ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada Singapur Ulusal Üniversitesi Sağlık sistemi (T1-2014 Ekim-12 ve T1-2015 Eylül-10) gelen hibe tarafından desteklenmiştir.

Bu protokol için kullanılan tüm fareler üzerinde C57BL/6 genetik arka plan vardı ve Singapur Ulusal Üniversitesi, patojen-Alerjik belirli koşullarda muhafaza. Tüm deneyler kurumsal hayvan bakım ve Singapur Ulusal Üniversitesi kullanım Komitesi tarafından onaylanmış protokolleri kullanılarak yapıldı.
1. reaktif ve malzeme hazırlığı
<ol><li>Fosfat tamponlu tuz (PBS) % 2 fetal Sığır serum (FBS) ve 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) içeren 500 mL hazırlayın. Not: en iyi sonuçlar için tüm prosedürü boyunca buzda arabellek tutun.</li>
	<li>50 mL RPMI 1640, %10 FBS ve % 1 penisilin streptomisin içeren tam RPMI ortam hazırlamak. 50 µM β-mercaptoethanol THGM hücre farklılaşması için içeren komple RPMI medya kullanın. β-mercaptoethanol bir duman mahallede ekleyin.</li>
	<li>Bir anti-CD3e antikor karışımı 7.5 mL anti-CD3e konsantre stok PBS 3 μg/ml sulandrarak hazırlayın. Her şey için 150 μL antikor karışımı ekleyerek 48-şey plakaları ceket ve plaka için en az 1 h 37 ° C'de veya 4 ° C'de gecede kuluçkaya.</li>
	<li>Bir çift makas ve forseps sterilize ve gruptakiler arasında % 70 etanol içinde saklayın.</li>
</ol>2. fare Splenocytes hazırlanması
<ol><li>(Toplam 6 – 8 haftalık) fare ötenazi bir kurumsal olarak onaylı CO2 boğulma veya servikal çıkması kullanarak. Fare % 70 etanol ile sprey ve sırtında polistren blokta monte edin. Biyolojik Emanet aşağıdaki adımlarla devam kabin fareyi aktarın.</li>
	<li>Forseps bir çift kullanarak cilt tutun ve yaklaşık 4 cm, makas kullanarak için sol tarafında göğüs kafesi altındaki deriyi kesme. Dalak ve steril forseps dalak ayıklamak için kullanın periton sac açın.</li>
	<li>50 mL tüp üzerinde 70 mikron hücre süzgeç koyun ve ön tampon 2 mL ile ıslak. Dalağı hücre süzgeç (2-3 dalağı bir hücre süzgeç için) yerleştirin ve 5 mL şırınga dalgıç sonuna kullanarak macerate.</li>
	<li>Hücrelerin tümünü tüpüne atılır kadar süzgeç ve tüp birkaç kez 1-2 mL hücre izolasyon arabelleği ile yıkayın. Hücre süzgeç atmak ve 350 x g 4 ° C'de 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.</li>
	<li>Hücre Pelet 5 mL soğuk (4 ° C) amonyum-klorür-arabellek (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA; pH 7.2-7,4) lysing potasyum (ACK) ile resuspend ve onları için 2 dk. eklemek 10 mL ACK nötralize etmek için tam RPMI medya karışımı yavaşça tampon ve hemen 350 x g 4 ° C'de 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi Süpernatant Santrifüjü sonra atın.</li>
</ol>3. manyetik CD4 lastikteki ve bir hücre ayrılık sütun kullanarak yalıtım CD4 + t hücreleri
<ol><li>Hücre Pelet hücre izolasyon arabellek 5 mL resuspend. Herhangi bir enkaz kaldırmak için yeni bir 15 mL tüp içine bir ön ayırma filtresi (30 mikron) kullanma hücre süspansiyon filtre.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 10 μL take ve 10 x seyreltme 90 μL arabelleği ekleyerek. Seyreltilmiş hücre süspansiyon 10 μL alıp trypan hücre sayımı için mavi 10 μL ile karıştırın. Hücrelerin verim belirlemek için bir hemasitometre hücreleri saymak.</li>
	<li>350 x g 4 ° C'de 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
	<li>Arabellek 90 μL hücrelerde başına 107 hücre resuspend. Manyetik CD4 lastikteki 107 hücre başına 10 μL ekleyin. 4 ° C'de 15 dakika için hücreleri kuluçkaya En iyi sonuçlar için hücre süspansiyon kuluçka sırasında hafifçe her 5 dakika karıştırın.</li>
	<li>Hücreleri kuluçka iken, bir ayrılık sütun manyetik sandalyesine koyun. Sütun 2 mL arabelleği ile önceden ıslak.</li>
	<li>Hücre/boncuk inkübasyon sonunda 5 mL arabelleği hücrelerle yıkama ve onları vasıl 350 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.</li>
	<li>1 mL arabelleği hücrelerde resuspend, örnek hücre ayrılık sütuna yük ve akışı sağlar. 15 mL santrifüj tüpü CD4 hücre kesir toplamak için kullanın. Önce kuru göl yıkamak için arabellek 1 mL ekleyin. 2 x çamaşır adımı yineleyin.</li>
	<li>Hücre ayrılık sütun manyetik standından çıkarın ve bir yeni 15 mL santrifüj tüpü yerleştirin. Hücre izolasyon arabelleğinin 2 mL hücre ayrılık sütununu ekleyin ve pistonu sıkıca sütun hücreleri zorlamak için geçerlidir.</li>
	<li>350 x g 5 min 4 ° C'de CD4 + hücre elde etmek için de kesir santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak.</li>
</ol>4. arıtma Naive CD4 + T hücre (CD4+CD25-CD44loCD62LMerhaba) Floresan aktif hücre sıralama ve THGM farklılaşma tarafından
<ol><li>Elde edilen CD4 + hücre Pelet arabellek 500 µL içinde resuspend. Hücreleri CD4-PerCp içeren bir floresan Birleşik antikorlar karışımı ile karıştırın (2.8 µg/mL), CD44-APC (2.4 µg/mL), CD25-PE (2 µg/mL) ve CD62L-FITC (10 µg/mL) (Tablo 1). 20-30 dk, buz hücrelerdeyse ışıktan koruyarak kuluçkaya. Not: Antikorlar konsantrasyonları daha önce laboratuarda optimize. 1-2 fareler hücrelerden için listelenen antikorlar sayısıdır.</li>
	<li>Kuluçka sonra arabellek 5 mL hücrelerle yıkama ve 350 x g 4 ° C'de 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Süpernatant atın ve 500 µL arabelleği hücrelerde resuspend. Tekrar bir naylon mesh kullanarak hücreleri filtre.</li>
	<li>Hücre süspansiyon hücre sıralama bir FACS tüp aktarın. Arabellek 500 µL koleksiyonu FACS tüplerini precoat.</li>
	<li>Bir CD4 elde+CD25-CD44loCD62LMerhaba nüfus (saf CD4,+ T hücreleri) FACS sıralama tarafından. CD4 kapıya+CD25- ilk ve o zaman seçme CD44loCD62LMerhaba hücreleri bu popülasyon.</li>
	<li>Saf CD4 toplamak+ T hücre kesirler yeni 15 mL santrifüj tüpüne. 350 x g 4 ° C'de 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
	<li>Saf CD4 + T hücreleri 106 hücre/mL 50 µM β-mercaptoethanol içeren tam RPMI medyada bir konsantrasyon, resuspend.</li>
	<li>Precoating 48-şey plaka için kullanılan anti-CD3e antikorlar Aspire edin. Her şey 7 Il ile tohum 0,25 milyon (250 µL) hücrelerinde (2 ng/mL), anti-CD28 (1 µg/mL) ve anti-IFNγ (10 µg/mL) (Tablo 1). Not: Sitokin ve antikorlar konsantrasyonları önceden laboratuarında bir THGM hücre farklılaşması için optimize.</li>
	<li>%5 CO2 37 ° C'de hücreler için 3 gün kuluçkaya. Orta kuluçka sırasında değiştirmeyin.</li>
</ol>5. analiz fare THGM hücre Vitro oluşturulan
<ol><li>Bir mikroskop kullanarak, sonra farklılaşma hücre farklılaşma 3 d kontrol edin. Hücreleri hasat ve onları vasıl 350 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi Hücreler 2 yıkama x komple RPMI medya ile. Not: Farklılaşmış hücreler daha naif CD4 + T hücre boyutu büyük.</li>
	<li>1 mL tam RPMI medya hücrelerde resuspend. Hücre süspansiyon 10 μL alıp trypan bir hemasitometre ile cep numarasını belirlemek için mavi 10 μL ile iyi karıştırın. Bir restimulation ve analiz için üç iksir farklılaşmış hücreler bölün. Not: Hücre içi sitokin boyama ve ELISA deneyleri ≥0.5 milyon hücre gerektirir ve ≥ 1 milyon hücre qPCR analiz gerektirir.</li>
	<li>
Hücre içi sitokin boyama için hücreleri phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) ile restimulate (100 ng/mL) ve ionomycin (1 μg/mL) 4-6 h için protein taşıma inhibitörü (1 µL/mL) huzurunda.
	<ol>
<li>Hücreleri hasat ve onları anti-CD4 antikor ile leke (0.2 mg/mL, 1: 100 seyreltme; PerCP-Birleşik, veya FITC-Birleşik, 0,5 mg/mL, 1: 100 seyreltme) 30 dk için.</li>
		<li>Hücreleri 200 μL fiksasyon arabelleği için 20-60 dk ile düzeltmek. Fiksasyon sonra hücreleri 2 yıkama x 1 mL permeabilization arabelleği ile.</li>
		<li>Hücre içi GM-CSF (PE-Birleşik, 0.2 mg/mL, 1: 100 seyreltme), karşı antikor ile IL-17A (FITC-Birleşik, 0,5 mg/mL, 1: 100 seyreltme; boyama. gerçekleştirmek APC-conjugated, 0.2 mg/mL, 1: 100 seyreltme), IL-4 (APC-Birleşik, 0.2 mg/mL, 1: 100 seyreltme) ve IFNγ (APC-Birleşik, 0.2 mg/mL, 1: 100 seyreltme; PE-conjugated, 0.2 mg/mL, 1: 100 seyreltme) 30 dk içinde belgili tanımlık karanlık için.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sitokin gen ekspresyonu farklılaşmış hücreler tarafından qPCR analiz için (1.3 adımda anlatıldığı gibi plaka precoating) hücreleri plaka bağlı anti-CD3e (3 μg/mL) ile aktif hale getirin. Stimülasyon sonra 3 h toplam RNA cDNA için qPCR hazırlamak için fenol RNA ayıklama reaktif kullanarak yalıtmak için hücre hasat. Astar ve qPCR için kullanılan program Tablo 2 ve 3, anılan sıraya göre listelenir.</li>
