü üzerine mitokondri için teklif translocates pro-apoptotik BCL-2 protein neden olmaktadır. Çeşitli teknikler bu değişiklikleri algılamak kullanılabilir. Western blot ve biyokimyasal olarak izole hücre altı yapıları (Örneğin, mitokondri veya çekirdek) bir arada de hedef3elde edebiliriz. Ancak, spesifik bir antikor protein ilgi karşı gerektirir. Böylece, köklü bir antikor başarı için anahtar olur. Farklı hücre altı yapıları veya organelleri yeşil floresans protein (GFP), kırmızı floresans protein (RFP), sarı floresans protein (YFP) ve mCherry gibi çeşitli işaretçileri olan etiket ve bu arada protein etiket için alternatif bir yaklaşımdır ilgi diğer işaretleri ile. O zaman, onları hedef5,6yerelleştirmek için confocal mikroskop altında gözlemlemek. Radyoaktif izotoplar hedef proteinler etiketleme ve onların hücre altı yerelleştirme7algılama için alternatif bir seçimdir. Ancak, bu yöntem uygun eğitim ve radyoaktif atıkların işlenmesi gerekir. Spesifik bir antikor eksikliği, uygun bir işaretleyici yokluğu veya ekipman confocal mikroskop gibi scarceness gibi bu şartlar altında başka bir yaklaşım dikkate alınması gerekiyor. Protein nükleer translocation tanımlamak için sadece bir işaretleyici ile hedef proteinler etiketlemek için ve çekirdeklerin Kimyasal reaktif 4', 6-diamidino-2-phenylindole (Bu sadece normal floresan mikroskop gerektirdiğinden DAPI) ile leke için çekici.
Immunolabeling C. elegans antikorlar ile yumurta kabuğu veya hayvan çevreleyen kolajen kütikül düşük geçirgenliği nedeniyle meydan okuyor. Bu arada, C. elegans proteinler--dan onların omurgalı orthologs önemli ölçüde farklı olduğu için birkaç ticari şirketler ile belirli ürünler C. elegans sağlar. C. elegans antikorlar kendileri için üretmek küçük bir laboratuvar için zordur. Araştırmacılar toplumda sık sık tagged proteinler protein yerelleştirme veya gen ifade göstermek için imleyicileri kullanın. Bu makale EXL-1::GFP bir protein nükleer translocation ısı stres8altında izlemek için örnek olarak kullanılmıştır. Bir entegre translasyonel exl-1::gfp içine hayvan genom stabil gen gfp füzyon ile ifade etmek için kullanılır. Araştırma exl-1 bağırsak, vücut duvar kas ve diğer hücre altı yapıları8ifade edilir gösterdi. Bu iletişim kuralı, solucanlar dördüncü larva (L4) sahneye eşleştirir, ısı stres deney ve davranış DAPI boyama, etanol fiksasyonu, aseton fiksasyon ve görüntüleme düzenli floresan mikroskop altında gerçekleştirmek gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Biotium</td><td>40043</td>, <td>hem Hoechst 33258 hem de Hoechst 33342 de iyi çalışıyor</td></tr><tr><td>OP50</td><td></td><td>CGC OP50</td><td>https://cgc.umn.edu/</td></tr> <tr><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td><td>https://cgc.umn.edu/</td></tr> <tr><td>Kim Wipe</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td></td><td>yumuşak doku</td></tr><tr><td>Zeiss&nbsp; AX10</td><td>Zeiss</td><td></td><td>floresan mikroskobu</td></tr><tr><td>Axiovision Rel 4.8</td><td>Zeiss</td><td></td><td>mikroskop yazılımı</td></tr><tr><td>AxioCam MR Rev3</td><td>Zeiss</td><td></td><td>dijital kamera</td></tr><tr><td>İnkübatörü&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikro santrifüj</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Şeffaf oje jeli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm petri kapları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam slaytlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam lameller</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-20 ve mikro; L pipetleyici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20-200 ve mikro; L pipetleyici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200-1000 ve mikro; L pipetleyici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-200 ve mikro; L pipet uçları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200-1000 & mikro; L pipet uçları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platin tel sonsuz çekme</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protein hücre altı yerelleştirme yeşil floresans protein etiketleme ve 4', 6-diamidino-2-phenylindole caenorhabditis elegans içinde boyama tarafından tespit

