Prostat kanserinde Phosphoproteome araştırmak için etiket içermeyen nicel kütle spektrometresi ile birleştiğinde Phosphopeptide zenginleştirme

Bu yöntem, terapötik dirençten sonra sinyal ağlarındaki değişiklikleri değerlendirmek için kanser alanı gibi fosforilasyon sinyalinin ilgi çekici olduğu herhangi bir araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, fosfoproteomu küresel olarak değerlendirmek için binlerce fosfopeptidin nispeten basit ve ucuz bir şekilde tanımlanabilmesidir. Tümör dokusunu toplamak için tümörü tartın ve bir kültür test tüpünde, her 100 miligram doku için iki mililitre buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin.

Ardından, lizatı homojenize etmek için el tipi veya tezgah üstü bir homojenizatör kullanın. Numuneyi azaltmak ve alkollemek için, tüpü 95 santigrat derecede beş dakika ısıtın, ardından numuneyi buz üzerinde 15 dakika soğutun. Hala buz üzerindeyken, lizatı üç kez sonikleştirin, ardından numuneyi beş dakika boyunca 95 santigrat derecede ısıtın.

Sonikasyon tüpünü sallanan bir kova rotoruna yerleştirin ve lizatı 15 dakika boyunca 3, 500 g ve 15 santigrat derecede santrifüjleyin, ardından süpernatantı toplayın ve peleti atın. Lizatı sindirmek için, guanidinyum miktarını azaltmak için numuneyi 12 kat seyreltmek için 100 milimolar tris kullanın. Beş miligram protein için 10 mikrogram lizil endopeptidaz veya lys-C ekleyin ve numuneyi oda sıcaklığında beş ila altı saat inkübe edin.

Bir ila 100 tripsin / protein oranında eklenen 20 milimolar kalsiyum klorür ve tripsin ile bir milimolar HCL'de TPCK ile muamele edilmiş tripsin mililitre başına bir miligram hazırlayın. Numuneyi 37 santigrat derecede üç saat inkübe edin. Daha sonra tüpe ilave bir tripsin alikotu ekleyin ve numuneyi gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Numuneyi 15 mililitre 10 kilodaltonluk bir kesme filtresine ekleyin. Numuneyi, tutma hacmi 250 mikrolitreden az olana kadar 3, 500 g ve 15 santigrat derecede sallanan bir kovada veya sabit açılı rotorda santrifüjleyin. Ardından akışı toplayın ve kalıntıyı atın.

Numuneyi asitleştirmek için, mililitre lizat başına yaklaşık 20 mikrolitre %5 Trifloroasetik Asit veya TFA ekleyin. Tüpü iyice karıştırın ve pH'ı ölçmek için bir pH şeridi kullanın. Gerekirse, pH'ı 2,5'e ayarlamak için ekstra %5 TFA ekleyin.

Ardından, bir C18 kolonunun daha kısa ucuna bir vakum manifolduna bağlayın. Vakumu 17 ila 34 kilopaskal arasında ayarladıktan sonra, sütunu ıslatmak için üç mililitre %100 asetonitril ve bir cam pipet kullanın. Bir cam pipet kullanarak ve %0,1 TFA'lık iki adet üç mililitrelik alikot uygulayarak sütunu dengeleyin.

Ardından asitlenmiş numuneyi kolona yükleyin. Sütunu yıkamak için üç adet üç mililitrelik 0.1 TFA hacmi kullanın. Daha sonra numuneyi elüte etmek için iki mililitre %40 ACN %0.1 TFA uygulayın ve iki iki mililitrelik fraksiyonu cam kültür tüplerine toplayın.

Parafilm ile, eluent tüplerini kapatın ve numuneleri gece boyunca liyofilize etmeden önce kapağa üç ila beş delik açmak için 20 gauge bir iğne kullanın. Liyofilize tozu, her fraksiyonda 0.5 mililitre buz gibi soğuk immünopresipitasyon veya IP bağlayıcı tampon ile yeniden süspanse edin. 0,5 mililitrelik yeniden süspansiyon hacmini ikinci fraksiyondan ilk fraksiyonla birlikte tüpe aktarın ve pipet ucunu saklayın.