	<li>Sitokin protein salgılanması farklılaşmış hücreler tarafından analiz için plaka bağlı anti-CD3e (3 μg/mL) hücrelerle 24 h (1.3 adımda anlatıldığı gibi plaka precoating) için restimulate. Hücre kültürü IL-17 ve GM-CSF ELISA için onların konsantrasyonu belirlemek için süpernatant hasat.</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, J., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4+T+cells%3A+fates%2C+functions%2C+and+faults%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD4 T cells: fates, functions, and faults.</a> Blood. 112, 1557-1569 (2008).</li>
<li>Kara, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailored+immune+responses%3A+novel+effector+helper+T+cell+subsets+in+protective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity.</a> PLoS Pathogens. 10, e1003905(2014).</li>
<li>Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Immunology+meets...Immunology%3A+Modified+cancer+cells+as+professional+APC+for+priming+naive+tumor-specific+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells.</a> Oncoimmunology. 6, e1356149(2017).</li>
<li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TH17+cells+in+development%3A+an+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).</li>
<li>Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17+and+Th17+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-17 and Th17 Cells.</a> Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).</li>
<li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT5+programs+a+distinct+subset+of+GM-CSF-producing+T+helper+cells+that+is+essential+for+autoimmune+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation.</a> Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).</li>
<li>Codarri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RORgammat+drives+production+of+the+cytokine+GM-CSF+in+helper+T+cells%2C+which+is+essential+for+the+effector+phase+of+autoimmune+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation.</a> Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).</li>
<li>El-Behi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+encephalitogenicity+of+T%28H%2917+cells+is+dependent+on+IL-1-+and+IL-23-induced+production+of+the+cytokine+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF.</a> Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).</li>
<li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+nuclear+receptor+RORgammat+directs+the+differentiation+program+of+proinflammatory+IL-17%2B+T+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells.</a> Cell. 126, 1121-1133 (2006).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+subset+of+helper+T+cells+promotes+immune+responses+by+secreting+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF.</a> Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).</li>
<li>Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+in+Neuroinflammation%3A+Licensing+Myeloid+Cells+for+Tissue+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage.</a> Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada bir iletişim kuralı yöntemi doğrulamak için farklılaştırılmış hücrelerin bir analizini tarafından takip fare saf CD4 + hücrelerden bir vitro THGM farklılaşma açıklanan. Not, dalak ve lenf bezleri saf CD4 + T hücre arıtma ve THGM farklılaşma için kullanılabilir. Hücre içi sitokin gösterdi ki hücreler yaklaşık % 55'i akış sitometresi ile kombine boyama tarafından belirlenen sitokin ifade indüklenen GM-CSF-ifade hücreleri (Şekil 1A) THGM koşul al...

