Name: Necroptosis MLKL-aracılı plazma zarı kopma karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Öğrenin necroptosis sırasında MLKL-aracılı plazma zarı kopmasını karakterize etme yöntemlerini. Canlı hücre mikroskobisi, taramalı elektron mikroskobisi ve NMR bazlı lipid bağlanma analizi kullanılarak hücre ölüm mekanizmaları incelenir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. klonlama ve hücre satırı üretimi
<ol><li>PCR yükseltmek NBB bölge çerçeve standart Restriksiyon enzimi tabanlı Oligomerizasyonda etki alanı 2 x FK506 bağlayıcı protein (2xFKBP veya 2xFV) ve Venüs floresan ile klonlama olarak amino asit kalıntıları eklenmesi 1-140 (NBB140), insan MLKL cDNA sayfasından için karşılık gelen protein doksisiklin (Dox) - indüklenebilir retroviral vektör pRetroX-NBB140elde etmek için TRE3G - 2xFV-Venüs (Tablo 1, rakamlar 1A-B).</li>
	<li>Ölümsüzleştirmek SV40 büyük antijen ile geçici transfection tarafından ilgili fareler yeşil laboratuarda elde edilen birincil mlkl- / - veya ripk3- / - mlkl- / - fare embriyonik fibroblastlar (MEFs) Plazmid ifade ediyorum. ~ 1 – 2 ile ölümsüzleştirdi hücreleri seçin hafta ve % 10 fetal Sığır serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U/mL penisilin ve streptomisin, 1 mM sodyum pyruvate ve 37 ° C ve % 5 CO2 standart doku'de gerekli olmayan amino asitler ile takıma DMEM korumak Kültür İnkübatörler.</li>
	<li>Transduce SV40 ölümsüzleştirilmiş mlkl- / - MEFs ile ters tetrasiklin kontrol transactivator (rtTA)-retrovirüsü blasticidin direnç gen (bizim değiştirilmiş plazmid) içeren bir plazmid ifade içeren ve 1 için tedavi hafta ile 5 μg/mL blasticidin stabil rtTA28ifade hücrelerini seçer.</li>
	<li>RtTA ifade MEFs ile Dox indüklenebilir retroviral vektör chimeric MLKL içeren transduce (pRetroX-NBB140-2xFV-Venüs-puro) ve bir hafta, 2 gün sonra iletim için 4 μg/mL puromisindir kullanarak seçin.</li>
</ol>2. canlı cep mikroskobu görüntüleme Necroptosis MLKL-aracılı
<ol><li>Plaka mlkl- / - NBB140ifade MEFs-2xFV-24 (1 mL/de) kuyuya başına 50.000 hücre yoğunluğu, Venüs de tabak ve gecede kuluçkaya (Şekil 2A). (Bkz. Tablo reçetesi) otomatik hücre sayımı için canlı hücre boyama kullanın.</li>
	<li>Hücreler Dox ile 12 h için tedavi (0.5 μg/NBB140ifade ikna etmek için mL)-2xFV-Venüs.</li>
	<li>Necroptosis 25 nM FKBP dimerizer (Dim) ile 25 nM membran geçirimsiz yeşil floresan yanı sıra teşvik ( Tablo malzemelerigörmek) standart DMEM boya (1.2 bakın). Necroptosis geçiren hücreleri birikir boya NBB140tarafından onların plazma membran bütünlüğü tehlikeye gibi-aracılı yırtılması. Deneyleri nüsha veya quadruplicate yerine getirmek.</li>
	<li>Tek veya çift renkli görüntüleme sistemleri ( Tablo malzemelerigörmek) kullanarak necroptosis izlemek için bir memeli doku kültürü kuluçka makinesine yer alan ilgili görüntüleme birimi damarları yerleştirin.</li>
	<li>Açık bilgisayar yazılımı ( Tablo malzemelerigörmek) ve zamanlama yaklaşan tarar görevler listesinin altında sekmesini seçin. Not: bu iletişim kuralı tek renkli sistemleri kullanarak görüntüleme için ama benzer bir yazılım çift renkli sistemlerinde kullanılabilir.</li>
	<li>"Tepsi, gemi, tarama türleri" ve "Tarama deseni" "Fiziksel düzeni" sekmesini ve "Hızlı floresan" Özellikler sekmesini seçin.</li>
	<li>"İnceden inceye gözden geçirmek yanında tıkırtı zaman" "Zaman çizelgesi" pencere ve toplam zaman puan ve frekans Alım (genellikle 1 edinme her 0,5 h 6 12 h s veya fast-kinetik necroptosis için her 5 dk 1 h) ekleyin ve resim alma "App seçerek başlayın ly"(kırmızı düğme).</li>
	<li>Görüntü analiz yazılımı kullanarak necroptosis ölçmek ( Tablo malzemelerigörmek) seçerek "görev bölmesinden", "Nesne sayma yeni analizi ile sabit segmentasyon eşik arka plan seviyesinden", hangi tespit üzerine gelerek fare imlecini birkaç görüntü analizinde kullanılan bölgelerde arka plan üzerinde.</li>
	<li>Geçerli görüntü kullanarak önizlemesini görüntülemek seçerek floresan nesneleri inceleyin ve gerektiği gibi eşit düzeylerine rafine.</li>
	<li>Yeşil floresans sayar "Denize indirmek yeni analiz" sekmesini açarak entegre, "Zaman aralığı" seçmek, çözümlenmesi, "Analiz iş adı" girin ve "Tamam" tuşuna basarak için kuyu seçin.</li>
	<li>Erişim ilgili işin adına çift tıklatıp ek çözümleme harici grafik yazılım grafik/verme penceresinden verme "Analiz işleri" sekmesinden veri analiz ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Veri yeşil floresans pozitif (+ ve) olarak sayar/mm2 quantitate veya sayıları izdiham tarafından normale ve verileri hızlı yeşil floresans + ve sayıları/izdiham olarak.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, deneysel uç noktada 100 hücrelerle leke membran-permeant yeşil floresan nM boya ( Tablo malzemelerigörmek). Yeşil floresans/yeşil floresans uç noktada oranı % necroptotic hücrelere veri normalleştirmek.</li>
</ol>3. canlı hücre Confocal mikroskobu görüntüleme plazma zarı işe alım ve Permeabilization MLKL tarafından
<ol><li>Plaka mlkl- / - NBB140ifade MEFs-2xFV-Venüs bir cam (0.5 mL/de) kuyuya başına 20.000 hücre yoğunluğu, alt için 30 dk 37 ° C'de PBS içinde 50 µg/mL fibronektin ile ön işleme 4-şey mikroskobu odası ve ~ 12 h ( için kuluçkaya Şekil 2B).</li>
	<li>Dox hücrelerle tedavi (0.5 μg/mL) ~ 12 h NBB140ifade ikna etmek için-2xFV-Venüs.</li>
	<li>Necroptosis taze orta ile 25 (1 mL/de) kuluçka tarafından teşvik nM NBB140ikna etmek için Dim-2xFV-Venüs harekete geçirmek ve plazma zarı için translocation.</li>