İçeriği kriyotüpe aktarmadan önce her bir liyofilizasyon tüpünü durulamak için 0,5 mililitre başka bir IP tamponu kullanın, ardından iki mililitre IP tamponu kullanarak durulamayı tekrarlayın. Mililitre başına 0.5 miligram antikor boncuk bulamacını mikrofüj tüpüne aktarmak için kesilmiş uçlu bir P200 kullandıktan sonra, 50 mikrolitre 4G10 antikor boncuk bulamacını yıkamak için 450 mikrolitre buz gibi soğuk IP bağlama tamponu ekleyin ve 25 mikrolitre 27 B10.4 antikor boncuk bulamacı bir mikrofüj tüpünde. Tüpü bir dakika boyunca 100 g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.

Süpernatanı aspire ettikten sonra, boncukları yeniden süspanse etmek için orijinal IP bağlama tamponu bulamacı olarak eşit bir hacim ekleyin. Vidalı kapaklı kriyotüplerde yeniden süspanse edilmiş numune çözeltisine önceden yıkanmış pY boncukları ekleyin, ardından bunları gece boyunca uçtan uca bir döndürücüde dört santigrat derecede inkübe edin. Boncukları döndürdükten sonra, pST peptitlerini zenginleştirmek için kullanılacak süpernatanı saklayın.

Daha sonra, boncukları yeniden süspanse etmek ve bunları iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için 300 mikrolitre IP bağlama tamponu kullanın. Numuneleri bir dakika boyunca 100 g ve dört santigrat derecede döndürün. Daha sonra 500 mikrolitre IP bağlama tamponu ile boncukları üç kez yıkayın.

Boncukları 450 mikrolitre 25 milimolar amonyum bikarbonat pH 7.5 ile dört kez yıkayın. Bir jel yükleme ucunu boncuk yüzeyinin biraz altına batırın ve süpernatanı tamamen aspire edin. Boncuklara %0,1 TFA'lık boncuk hacminin dört katını ekleyin.

Daha sonra bunları iyice karıştırın ve tüpü 1.000 rpm ve 37 santigrat derecede bir termomikserde 15 dakika inkübe edin. Yeniden süspansiyonu 0,2 mikrometre döndürme filtresine aktarın ve filtreyi bir dakika boyunca 850 g'da santrifüjleyin. Elüsiyonu düşük proteinli bağlayıcı bir mikrosantrifüj tüpüne aktardıktan sonra, eluenti gece boyunca 300 dakikalık bir ısı süresiyle 40 santigrat derecede kuruyana kadar vakumla konsantre edin.

Uçlarda bulunan titanyum oksit boncukları hazırlamak için 200 mikrolitre %100 ACN ekleyin. Ardından ters çevirin ve sıvıyı kapağa doğru hareket ettirmek için dar ucunu hafifçe vurun. Bir tıraş bıçağı kullanarak ucu kesin ve düşük proteinli bağlayıcı tüpün üzerine yerleştirin.

Ardından kapağı çıkarın ve yıkamayı tekrarlamadan önce kalan ACN'yi çıkarmak için bir mikropipet yerleştirin. Titanyum dioksiti 500 mikrolitre% 100 ACN ile iki kez ön koşullandırın. Daha sonra titanyum dioksiti 500 mikrolitre 0.2 molar sodyum fosfat tamponu pH 7 ile iki kez şartlandırın.

Son olarak, boncukları üç kez yıkamak için 300 mikrolitre dengeleme tamponu kullanın. Düşük proteinli bağlama tüpüne 400 mikrolitre %50 ACN %0.1 TFA ekleyin. Sonra 84 mikrolitre laktik asit ekleyin.