CD4 + T yardımcı (TH) hücreleri mikrobiyal patojenler karşı ana savunma, kanser gözetim ve otoimmünite1,2,3çok önemli rolleri olan bağışıklık sisteminin temel bileşenleridir. T hücre reseptör (TCR) etkinleştirme, üzerine saf CD4 + T hücreleri TH1, TH2 farklılaşmış, TH 17 veya düzenleyici T (Treg) farklı sitokin ni2,4, etkisi altında hücreleri. 5. son zamanlarda, ağırlıklı olarak GM-CSF üreten yeni hücre alt grubunu TH , tespit ve THGM6adında. THGM hücrelere farklılaşma sinyal dönüştürücü aktivasyonu ve bir aktivatör transkripsiyon 5 (STAT5) IL-7 tarafından tahrik edilmektedir. Bu hücreler diğer THdüşük bir ifade yaparken GM-CSF büyük miktarda hızlı-IFNγ ve IL-176gibi imza sitokinler hücre. GM-CSF CD4 + T hücre-aracılı neuroinflammation7,8gelişiminde önemli bir rol oynamaya bulundu. IFNγ - veya IL-17-ifade autoreactive T hücrelere kıyasla, GM-CSF-ifade T bir önceki hastalığı başlangıçlı ve daha yüksek hastalık şiddeti neden vahşi-türüne aktarılan (WT) fare hücreleri. IFNγ veya IL-17A eksik T hücreleri EAE7aracılık yeteneğini muhafaza, ancak buna ek olarak, Csf2- / - T hücreleri deneysel otoimmun ensefalomiyelit (EAE) ikna etmek WT alıcıya aktarılan adoptively sonra başarısız oldu. Ayrıca, GM-CSF nötralize antikorları kullanarak bir abluka EAE hastalık şiddeti8iyileştirmiştir. Ayrıca, STAT5 T hücrelerin farelerde eksikliği azalmış THGM üretimi ve bu nedenle, bir direnç farelerin EAE geliştirme6' sonuçlandı. Bu bulgular önemini GM-CSF-ifade TH hücre otoimmün neuroinflammatory hastalığında altını çiziyor. Böylece, saf CD4 + T hücreleri GM-CSF-ifade TH hücrelerden ayırt etmek için bir yöntem oluşturma otoimmün neuroinflammation ve T hücre-aracılı bağışıklık yanıtı patogenezinde çalışmada önemli olacaktır. Ancak, bir protokol bu verimli THGM hücreleri fare saf kurulmuştur CD4 + değil oluşturur.
Burada saf CD4 + T hücreleri fare THGM hücrelerden ayırır bir yöntem mevcut. Bu iletişim kuralı fareden dalak çıkarma, bir tek hücre süspansiyon, CD4 pozitif seçim, floresans aktif hücre (FACS) sıralama ve TH hücre hazırlanması da dahil olmak üzere tüm yordamı açıklar farklılaşma ve analiz. Farklılaştırılmış T yardımcı hücreleri tek hücre düzeyinde sitokin ifade mRNA düzeyinde belirlemek için nicel bir gerçek zamanlı PCR tarafından sitokin ifade belirlemek için akış sitometresi ile kombine boyama hücre içi sitokin tarafından incelenir ve protein düzeyinde sitokin ifade değerlendirmek için ELISA tarafından. Bu yöntem THGM hücre biyolojisi EAE, nerede GM-CSF patogenezinde önemli bir rol oynar gibi çeşitli koşullarda çalışmaları uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Biowest</td><td>L0500-500</td><td></td></tr><tr><td>FBS Isı ile Etkisiz</td><td>Oğlak</td><td>FBS-HI-12A</td> Penisilin-Streptomisin <td></td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>1. Baz</td><td>BUF-2040-10</td><td>Steril suda 1x PBS'ye Seyreltilmiş</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>1. Baz</td><td>BUF-1053-100ml-pH8.0</td><td></td></tr><tr><td>10x ACK tamponu</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td>steril suda seyreltilmiş</td></tr><tr><td>Hücre süzgeci</td><td>SPL Yaşam Bilimleri</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>CD4 mikro boncuklar</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-201</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>LS sütunu</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>manyetik stand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>1 mL şırınga</td><td>Terumo</td><td>SS + 01T</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Sony SY3200 hücre sıralayıcı</td><td>Sony</td><td>Sony SY3200 hücre sıralayıcı</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik santrifüj tüpü</td><td>Greiner Bio-One</td><td>210261</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konik santrifüj tüpü</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>FACS tüpü</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu hücre kültürü plakası</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>anti-fare CD4 PerCP-eFluor 710</td><td>eBioscience</td><td>46-0041-82</td><td></td></tr><tr><td>PE konjuge anti-fare CD25 (IL-2Ra, p55)</td><td>eBioscience</td><td>12-0251-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan/fare CD44 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0441-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-fare CD62L FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0621-85</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer tarafından geliştirilmiş sayım odası</td><td>Marienfeld</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Tripan Mavi Çözümü</td><td>GE healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Nikon Elipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırılmış&nbsp; anti-fare CD3e&nbsp; antikor</td><td>Biolegend</td><td>100314</td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırılmış hamster anti-fare CD28</td><td>BD Biosciences</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırılmış Sıçan&nbsp; anti-fare IFN ve gama; &nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>16-7312-85</td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırılmış anti-fare IL-4 Antikor</td><td>Biyoefsanesi</td><td>504102</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Fare IL-7 Protein R</td><td>& D sistemi</td><td>407-ML</td><td></td></tr><tr><td>rekombinant insan TGF-beta</td><td>R& D sistemi</td><td>240-B-010</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Merck Millipore</td><td>19-144</td><td></td></tr><tr><td>İyonomisin</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>GolgiPlug protein taşıma inhibitörü</td><td>BD Biosciences</td><td>51-2301KZ</td><td></td></tr><tr><td>Hücre İçi Fiksasyon ve Geçirgenleştirme tampon seti</td><td>eBioscience</td><td>88-8824-00</td><td></td></tr><tr><td>anti-fare GM-CSF PE</td><td>eBioscience</td><td>12-7331-82</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-fare IL-17A</td><td>Biolegend</td><td>506908</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-fare IFN-gamma</td><td>Biolegend</td><td>505810</td><td></td></tr><tr><td>GO Taq qPCR ana karışımı</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td></td></tr><tr><td>fare GM-CSF ELISA Ready-SET-Go!</td><td>invitrogen</td><td>88-7334-88</td><td></td></tr><tr><td>Fare IL-17A Açılmamış ELISA</td><td>invitrogen</td><td>88-7371-22</td><td></td></tr></tbody></table>