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

Bu iletişim kuralı, bir yeşil floresans protein (GFP) füzyon protein ve 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) boyama protein hücre altı yerelleştirme değişiklikleri; izlemek için kullanılır Özellikle, bir ısı altında nükleer translocation stres durumu. Proteinler buna bağlı olarak dış ve iç sinyalleri tepki. Onun hücre altı yerelleştirme değiştirmek için ortak bir mekanizmadır. Bu makalede bir antikor, radyoaktif etiketleme veya confocal mikroskop gerektirmez protein yerelleştirme izlemek için bir iletişim kuralı. Bu makalede, GFP memeli CLIC4 de dahil olmak üzere klorür hücre içi kanal proteinleri (CLICs) ailesinin C. elegans, üye EXL-1 hedef protein etiketlemek için kullanılır. Bir entegre translasyonel exl-1::gfp transgenik satır (bir organizatörü ve tam gen sıralaması) dönüştürme ve γ-radyasyon tarafından oluşturulmuş ve stabil gfpve gen ifade eder. Son araştırma ısı stres, değil oksidatif stres, EXL-1::GFP çekirdeğinde biriken gösterdi. GFP sinyal çekirdek yapısı ve DAPI ile örtüşen sinyalleri stres altında EXL-1 hücre altı yerelleştirme değişiklikleri onaylar. Bu iletişim kuralı DAPI boyama için iki farklı fiksasyon yöntemi sunar: etanol fiksasyon ve aseton fiksasyon. Bu makalede sunulan DAPI boyama iletişim kuralı hızlı ve verimli ve GFP sinyal hem protein hücre altı yerelleştirme değişiklikleri korur. Bu yöntem yalnızca Nomarski, FITC filtre ve DAPI filtre ile floresan mikroskop gerektirir. Bir küçük laboratuvar ayarı, lisans öğrencisi araştırma, lise öğrenci araştırma ve biyoteknoloji derslik için uygundur.

Klorür hücre içi kanal proteinler (klik) türler12arasında son derece korunmuş çok fonksiyonlu proteinlerdir. CLICs hücresel stres, autophagy, apoptozis, karsinojenezis, anjiogenez ve makrofaj doğuştan gelen bağışıklık yanıtı memeli sistem13,14,15,16 düzenleyen çok araştırma gösterir ,17. C. elegans<...

Bu iletişim kuralı bir protein nükleer translocation ısı stres altında bir yeşil floresans protein (GFP) füzyon proteini bir işaretleyici olarak ve 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kullanarak izlemek gösterilmiştir boyama. İletişim kuralı boyama DAPI hızlı ve GFP ve protein hücre altı yerelleştirme sinyalleri korur.

Protein hücre altı yerelleştirme yeşil floresans Protein etiketleme ve 4', 6-Diamidino-2-phenylindole Caenorhabditis elegans içinde boyama tarafından tespit

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

Bu yöntem, hücre biyolojisi gibi C.elegans alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, nükleer boyama, GFP ve hücre altı lokalizasyon değişikliklerinin sinyallerini aynı anda elde etmenin hızlı ve verimli olmasıdır. Başlamak için, hedef genlerin translasyonel yapısıyla hizalanmış bir ekstrakromozomal dizi oluşturun.Alternatif olarak, bu tür çizgileri C.elegans araştırmaları için halka açık bir kaynak olan Caenorhabditis Genetik Merkezi'nden edinin. Veya daha önce yayınlanmış bir araştırma laboratuvarından. Ekstrakromozomal çizgileri genoma entegre etmek için solucanları gama radyasyonuna maruz bıraktıktan sonra, her hayvanın bir GFP veya silindir gibi bir işaretleyici proteini ifade etmesi için kararlı bir şekilde ifade edilen çizgileri seçin.Radyasyon sırasında oluşan mutasyonları ortadan kaldırmak için, çizgileri en az iki kez geçin. Stres altında protein ekspresyon paterni değişikliklerini tespit etmek için elde edilen transgenik çizgiyi kullanın. Daha sonra, metin protokolüne göre NGM solucan plakalarını hazırladıktan sonra, bir OP50 klonu çizin ve bakterileri gece boyunca sıvı LB suyunda kültürleyin.NGM plakalarını sıvı OP50 kültürü

detecting-protein-subcellular-localization-green-fluorescence-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Sıvı tabanlı kültür ve dağıtımı için bir...

Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

"Freeze-kırma," nematod C iç dokuları sergilemek için bir yöntem protein lokalizasyonu için antikorlara elegans, gösterilmiştir.

Antikor boyamasında<em&gt; C. Elegans</em&gt; &quot;Freeze-Cracking kullanma&quot;

Protein homeostazı, stres ve yaşlanma arasındaki ilişkiyi incelemek için, genetik olarak izlenebilir metazoan Caenorhabditis elegans'ı model sistem olarak kullanarak, protein disfonksiyonunu, hücredeki protein lokalizasyonunu ve organizma, hücresel ve protein seviyelerinde protein stabilitesini takip ederek protein katlanmasındaki değişiklikleri izledik.

Caenorhabditis elegans'ın Çok Hücreli Bir Organizmada Protein Homeostazını İncelemek için Model Sistem Olarak Kullanılması

İskelet kası hareket etmek için gerekli olan ve bedenimizin ana protein deposudur. C. elegans içinde kas sağlık ölçüleri tanımlanmıştır. Kas yapısı ve fonksiyonu için Aday değişiklikler lokalize GFP ve katyonik boyalar kullanılarak değerlendirilir.

Yöntemler içinde Muscle hücrealtı Kompartmanları DeğerlendirecekÜSKÜP ° C. elegans

Saydam C. elegans bağırsak "sırasında çok hücreli tubulogenesis apicobasal membran ve Lümen Biyogenez tek hücre ve hücre altı düzeyde çalışmak için birvivo içinde doku odası" olarak hizmet edebilir. Bu protokolü nasıl standart etiketleme birleştirmek için işlev kaybı genetik/RNAi ve moleküler düzeyde bu işlemleri incelemek için mikroskobik yaklaşımları açıklar.

C. elegans bağırsak olarak bir Model hücreler arası Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek hücre düzeyinde için: etiketleme antikor boyama, işlev RNAi kaybı çözümleme ve görüntüleme

Caenorhabditis elegans (C. elegans) aksonlar ve hücre içi taşıma çalışma için iyi bir modeldir. Burada, vivo içinde kayıt ve analiz C. elegansaksonlar ve intraflagellar taşıma için bir protokol açıklayın.

Caenorhabditis elegans nöron hücre içi taşıma analiz immobilizasyon

Dinamik mikrotübüllerin floresan etiketli Uç bağlayıcı protein kullanılarak vivo olarak görüntülenmesi için bir protokol sunulmuştur. C. elegans'ınPosterior lateral mikrotübül (PLM) nöronunda dinamik mikrotübülleri etiketleme, görüntüleme ve analiz etme yöntemlerini açıkladık.

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

Hücre dışı bakteriler ve Orsay virüsü ve mikrosporidia (mantarlar) gibi hücre içi patojenler de dahil olmak üzere bağırsak mikropları genellikle vahşi Caenorhabditis nematodları ile ilişkilidir. Bu makalede, C. elegans nematodlarını kolonize eden ve/veya enfekte eden mikropların tespiti ve nicelleştirilmesi ve laboratuvarda kontrollü enfeksiyonlardan sonra patojen yükünün ölçülmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Caenorhabditis elegans Bağırsaklarında Mikrobiyal Kolonizasyon ve Enfeksiyonu Görselleştirmek için RNA Floresan in situ Hibridizasyon (FISH)

Makale, canlı bir nematoda tek nöron çözünürlüğünde endojen etiketli kargoların aksonal taşınmasını görselleştirmek için floresan mikroskobu edinim parametrelerinin optimizasyonunu açıklamaktadır.

Canlı Caenorhabditis elegans'ta Floresan Mikroskobu ile Endojen Yükün Aksonal Taşınmasının Görüntülenmesinin Optimize Edilmesi

Burada, geniş alan mikroskobu görüntülerinde tek tek solucanların otomatik segmentasyonu için geliştirdiğimiz bir derin öğrenme sistemi olan SegElegans'ın daha sonra ImageJ gibi görüntü analiz yazılımlarında kullanılmak üzere etkin bir şekilde kullanılmasına ilişkin talimatlar sunuyoruz. Sistemi hem çevrimiçi hem de çevrimdışı kullanmanın yollarını sunuyoruz.

SegElegans Kullanarak C. elegans Floresan Görüntülerinin Otomatik Analizi

Caenorhabditis elegans germ hattında endogen floresan etiketleme için CRISPR/Cas9 mikroenjeksiyon iş akışı, in vivo protein lokalizasyon analizi için homozigot knock-in çizgileri elde etmek.

Caenorhabditis elegans'ta CRISPR/Cas9 aracılı Endojen Floresan Etiketleme Germline-Spesifik Genlerin

Öğrenin, Caenorhabditis elegans'ta GFP füzyon proteini ve DAPI boyama kullanarak ısı stresi altında protein çekirdek translokasyonunu izleme yöntemini. Bu hızlı protokol, hücre biyolojisi araştırmalarında protein yerelleşme dinamiklerini incelemek için değerlidir.

Protein hücre altı yerelleştirme yeşil floresans Protein etiketleme ve 4, 6-Diamidino-2-phenylindole Caenorhabditis elegans içinde boyama tarafından tespit (Video) | JoVE Journal

Protein hücre altı yerelleştirme yeşil floresans Protein etiketleme ve 4', 6-Diamidino-2-phenylindole Caenorhabditis elegans içinde boyama tarafından tespit

Daha fazla video keşfet