	<li>Çevre denetimi ve bir 63 ile donatılmış bir ters stand üzerinde inşa confocal mikroskobu tarama dönen disk lazer odası yerleştirin 1.4 NA amaç ve yazılım kullanarak edinme Imaging başlar ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı başlatmak, YFP filtre yapılandırma (uyarma dalga boyu 515 nm) ve "Focus" simgesini seçin.</li>
	<li>Görüş alanı ve odak düzlemi bulun ve "Kesin Focus" sekmesini kullanarak odak bakım sistem meşgul.</li>
	<li>Satın alma başlamak için filtre yapılandırma, uygun EMCCD fotoğraf makinesi pozlama zaman ve yoğunlaştırılması kazanç ve hızlandırılmış edinme parametrelerini aralığı ve edinme uzunluğu gibi atama tarafından takip "Yakalama" sekmesini seçin.</li>
	<li>İzlemek floresan NBB140hücresel yeniden dağıtım-2xFV-Venüs protein elde tarafından necroptosis sırasında görüntüleri her 10 515 nm lazer (Film 1) kullanarak bir EMCCD kamera tarafından s. Not: Photobleaching floresan protein görüntüleme ile bir husustur. Venüs daha dayanıklı floresan proteinler photobleaching29biridir. Photobleaching için daha duyarlı floresan proteinler kullandıysanız, her 30 resim s veya kurtarma görüntüleme zaman puan arasında sinyal sağlamak için daha uzun.</li>
	<li>NBB140Derneği plazma zarı izlemek için-2xFV-Venus necroptosis sırasında görüntü her 10 s örnek hazırlanan 3.3 içinde toplam iç yansıma floresans tarafından bir otomatik TIRF slider ile donatılmış bir mikroskop kullanarak (TIRF) mikroskopi ve bir 100 x 1.4 NA objektif ve bir EMCCD kamera (Movie 2). 3.5-3.7, adımları izleyin ama TIRF odak sekme mikroskobu odası örnek ve alt cam kalınlığı göre içindeki TIRF açısını ayarlamak. Not: plazma zarı işaretleyicileri LCK-C-RFP gibi denetimleri plazma zarı yerelleştirme TIRF analizi için kullanılabilir.</li>
	<li>Görüntü kalitesi Gauss işlev (Marr algoritması) negatif normalleştirilmiş ikinci türev ile evrişim tarafından geliştirmek için işleme gerçekleştirin.</li>
</ol>4. elektron mikroskobu
<ol><li>Plaka mlkl- / - NBB140ifade MEFs-2xFV-Venüs bir yoğunluk plazma kaplı 150 mm 5 milyon hücre, hücre kültür çanak ve kuluçkaya 12 h (Şekil 3).</li>
	<li>Doksisiklin hücrelerle tedavi (0.5 μg/NB1-140ifade ikna etmek için mL)-2xFV-Venüs 12 h için.</li>
	<li>NBB140ikna etmek-2xFV-Venüs harekete geçirmek ve 25 ile plazma zarı translocation homodimerizer 5 min için nM. Bu sefer canlı hücre görüntülemede gözlenen necroptosis kinetik üzerinden kurulur.</li>
	<li>Medyayı çıkarın ve 10 mL % 2.5 oxazolidin, 37 ° C'de önceden ısınmış % 2 paraformaldehyde 0.1 M sodyum cacodylate tampon pH 7.4 içinde (cacodylate arabellek) kullanarak hücreleri tamir</li>
	<li>Kazıma örnek toplamak ve örnekleri 500 x g, 10 min için spin. Süpernatant atmak.</li>
	<li>Örnek % 1.5 potasyum ferrocyanide 0.1 M sodyum cacodylate tampon ile 1,5 saat içinde indirimli % 2 osmiyum tetroxide için postfix. Osmiyum tetroxide TEM içinde kontrast sağlamak için yaygın olarak kullanılan boyama bir ajandır. TEM necroptosis geçiren hücre SEM önce ön analiz olarak kullanılır.</li>
	<li>Örnek 5 kere 5 min için ultrasaf su vasıl 500 x gdurular arabelleği ardından, durulama (bkz: 4.6), su ve etanol otomatik bir işlemci. Süpernatant atmak.</li>
	<li>SEM için % 1 uranyl asetat ve kurşun aspartat heavy metalci leke31ile daha önce sabit örnekleri leke.</li>
	<li>Alkol ve propilen oksit çözümleri kademeli bir dizi örnekleri kurutmak.</li>
	<li>Örnek bir reçine blok elde etmek için sert reçine32 içinde embed.</li>
	<li>Analiz doğru alan belirlemek için 0.5 mikron kalınlığında bölümlerini kes.</li>
	<li>Elektriksel olarak iletken metal (Iridium) ultra ince bir film örnekleriyle kat.</li>
	<li>Görüntü ve örneklerini (Şekil 3). Miktar için reçine blok yüzey maruz kalan hücrelerle düşük-büyütme resim 5'te taranır bir elektron mikroskop kullanarak keV.</li>
	<li>Hücrelerin SEM tarafından yakalanan bireysel görüntüleri karşısında görselleştirmek veya görüntüleme yazılımı birden çok alan görünümü bir bitişik resim30birleştirmek için kullanılan. Kabaca 100 hücreler hücreleri necroptosis bu şekilde seçim yazılımında yüksek çözünürlüklü resim dizisi oluşturarak geçiren kısmını değerlendirmek için kullanılan ( Tablo malzemelerigörmek). Not: SEM tarafından nekrotik morfoloji Puanlama normal hücre özellikleri önceden nekrotik veya nekrotik fenotipleri ilerleme ile karşılaştırır. Bu özellikler microvilli ortadan kalkması da dahil olmak üzere, düzleştirme, yırtığı 10 arasında değişen hücrelerdeki plazma zarı değişiklikler içerir nm 1 µm boyutu veya organel yapısı sitozolik hücre alan en az % 30-40 arasında kaybı için.</li>
</ol>5. lipid bağlama, nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi tarafından MLKL
<ol><li>15N etiketli NBB1-156 standart protein ifade ve arıtma yukarıda açıklanan24olarak hazırlayın.</li>
	<li>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol amonyum tuz (18:0 PI) ve 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) amonyum tuzu (18:1 PI) buz gibi CHCl3 her için son 1 mg/mL konsantrasyonda 500 µL 500 µg geçiyoruz.</li>
	<li>1 mg/mL 18:0 ve sonication su banyosu oda sıcaklığında 1 dk 18:1 PI solüsyon içeren temizleyicide veya en fazla 5 dakika içinde bir buz-su karışımı.</li>
	<li>
Aliquot 1 mg/mL 18:0 ve 18:1 PI içine temiz cam şişeler için bireysel NMR titrasyon serisi (Şekil 4). Transfer lipidler organik çözücüler hava geçirmez cam şırınga kullanarak içinde.
	<ol>