Yeniden süspanse edilmiş fosfopeptitleri düşük proteinli bağlayıcı tüpe aktarın ve bir saat boyunca uçtan uca döndürücü kullanarak oda sıcaklığında inkübe edin. Boncukları peletledikten sonra, iki kez yıkamak ve döndürmek için 300 mikrolitre dengeleme tamponu kullanın. 300 mikrolitre durulama tamponu ile boncukları iki kez durulayın.

Ardından bunları 0,2 mikrometre döndürme filtresine aktarın. Döndürdükten sonra, filtre ünitesini temiz bir 1,5 mililitre düşük proteinli bağlayıcı tüpe aktarın ve 200 mikrolitre %0,9 su ile içindekileri iki kez elüte edin. PH'ı kontrol ettikten sonra, amonyağı buharlaştırmak için eluenti gece boyunca kuruyana kadar vakumla konsantre edin.

MS analizi için peptitleri tuzdan arındırmak için, fosfopeptitleri 15 mikrolitre% 0.1 TFA ile sulandırın. Numuneyi beş mikrogram bağlama kapasitesine sahip bir C18 ucu kullanarak temizleyin ve üreticinin protokolünü izleyin. Son olarak, elüsyon hacmini vakum konsantrasyonu ile tamamen kuruttuktan sonra, kurutulmuş fosfopeptitleri 12.5 mikrolitre kütle spektrometresi çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.

Bu Coomassie ile boyanmış önceden sindirilmiş lizat jeli, proteinlerin varlığını doğrularken, sindirildikten sonra lizatın boyanması tam sindirimi doğrular. Tam sindirim için, lys-C ve tripsin için sırasıyla 30 kilodalton ve 23.3 kilodalton bantları dışında 15 kilodaltonun üzerinde hiçbir bant görünmemelidir. Lys-C'nin eklenmesi aynı zamanda kaçırılan dekoltelerin sayısını da azaltır.

pY immünopresipitasyonu, pY'yi pST'den etkili bir şekilde ayırır, peptitler, pY preparatından tanımlanan fosfopeptitlerin ortalama %85'i pY ve pST preparatından tanımlanan fosfopeptitlerin %99'undan fazlası pST'dir. Titanyum dioksit, her iki preparatta da fosfopeptitleri zenginleştirmek için kullanılır. MS hazır preparatında fosforile edilen peptitlerin beklenen yüzdesi %30 ila %50 arasındadır ve tespit edilen fosfopeptitlerin çoğu tek veya çift fosforil grubuna sahiptir.

Kütle spektrometresi gerçekleştirildikten sonra, MS ham dosyaları bir MS analiz yazılımına yüklenir. Burada gösterildiği gibi, 0.75'ten daha büyük bir lokalizasyon olasılığı kesme ayarı, pY peptitlerinin yaklaşık% 5'ini ve pS ve pT peptitlerinin% 15'ini% ve% 34'ünü filtreler. Bu filtreleri uyguladıktan sonra, MS analizinin sonunda beklenen fosfopeptit tanımlaması sayısı, başlangıç proteininin beş miligramı için yaklaşık 300 pY peptit ve ilgili zenginleştirme preparatlarından 2.5 miligram başlangıç peptit miktarı için yaklaşık 7.500 pS peptit ve 640 pT peptittir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, pY ve pST adımları paralel olarak gerçekleştirilirse bu teknik altı gün içinde yapılabilir. Bununla birlikte, sekizden fazla numune için, teknik hatayı azaltmak için fazladan dört gün boyunca adımları sırayla gerçekleştirin. Bu prosedürleri denerken, ayrıntılara odaklanmayı unutmamak önemlidir.

Her adım önemlidir ve gerekli kalite kontrolleri de dahil olmak üzere son hazırlıkların kalitesini etkileyebilir. Bu videoyu izledikten sonra, proteinlerin nasıl ekstrakte edileceğini ve sindirileceğini iyi anlamalı ve ardından fosfoproteomdaki küresel değişiklikleri araştırmak için kütle spektrometresi yoluyla analiz için fosfopeptit zenginleştirme yapmalısınız.