Vitro Farklılaşma fare granülosit-makrofaj-koloni uyarıcı faktör (GM-CSF)-T yardımcı (T_HGM) hücreleri üreten

Bu yöntem, multipl skleroz gibi inflamatuar hastalıkların patogenezinde hangi T-yardımcı hücre alt kümesinin GM-CSF'nin ana kaynağı olduğu gibi CD4 T hücresi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, yeni bir T-yardımcı hücre kümesi olan THGM'nin regresyonunun ve fonksiyonunun araştırılması için temel hücresel kaynak sağlayan, hiç etkileşime giren gama OI17 ekspresyon hücresi olmayan veya çok az enterferans yapan gama OI17 hücresi olan naif CD4 T hücrelerinden %50'den fazla GM-CSF eksprese eden T-hücreleri üretmesidir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Yi Lu olacak.

Altı ila sekiz haftalık bir farenin karnının üzerindeki cildi kaldırmak için forseps kullanarak ve hayvanın sol tarafında göğüs kafesinin altında yaklaşık dört santimetrelik bir kesi yaparak başlayın. Dalağı ortaya çıkarmak için periton kesesini açın ve dalağı iki mililitre hücre izolasyon tamponu ile önceden ıslatılmış 70 mikrometrelik bir süzgecin üzerine aktarmak için steril forseps kullanın. İki ila üç dalak toplandığında, dalak dokusunu yumuşatmak için beş mililitrelik bir şırınganın ucunu kullanın ve tüm hücreler tüpe atılana kadar süzgeci bir ila iki mililitre hücre izolasyon tamponu ile birkaç kez durulayın.

Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti beş mililitre dört santigrat derece amonyum klorür potasyum lizis tamponunda yeniden süspanse edin. İki dakikalık hafif karıştırmadan sonra, 10 mililitre tam RPMI ortamı ile lizizi durdurun ve hücreleri hemen santrifüjleyin. CD4 pozitif T hücrelerini izole etmek için, beyaz kan hücresi peletini beş mililitre hücre izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin ve herhangi bir kalıntıyı gidermek için hücre süspansiyonunu 30 mikrometrelik bir süzgeçten yeni bir 15 mililitrelik tüpe süzün

Saydıktan sonra, hücreleri 90 mikrolitre tampon konsantrasyonu başına bir kez 10 ila yedinci hücrede yeniden süspanse edin ve her beş dakikada bir karıştırarak dört santigrat derecede 15 dakikalık bir inkübasyon için yedinci hücrelere 10 kez 10 mikrolitre anti-CD4 konjuge manyetik boncuk ekleyin. Hücreler inkübe edilirken, manyetik bir stand üzerine bir ayırma sütunu yerleştirin ve sütunu iki mililitre tamponla önceden ıslatın. Daha sonra, hücreleri beş mililitre tamponla yıkayın ve peleti bir mililitre tampon içinde yeniden süspanse edin.

Numuneyi kolona yükleyin ve CD4 negatif fraksiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın. Tüm hücreler kolondan geçtiğinde, rezervuarı kurumadan önce yıkama başına bir mililitre tamponla üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, kolonu 15 mililitrelik yeni bir konik tüpe aktarın ve pozitif boncuk fraksiyonunu dışarı atmak için kolonu iki mililitre hücre izolasyon tamponu ile daldırın.

Daha sonra, CD4 pozitif hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Floresanla aktive edilen hücre sıralaması için, saf T hücreleri, boncuk sıralanmış CD4 pozitif hücre peletini 500 mikrolitre tampon içinde yeniden süspanse edin ve hücreleri uygun bir floresan konjuge antikor kokteyli ile karıştırın. Işıktan korunan buz üzerinde 20 ila 30 dakika sonra, hücreleri beş mililitre taze tamponda yıkayın ve peleti 500 mikrolitre taze tamponda tekrar süspanse edin.

Hücreleri naylon bir ağdan süzün ve hücreleri 500 mikrolitre tampon ile önceden kaplanmış bir FACS tüpüne aktarın. CD4 pozitif, CD25 negatif ve CD44 düşük CD62 ligandı yüksek hücre popülasyonlarını seçmek için kapı. Daha sonra, saf CD4 pozitif CD25 negatif CD44 düşük CD62 ligand yüksek T hücresi fraksiyonlarını yeni bir 15 mililitrelik santrifüj tüpüne sıralayın ve izole edilmiş saf CD4 pozitif T hücrelerini santrifüjleme ile peletleyin.