<li>1 mg/mL 18:1 PI aliquot 132 µL (molar kütlesi = 880.137 g/mol) CHCl3 125 µM konsantrasyon, 1200 µL son resuspension hacmi için. Not: 5 mm NMR tüpler için seri seyreltme hacimleri hazırlamak > 1000 µL ve son NMR örnek hacimleri > 500 µL. 3 mm NMR tüpler için seri seyreltme hacimleri hazırlamak > 300 µL ve son NMR örnek hacimleri > 150 µL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aliquot 1 mg/mL domuz beyin 20 L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate amonyum tuzu: 9:1 CHCl3/MeOH/H2O (beyin PI (4,5) P2) temiz cam şişe içine.</li>
	<li>Şişeleri argon (Ar) veya azot (N2) karşı cam şişe duvarları sıçramasına olmadan organik çözücü buharlaşır için orta akış ile gaz akışı altına yerleştirin. Otuz beş dk 10-200 µL organik çözücü birimler için genellikle yeterli olur.</li>
	<li>Cam vial(s) Büchner veya vakum büyük Cımbız kullanarak flask altındaki bir kauçuk tıpa ile mühür ve bir vakum hattına bağlı plastik boru eklemek düzenlemek. Şişesi altında kalan organik kaldırmak için hafif vakum gecede tahliye edin.</li>
	<li>Lipid film aliquots inert gaz ile yerleşimi, hava geçirmez bir kapak ile mühür ve daha uzun vadeli depolama için kullanmak bir ay içinde veya-80 ° C-20 ° C'de depolayın.</li>
	<li>NMR örnek arabellek deterjan olmadan hazırlamak (-Det) 20 mM NaxHyPO4 pH 6.8, %10 D2içeren O ve deterjan (+ Det ile) 20 mM NaxHyPO4 pH 6.8, içeren %10 D2O, 0,34 mM n-Lauryl-β-D-maltopyranoside (demir).</li>
	<li>Ekle + cam şişe istenen toplama ulaşmak için ve su banyosu ilâ 30 dk sonication için 10 dk alternatif için solüsyon içeren temizleyicide lipid film ile Det arabelleğe görsel denetim tarafından takip. Not: Örnek Sonication sıcak. Oda sıcaklığında son protein örnek sulandırma önce 15 dakika soğumasını bekleyin.</li>
	<li>Lipid-deterjan micelles + 1:1 karışımları sonication için istenen konsantrasyon serisi kullanarak Det arabellek seri seyreltme gerçekleştirin. 125 µM lipid konsantrasyonu başlayarak, üç tekrarlama 62.5 µM, 31.3 µM ve 15,6 µM lipid 0,34 mm DDM ortaya çıkarır.</li>
	<li>Denetim hazırlayın ve protein ve katkı - Det NMR örnekleri başvuru ve + Det arabellekleri, anılan sıraya göre. Protein ve lipit içinde her seyreltme için katkı + Det arabellek ekleyin. Not: 15N NBB156için protein 40 µM son bir konsantrasyon için eklendi ve azaltılmış Cys artıkları tutmak için 2 mM deuterated dithiothreitol ile desteklenmiştir.</li>
	<li>Örnekler uygun hacmi (bkz: Not Adım 5,4) 5 mm veya 3 mm NMR tüpler aktarın.</li>
	<li>El ile yükleme örnekleri NMR alet veya bir Otomasyon platform SampleCase yükleyici gibi düzenleyin.</li>
	<li>Kalite kontrol en iyi duruma getirilmiş enine gevşeme spektroskopisi (TROSY) olarak 2D 1H -15N korelasyon spectra tarafından takip olarak 1H proton spectra için standart darbe programları kullanarak bileşik NMR spectra elde etmek veya heteronuclear birden fazla kuantum tutarlılık (SOFAST-HMQC)33. Not: 3 mm NMR tüpler kullanımı 1 H -15N TROSY (~ 3 h) veya 1H -15N SOFAST-HMQC (~ 90 dk) 64 inceden inceye gözden geçirmek ister. Tarama numaraları 5 mm NMR tüpler için yarıya iner.</li>
	<li>İşlenmiş 2D NMR spectra çözümleme veya kullanıcıya diğer yazılım CARA depo34 eklenebilir.</li>
	<li>
Yazılım 2D NMR rezonanslar her protein durumu için üç iyi dağınık ve çözümlenen tepeler için ek açıklama ekleme tarafından analiz. Her NBB156 (Şekil 5A) içeren her arabellek koşul için altı zirvesinin en yüksek genlikleri kaydedin.
	<ol>
<li>Bir toplu iş-entegrasyon liste hazırlamak için Cara'yı kullanın (tıklatın ana menü başlığı "spektrum | Kurulum toplu iş listesi"...) Tüm spectra toplanan ve bir tek en yüksek atama dosyasını kullanarak analiz (tıklatın ana menü başlığı "tepeler | Peaklist alma"..... .ve 6 Toplam tepeler, 3 içinde tanımlanan her protein durum için bir .peaks Kullanıcı tanımlı dosya seçin).</li>
		<li>Uygulamasının ayarlarını ("ıntegrator | En yüksek Model tune"...) X-genişlikte 0.06 ppm ve Y-genişlik 0.30 ppm (tıklatın ana menü başlığı "ıntegrator | En yüksek Model tune"...) Son çıktı iki menü seçimlerini (1. kaydetmeden önce Ana menü başlığını tıklatın "ıntegrator | «««Entegre"toplu liste) (2. Ana menü başlığını tıklatın "tepeler | Entegrasyon tablosunu verin") (Şekil 5B). Not: Kalıntıları M21, V53 ve L105 omurga Amid rezonanslar NBB156 kapalı küme ayracı devlet için atanmıştır. Açık küme ayracı devlet omurga Amid rezonanslar kalıntılarının G130 ve A141 ve 3D NMR deneyler24kullanarak epsilon proton yan zinciri rezonans W133 atandı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Örnekleri farklı mıknatıslar veya örnek koşullar doğrudan karşılaştırma için üç açık küme ayracı genlikleri başvuru örneklerinin ortalama ve iki başvuru ile ilgili bir normalleştirme faktörünün hesaplanması normalleştirmek. NBB156 rezonanslar normalleştirme faktörü ve ayar negatif genlikleri (Tablo 2) sıfır olarak kullanarak için ölçekli genlikleri hesaplayın. Örnekler: 1) farklı mıknatıslar örnekleri karşılaştırma: mıknatıs A, NBB156+ DDM ve mıknatıs B, NBB156+ DDM. 2) deterjan karşılaştırma: 0,34 mM DDM ve 1.7 mM DDM.</li>
	<li>Ölçekli kesir, kapalı - veya açık-tüm spectra ürününün için maksimum minimum genlik yelpazesi ile bölünerek küme ayracı içeren uygun başvuruları ücretsiz NBB156 ve tamamen açık ayraç NBB156 içinde toplanan her rezonans için hesaplamak deterjan.</li>
	<li>Normalleştirilmiş NMR genlikleri lipid konsantrasyonu bir fonksiyonu olarak arsa ve açık küme ayracı NBB156 farklı koşullarda (şekil. 5 C) kısmını karşılaştırın. Not: Alternatif olarak, kapalı küme ayracı conformation lipid konsantrasyon karşı kısmını analizini NBB156lipid bağlama karşılaştırmak için gerçekleştirilebilir. Çünkü bu daha hızlı ve lipidler tarafından daha iyi kesir raporlarda tam-nişanlı eski analiz tercih ederim.</li>
</ol>

<ol><li>Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+in+development%2C+inflammation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Necroptosis in development, inflammation and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).</li>
<li>Kaiser, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIP3+mediates+the+embryonic+lethality+of+caspase-8-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice.</a> Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).</li>
<li>Murphy, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pseudokinase+MLKL+mediates+necroptosis+via+a+molecular+switch+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism.</a> Immunity. 39 (3), 443-453 (2013).</li>
<li>Oberst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+activity+of+the+caspase-8-FLIP%28L%29+complex+inhibits+RIPK3-dependent+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis.</a> Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+complementation+between+FADD+and+RIP1+in+embryos+and+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes.</a> Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).</li>
<li>Dondelinger, Y., Hulpiau, P., Saeys, Y., Bertrand, M. J. M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionary+perspective+on+the+necroptotic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">An evolutionary perspective on the necroptotic pathway.</a> Trends in Cell Biology. 26 (10), 721-732 (2016).</li>
<li>Newton, K., Manning, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26865533">Necroptosis and Inflammation.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 743-763 (2016).</li>
<li>Kaiser, W. J., Upton, J. W., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23773332">Viral modulation of programmed necrosis.</a> Current Opinion in Virology. 3 (3), 296-306 (2013).</li>
<li>Newton, K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27177019">RIPK3 deficiency or catalytically inactive RIPK1 provides greater benefit than MLKL deficiency in mouse models of inflammation and tissue injury.</a> Cell Death & Differentiation. 23 (9), 1565-1576 (2016).</li>
<li>Kearney, C. J., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Inflammatory+Perspective+on+Necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">An Inflammatory Perspective on Necroptosis.</a> Molecular Cell. 65 (6), 965-973 (2017).</li>
<li>Pasparakis, M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25592536">Necroptosis and its role in inflammation.</a> Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).</li>
<li>Sun, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+kind+of+cell+suicide%3A+mechanisms+and+functions+of+programmed+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis.</a> Trends in Biochemical Sciences. 39 (12), 587-593 (2014).</li>
<li>Grootjans, S., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+and+execution+mechanisms+of+necroptosis%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Initiation and execution mechanisms of necroptosis: an overview.</a> Cell Death & Differentiation. 24 (7), 1184-1195 (2017).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+MLKL+causes+necrotic+membrane+disruption+upon+phosphorylation+by+RIP3%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3.</a> Molecular Cell. 54 (1), 133-146 (2014).</li>
<li>Cai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+translocation+of+trimerized+MLKL+protein+is+required+for+TNF-induced+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 55-65 (2014).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+to+plasma+membrane+leads+to+necrotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death.</a> Cell Research. 24 (1), 105-121 (2014).</li>
<li>Dillon, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPK1+blocks+early+postnatal+lethality+mediated+by+caspase-8+and+RIPK3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3.</a> Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).</li>
<li>Rickard, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPK1+regulates+RIPK3-MLKL-driven+systemic+inflammation+and+emergency+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis.</a> Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).</li>
<li>Kaiser, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+3-mediated+necrosis+via+TRIF%2C+RIP3%2C+and+MLKL%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).</li>
<li>Upton, J. W., Kaiser, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAI+Another+Way%3A+Necroptotic+Control+of+Viral+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection.</a> Cell Host & Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).</li>
<li>Tanzer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+signalling+is+tuned+by+phosphorylation+of+MLKL+residues+outside+the+pseudokinase+domain+activation+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop.</a> Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).</li>
<li>Quarato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Engagement+of+Distinct+MLKL+Phosphatidylinositol-Binding+Sites+Executes+Necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis.</a> Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).</li>
<li>Davies, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brace+helices+of+MLKL+mediate+interdomain+communication+and+oligomerisation+to+regulate+cell+death+by+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis.</a> Cell Death & Differentiation. , (2018).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plug+release+mechanism+for+membrane+permeation+by+MLKL%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL.</a> Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).</li>
<li>Dondelinger, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLKL+compromises+plasma+membrane+integrity+by+binding+to+phosphatidylinositol+phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates.</a> Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).</li>
<li>Llambi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BOK+Is+a+Non-canonical+BCL-2+Family+Effector+of+Apoptosis+Regulated+by+ER-Associated+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation.</a> Cell. 165 (2), 421-433 (2016).</li>
<li>Malkani, N., Schmid, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+secrets+of+fluorescent+proteins%3A+distinct+bleaching+in+various+mounting+fluids+and+photoactivation+of+cyan+fluorescent+proteins+at+YFP-excitation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation.</a> PLoS One. 6 (4), 18586(2011).</li>
<li>Perez, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+workflow+for+the+automatic+segmentation+of+organelles+in+electron+microscopy+image+stacks%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126(2014).</li>
<li>Walton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lead+aspartate%2C+an+en+bloc+contrast+stain+particularly+useful+for+ultrastructural+enzymology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).</li>
<li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), 329(2004).</li>
<li>Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((15N+and+13C-+SOFAST-HMQC+editing+enhances+3D-NOESY+sensitivity+in+highly+deuterated%2C+selectively+%5B1H%2C13C%5D-labeled+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).</li>
<li>Keller, R. <a target="_blank" href="http://cara.nmr-software.org/downloads/3-85600-112-3.pdf">The computer aided resonance assignment tutorial.</a> Cantina Verlag. , (2004).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+sequence+determinants+control+human+and+mouse+receptor+interacting+protein+3+%28RIP3%29+and+mixed+lineage+kinase+domain-like+%28MLKL%29+interaction+in+necroptotic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).</li>
<li>Tanzer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+divergence+of+the+necroptosis+effector+MLKL%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL.</a> Cell Death & Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).</li>
</ol>

