Necroptosis MLKL-aracılı plazma zarı kopma karakterizasyonu

Bu yöntemler, lipid bağlanmasında membran translokasyonu ve geçirgenlik gibi nekrotozda psödokinaz karışık soy kinaz alanının veya MLKL'nin rolü hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniklerin en büyük avantajı, nekrotozda plazma membran rüptürünün uygulayıcısı olarak MLKL'yi doğrudan ima etmeleridir. Canlı hücre görüntüleme, özellikle MLKL aracılı nekrotoz için hücre ölümü araştırmaları alanında devrim yaratmıştır.

Nükleer manyetik rezonans, burada MLKL için gösterildiği gibi proteinlere lipid bağlanmasını izlemek için güçlü bir tekniktir. Bir hücre kültürü inkübatöründe gece boyunca inkübasyonları için 24 oyuklu plakalarda bir oligomerizasyon kasetine ve Venüs'e kaynaşmış MLKL'nin cellat alanını ifade eden dördüncü MLKL nakavt fare embriyonik fibroblastları veya MEF'leri beş kez 10 kez kaplayarak başlayın. Ertesi sabah, transgenin ekspresyonunu indüklemek için hücreleri 12 saat boyunca doksisiklin ile muamele edin, ardından nekrotozu indüklemek için FK506 bağlayıcı protein dimerizer ve zar geçirimsiz yeşil floresan boya ile takviye edilmiş standart DMEM ilavesi ile

Hücre ölümünü izlemek için, plakayı bir memeli doku kültürü inkübatöründe bulunan uygun bir görüntüleme ünitesine yerleştirin ve görüntüleme sistemi yazılımını açın. Schedule Upcoming Scans (Yaklaşan Taramaları Planla) sekmesini seçin ve Physical Layout (Fiziksel Düzen) sekmesinde tepsiyi, kabı, tarama türlerini ve tarama modelini seçin. Özellikler sekmesinde hızlı floresansı seçin ve tarama süresini eklemek için Zaman Çizelgesi penceresine ve toplam zaman noktası sayısına ve alım sıklığına tıklayın.

Ardından, görüntü alımını başlatmak için Uygula'ya tıklayın. Nekrotozu ölçmek için, Görevler bölmesini seçin ve arka plan seviyesinin üzerinde sabit segmentasyon eşiği ile nesne sayma yeni analizini ayarlamak için fare imlecini birkaç görüntünün arka planının üzerine getirin. Ardından, geçerli görüntüdeki floresan nesneleri incelemek ve eşik düzeylerini gerektiği gibi iyileştirmek için Önizleme'yi seçin.

Eşiğin dikkatli bir şekilde seçilmesi, plaka üzerindeki çoklu kuyucukların gözlemlenmesi ve yazılımdaki Önizleme özelliği kullanılarak gerçekleştirilebilir. Plakadaki tüm kuyucuklar için aynı eşik ayarını kullanmaya dikkat edin. Yeşil floresan sayımlarını entegre etmek için, Yeni Analizi Başlat sekmesi altında zaman aralığını ve analiz edilecek kuyuları seçin ve analiz işi adını girin.

Ardından, Tamam'a tıklayın ve verileri uygun bir grafik yazılım programında ek analiz için dışa aktarmak için iş adına çift tıklayın. MLKL'nin nükleer manyetik rezonans spektroskopisi veya NMR ile lipit bağlanması için, ilgilenilen fosfolipidlerin mililitresinde bir miligramı ayrı NMR titrasyon serileri için temiz cam şişelere ayırmak için hava geçirmez şırıngalar kullanın ve şişeleri beş ila 30 dakika boyunca gaz halinde bir argon veya nitrojen akışı altına yerleştirin. Çözücü buharlaşması nedeniyle numuneler arasındaki lipit konsantrasyonlarındaki tutarsızlıkları en aza indirmek için kloroform veya metanol gibi uçucu çözücülerden lipitlerin dağıtımı, kuru buz üzerinde tutulan stoklardan hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir.

Buharlaşma süresinin sonunda, şişeleri bir Buchner şişesinin dibine yerleştirmek için büyük cımbız kullanın. Şişeyi bir lastik tıpa ile kapatın ve kalan organik maddeleri çıkarmak için flakon içeriğini gece boyunca hafif vakum altında boşaltmak için bir vakum hattına bağlı plastik boruyu takın. Ertesi sabah, bir lipit film ile her bir cam şişeye uygun deneysel konsantrasyonda deterjanla takviye edilmiş NMR tamponu ekleyin ve şişeyi bir su banyosunda 30 dakikaya kadar sonikasyon yapın, lipit filmin çözünmesini kontrol etmek için her 10 dakikada bir sonikasyonu durdurun.

Sonikasyonun sonunda, şişelerin 15 dakika boyunca soğumasına izin verin ve istenen konsantrasyon serisi için 1: 1 karışımları sonikleştirerek, deterjan pozitif NMR tamponunda lipit-deterjan misellerinin seri bir seyreltmesini gerçekleştirin. Deterjan pozitif tampondaki her lipid seyreltmesine protein ve katkı maddeleri ekleyerek, sırasıyla deterjan negatif ve deterjan pozitif NMR tamponlarında protein ve katkı maddelerinin NMR örneklerini hazırlayın, kontrol edin ve referans alın. Ardından, uygun hacimdeki numuneleri uygun boyuttaki NMR tüplerine aktarın ve numuneleri NMR cihazına yükleyin.

MLKL-nakavt MEF'lerin tam nekrotozu, kaynaşmış transgeni eksprese eden doksisiklin önceden inkübe edilmiş hücrelerin dimer aracılı oligomerizasyonundan bir saat sonra gözlemlenebilir. Bu hızlı kinetik nekrotoz, MLKL'nin plazma zarı yırtılmasının varsayılan uygulayıcısı olarak rolünü destekler, bu da hücre çevresinin dimer ve Venüs kodlaması ile tedaviden bir ila iki dakika sonra plazma zarı ile ilişkili Venüs puncta üretimi ve iki ila üç dakika içinde kademeli hücre yuvarlaklaşması ile sonuçlanır. Hızlı nekrotoz altında, hücreler morfolojiyi normal uzamış şekillerinden yuvarlaklaşır ve oligomerizasyondan sonraki beş dakika içinde şişer, 10 dakikada kısmen yırtılır ve 20 dakikada kaybolan sitozol ile geniş ölçüde parçalanır.

NMR spektroskopisi ile izlenen in vitro lipid bağlama deneyleri, inhibitör destek bölgesini kapalı N-sarmaldan açık ve içsel olarak düzensiz konformasyona taşımak için lipid bağlanması üzerine MLKL uygulayıcı alan proteininde büyük yapısal değişiklikler ve ayrıca her iki konformerin karışımları hakkında kalıntı başına bilgi ortaya koymaktadır. Belirli bir numunedeki kapalı ve açık konformerlerin yüzdeleri de izlenebilir, bu da MLKL uygulayıcı alanının fosfolipidlerle etkileşimi için destekleyici kanıtlar sağlar ve MLKL ile plazma zarı arasında doğrudan bir bağlantı olduğunu düşündürür. Bu nedenle, bu prosedürü kullanarak hücre ölümünü ölçmeye çalışırken, DNA bağlayıcı boyanın normalde genetik olarak kodlayan floresan proteininden daha yüksek eşik floresansına sahip olduğunu bilmek ve hatırlamak önemlidir.

Bu nedenle paralel olarak kullanılabilirler. Ayrıca, misel lipidlerinin sıcaklığa duyarlı olduğunu ve bu nedenle NMR numune sıcaklığının optimize edilmesi gerekebileceğini unutmayın. Bu prosedürü takiben, nekrotoz geçiren hücrelerde hücre yırtılmasının ne kadar hızlı gerçekleştiğini ve yırtılmanın plazma zarı üzerinde nerede lokalize olduğunu ele almak için toplam iç yansıma mikroskobu ve elektromikroskopi gibi başka teknikler de kullanılabilir.

Ek olarak, MLKL'nin misel lipidlerine bağlanmasını ortogonal olarak doğrulamak için mikro ölçekli termoforez gerçekleştirilebilir. Bu videoda açıklanan teknikler, nekrotoz alanındaki araştırmacıların, MLKL'nin plazma zarı rüptürünün uygulayıcısı olarak rolünü keşfetmelerinin yolunu açtı. Kloroform ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven giymek ve iyi havalandırılan bir alanda çalışmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.