Granülosit Makrofaj-Koloni Uyarıcı Faktör veya GM-CSF T-yardımcı hücre farklılaşması için, sıralanmış T hücrelerini, 50 mikromolar beta-merkaptoetanol içeren tam RPMI ortamında mililitre başına 10 ila altıncı hücre konsantrasyonunda bir kez yeniden süspanse edin ve anti-CD3 epsilon antikorunu önceden kaplanmış 48 oyuklu bir plakanın her bir oyuğundan aspire edin. Daha sonra, IL7, anti-CD28 ve anti-IFN gama ile birlikte her bir oyuğa 2,5 kez 10 ila beşinci hücre tohumlayın ve hücreleri üç gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin. Kültürün üçüncü gününde, hücre farklılaşmasını kontrol etmek ve hücreleri santrifüjleme için toplamak için bir mikroskop kullanın.

Peletleri iki yıkama için taze tam RPMI ortamında yeniden süspanse edin, sayım için ikinci yıkamadan sonra hücreleri bir mililitre taze tam ortamda yeniden süspanse edin. Hücreleri üç eşit hacme bölün ve dört ila altı saat boyunca bir protein taşıma inhibitörü varlığında PMA ve İyonomisin ile hücrelerin ilk alikotunu yeniden uyarın. Stimülasyonun sonunda, anti-CD4 antikoru ile boyama için hücreleri toplayın.

30 dakika sonra, hücreleri 20 ila 60 dakika boyunca 200 mikrolitre fiksasyon tamponu ile sabitleyin, ardından yıkama başına bir mililitre geçirgenlik tamponunda iki yıkama yapın. Ardından, karanlıkta 30 dakika boyunca hücre içi sitokin ekspresyonu için boyayın. Farklılaşmış hücre sitokin gen ekspresyonunun kantitatif PCR analizi için, hücreleri üç saat boyunca plakaya bağlı anti-CD3 epsilon ile aktive edin.

Ardından, kantitatif PCR için cDNA hazırlığına izin vermek üzere toplam RNA'yı izole etmek için bir fenol RNA ekstraksiyon reaktifi kullanın. Farklılaşmış hücreler tarafından sitokin protein sekresyonunu değerlendirmek için, hücreleri 24 saat boyunca plakaya bağlı anti-CD3 epsilon ile yeniden uyarın ve IL17 ve GM-CSF için kültür süpernatantlarını ELISA ile analiz edin. GM-CSF T-yardımcı hücre farklılaşması koşulları altında kültürlenen hücrelerin yaklaşık% 55'i GM-CSF'yi eksprese ederken, T-yardımcı 17 koşulları altında farklılaşan hücrelerin sadece yaklaşık% 2'si bu sitokini eksprese etti.

Hücrelerin yaklaşık% 8'i tarafından IL17 üretimi ile sonuçlanan T-yardımcı 17 farklılaşma koşullarıyla karşılaştırıldığında, GM-CSF T-yardımcı hücre farklılaşma koşulları, hücrelerin sadece yaklaşık% 1'inde IL17 ekspresyonunu indükledi. Özellikle, hücrelerin sadece bir kısmı, her iki kültür koşulu altında IFN gama veya IL4'ü eksprese eder. GM-CSF T-yardımcı farklılaşmış hücreler, önemli ölçüde daha yüksek bir CSF2 mRNA ekspresyonu gösterir, ancak T-helper 17 hücrelerine kıyasla çok daha düşük bir IL17 ekspresyonu gösterir.

Bu, T-yardımcı GM-CSF ve T-yardımcı 17 hücrelerinden kültür süpernatantlarında gözlenen GM-CSF protein ekspresyonu ile ilişkilidir, T-yardımcı GM-CSF hücre kültürlerinde tespit edilen sitokin konsantrasyonunun üç katı ve hiç ölçülebilir IL17 yoktur. T-yardımcı GM-CSF hücreleri ayrıca T-yardımcı 17 hücrelerine göre biraz daha düşük bir Rorc ekspresyonu, daha yüksek bir Stat5 ekspresyonu ve biraz daha düşük bir Stat3 ekspresyonu sergiler, bu da T-yardımcı hücre GM-CSF ve IL17 farklılaşmasının farklı transkripsiyonel faktörler tarafından yönetilmesine rağmen, bazı ortak özellikleri paylaşabilirler. Bu prosedürü denerken, hücreleri ve reaktifleri steril tutmak için biyolojik güvenlik kabinindeki tüm adımları gerçekleştirmeyi unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, THGM hücreleri tarafından ifade edilen önemli genler nelerdir gibi ek soruları yanıtlamak için transkriptom analizi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, immünoloji alanındaki araştırmacıların, T hücresinden türetilen GM-CSF'nin kemirgenlerde iltihaplanmaya nasıl katkıda bulunduğunu keşfetmelerinin yolunu açtı. Beta-merkaptoetanol ve RNA ekstraksiyon reaktifi ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu reaktifleri kullanırken çeker ocak kullanmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.