MLKL plazma zarı yırtılması24sözde cellat karıştığı için kombine teknikleri için iletişim kuralları sağlar. Necroptosis MLKL-aracılı düzenleyen yasal ağ deşifre ek olarak, bu tekniklerin uygun diğer biyolojik sistemleri tanımlamak için bağımsız olarak kullanılabilir. Pratik olarak konuşursak, bu teknikleri orta-düşük verimi keşif araçları vardır.
Biz düzenli olarak canlı hücre görüntüleme NBB140kullandık-2xFV-Venüs-aracılık necroptosis ve mechanistically necr...

Necroptosis genetik bileşenleri tanımlayan necroptosis dolaylı fizyolojisi ve hastalığı1,2,3,4,5' te test etmek için hayvan modellerinin kullanımı kolaylaştırdı. RIPK3 veya MLKL nakavt farelerde en az dolaylı geliştirme ve yetişkin homeostazı o necroptosis için hayat3,6şart değil ima vardı. Ayrıca, bazı türler ya RIPK3 ya da MLKL genler, necroptosis olmayan temel rolü hayvanların7,8' destek içermez. Öte yandan, çeşitli patolojileri laboratuvarda indüklenen ile nakavt hayvan modelleri zorlu necroptosis inflamasyon, doğuştan gelen bağışıklık ve viral enfeksiyon9,10, önemli bir rol ortaya koymuştur 11 , 12.
Necroptosis etkinleştirilmesi birkaç şekilde farklı doğuştan gelen bağışıklık sensörler sinyal tarafından tüm belgili tanımlık harekete geçirmek RIPK31,13,14hangi sonucu. Active RIPK3 sırayla phosphorylates ve MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 etkinleştirir ,11,12,13,14,15,16,17,18. En iyi okudu ve belki de RIPK3 aktivasyonu için önde gelen en karmaşık yolu da apoptozis ya da necroptosis1ikna etmek için sinyal kompleksleri aşağı akım kompozisyona göre hangi bifurcates ölüm reseptör ligasyonu, geçiyor. RIPK1 sinyal tercih edilir ve nişan RIPK319,20sonuç Necroptosis ensues. Bu sonuç kolayca farmakolojik inhibisyon veya caspase 8, bir sözde endojen inhibitörü olan necroptosis koyunda tutar necroptosis genetik silinmesi üzerine tercih edilir. RIPK1 bağlar ve RIPK3'ı etkinleştirir. Necroptosis etkinleştirmek için başka bir yol TLR3/TLR4 Toll benzeri reseptörler sinyal aracılığıyla yürütmektedir ve RIPK3 tır etki alanını içeren bağdaştırıcı indükleyici interferon-β (TRIF)21aktive olduğu. Henüz doğrudan yürütmektedir ve RIPK322etkinleştirir DNA sensör DAI, etkinleştirme tarafından necroptosis tarafından ölmek için başka bir yol olduğunu.
MLKL bir N-terminal helix paket (NB) ve bir düzenleyici küme ayracı bölge3ile bağlantılı bir C-terminal pseudokinase etki alanı (psKD) oluşan sitozolik bir proteindir. Normal hücrelerde, MLKL nereye RIPK314ile etkin olmayan bir karmaşık olduğu düşünülen sitozol bulunur. Harekete geçirmek-in necroptosis MLKL RIPK3 fosforilasyon harekete geçirmek ilmik psKD ve NF ve kaşlı ayraç3,15,23yılında potansiyel olarak ek siteler içinde tetikler. Fosforilasyon ayrılma RIPK314sonuç MLKL konformasyon bir değişiklik neden olmaktadır. Kötü anlaşılır konformasyon değişiklikleri küme ayracı psKD24yayın. 2 sarmal içeren küme ayracı, MLKL Oligomerizasyonda sözde trimer ile C-terminal helix25içine aracılık eder. Brace N-terminal helix membran permeabilization24,26için gerekli olan NB etki alanı engeller. Tecrit NB etki alanı plazma zarı permeabilization ve necroptosis16,24,27ikna etmek yeterlidir. NB pro-necroptotic etkinliği içinde fare embriyonik fibroblastlar MLKL (mlkl- / - MEFs) eksik öldürüldüğüne tanıklık etmişlerdir. NB tercihen fosfolipid phosphatidylinositol 4,5 nükleotittir (PIP2) yürütmektedir bir lipid bağlayıcı etki alanıdır. Biz MLKL, onda MLKL alımı için plazma zarı NB zayıf etkileşimler PIP2 kutup baş grup24ile üzerinden küme ayracı Oligomerizasyonda kolaylaştırır aktivasyon kademeli bir mekanizma önerdi. Membran NB PIP2etkin olmayan MLKL brace tarafından maskeli için bir ek yüksek afinite bağlama sitesinin düzenlenmiş pozlama uğrar. Genel olarak, her ne kadar bu olayların moleküler mekanizması-değil var aydınlatılmamıştır NB birden çok etkileşimler PIP2 ile onun kopmalara önde gelen plazma zarı istikrarsızlaştırmak.
Burada MLKL işlevini necroptosis24cellat tanımlamak için kullanılan belirli yöntemleri gösterilmektedir. Özellikle, biz odaklanmak en az etki alanı MLKL, NB ve küme ayracı (NBB), hangi küme ayracı inhibisyon tarafından düzenlenir ve plazma membran rüptürü ve necroptosis ikna etmek için zorunlu dimerization ile aktif hale getirebilirsiniz. Biz zorunlu uyuşturucu kaynaklı FKBP-aracılı dimerization canlı hücre görüntüleme ve necroptosis geçiren hücrelerin elektron mikroskobu ile birlikte bizim indüklenebilir ifade sistemi açıklanmaktadır. Ayrıca, bizim vitro NMR Analizi NBB etkileşimleri ile phosphatidylinositols (pip) göstermektedir.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Klonlama ve hücre hattı oluşturma</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pRetroX-TRE3G</td><td>Clontech</td><td>631188</td><td></td></tr><tr><td>Tet-On transaktivatör plazmidi</td><td></td><td></td><td>Llambi et al., 2016</td></tr><tr><td>Fare Embriyonik Fibroblastları (MEF'ler) mlkl-/-</td><td></td><td></td><td>Dillon et al., 2014</td></tr><tr><td>Blasticidin S Hidroklorür</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2647100 CAS # 3513-03-9</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Hücre ölümü miktar tayini ve canlı hücre mikroskobu< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Doksisiklin</td><td>Clontech</td><td>631311 CAS # 24390-14-5</td><td></td></tr><tr><td>B / B Homodimerizer AP20187</td><td>Takara</td><td>635059 CAS # 195514-80-8</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Yeşil</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Syto16</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7578</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>NMR</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 N Amonyum Klorür</td><td>Cambridge İzotop Laboratuvarları</td><td>NLM-467-10 CAS # 12125-02-9</td><td></td></tr><tr><td>Döteryumlu DTT</td><td>Cambridge İzotop Laboratuvarları</td><td>DLM-2622-1</td><td></td></tr><tr><td>Döteryum Oksit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>617385-1 CAS # 7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodesil-&beta;-D-Maltopiranosid</td><td>Anatrace</td><td>D310 CAS # 69227-93-6</td><td></td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatidilinositol-4,5-bifosfat (Beyin, Domuz) (amonyum tuzu)</td> <td>Avanti Polar Lipidler</td><td>840046X CAS # 383907-42-4</td><td></td></tr><tr><td>1,2-distearoil-sn-glisero-3-fosfoinositol (amonyum tuzu) (18:0 PI)</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>850143 CAS # 849412-67-5</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfo-(1'-miyo-inositol) (amonyum tuzu) (18:1)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850149 CAS # 799268-53-4</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Özel Ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte FLR veya ZOOM</td><td>Essen BioScience, Inc.</td><td></td><td>Canlı hücre mikroskobu görüntüleme</td></tr><tr><td>Helios NanoLab 660 DualBeam&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific Elektron</td><td></td><td>mikroskobu</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)</td><td>Essen BioScience, Inc.</td><td>http://www.essenbioscience.com</td><td>Görüntüleme analizi</td>,</tr><tr><td>FEI MAPS, Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>https://www.fei.com/software/maps/</td> <td>EM analizi</td></tr>, <tr><td>TopSpin v3.2</td>, <td>Bruker BioSpin</td><td>http://www.bruker.com</td>, <td>NMR veri toplama</td></tr><tr>,<td>CARA v1.9.1.7</td><td></td>, <td>http://cara.nmr.ch/&nbsp;</td><td>NMR veri analizi</td></tr><tr><td>Slidebook</td><td>3i (Akıllı Görüntüleme Yenilikleri)</td><td>https://www.intelligent-imaging.com/slidebook</td><td>Konfokal mikroskopi</td></tr></tbody></table>

