Hassas ölçüm Mitophagy floresan muhabir akış sitometresi kullanarak pH bağımlı mt-Keima tarafından

Bu prosedürün genel amacı, akış sitometrisi kullanarak hücresel mitofaji aktivitesini ölçmek için hassas bir teknik sağlamaktır. Burada, bu yöntemin, bir mitokondriyal birleştirici olan CCCP ile tedaviden sonra HeLa hücre mitofajisindeki dramatik artışı değerlendirmek için başarıyla kullanıldığını gösteriyoruz. Bu teknik, mitofaj aktivitesinin çok hızlı ve kolay bir şekilde ölçülmesini sağlar.

Bu tekniğin temel avantajı, herhangi bir ek boyama olmadan canlı hücrelerdeki mitofaj aktivitesini hassas bir şekilde ölçebilmenizdir. Bu nedenle, bu teknik sonuçta mitofilin mekanizmasını ve fizyolojik rolünü anlamada yardımcı olabilir. Prosedürü göstermek için laboratuvarımdan Jee-Hyun Um ve Young Yeon Kim olacak.

Bu prosedüre, Keima lentivirüsünü hedefleyen bir mitokondri olan mt-Keima'yı hazırlayarak başlayın. İlk olarak, HEK293T hücreleri poli-L-lizin kaplı bir kültür kabına tohumlayın ve bir gün boyunca bir doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede kültürleyin. Ertesi gün, mt-Keima lentiviral DNA ile HEK293T hücrelerini transfekte edin ve üreticinin talimatlarına göre bir transfeksiyon reaktifi kullanarak DNaz'ı paketleyin.

Sekiz saatlik transfeksiyondan sonra, transfeksiyon ortamını çıkarın ve sekiz mililitre taze medya ekleyin. Viral partiküller içeren ortamları 48 saat sonra toplayın ve santrifüjleme ile hücresel kalıntıları uzaklaştırın. Daha sonra virüs içeren ortamı 0.45 mikrometre şırınga filtresi ile filtreleyin.

HeLa-Parkin hücrelerini, mt-Keima lentivirüsünü hasat etmeden bir gün önce 60 milimetrelik bir kültür kabına yerleştirin ve hücreleri bir inkübatörde 37 santigrat derecede bir gün boyunca dört mililitre büyüme ortamı ile kültürleyin. Ertesi gün, büyüme ortamını çıkarın, bir milimetre mt-Keima virüs ortamı ekleyin, 3 mikrolitre polibren stok çözeltisi içeren iki mililitre büyüme ortamı ekleyin ve hücreleri bir CO2 inkübatöründe bir gün inkübe edin. Enfeksiyondan 24 saat sonra, virüs ortamını çıkarın, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve dört mililitre büyüme ortamı ekleyin.

Enfekte olmayan hücreleri çıkarmak için, hücreleri iki gün boyunca mikrolitre puromisin başına iki mikrogram ile tedavi edin. 10 mikromolar CCCP içeren taze ortam hazırlayın. Kültürlenmiş ortamı çıkarın ve CCCP içeren dört mililitre taze büyüme ortamı ekleyin.

Hücreleri 37 santigrat derecede bir CO2 inkübatörde altı saat boyunca inkübe edin. Büyüme ortamını çıkarın ve hücreleri bir kez PBS ile yıkayın. Tripsin EDTA çözeltisi ile muamele ederek hücreleri ayırın.

Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. Hücreleri bir FACS tüpüne aktarın ve buzun üzerine yerleştirin. Akış sitometrisi için akış sitometresini açın ve analiz yazılımını başlatın.

Yeni bir deney oluşturun ve parametre penceresinde mor lazer için BV605'i ve sarı-yeşil lazer için PE-CF594'ü seçin. İlk olarak, mt-Keima lentivirüsü ile enfekte olmayan hücrelerin bir kontrol örneğini çalıştırın. İleri saçılma ve yan saçılma grafiğinde, çokgen simgesini kullanarak canlı hücrelerin etrafına bir kapı çizin ve ölü hücreleri ve hücre kalıntılarını ortadan kaldırın.

Daha sonra mt-Keima lentivirüsü ile enfekte olmuş HeLa-Parkin hücrelerini çalıştırın. BV605'in yan saçılmaya karşı nokta grafiğinde, voltajı, mt-Keima'yı ifade eden HeLa-Parkin hücreleri, mt-Keima'yı ifade etmeyen kontrol hücrelerinden açıkça ayırt edilecek şekilde ayarlayın. PE-CF594'ün yan saçılmaya karşı nokta grafiğinde daha sonra, voltajı, mt-Keima'yı ifade eden HeLa-Parkin hücreleri kontrol hücrelerinden açıkça ayırt edilecek şekilde ayarlayın.

Ardından, BV605'in PE-CF594'e karşı nokta grafiğinde, çokgen simgesini kullanarak bir kapı çizerek mt-Keima-pozitif hücre popülasyonunu seçin. Ardından, yalnızca mt-Keima kapılı hücreleri gösteren PE-CF594'e karşı BV605'in başka bir nokta grafiği oluşturun. Bu nokta grafiğinde, tedavi edilmemiş mt-Keima-pozitif hücrelerin etrafına bir kapı çizin.

Bu kapı alçak kapı olarak adlandırılır. Ardından, alçak kapının üzerindeki bölgeyi içeren başka bir kapı çizin. Bu kapı, yüksek mitofaji aktivitesine sahip hücreler içerdiği için yüksek kapı olarak adlandırılır.

Ardından Nüfus Hiyerarşisini Göster menüsünü seçin. Ana değerin Yüzdesi, mt-Keima pozitif popülasyon arasındaki yüksek kapıdaki hücrelerin yüzdesini temsil eder. Şimdi her örneği çalıştırın ve mt-Keima durdurma kapısında en az 10.000 olay kaydedin.

mt-Keima'yı eksprese eden tedavi edilmemiş HeLa hücrelerinin akış sitometrisi analizi, düşük mitofaji seviyesi gösterdi. CCCP tedavisi, yüksek kapıdaki mitofaji hücrelerinde dramatik bir artışa neden oldu. Mitofaji hücrelerinin yüzdesi, CCCP tedavisinden altı saat sonra 10 kattan fazla artmıştır.

CCCP tedavisi ile mitofajideki bu artış, bafilomisin A ile birlikte tedavi ile tamamen ortadan kaldırılmıştır.Mito-Keima eksprese eden hücreler hazır olduğunda, akış sitometrisi kullanılarak mitofaj ölçümü, uygun şekilde hazırlanırsa bir saat içinde gerçekleştirilebilir. Akış sitometrisi ile doğru mitofaj analizi için doğru yüksek ve alçak kapıların ayarlanması önemlidir. Yeni hücre türlerini analiz ederken, HeLa hücreleri gibi iyi bilinen hücreleri kontrol olarak kullanmak gerekir.

Ek olarak, mitofajın, mitokondriyal proteinde bir azalma ve mitokondriyal DNA'da bir azalma gibi ek özelliklerle tam olarak doğrulanması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu teknik çok çeşitli hücre tiplerine uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, akış sitometrisi ile mitofajın nasıl analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız.