Name: Düzenlenmiş ekzositozu için muhabir olarak FITC dextran görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Öğrenin, FITC-dextran muhabir kullanarak düzenlenmiş ekzositoz modlarını canlı hücre görüntüleme ile ayırt etme yöntemini. Mast hücreleri ve diğer salgılayıcı hücre türlerinde sekresyon mekanizmalarını gerçek zamanlı inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. U. Ashery cDNA cömert bir hediye için teşekkür ederiz. Biz Drs. G. kütle, L. Mittleman, M. Shaharbani ve Y.Zilberstein Sackler hücresel ve moleküler görüntüleme Merkezi mikroskobu ile onların çok değerli yardım için teşekkür ederim. Bu eser Amerika Birleşik Devletleri-İsrail iki uluslu Bilim Vakfı (grant 2013263 R. Sagi-Eisenberg, ı. Hammel ve S.J.Galli) tarafından desteklenen ve 933/15 Bilimler (için R.Sagi-Eisenberg İsrail Akademisi tarafından kurulan İsrail Bilim Vakfı Hibe ) ve NIH hibe U19 AI 104209 ve R01 AR067145 (için S.J. Galli).

1. hazırlıkları
<ol><li>RBL Kültür medya hazırlanması<ol>
<li>Mix 500 mL düşük glikoz Dulbecco'nın 5.5 mL penisilin-streptomisin-nistatin çözeltisi, 5.5 mL L-glutamin 200 mM çözeltisi ile 56 mL fetal Sığır serum (FBS), kartal'ın orta (DMEM) değiştiren. Bu sonuçlarında düşük glikoz DMEM %10 FBS, 100 µg/mL streptomisin, 100 adet/mL penisilin, 12 adet/mL nistatin ve 2 mM L-glutamin ile desteklenmiştir.</li>
		<li>Medya 4 ° C'de 0,22 µm gözenek boyutu ve mağaza bir üst-vakum filtre kullanarak filtre uygulama</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bakım RBL hücre.<ol>
<li>RBL hücreleri maksimum confluency 10 cm tabak içinde % 90 için büyür. Hücre kültürü sağlıklı ise, hücreleri ara sıra çıkıntılar bir iğ şeklinde olmalı.</li>
		<li>Medya aspirating ve 5-10 dakika oksijen bir atmosferde % 5 CO2 37 ° C'de 2 mL trypsine/EDTA çözeltisi B. Incubate ile değiştirerek çanak hücreleri bölme hücre için ayırmak</li>
		<li>Hücreleri ayırdıktan sonra kültür ortamının bir pipet kullanarak 2 mL ekleyerek tripsin etkisiz hale getirmek ve bir 1:2-1'deki hücreleri bölme: 10 oranı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>20 x Tyrode'nın arabellek hazırlanması<ol>
<li>Bir hisse senedi 20 x 54 mM KCl çözeltisi, 20 mM MgCl2, 2.74 M NaCl ve 8 mM NaH2PO4 kişilik distile su (DDW)'te hazırlayın. Mix iyi ve 4 ° C'de depolayın</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. canlı cep mikroskobu RBL hücre kültürü
<ol><li>FITC dextran çözüm hazırlanması.<ol>
<li>FITC dextran tozu (150 K) 1 mg 1 mL (bkz. Adım 1.1.1) kültür ortamının karıştırın. Tam bir odacıklı coverglass için 3 mL hazırlayın.</li>
		<li>Selüloz asetat şırınga filtre ünitesi 0,22 µm gözenek boyutu ile kullanarak, çözünmüş FITC dextran filtre uygulama.</li>
		<li>Fare IgE 1 µg/mL konsantrasyonu için ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RBL hücreleri görüntüleme için tohum<ol>
<li>Görüntüleme, önceki gün kültür çanak medyadan Aspire edin ve 5-10 dakika 37 ° C'de % 5 CO2 oksijen bir ortamda 2 mL trypsine/EDTA çözeltisi B. Incubate ile değiştirin Hücreleri ayırdıktan sonra tripsin kültür ortamının 2 mL ekleyerek etkisiz hale getirin.</li>
		<li>Count RBL bir hemasitometre kullanarak hücreleri ve buna göre ses seviyesini kültür medyayla 7.5 x 105/mL bir hücre konsantrasyon.</li>
		<li>Hücre süspansiyon ile taze FITC dextran önceden doldurulmuş bir odacıklı coverglass için 10 µL Kültür (Bu 7.5 x 103 hücreleri bir odasında, tohum sonuçlanır) medya takıma ekleyin.</li>
		<li>Gecede bir atmosferde humified 37 ° C'de % 5 CO2 RBL hücrelerin büyümesine Hücreleri bir alt konfluent kademede hücreler ayrılır ve mikroskop altında tek tek her hücre tanımlamak için kolay emin olmak için kalmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RBL hücre - isteğe bağlı transfection.<ol>