necroptosis mlkl-aracılı plazma zarı kopma karakterizasyonu

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Necroptosis phosphorylates ve karışık soy kinaz benzeri etki alanı pseudokinase, MLKL rüptürü veya plazma zarı permeabilize, aktive protein kinaz 3 (RIPK3), etkileşim reseptör etkinleştirme tarafından tetiklenen bir programlı hücre ölümü yoludur . Necroptosis otoimmünite, bulaşıcı ve kalp-damar hastalıkları, felç, ateş ve kanser de dahil olmak üzere birden çok patolojileri ile ilişkili inflamatuvar bir yoludur. Burada, MLKL necroptosis plazma zarı kopma cellat olarak karakterize etmek için kullanılan iletişim kurallarını açıklar. Biz necroptosis confocal ve konvansiyonel floresans mikroskobu ile canlı hücre Imaging'i kullanma hücreleri ve sabit hücrelerin elektron mikroskobu, birlikte plazma için sitozol üzerinden MLKL dağıtılması ortaya kullanarak işlem görselleştirmek membran plazma zarı büyük delikler indüksiyon öncesinde. Biz MLKL-aracılı necroptosis sözde modülatörler tanımlamak için lipidler kullanarak vitro nükleer manyetik rezonans (NMR) analiz mevcut. Bu yöntem üzerinde bağlı olarak, biz nicel lipid-bağlama tercihleri ve phosphatidyl inositol fosfatlar (pip) MLKL, plazma zarı hedefleme ve necroptosis permeabilization için gerekli olan kritik bağlayıcı olarak tespit edilmiştir.

Düzenlenmiş necroptosis yürütme canlı hücrelerdeki görselleştirme en az bir kesilmiş yapı, NBB140MLKL indüklenebilir ifade yoluyla mümkün olmuştur-2xFV-Venüs. Bu yapıyı plazma zarı permeabilization ikna yeteneği korur ve Dim kaynaklı Oligomerizasyonda FKBP kaset (2xFV) etkinleştirilir. Biz gözlemlemek ve necroptosis tarafından Imaging, kinetically (her 5 dk) bir hücre geçirimsiz yeşil floresans DNA bağlama boya (Şekil 6A) alımını i...

Biz yöntemleri konvansiyonel ve confocal live-cep mikroskobu görüntüleme, dahil olmak üzere necroptosis MLKL-aracılı plazma zarı kopma karakterizasyonu için scanning elektron mikroskobu ve lipid NMR tabanlı bağlama raporu.

Necroptosis MLKL-aracılı plazma zarı kopma karakterizasyonu

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

Bu yöntemler, lipid bağlanmasında membran translokasyonu ve geçirgenlik gibi nekrotozda psödokinaz karışık soy kinaz alanının veya MLKL'nin rolü hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniklerin en büyük avantajı, nekrotozda plazma membran rüptürünün uygulayıcısı olarak MLKL'yi doğrudan ima etmeleridir. Canlı hücre görüntüleme, özellikle MLKL aracılı nekrotoz için hücre ölümü araştırmaları alanında devrim yaratmıştır.Nükleer manyetik rezonans, burada MLKL için gösterildiği gibi proteinlere lipid bağlanmasını izlemek için güçlü bir tekniktir. Bir hücre kültürü inkübatöründe gece boyunca inkübasyonları için 24 oyuklu plakalarda bir oligomerizasyon kasetine ve Venüs'e kaynaşmış MLKL'nin cellat alanını ifade eden dördüncü MLKL nakavt fare embriyonik fibroblastları veya MEF'leri beş kez 10 kez kaplayarak başlayın. Ertesi sabah, transgenin ekspresyonunu indüklemek için hücreleri 12 saat boyunca doksisiklin ile muamele edin, ardından nekrotozu indüklemek için FK506 bağlayıcı protein dimerizer ve zar geçirimsiz yeşil floresan boya ile takviye edilmiş standart DMEM ilavesi ile muamele edin.Hücre ölümünü izlemek için, plakayı bir memeli doku kültürü inkübatöründe bulunan uygun bir görüntüleme ünitesine yerleştirin ve görüntüleme sistemi yazılımını açın. Schedule Upcoming Scans (Yaklaşan Taramaları Planla) sekmesini seçin ve Physical Layout (Fiziksel Düzen) sekmesinde tepsiyi, kabı, tarama türlerini ve tarama modelini seçin. Özellikler sekmesinde hızlı floresansı seçin ve tarama süresini eklemek için Zaman Çizelgesi penceresine ve toplam zaman noktası sayısına ve alım sıklığına tıklayın.Ardından, görüntü alımını başlatmak için Uygula'ya tıklayın. Nekrotozu ölçmek için, Görevler bölmesini seçin ve arka plan seviyesinin üzerinde sabit segmentasyon eşiği ile nesne sayma yeni analizini ayarlamak için fare imlecini birkaç görüntünün arka planının üzerine getirin. Ardından, geçerli görüntüdeki floresan nesneleri incelemek ve eşik düzeylerini gerektiği gibi iyileştirmek için Önizleme'yi seçin.Eşiğin dikkatli bir şekilde seçilmesi, plaka üzerindeki çoklu kuyucukların gözlemlenmesi ve yazılımdaki Önizleme özelliği kullanılarak gerçekleştirilebilir. Plakadaki tüm kuyucuklar için aynı eşik ayarını kullanmaya dikkat edin. Yeşil floresan sayımlarını entegre etmek için, Yeni Analizi Başlat sekmesi altında zaman aralığını ve analiz edilecek kuyuları seçin ve analiz işi adını girin.Ardından, Tamam'a tıklayın ve verileri uygun bir grafik yazılım programında ek analiz için dışa aktarmak için iş adına çift tıklayın. MLKL'nin nükleer manyetik rezonans spektroskopisi veya NMR ile lipit bağlanması için, ilgilenilen fosfolipidlerin mililitresinde bir miligramı ayrı NMR titrasyon serileri için temiz cam şişelere ayırmak için hava geçirmez şırıngalar kullanın ve şişeleri beş ila 30 dakika boyunca gaz halinde bir argon veya nitrojen akışı altına yerleştirin. Çözücü buharlaşması nedeniyle numuneler arasındaki lipit konsantrasyonlarındaki tutarsızlıkları en aza indirmek için kloroform veya metanol gibi uçucu çözücülerden lipitlerin dağıtımı, kuru buz üzerinde tutulan stoklardan hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir.Buharlaşma süresinin sonunda, şişeleri bir Buchner şişesinin dibine yerleştirmek için büyük cımbız kullanın. Şişeyi bir lastik tıpa ile kapatın ve kalan organik maddeleri çıkarmak için flakon içeriğini gece boyunca hafif vakum altında boşaltmak için bir vakum hattına bağlı plastik boruyu takın. Ertesi sabah, bir lipit film ile her bir cam şişeye uygun deneysel konsantrasyonda deterjanla takviye edilmiş NMR tamponu ekleyin ve şişeyi bir su banyosunda 30 dakikaya kadar sonikasyon yapın, lipit filmin çözünmesini kontrol etmek için her 10 dakikada bir sonikasyonu durdurun.Sonikasyonun sonunda, şişelerin 15 dakika boyunca soğumasına izin verin ve istenen konsantrasyon serisi için 1: 1 karışımları sonikleştirerek, deterjan pozitif NMR tamponunda lipit-deterjan misellerinin seri bir seyreltmesini gerçekleştirin. Deterjan pozitif tampondaki her lipid seyreltmesine protein ve katkı maddeleri ekleyerek, sırasıyla deterjan negatif ve deterjan pozitif NMR tamponlarında protein ve katkı maddelerinin NMR örneklerini hazırlayın, kontrol edin ve referans alın. Ardından, uygun hacimdeki numuneleri uygun boyuttaki NMR tüplerine aktarın ve numuneleri NMR cihazına yükleyin.MLKL-nakavt MEF'lerin tam nekrotozu, kaynaşmış transgeni eksprese eden doksisiklin önceden inkübe edilmiş hücrelerin dimer aracılı oligomerizasyonundan bir saat sonra gözlemlenebilir. Bu hızlı kinetik nekrotoz, MLKL'nin plazma zarı yırtılmasının varsayılan uygulayıcısı olarak rolünü destekler, bu da hücre çevresinin dimer ve Venüs kodlaması ile tedaviden bir ila iki dakika sonra plazma zarı ile ilişkili Venüs puncta üretimi ve iki ila üç dakika içinde kademeli hücre yuvarlaklaşması ile sonuçlanır. Hızlı nekrotoz altında, hücreler morfolojiyi normal uzamış şekillerinden yuvarlaklaşır ve oligomerizasyondan sonraki beş dakika içinde şişer, 10 dakikada kısmen yırtılır ve 20 dakikada kaybolan sitozol ile geniş ölçüde parçalanır.NMR spektroskopisi ile izlenen in vitro lipid bağlama deneyleri, inhibitör destek bölgesini kapalı N-sarmaldan açık ve içsel olarak düzensiz konformasyona taşımak için lipid bağlanması üzerine MLKL uygulayıcı alan proteininde büyük yapısal değişiklikler ve ayrıca her iki konformerin karışımları hakkında kalıntı başına bilgi ortaya koymaktadır. Belirli bir numunedeki kapalı ve açık konformerlerin yüzdeleri de izlenebilir, bu da MLKL uygulayıcı alanının fosfolipidlerle etkileşimi için destekleyici kanıtlar sağlar ve MLKL ile plazma zarı arasında doğrudan bir bağlantı olduğunu düşündürür. Bu nedenle, bu prosedürü kullanarak hücre ölümünü ölçmeye çalışırken, DNA bağlayıcı boyanın normalde genetik olarak kodlayan floresan proteininden daha yüksek eşik floresansına sahip olduğunu bilmek ve hatırlamak önemlidir.Bu nedenle paralel olarak kullanılabilirler. Ayrıca, misel lipidlerinin sıcaklığa duyarlı olduğunu ve bu nedenle NMR numune sıcaklığının optimize edilmesi gerekebileceğini unutmayın. Bu prosedürü takiben, nekrotoz geçiren hücrelerde hücre yırtılmasının ne kadar hızlı gerçekleştiğini ve yırtılmanın plazma zarı üzerinde nerede lokalize olduğunu ele almak için toplam iç yansıma mikroskobu ve elektromikroskopi gibi başka teknikler de kullanılabilir.Ek olarak, MLKL'nin misel lipidlerine bağlanmasını ortogonal olarak doğrulamak için mikro ölçekli termoforez gerçekleştirilebilir. Bu videoda açıklanan teknikler, nekrotoz alanındaki araştırmacıların, MLKL'nin plazma zarı rüptürünün uygulayıcısı olarak rolünü keşfetmelerinin yolunu açtı. Kloroform ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven giymek ve iyi havalandırılan bir alanda çalışmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

characterization-mlkl-mediated-plasma-membrane-rupture

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada, bitişik ölü veya ölmekte olan hücrelerle fiziksel etkileşim yoluyla canlı hücrelerde indüklenen hücre içi sinyal olaylarının belirlenmesi için bir protokol sunuyoruz. Protokol, fagositik alımlarının veya çözünür aracıların salınmasının aksine, ölü hücrelerin reseptör aracılı tanınmasıyla indüklenen sinyal olaylarına odaklanır.

Hücre içi Komşu maruz kalan hücreler, apoptotik hücre ölümü ile etkileşim yoluyla canlı hücreler İndüklenen sinyal olaylarının tanımlanması

Bu iletişim kuralı yalıtma ve birincil fare serebral granül neurons (CGNs) 6-7 gün eski pups, CGNs kaybı için verimli iletim ve kazanç işlevi çalışmalar, kültür ve nöronal excitotoxicity NMDA kaynaklı modelleme için basit bir yöntem açıklar, düşük potasyum indüklenen hücre ölümü, DNA hasarı ve oksidatif stres aynı kültür modelini kullanarak.

Modelleme nöronal ölüm ve fare birincil serebellar granül nöronlar dejenerasyon

NLRP3 inflammasome harekete geçirmek algılama floresans mikroskobu kullanarak ve etkin caspase-1 ve adaptörü, ASC için boyama hücresel olarak açıklanmaktadır. Laktat dehidrogenaz yayın tahlil pyroptotic lizis nüfus olarak algılamak için sunulmuştur. Bu teknikler birçok açıdan inflammasome biyoloji çalışmaya adapte edilebilir.

Inflammasome harekete geçirmek ve Pyroptotic hücre ölümü fare kemik iliği türevi makrofajlar içinde tespiti

Burada biz verimliliği Fluorometrik ve görüntüleme analizleri canlı hücreler aracılığıyla yeniden mühürlemeden plazma zarı ölçer yüksek üretilen iş floresans tabanlı bir tahlil tanımlamak. Bu tahlil uyuşturucu ya da plazma zarı memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden düzenleyen hedef genlerin eleme için kullanılabilir.

Plazma zarı verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden yüksek üretilen iş ölçümü

İmmünofloresan boyama sırasında tiramid sinyal amplifikasyonu, HSV-1 enfeksiyonundan sonra ZBP1 kaynaklı nekroptoz sırasında fosforile RIPK3 ve MLKL'nin hassas tespitini sağlar.

İnsan Hücrelerinde HSV-1 Enfeksiyonu Sonrası ZBP1'e Bağlı RIPK3 ve MLKL'nin İmmünofloresan Boyama İçin Timamid Sinyal Amplifikasyonu

Bu protokol, PMA ile farklılaşmış THP-1 makrofajlarının LPS ve ATP'ye bağlı ölümüne dayanmaktadır. Hücre ölümünü tespit etmek için Annexin V ve 7-AAD çift boyamayı analiz etmek için akış sitometrisi kullanıyoruz, tüm hücreyi kullanıyoruz ve hücre zarı morfolojisini gözlemlemek için taramalı elektron mikroskobu kullanıyoruz.

PMA ile Farklılaşmış THP-1 Makrofajlarının LPS ve ATP ile İndüklenen Ölümü ve Validasyonu

Bu protokol, lizozomal membran bütünlüğü ve asitleşmedeki değişiklikleri tespit eden floresan problar kullanarak, nekroptoz sırasında lizozomal membran geçirgenliğini izlemek için bir canlı hücre görüntüleme yöntemini açıklar.

Nekroptoz Sırasında Lizozomal Membran Geçirgenliğinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Biz toplam iç yansıma ve Epifloresans mikroskopi kullanılarak kültürlü astrositler membran ve küresel hücre içi kalsiyum dinamikleri yakın ölçmek için nasıl açıklar.

Astrositler Plazma Membran ve Küresel Hücre içi kalsiyum Dynamics civarında Ölçüm

Düzenlenmiş endositoz, hücre zarı proteinleri çoğunluğu yüzey ekspresyon düzeyleri yönetir. Burada, dopamin taşıyıcısı (DAT), polytopic membran proteini endositik hızını ölçmek için indirgenebilir, Membran geçirgenliği olmayan biyotinilasyon reaktifleri kullanmaktadır. Bu yöntem çoğu plazma membran proteinlerinin endositik oranını ölçmek için basit bir yaklaşımdır kolaylaştırır.

Tersinir biyotinilasyon Plazma Membran Protein endositik Oranları Ölçüm

Bu protokol, flow sitometri ile hücre plazma membranı, sitoplazma GLUT4 translokasyon ölçmek hızlı bir teknik anlatılmaktadır.

Akış Sitometri Plazma Membran GLUT4 Translokasyon Kantitatif Ölçüm

Öğrenin necroptosis sırasında MLKL-aracılı plazma zarı kopmasını karakterize etme yöntemlerini. Canlı hücre mikroskobisi, taramalı elektron mikroskobisi ve NMR bazlı lipid bağlanma analizi kullanılarak hücre ölüm mekanizmaları incelenir.

Necroptosis MLKL-aracılı plazma zarı kopma karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet