Protein hücre altı yerelleştirme yeşil floresans Protein etiketleme ve 4', 6-Diamidino-2-phenylindole Caenorhabditis elegans içinde boyama tarafından tespit
30 Temmuz 2018
Bu iletişim kuralı bir protein nükleer translocation ısı stres altında bir yeşil floresans protein (GFP) füzyon proteini bir işaretleyici olarak ve 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kullanarak izlemek gösterilmiştir boyama. İletişim kuralı boyama DAPI hızlı ve GFP ve protein hücre altı yerelleştirme sinyalleri korur.
Bu yöntem, hücre biyolojisi gibi C.elegans alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, nükleer boyama, GFP ve hücre altı lokalizasyon değişikliklerinin sinyallerini aynı anda elde etmenin hızlı ve verimli olmasıdır. Başlamak için, hedef genlerin translasyonel yapısıyla hizalanmış bir ekstrakromozomal dizi oluşturun.
Alternatif olarak, bu tür çizgileri C.elegans araştırmaları için halka açık bir kaynak olan Caenorhabditis Genetik Merkezi'nden edinin. Veya daha önce yayınlanmış bir araştırma laboratuvarından. Ekstrakromozomal çizgileri genoma entegre etmek için solucanları gama radyasyonuna maruz bıraktıktan sonra, her hayvanın bir GFP veya silindir gibi bir işaretleyici proteini ifade etmesi için kararlı bir şekilde ifade edilen çizgileri seçin.
Radyasyon sırasında oluşan mutasyonları ortadan kaldırmak için, çizgileri en az iki kez geçin. Stres altında protein ekspresyon paterni değişikliklerini tespit etmek için elde edilen transgenik çizgiyi kullanın. Daha sonra, metin protokolüne göre NGM solucan plakalarını hazırladıktan sonra, bir OP50 klonu çizin ve bakterileri gece boyunca sıvı LB suyunda kültürleyin.
NGM plakalarını sıvı OP50 kültürü ile tohumlayın ve solucanlar için bir besin kaynağı olarak bakteri çimi yetiştirmek için plakaları gece boyunca 37 derecelik bir inkübatörde inkübe edin. Kullanmadan önce plakaları oda sıcaklığında en az 30 dakika soğutun. Transgenik çizgiyi, ısı stresi testinden en az iki nesil önce aç kalmadan 20 santigrat derecede büyütün.
Sekiz ila on genç, ağır yetişkini yeni bir solucan plakasına seçin. Daha sonra yaklaşık üç ila beş saat yumurta bırakmalarına izin verin ve tüm yetişkinleri plakalardan çıkarın. Solucanları senkronize etmek için, yumurtaların çatlamasına ve larvaları yaklaşık 48 saat boyunca dördüncü larva veya L4 aşamasına kadar büyütmesine izin verin.
Bu, yarım aylık bir yapı olan vulva ile tanımlanabilir. Daha sonra, plakaları L4 larvaları ile 35 santigrat derecede iki ila beş saat kuluçkaya yatırarak solucanları ısıtın. Sıcaklığı doğru bir şekilde ölçmek için bir inkübatöre bir termometre ekleyin.
Bir cam slaytın ortasına 10 mikrolitre M9 pipetleyin. Daha sonra ısı şoku ile şok verilmiş solucanları toplayın ve bunları bir damla tampona aktarın. Alternatif olarak, solucanları plakadan yıkamak için M9'u kullanın.
Daha sonra numuneyi oda sıcaklığında yerçekiminin 1000 katı sıcaklıkta bir dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın, ardından solucanları cam slayta ekleyin. Diseksiyon mikroskobu altında, fazla sıvıyı boşaltmak için yumuşak bir doku kullanın.
Daha sonra, hala mikroskop altındayken, solucanların üzerine 10 mikrolitre% 95 alkol ekleyin ve onları gözlemlemeye devam edin. Etanol kuruduktan hemen sonra, etanol ilavesini iki kez daha tekrarlayın. Diseksiyon mikroskobu altında hayvanlardan etanolün buharlaşması süreci için kritik öneme sahiptir.