vitro farklılaşma fare granülosit-makrofaj-koloni uyarıcı faktör (gm-csf)-t yardımcı (thgm) hücreleri üreten

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells

Granülosit-makrofaj-koloni uyarıcı faktör (GM-CSF)-T yardımcı (THGM) hücresi üretim ağırlıklı olarak interferon (IFN) γ veya interlökin (IL) -17 üretmeden GM-CSF salgılar ve için bulunan yeni saptanan bir T yardımcı hücresi alt budur otoimmün neuroinflammation önemli bir rol oynamaktadır. Bir yöntem tecrit splenocytes bir tek hücreli askıya saf CD4 + T hücreleri ve THGM hücre üretimi saf CD4 + T hücreleri, T hücre-aracılı bağışıklık ve otoimmün hastalıklar içinde yararlı bir yöntem olacaktır. Burada THGM hücrelere IL-7 tarafından terfi fare saf CD4 + T hücreleri ayırır yöntemi açıklanmaktadır. Farklılaşma sonucu hücre içi sitokin akış sitometresi ile bir nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir tepkimesi (PCR), kombine boyama da dahil olmak üzere farklı yöntemlerle sitokinler ifade analizi tarafından değerlendirildi ve enzim bağlı immunosorbent deneyleri (ELISA). THGM farklılaşma Protokolü burada açıklandığı gibi kullanarak, hücreleri yaklaşık % 55'i IFNα veya IL-17 en az bir ifade ile GM-CSF ifade. GM-CSF THGM hücreleri tarafından baskın ifade daha fazla GM-CSF, IFNα ve IL-17 mRNA ve protein düzeylerinde ifade analizi tarafından doğrulandı. Böylece, bu yöntem saf CD4 + T hücreleri t ayırt etmek için kullanılabilirHGM hücreleri vitro, hangi THGM hücre biyolojisi çalışmada yararlı olacak.

İki 8-hafta-yaşlı erkek C57BL/6 fare izole naive CD4 + T hücreleri üç porsiyon ayrıldı. Hücrelerin bir kısmı açıklanan protokol sonrası THGM hücrelere farklı. Başka bir bölümü anti-IL-4 antikor (10 µg/mL) huzurunda bir THGM koşulda THGM farklılaşma Il-4 abluka etkisini test etmek için kültürlü. Son bölümü (3 µg/mL anti-CD3e, 1 µg/mL anti-CD28, 10 ng/mL TGFβ, 30 ng/mL Il-6, 10 µg/mL anti-IFNγ ve 10 µg/mL anti-IL-4) bir TH17 farklılaşma koşul altı...

Burada, fare granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T yardımcı (THGM) hücreleri yalıtım saf CD4 + T hücreleri, THGM, farklılaşma da dahil olmak üzere saf CD4 + T hücrelerden ayırt etmek için bir iletişim kuralı mevcut ve farklılaştırılmış THGM hücre analizi. Bu yöntem çalışmaları Yönetmeliğin ve THGM hücre işlevi uygulanır.

Vitro Farklılaşma fare granülosit-makrofaj-koloni uyarıcı faktör (GM-CSF)-T yardımcı (THGM) hücreleri üreten

The granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing T helper (THGM) cell is a newly identified T helper cell subset that predominantly ...

Bu yöntem, multipl skleroz gibi inflamatuar hastalıkların patogenezinde hangi T-yardımcı hücre alt kümesinin GM-CSF'nin ana kaynağı olduğu gibi CD4 T hücresi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, yeni bir T-yardımcı hücre kümesi olan THGM'nin regresyonunun ve fonksiyonunun araştırılması için temel hücresel kaynak sağlayan, hiç etkileşime giren gama OI17 ekspresyon hücresi olmayan veya çok az enterferans yapan gama OI17 hücresi olan naif CD4 T hücrelerinden %50'den fazla GM-CSF eksprese eden T-hücreleri üretmesidir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Yi Lu olacak.Altı ila sekiz haftalık bir farenin karnının üzerindeki cildi kaldırmak için forseps kullanarak ve hayvanın sol tarafında göğüs kafesinin altında yaklaşık dört santimetrelik bir kesi yaparak başlayın. Dalağı ortaya çıkarmak için periton kesesini açın ve dalağı iki mililitre hücre izolasyon tamponu ile önceden ıslatılmış 70 mikrometrelik bir süzgecin üzerine aktarmak için steril forseps kullanın. İki ila üç dalak toplandığında, dalak dokusunu yumuşatmak için beş mililitrelik bir şırınganın ucunu kullanın ve tüm hücreler tüpe atılana kadar sü

in-vitro-differentiation-mouse-granulocyte-macrophage-colony

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, birincil monositlerin makrofajlara hazırlanmasını göstermektedir. Birincil insan monositleri, granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) kullanılarak M1 benzeri bir pro-inflamatuar fenotipe veya makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) kullanılarak M2 benzeri bir anti-inflamatuar fenotipe izole edilebilir ve farklılaştırılabilir.

İn Vitro Kültür ve Primer Monositlerin Makrofajlara Farklılaşması

Bu video, granülosit-makrofaj-koloni uyarıcı faktör veya GM-CSF üreten T yardımcı hücrelerinin (THGM) in vitro farklılaşmasını göstermektedir. İzole edilmiş naif T hücreleri, yüksek hücre içi GM-CSF üretimi ve diğer T yardımcı hücreye özgü sitokinlerin düşük ekspresyonu ile doğrulanan THGM'ye farklılaşma için uyarılır.

GM-CSF Üreten T Yardımcı Hücrelerini Naif T Hücrelerinden Ayırt Etmek İçin İn Vitro Bir Teknik

Fare embriyonik kök hücreleri, OP9-DL1 ko-kültür sistemi kullanılarak in vitro olarak T hücrelerine farklılaştırılabilir. Bu prosedürde başarı, reaktif/hücre bakımına ve tekniğe duyarlı temel adımlara dikkat edilmesini gerektirir. Burada bu kritik parametreleri tartışıyor ve bu teknolojinin benimsenmesini teşvik etmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

T hücrelerinin türetilmesi İn Vitro Fare Embriyonik Kök Hücreleri

Naif CD4+ T hücreleri, aktivasyon sırasındaki ortama bağlı olarak çeşitli alt kümelere polarize olur.  Naif CD4 + T hücrelerinin çeşitli efektör alt kümelerine farklılaşması, T hücresi reseptör uyaranlarının ve spesifik sitokin sinyallerinin eklenmesiyle in vitro olarak elde edilebilir.

Fare Naif CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Hücre İzolasyonu ve<em&gt; In vitro</em&gt; T hücre alt içine Farklılaşma

Granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ile kültürlenen kemik iliği hücreleri, makrofajlar ve dendritik hücreler (DC'ler) içeren heterojen bir kültür oluşturur. Bu yöntem, makrofajları GM-CSF kültüründeki DC'lerden ayırt etmek için MHCII ve hyaluronan (HA) bağlanmasının kullanılmasını vurgular. Bu kültürdeki makrofajlar, alveolar makrofajlarla birçok benzerliğe sahiptir.

Fare Kemik İliği itibaren Üretimi ve GM-CSF tanımlanması Türetilmiş Alveoler gibi makrofajlar ve dendritik hücrelerin

Makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) farklılaşmış insan monosit türevi makrofajların hücre kültürü için bir protokol sunulmuştur. Protokol, monositlerin makrofajlara toplu farklılaşması ile birlikte dondurularak saklanmasını kullanır. Daha sonra hasat edilen makrofajlar daha sonra deneyler yapmak için gerekli hücre yoğunluklarında kültür kuyularına ekilebilir.

Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

Burada fare Miyeloid habercisi 32D/G-CSF-R hücre kültürünü kültür, viral enfeksiyonlar gerçekleştirme ve yayılmasını önleme ve farklılaşma deneyleri için detaylı protokol sunulmuştur. Bu hücre kültürünü myeloid hücre gelişimini ve myeloid hücre büyümesi ve Nötrofilik farklılaşma ilgi genlerin rol çalışmak için uygundur.

Nükleer silahların yayılmasına karşı ve fare Miyeloid habercisi 32D/G-CSF-R farklılaşma hücre

Burada biz belirlenmesi ve GM-CSF myeloid hücrelerin hücre yüksek hızlı sıralama kullanarak tahrik çok sayıda ayırma için bir yöntem sağlar. Beş ayrı nüfus (ortak miyeloid ataları, granülosit/makrofaj ataları, monosit, monosit kaynaklı makrofajlar ve monosit kaynaklı DCs) Ly6C ve CD115 ifade üzerinde göre tespit edilebilir.

Çok sayıda miyeloid ataları ve dendritik hücre öncüleri fare kemik iliği strateji sıralama bir roman hücre kullanarak gelen nesil

Bu çalışmada embriyonik kök hücrelerden immün uyarıcı granülosit makrofaj kolonisi uyarıcı faktörler taşıyan ekzozomla zenginleştirilmiş hücre dışı veziküllerin izole edilmesine yönelik bir yöntem açıklanmaktadır.

Embriyonik Kök Hücrelerden Granülosit-Makrofaj Kolonisi Uyarıcı Faktör Taşıyan EkzozomLa Zenginleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu

Bu protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden makrofajların sağlam nesil açıklar, ve sonraki karakterizasyonu için yöntemler. Hücre yüzeyi belirteç ekspresyonu, gen ekspresyonu ve fonksiyonel tahliller bu iPSC kaynaklı makrofajların fenotip ve fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılır.

Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Makrofajlarının Üretimi ve Karakterizasyonu

Öğrenin fare bağışıklık sistemi araştırmaları için T hücrelerinden GM-CSF üreten THGM hücreleri farklılaştırma yöntemini. Bu teknik, iltihabi hastalıklardaki hücresel kaynakları incelemek için yüksek verimli sonuçlar sağlar.

Vitro Farklılaşma fare granülosit-makrofaj-koloni uyarıcı faktör (GM-CSF)-T yardımcı (T_HGM) hücreleri üreten

Daha fazla video keşfet