<li>Exocytic olaylar fluorescently etiketli diğer proteinler ile birlikte görüntüleme için Azouz ve ark. hücrelerde RBL için transfection Protokolü Bkz: 67
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. canlı cep mikroskobu ekzositozu
<ol><li>Çözümler hazırlanması:<ol>
<li>Bir son Tyrode'nın arabellek çözüm 1: 20'ddw hisse senedi çözümde sulandrarak hazırlamak seyreltme ve ek 20 mM Hepes pH 7, 1.8 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA ve 5.6 mM glikoz ile.</li>
		<li>Taze bir 20 x salgılatıcı reaktif Tyrode'nın tampon hazırlamak [1 µg/mL dinitrophenyl Birleşik insan serum albumin (DNP-(Ag) vardır) bir 50 ng/mL 1 x konsantrasyon için bizim durumumuzda].</li>
		<li>400 mM amonyum klorür çözüm toz Tyrode'nın tampon çözülerek hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücreleri hazırlanması.<ol>
<li>Odacıklı coverglass odası ortamdan aspirating ve 37 ° C'ye prewarmed Tyrode'nın tamponunun 300 µL ile dolum tarafından 3 kez yıkamak Son olarak, odası 37 ° C'ye prewarmed Tyrode'nın tamponunun 300 µL ile doldurmak</li>
		<li>Odacıklı coverglass mikroskop'ın kuluçka odasında yerleştirin. Odası kararlı olduğundan emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikroskop kurma<ol>
<li>İzlemek ilgi bir bölge seçmek için floresan ışık kaynağı (civa lamba geleneksel olarak) açın ve uygun floresan filtre seçin (yeşil fluorophores FITC dextran görüntülemek için filtre seçin). Bölgenin ilgi odak ve görüş alanı ortasında kez fotoğraf ağartma ve toksisite önlemek için ışık kaynağının açmak. Not: Bazı hücrelerde dahil FITC dextran floresans saklayabiliriz. Bunun nedeni FITC dextran da endosomes gibi sigara lizozomal bölmeleri için sıralanmış.</li>
		<li>Uygun aydınlatma FITC uyarma için açın. Lazer tabanlı bir mikroskop kullanarak, 488 nm lazer üzerinde açın. Emisyon çevresinde toplanan 500-550 nm (FITC emisyon tepeler, 510-520 nm).</li>
		<li>Confocal mikroskop kullanırken, iğne deliği ve sondaj maksimum açın. Bu beyazlatma önlemek için daha düşük lazer güç ve toksisite kullanarak sağlayacak ve hücrenin tüm uçaklar olaylardan ekzositozu yakalanması sağlayacaktır.</li>
		<li>Resim satın almalar arasındaki zaman aralığını ayarlama.<ol>
<li>Farklı hücrelere düzenlenmiş ekzositozu68onların kinetik içinde değişebilir. Bileşik ekzositozu belirli görüntüleme için bir zaman aralığı en az 5 saniye öneririz. Ancak, kural olarak, hızlı görüntüleme için izin vermek için tek bir kare alma zamanın hızlı olduğundan emin olun.</li>
			<li>Lazer tarama confocal mikroskop kullanırken, çift yönlü tarama yönünü ayarlamak, değil ortalama için izin ve ayarla çözünürlük 512 x 512 (önerilen; ikinci iki Hükümler Ayrıca ağartma ve toksisite en aza indirmek için yardımcı olur).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ekzositozu görüntüleme.<ol>
<li>Görüntü hücre hücre veya salgılatıcı türüne bağlı olarak istenilen süreler için. IgE/Ag ile tetiklenen RBL hücrelerde en exocytic olayları harekete geçirmek içinde 15-20 dk oluşur.</li>
		<li>Hücrelerin aktivasyonu için odasına salgılatıcı çözüm x 20 16 µL ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücreleri FITC dextran huzurunda teyit.<ol>
<li>Varlığı ve yerelleştirme FITC-dextran SGs için onaylamak için 16 µL amonyum klorür çözüm (dikkatli odası odak kaybetmek değil sırayla hareket olmak) odasına yavaşça ekleyin (bu-ecek yapmak son bir konsantrasyon 20 mm). Bu SGs alkalization ve saniye içinde gerçekleşir FITC floresan, dequenching neden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip finansal faiz beyan

Burada nasıl izleme FITC dextran SGs yüklenen floresans özellikle bileşik ekzositozu olayları yakalamak için kullanılabilir açıklar. Bu her 15 saniyede bir görüntü elde etmek için mikroskop ayarlayarak, böylece yalnızca uzun ömürlü olaylar zaman içinde kaydedilecek sağlanması ve bu nedenle tam ekzositozu veya öpücük tarafından işletilen ekzositozu karşılık kısa etkinlikleri hariç sağlanır. Yöntem kurmak için RBL hücrelerde ifade edilir ve bileşik ekzositozu için hayati önem, genel salgısı hücre tarafından değil etkilenir...

Düzenlenmiş ekzositozu tarafından kolayca yapılan kargo yanıt-e doğru belirli bir tetikleyicinin salgı bir hücrede bulunan serbest için birincil mekanizmasıdır. Kargo önceden oluşmuş ve salgı veziküller, tetikleyici SGs içerik sürümü için sinyal rölesi kadar bu depolandığı içine münzevi. Farklı tipteki sinyalleri düzenlenmiş ekzositozu farklı modlarda neden olabilir veya düzenlenmiş ekzositozu farklı mod aynı anda ortaya çıkabilir. Düzenlenmiş ekzositozu üç ana mod bilinmektedir: tam füzyonu ile plazma zarı; tek bir salgı granül içerir tam ekzositozu Onun geri dönüşüm tarafından takip plazma zarı ile geçici füzyon salgı granül içerir öpücük tarafından işletilen ekzositozu; ve birkaç SGs önceden (yani, multigranular ekzositozu) homotipik füzyon tarafından karakterize bileşik ekzositozu veya sıralı (yani, sıralı ekzositozu) Fusion plazma zarı1. Kargo yer alan SGs--dan da dahil olmak üzere, hızlı salgılanmasını sağlar gibi bileşik ekzositozu kargo release2, en geniş modunda plazma zarı distal kabul edilir. Bileşik ekzositozu hem ekzokrin ve endokrin hücreleri3,4,5,6,7,8,9, hem de belgelenmiş oldu bağışıklık hücreleri. Bağışıklık hücreleri, eozinofiller10,11,12 ve nötrofil13gibi bileşik ekzositozu arabulucu gibi işgal patojenleri öldürmek için gerekli olan hızlı ve sağlam sürümü sağlar bakteri ya da asalak. Doğuştan gelen bağışıklık yanıtı, anafilaksi ve diğer alerjik reaksiyonlar14,15,16 sırasında önceden saklı inflamatuar aracılar verimli sürümü için bileşik ekzositozu mast hücreleri (MCs) dağıtma , 17. bu yana ekzositozu farklı mod18,19aynı anda ortaya çıkabilir, onları gerçek zamanlı olarak ayırt etmek için ya da bu nedenle elucidating onların anılan sıraya göre fusion makineleri belirlemek için bir meydan okuma olmuştur onların temel mekanizmaları.
Burada dayalı bir yöntem mevcut canlı hücre hücrenin görüntüleme exocytic olaylar gerçek zamanlı izleme ve onların farklı modları arasında ayrım sağlar FITC-dextran, yüklü. Özellikle, bizim Yöntem özel bileşik ekzositozu izleme sağlar.
FITC dextran glukan polisakkarit dextran ile pH duyarlı fluorophore FITC eşlenik var. Fluorescently etiketli dextrans hücre girmek için micropinocytosis20,21 ve macropinocytosis22,23tarafından gösterilmiştir. Endositik bölmeleri organellerin olgun olarak FITC dextran hiçbir belirgin bozulma ile lysosome içinde biriken gösterilmiştir. Ancak, beri FITC çok pH hassas fluorophore24ve lysosome lümen asittir, lysosome24ulaşan üzerine FITC dextran floresans quenches. Bu nedenle dextrans lysosome kurulması, FITC pH hassasiyeti ile birlikte alınan kargo, hedeflenen çalışmalar lysosome ekzositozu25,26,27 FITC dextran kullanımında temeli atılmıştır var , 28 , 29.
MCs, nötrofiller, eozinofiller, sitotoksik T hücreleri, melanosomes ve diğerleri de dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinin SGs lizozomal özellikleri görüntülemek ve organelleri (LROs) lysosome ile ilgili ya da salgı organellerin30,31 sınıflandırılır . LROs asidik bir luminal pH var, FITC dextran daha yüksek pH LROs exteriorization ile ilişkili bir sonucu olarak kendi ekzositozu görselleştirmek için kullanılabilir. Nitekim, FITC dextran ekzositozu MCs18,32,33içinde izlemek için kullanılır. Bu yöntemde, FITC dextran hücre kültürü için eklendi, hücreler tarafından pinocytosis tarafından alınan ve SGs sıralanmış. Organellerin içinde olduğu gibi hücre içinde oldukları zaman FITC floresans SGs söndürülür. Ancak, plazma zarı ve bunun sonucunda maruz kalma dış çevre ile SG fusion FITC dextran onun floresans SG pH yükselir olarak basit bir izleme exocytic olayları canlı cep mikroskobu tarafından izin kavuşur. Burada, bileşik ekzositozu benzersiz izlemeyi etkinleştirmek için bu yöntemi ayarlanır.
Diğer iki yöntem daha önce bileşik ekzositozu izlemek için kullanılmaktadır. Elektron mikroskobu ekzositozu farklı mod oluşumunu önerdi exocytic yapıları karakterize etmek için ilk yöntem oldu. Özellikle, "salgı tünellerde" pankreas acinar hücreleri34 ve MCs35,36,37 gözlemleri bileşik ekzositozu hipotez için doğuran. Ancak, elektron mikroskobu yüksek çözünürlüklü erimiş veziküller ortaya çıkarmak için güç olsa da, onların füzyon dinamikleri takip edemez ve bu nedenle onlar SG füzyon bileşik ekzositozu sırasında veya alınmış granül füzyonu karşılık tanımlayamazsınız onların endositoz takip. Plazma zarı kapasite11,13,38,39 veya amperometry düzeltme eki kelepçe ölçülerini gibi canlı hücrelerdeki ekzositozu ölçebilirsiniz diğer yöntemleri bu engeli aşmak 40 medya. Ancak, özel bir kurulum gerektirir yama sıkma ve tüm hücre türleri için uygun olmayabilir. Amperometry ölçümler elektrot birbirine çok yakın kargo yayımlanırsa ekzositozu takip edebiliyoruz. Bu nedenle, canlı hücre Imaging'i kullanma gibi sadece ekzositozu gerçek zamanlı izleme için sağlar, ama aynı zamanda tüm cep telefonu veri hızlı ve basit edinimi sağlar Bu yöntemler üzerinde bir avantaj sağlar.
FITC dextran izleme canlı cep mikroskobu tarafından bazı avantajları diğer canlı hücre için görüntüleme tabanlı yöntemleri sunuyor. Örneğin, yaygın olarak kullanılan bir yöntem bir floresan SG sonda ile yüklenen veya bir floresan protein öğesini SG kargo veya membran protein26,41, ifade hücrelerinin toplam iç yansıma floresans mikroskobu (TIRFM) olduğunu 42 , 43. sadece (burada ayak izi adlandırılır), plazma zarı yakın meydana gelen olayları izlemek için onun yetenek bu yöntemin gücü yatıyor dolayısıyla exocytic olaylar. Bu coverglass için bitişik ve mikroskop objektif yakın olabilir hücre Kesir44yansıma ancak, aynı zamanda bu yöntemin dezavantajı olmasıdır. Böyle ayak izleri gerçekten tüm hücre membran yüzey temsil olup olmadığını hala tartışmaya açık45,46,47yaşında. Bu bağlamda, bir pH duyarlı boya gibi FITC dextran ve Standart Floresan mikroskop ya da confocal mikroskop ile açık bir iğne deliği kullanarak böylece o hücrede oluşan toplam exocytic olayları yakalama tüm cep telefonu, görüntüleme sağlar.
Tüm cep telefonu görüntüleme veya TIRFM tarafından düzenlenir ekzositozu eğitim için kullanılan ek pH duyarlı gazetecilere SG kargo veya phlourin için bir pH duyarlı GFP değişken erimiş SG membran protein içerir. Örnek NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin ve synapto-phluorin48,49,50,51,52verilebilir. Bu sondalar ifade daha yakından SGs endojen bileşimi temsil ederken, transfection hücre gerektirir ve bu nedenle daha az transfect zor olan hücreler için uygun olabilir. Bu nedenle, ne zaman eğitim bu hücreleri transfect zor veya birden çok genomik manipülasyonlar gerektiren deneysel koşullar altında sadece FITC-dextran gibi hücre kültür ortamına içine desteklenebilir bir bileşik kullanımı avantajlıdır . FITC dextran akridin turuncu (AO), üzerinde bir avantaj sunduğu diğer ekzositozu izleme için canlı cep mikroskobu53,54,55,56 tarafından kullanılan başka bir pH duyarlı boya , 57 , 58. AO gerçek salgılanması için karşılık gelmeyen yanlış yanıp söner, sonucu27işler veziküller photolysis ikna etmek için gösterilen. Buna ek olarak, FITC dextran düşük fotoğraf kaynaklı üretim / reaktif oksijen27nedeniyle muhtemelen daha iyi salgı olayları yansıtır.
Özellikle, ekzositozu eğitim için alternatif bir boya, bu işlem sırasında açılır füzyon gözenek aracılığıyla SG içine dış ortamdan akını izleyerek yaklaşımıdır. Bu durumda, boya salgı tetik yanında dış ortama eklenir. O zaman, Füzyon gözenek açıldığında, boya SG59,60dağılır. Bu yöntemin açık bir avantaj bu da füzyon gözenek boyutu, değişken boyutu boyalar kullanılarak tahmin olanağı sunuyor olmasıdır. Örneğin, farklı molekül ağırlığı (MW), farklı fluorophores için Birleşik dextrans ekstrasellüler boyaları nereye SG nüfuz dextran en büyük boyutunu füzyon gözenek59, boyutuna karşılık olarak kullanılabilir 61 , 62 , 63 , 64. Buna ek olarak, bu yaklaşım bir pH duyarlı sonda kullanımı gerektirmez. Ancak, önemli bir dezavantaj boya büyük miktarda alım kaynaklanan yüksek arka planda görüntülerin sırasında medyada mevcut olduğu için sinyal gürültü oranı çok düşük olmasıdır.
Genel olarak, ekzositozu avans olarak FITC dextran kullanımı daha önce raporlanmış yöntemleri, sinyal gürültü oranı, toksisite, dinamik izleme ve karmaşıklık gibi çeşitli dezavantajları üstesinden gelir.
Burada FITC dextran (burada RBL, öncelikle Eccleston vd tarafından kurulan denir RBL - 2 H 3 mast hücresi doğrultusunda bileşik ekzositozu izlemek için nasıl kullanılacağını açıklar 65 ve daha da klonlanmış tarafından Barsumian vd. 66), yanıt immünglobulin E (IgE) / antijen (Ag) etkinleştirme.

<table><tbody><tr><td>DMEM düşük glikoz</td><td>Biyolojik İndükleyiciler</td><td>01-050-1A</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Gibco</td><td>12657</td><td></td></tr><tr><td>Pen-strep-nistatin çözeltisi</td><td>Biyolojik İndükleyiciler</td><td>03-032-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM çözeltisi ve nbsp;</td><td>Biyolojik İndüktörler</td><td>03-020-1A</td><td></td></tr><tr><td>FITC dekstran 150K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46946-500MG-F</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin / EDTA Çözeltisi B</td><td>Biyolojik İndüktörler</td><td>03-052-1A</td><td>37 °C'de Sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>0.22 & mikro üst vakum filtresi; m gözenek boyutu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430769-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Selüloz asetat şırınga filtre ünitesi, 0.22 & m gözenek boyutu</td><td>Sartorius</td><td>16534K</td><td></td></tr><tr><td>Odacıklı kapak camı&nbsp;</td><td>Termo bilimsel</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Corning doku kültürü ile muamele edilmiş kültür kapları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Anti-DNP monoklonal IgE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8406</td><td></td></tr><tr><td>DNP-HSA (Ag)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A6661 ve nbsp;</td><td>Doğrudan ışığa maruz kalmaktan kaçının</td></tr><tr><td>Hepes tamponu 1M, pH 7.4</td><td>Biyolojik İndükleyiciler</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>MERK</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>BDH Laboratuvarları</td><td>284515V</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum klorür</td><td>MERK</td><td>1145</td><td></td></tr><tr><td>BORULAR dipotasyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108321-27-3</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum asetat hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114460-21-8</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum asetat tetrahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum glutamat (L-Glutamik asit potasyum tuzu monohidrat)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO 4</td><td>MERK</td><td>6346</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>MERK</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>MERK</td><td>105833</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>MERK</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporatörü&nbsp;</td><td>BTX</td><td>ECM830</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop, Zeiss</td><td>Zeiss</td><td>LSM 5 Pascal, Axiovert 200M</td><td>Şekil 3'te kullanılmıştır. Elektronik sıcaklık kontrollü hava akımı inkübatörü ile donatılmış</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop, Zeiss</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800, Axio Observer.Z1 /7</td><td>Şekil 2'de kullanılmıştır. GaAsP dedektörü ile donatılmış, elektronik sıcaklık kontrollü hava akımı inkübatörü</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop, Leica</td><td></td><td>Leica SP5</td><td>Şekil 1'de kullanılmıştır. Bir leica HyD dedektörü ve bir üst aşama inkübatörü (okolab) ile donatılmış</td></tr> <tr><td>RBL-2H3 hücreleri</td><td></td><td></td><td>RBL-2H3 hücreleri, Reuben P. Siraganian laboratuvarında klonlandı. Referans 67'ye bakın</td></tr></tbody></table>

düzenlenmiş ekzositozu için muhabir olarak fitc dextran görüntüleme

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Düzenlenmiş ekzositozu tarafından salgı granül (SGs) depolanan, kargo, yanıt salgı tetikleyici olarak yayımlanan bir süreçtir. Düzenlenmiş ekzositozu hücreler arası iletişim için temel ve nörotransmitter, hormonlar, inflamatuar aracılar ve diğer bileşenleri, hücreler çeşitli tarafından salgılanmasını için önemli bir mekanizma. En az üç farklı mekanizmaları için düzenlenmiş ekzositozu bilinir: tam ekzositozu nerede tek bir SG tam olarak plazma zarı, nerede bir tek SG geçici plazma zarı ile sigortalar, öpücük ve çalıştırma ekzositozu ve bileşik ekzositozu, sigortalar, nerede birkaç SGs ile her diğer, önce veya sonra SG füzyon plazma zarı ile sigorta. Düzenlenmiş ekzositozu bir hücre tarafından üstlenilen tipi kez salgı tetikleyici türü tarafından belirlenir. Ancak, birçok hücrelerde, tek bir salgı tetikleyici düzenlenmiş ekzositozu birden çok modları aynı anda etkinleştirebilirsiniz. Bereket ve hücre tipleri ve türler arasında önem rağmen salgı farklı mod belirlemek mekanizmaları büyük ölçüde çözümlenmemiş. Düzenlenmiş ekzositozu, farklı mod soruşturma içinde ana sorunlardan biri onları ayrı ayrı keşfetmek gibi aralarında ayrım zorluk var. Burada floresein isothiocyanate (FITC) nasıl kullanılacağını açıklar-dextran bir ekzositozu gazeteci ve canlı hücre düzenlenmiş ekzositozu bileşik ekzositozu üzerinde odaklanarak, farklı yollar arasında ayırt etmek için Imaging olarak dayalı sağlamlık ve exocytic olaylar süresi.

Şekil 1a şematik nasıl FITC dextran muhabir olarak ekzositozu düzenlenmekte ve exocytic olayları farklı mod özetlemek için hareket edebilir temsil eder. İlk olarak, hücre hangi pinocytosis tarafından içselleştirilmiş ve SGs için sıralanmış FITC-dextran ile inkübe. MCs SGs LROs olduğundan, onların düşük pH FITC, burada gösterildiği gibi siyah granül floresans bozamıyor (A-C, ben). Hücreleri bir salgılatıcı ve plazma zarı ile SGs sigorta tarafından tetiklendiği...

Burada biz ayrıntılı olarak düzenlenmiş ekzositozu canlı hücre görüntüleme için bir yöntem. Bu yöntem lysosome ilgili organelleri içinde birikir, FITC-dextran muhabir olarak kullanır. Bu basit yöntem aynı zamanda genetik olarak işlemek zor olan hücrelerdeki düzenlenmiş ekzositozu farklı modları arasında ayrım sağlar.

Düzenlenmiş ekzositozu için muhabir olarak FITC dextran görüntüleme

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

Bu yöntem, araştırmacıların canlı hücredeki farklı ekzositoz modları arasında ayrım yapmalarına izin vererek, düzenlenmiş ekzositoz araştırmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, basit olması ve hücrelere minimum bozulma gerektirmesidir. Bu yöntem mast hücre ekzositozu hakkında bilgi sağlayabilse de, nötrofiller ve eozinofiller gibi diğer salgı hücrelerine de uygulanabilir.Başlamak için, metin protokolüne göre 20x Tyrode tamponundan oluşan bir stok çözeltisi hazırlayın. Daha sonra, üç miligram FITC-dekstran tozunu üç mililitre kültür ortamı ile karıştırın. Çözünmüş FITC-dekstanı bir selüloz asetat şırınga filtre ünitesi ile filtreleyin.Ardından, fare IgE'sini mililitre başına bir mikrogram konsantrasyona ekleyin. Görüntülemeden bir gün önce, bir kültür kabından ortamı aspire edin ve iki mililitre Tripsin EDTA Çözeltisi B ile değiştirin. Hücreler ayrıldıktan sonra, Tripsin'i nötralize etmek için tabağa iki mililitre kültür ortamı ekleyin.Ardından, RBL hücrelerini saymak için bir hemositometre kullanın. Mililitre başına 750.000 hücrelik bir konsantrasyon elde etmek için süspansiyonun hacmini kültür ortamı ile ayarlayın. Daha sonra, taze FITC-dekstran takviyeli kültür ortamı ile odacıklı bir kapak camına 10 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve RBL hücrelerini gece boyunca büyütün.İlk olarak, metin protokolüne göre son bir Tyrode tampon çözeltisi hazırlayın. Ardından, yeni yapılmış tamponda 20x sekretagog reaktifi hazırlayın. 400 milimolar amonyum klorür çözeltisi oluşturmak için amonyum klorür tozunu Tyrode'un tamponunda çözün.Ardından, medyayı odacıklı kapak camından aspire edin ve 300 mikrolitre önceden ısıtılmış Tyrode tamponu ile değiştirin. Yıkama işlemini iki kez tekrarladıktan sonra, hazneyi 300 mikrolitre Tyrode tamponu ile doldurun. Ardından, odacıklı kapak camını bir mikroskobun inkübatör odasına yerleştirin ve haznenin stabil olduğundan emin olun.Floresan ışık kaynağını açın ve uygun floresan filtresini seçin. İlgilenilen bölge netlendiğinde, görüş alanının ortasında ışık kaynağını kapatın. Ardından, 500 ila 550 nanometre civarında toplanan emisyon ile 488 nanometre lazeri açın.Ardından, görüntü alımları arasındaki zaman aralığını kalibre edin. Tarama yönünü çift yönlü olarak ayarlayın, ortalamaya izin vermeyin, iğne deliğini açın ve çözünürlüğü 512 x 512 olarak ayarlayın. Ardından, hücreleri belirli hücre tipi veya sekretagog için uygun süre boyunca görüntüleyin.Daha sonra sekretagog çözeltisinden hazneye 16 mikrolitre ekleyin ve çekime devam edin. Son olarak, FITC-dekstran'ın salgı granüllerine varlığını ve lokalizasyonunu doğrulamak için, odaya yavaşça 16 mikrolitre amonyum klorür çözeltisi ekleyin. Bu protokolde, düzenlenmiş ekzositozun canlı hücre görüntülemesi için raportör olarak FITC-dekstran kullanılmıştır.FITC-dekstran salınımının görüntülenmesi, bileşik ekzositozun sıralı doğasının yakalanmasına izin verir. Ortama amonyum klorür eklendikten sonra, FITC-dekstran görünür hale gelir ve RBL hücrelerinde salgı granüler raportörü olarak mRFP etiketli nöropeptit Y ile birlikte lokalize olur. Bu prosedürü denerken, hücrelerin lazere maruz kalmasını en aza indirerek film çekerken hücrelere toksisiteyi en aza indirmek önemlidir.Bu, düşük lazer gücü ve kısa alım süresi kullanılarak elde edilebilir. Bileşik ekzositotik olaylar, diğer düzenlenmiş ekzositik olaylara kıyasla daha uzun ömürlü olduğundan, edinimler arasında uzun bir zaman aralığı ayarlayarak bileşik ekzositozu kategorik olarak yakalayabiliriz.

imaging-fitc-dextran-as-a-reporter-for-regulated-exocytosis

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, etiket ve görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi kullanılarak goldfish retina bipolar hücreleri tek sinaptik vezikül ekzositoz ve ticareti nasıl göstermek.

Retina Bipolar Hücreler TIRF Mikroskopi Görüntüleme ekzositoz

Bu video, mast hücrelerinde ekzositozu görselleştirmek için bir tekniği göstermektedir. Hücreler, asidik pH'ın floresansını söndürdüğü salgı granülleri (SG'ler) içindeki hücreler tarafından alınan bir floresan raportör olan FITC-dekstran ile inkübe edilir. Granül ekzositozunun uyarılması üzerine, ortamın daha yüksek pH'ı, bir floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilen kaynaşmış SG'lerin içinde raportör floresansını indükler.

Mast Hücrelerinde Salgı Granüllerinin Ekzositozunu Görselleştirmek için İn Vitro Bir Teknik

Polarizasyon tabanlı Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (pTIRFM) hücre zarı dinamiklerinin gerçek zamanlı algılama sağlar. Bu makalede, düzenlenmiş Ekzositoz sırasında zar yeniden çalışma için pTIRFM uygulanmasını tarif etmektedir. Teknik doğrudan veya dolaylı membran şekil değişiklikleri içeren hücre biyolojisi diğer işlemler için genellenebilir.

PTIRFM ile görüntüleme Plazma Membran deformasyonlar

Klatrin aracılı endositoz, hızlı ve oldukça dinamik bir süreç, sinyal reseptörleri de dahil olmak üzere birçok proteini içselleştirir. Burada açıklanan protokol, bireysel endositik olayların kinetiğini doğrudan görselleştirir. Bu, endositik makinenin çekirdek üyelerinin birbirleriyle nasıl koordine olduğunu ve protein yükünün bu süreci nasıl etkilediğini anlamak için gereklidir.

TIRF Mikroskopi ile Tek olay ebatları da G protein-bağlanmış alıcılar üzerinden Klatrin dolayımlı endositoz görselleştirme

Bu makale, bir sinaptobrevin2-pHluorin yapısı ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanarak nöroblastom hücrelerinde nörotransmitter vezikül dinamiklerini araştırmak için bir yöntem sağlar. Görüntü işleme ve veri analizi için geliştirilen strateji de raporlanmaktadır.

TIRFM ve pH-duyarlı GFP-sondalar SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde nörotransmitter Vesikül Dynamics değerlendirin: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi

Endositik organellerin sızmasına neden olan bir reaktifle basit bir birlikte inkübasyon protokolü ile proteinlerin ve hücre geçirimsiz küçük moleküllerin kültürlenmiş memeli hücrelerine nasıl verileceğini açıklıyoruz.

Endosomolitik Reaktif dfTAT ile kuluçkaya yatırılması ile Canlı hücreler içine proteinler, peptitler ya da hücre-geçirgen olmayan küçük moleküller teslimi

pH'ya duyarlı bir florofor ile bir membran proteinin hücre dışı alanını Etiketleme, superecliptic pHluorin (SEP), hücre içi lokalizasyonu, sentezleme ve trafik saptanmasına olanak sağlamaktadır. Görüntüleme toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) proteinleri Eylül-etiketli periferal ER ve plazma membranı protein seviyelerinin ölçümü sağlar.

pHluorin etiketli Reseptör kullanarak Subselüler Yerelleşme ve Ticareti Monitör

Çok kuyulu mikro plakalar kullanan otomatik tahliller, tek bir deneyde çok sayıda koşulun değerlendirilmesine izin vererek yol düzenleyicilerini tanımlamak için avantajlı yaklaşımlardır. Burada, köklü makropinozom görüntüleme ve niceleme protokolünü 96 kuyulu bir mikro plaka formatına uyarladık ve çok modlu bir plaka okuyucu kullanarak otomasyon için kapsamlı bir anahat sağladık.

Floresan Etiketli Makropinozomların Nicelleştirilmesi için Otomatik Görüntüleme ve Analiz

Bu çalışmada, floresein-izotiyosiyanat etiketli (FITC) dekstran, hem in vivo hem de plazma ve dışkı örneklerinde bağırsak geçirgenliğini değerlendirmek için farelere oral gavaj yoluyla uygulanmaktadır. Bağırsak bariyeri fonksiyonu birçok hastalık sürecinde etkilendiğinden, bu doğrudan ve nicel tahlil çeşitli araştırma alanlarında kullanılabilir.

Floresein-İzotiyosiyanat-Etiketli Dextran Kullanarak Farelerde Bağırsak Bariyer Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Vezikül serbest kinetiği ölçmek için yeteneği nörotransmisyon bazı temel içgörü sağlamak yardımcı olabilir. Burada kırmızı floresan boya FM 4-64 etiketli veziküller presinaptik hipokampal nöron kültürlerinde vezikül serbest hızını ölçmek için gerçek zamanlı görüntüleme kullanılır.

Nöronlar FM Etiketleme kullanarak ölçüm ekzositoz

Öğrenin, FITC-dextran muhabir kullanarak düzenlenmiş ekzositoz modlarını canlı hücre görüntüleme ile ayırt etme yöntemini. Mast hücreleri ve diğer salgılayıcı hücre türlerinde sekresyon mekanizmalarını gerçek zamanlı inceleyin.

Düzenlenmiş ekzositozu için muhabir olarak FITC dextran görüntüleme

Daha fazla video keşfet