Etanol hayvanlardan çıktıktan sonra hemen bir sonraki adıma geçin. Solucanlara 10 mikrolitre DAPI ekleyin. Hemen bir kapak fişi uygulayın ve slaytı şeffaf oje jeli ile kapatın.
Oje'nin yaklaşık 10 dakika sertleşmesine izin verdikten sonra, hayvanları floresan mikroskobu altında görüntüleyin. Hayvanları asetonla sabitlemek için, ısı şoklu plakayı yıkamak için M9'u kullanın ve numuneyi bir dakika boyunca oda sıcaklığında yerçekiminin 1000 katı sıcaklıkta santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti yıkamak için bir mililitre damıtılmış su kullanın.
Süpernatanı çıkardıktan sonra, 400 mikrolitre% 30 aseton ekleyin ve numuneyi 15 dakika inkübe edin. Daha sonra tüpü oda sıcaklığında yerçekiminin 1000 katı sıcaklıkta bir dakika santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, hayvanları iki kez yıkamak için 500 mikrolitre damıtılmış su kullanın.
Peletin içine 200 mikrolitre DAPI ekleyin veya toplam solucan hacminin dört katını tüpe ekleyin ve numuneyi 15 dakika inkübe edin. Numuneyi santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Ardından, daha önce olduğu gibi monte etmeden ve görüntülemeden önce peleti iki kez yıkamak için 500 mikrolitre damıtılmış su kullanın.
Görüntüleme yapmak için UV ışık kaynağını ve floresan mikroskobunu açın. Ardından mikroskoba bağlı bilgisayarı açın. Slaytı floresan mikroskobuna yükleyin.
Solucanları bulmak için 10X objektif lens kullanın. Ardından büyütme gücünü 400X'e yükseltin ve numuneye odaklanın. Ardından, mikroskopla birlikte verilen yazılımı açın.
Edinme'ye tıklayın, ardından Kamera'ya tıklayın ve mikroskoba bağlı kamerayı seçin. Aynı Edinme altında, Çok Boyutlu Edinme'ye tıklayın. Bu, yeni bir Çok Boyutlu Alım gezinti penceresi açar.
Çok kanallı düğmesine tıklayın, mevcut tüm kanallar görünecektir. Örneği gözlemlemek için mavi, yeşil ve DIC'yi seçin. Çok Boyutlu Alım gezinti penceresinde, mavi DAPI, yeşil GFP ve gri DIC kanallarını açık bırakın ve kapatmak için kırmızı Rhodamine ve beyaz Brightfield gibi diğer kanallara sağ tıklayın.
Her kanalın maruz kalma süresini ölçmek için, seçmek üzere mavi DAPI kanalına sol tıklayın ve otomatik pozlama süresine sahip canlı bir görüntü çekmek için "ölç"e tıklayın. Canlı görüntü penceresinin sol tarafında, isterseniz pozlama süresini manuel olarak ayarlayın ve ardından Tamam'ı tıklayın. GFP ve DIC kanalları için pozlama sürelerini benzer şekilde ayarlayın. Çok Boyutlu Alım gezinme penceresinde, ayarlanan pozlama süreleriyle sırayla üç farklı kanal altında üç görüntüyü otomatik olarak toplamak için "Başlat"a tıklayın.
Dosyayı kaydetmek için ana menüde Dosya'ya tıklayın, Farklı Kaydet'e tıklayın.Dosya adını ve klasörü girin. Ayrıntılı görüntüleme bilgilerini ileride başvurmak üzere saklamak için dosyayı varsayılan dosya biçimi olarak kaydedin. Dosyayı başka biçimlerde vermek için, Dosya'nın altında Dışa Aktar'ı tıklatın.
Dosya adını ve klasörü ayarlayın. Verileri daha iyi düzenlemek için "Proje klasörü oluştur" seçeneğini işaretleyin. Açılır menüden istediğiniz dosya türünü seçtikten sonra, dışa aktarmak için "Başlat"a tıklayın.
C.elegans'ta exl-1 ve exc-4 olmak üzere iki klorür hücre içi kanal protein homologu vardır. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, exl-1'in hayvan stres yönetimini düzenlediğini gösterdi. Burada, bir translasyonel exl-1 GFP yapısı bir hayvan genomuna entegre edildi ve yeşil floresan exl-1'i kararlı bir şekilde ifade eden transgenik çizgiler oluşturuldu.
Isı stresi altında, exl-1 GFP, güçlü bir GFP sinyali çekirdekle örtüştüğü için bağırsak bölgesindeki çekirdekte birikir. Exl-1'in hücre altı lokalizasyonunu doğrulamak için, hem etanol hem de asetonla sabitlenmiş hayvanlarda DAPI boyaması gerçekleştirildi. Her iki yöntem de hayvan vücudunda berrak çekirdekler gösterir ve örtüşen GFP ve DAPI sinyalleri, exl-1 GFP'nin gerçekten bağırsak bölgesindeki çekirdeklerde biriktiğini doğrular.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa bir saat içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, C.elegans'ta stres altında GFP sinyalini ve protein nükleer translokasyonunu korumak için hızlı bir fiksasyonun nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, bir marker olarak GFP füzyon proteini ve DAPI boyaması kullanılarak, ısı stresi altında bir proteinin nükleer translokasyonunun nasıl takip edileceğini göstermektedir. Yöntem hızlı ve verimlidir; nükleer boyamanın ve hücre altı lokalizasyon değişikliklerinin eş zamanlı olarak gözlemlenmesine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Nörobilim
- Genetik
Arka Plan
- Protein lokalizasyonunu anlamak hücre biyolojisinde kritik öneme sahiptir.
- Isı stresi, protein translokasyonunu ve lokalizasyonunu etkileyebilir.
- GFP füzyon proteinleri, proteinlerin takibi için değerli markörlerdir.
- DAPI boyaması, çekirdeklerin görselleştirilmesi için bir yöntem sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Isı stresi altında proteinin nükleer translokasyonunu izlemek.
- Protein lokalizasyonu için bir belirteç olarak GFP'den yararlanmak.
- DAPI boyama için hızlı bir protokol uygulamak.
Kullanılan Yöntemler
- Translasyonel konstrüktler içeren ekstrakromozomal dizilerin oluşturulması.
- İntegrasyon için C.elegans'ın gama radyasyonuna maruz bırakılması.
- Markör proteinler ile stabil eksprese edilen hatların seçimi.
- Nükleer ve hücre altı lokalizasyonun eş zamanlı gözlemlenmesi.
Temel Sonuçlar
- Isı stresi altında nükleer translokasyonun başarıyla takibi.
- GFP ve DAPI boyamasının etkili görselleştirilmesi.
- Protokolün C.elegans üzerindeki etkinliğinin kanıtlanması.
- Protein lokalizasyon dinamiklerine dair içgörülerin sağlanması.
Sonuçlar
- Protokol, protein dinamiklerini incelemek için değerli bir araçtır.
- Hızlı ve verimli yöntemler, hücre biyolojisi araştırmalarını geliştirmektedir.
- Gelecekteki uygulamalar diğer stres koşullarına da genişletilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulanabilirlik Özeti
Bu protokol, strese yanıt olarak proteinlerin hücre altı lokalizasyon değişimlerinin antikor kullanılmadan hızlı bir şekilde takip edilmesini sağlayarak, keşif iş akışlarındaki erken aşama hedef doğrulama süreçlerini destekler. GFP etiketlemesini DAPI nükleer boyama ile birleştiren bu yöntem, ısı stresi altında nükleer birikim gibi translokasyon olaylarının kantitatif ve görsel onayını sağlayarak, terapötik hipotezlerin mekanistik risk analizine veri sağlar. Yöntemin standart floresan mikroskoplarla uyumlu olması, yüksek kapasiteli tarama hazırlıkları ve biyofarma Ar-Ge ortamlarındaki fonksiyonlar arası ekip kullanımı için erişilebilirliğini artırmaktadır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Stresle tetiklenen protein translokasyonunun doğrudan gözlemlenmesini sağlayarak, fonksiyonel hedef doğrulamayı ve yolak sorgulamasını destekler.
- Operasyonel Değer: Antikor veya radyoaktif işaretleyici ihtiyacını ortadan kaldırarak, analiz geliştirme süresini ve maliyetini azaltır.
- Öngörücü Değer: Etki mekanizmasını veya stres yanıtı modülasyonunu işaret edebilecek hücre altı lokalizasyon değişimlerini doğrular.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Tutarlı ve tekrarlanabilir tarama platformları için GFP etiketli proteinler eksprese eden stabil transgenik hatlar oluşturur.
- Kantitatif Çıktı: Ko-lokalizasyon analizi için GFP sinyali ile nükleer DAPI boyamasının eş zamanlı ölçümüne olanak tanır.
- Ölçeklenebilirlik: Standart floresan mikroskopi ile uyumludur ve bileşik taraması için çok kuyucuklu formatlara uyarlanabilmesini sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlişkisi: Memeli homologları (örneğin, CLIC4) bulunan bir CLIC ailesi proteini olan EXL-1'in lokalizasyonunu izleyerek translasyonel hedef değerlendirmesini destekler.
- Mekanistik Risk Azaltma: Isı stresi altında nükleer translokasyonu doğrular ancak oksidatif stres altında doğrulamaz; böylece koşula özgü hedef davranışının tanımlanmasına yardımcı olur.
- Preklinik Süreklilik: In vivo doğrulama öncesinde, farklı stres koşulları altında protein dinamiklerini değerlendirmek için yeniden kullanılabilir bir sistem sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef hipotez testinden öncü bileşik tanımlamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine, özellikle stres yanıtlı proteinler için uyum sağlar. Bileşik tarama kampanyaları öncesinde hedef etkileşimini ve hücre altı dinamikleri doğrulayarak erken aşamadaki devam/durdurma kararlarını destekler.
- Keşif Biyolojisi: Belirlenmiş stres koşulları altında protein lokalizasyon değişikliklerini görselleştirerek terapötik hipotezleri test eder.
- Tarama: Yerleşik lokalizasyon okumalarıyla, bileşik kütüphanesi taramaları için valide edilmiş hücre tabanlı sistemler hazırlar.
- Analitik: Bileşiklerin protein trafiği üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kantitatif bir çıktı olarak ko-lokalizasyon verileri (GFP/DAPI örtüşmesi) üretir.
- Translasyonel Araştırma: Korunmuş CLIC proteinleri aracılığıyla C. elegans bulgularını memeli sistemleriyle ilişkilendirerek türler arası hedef validasyonunu destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Stres veya bileşik maruziyeti altında herhangi bir GFP etiketli proteinin subselüler dinamiklerini izlemek için modüler, yeniden kullanılabilir bir işlem hattı oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Canlı hücre bağlamlarında protein translokasyonuna dair doğrudan görsel kanıtlar sunarak mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Fixasyon ve görüntüleme protokollerini ekipler arasında standartlaştırarak tekrarlanabilirliği artırır ve değişkenliği azaltır.
- Stratejik Değer: Hedef doğrulama sürelerini hızlandırarak daha hızlı portföy önceliklendirmesi sağlar ve yanlış pozitif hedeflere yapılan yatırımları azaltır.
- Portföy Etkisi: Hastalıkla ilişkili stres modellerinde hedef davranışını doğrulayarak risk ayarlı ilerlemeyi destekler.
Uygulama Hususları
- C. elegans kullanımı, transgenik hat oluşturma ve floresan mikroskopi konularında uzmanlık gerektirir.
- FITC ve DAPI filtre setlerine ve Nomarski optiklerine sahip bir floresan mikroskoba erişime bağlıdır.
- GFP sinyalini korumak ve tutarlı DAPI nükleer etiketlemesi sağlamak için fiksasyon (etanol/aseton) ve boyama sürelerinin standartlaştırılması gerekir.
- Diğer model sistemlere adaptasyon; promotör gücünün, etiketleme verimliliğinin ve stres paradigmalarının optimizasyonunu gerektirebilir.
- Pratik sınırlama: Saptanabilir translokasyona sahip proteinler için en uygundur; canlı görüntüleme olmadan hızlı veya geçici mekikleme olaylarını çözümleyemeyebilir.
