Hassas ölçüm Mitophagy floresan muhabir akış sitometresi kullanarak pH bağımlı mt-Keima tarafından
August 12th, 2018
Mitophagy, mitokondri, seçici bozulması mitokondrial homeostazı karıştığı ve çeşitli insan hastalıklarda deregüle. Ancak, mitophagy etkinliğini ölçmek için uygun deneysel yöntemleri çok sınırlıdır. Burada, biz hassas bir tahlil akış sitometresi kullanarak mitophagy etkinliğini ölçmek için sağlar.
Bu prosedürün genel amacı, akış sitometrisi kullanarak hücresel mitofaji aktivitesini ölçmek için hassas bir teknik sağlamaktır. Burada, bu yöntemin, bir mitokondriyal birleştirici olan CCCP ile tedaviden sonra HeLa hücre mitofajisindeki dramatik artışı değerlendirmek için başarıyla kullanıldığını gösteriyoruz. Bu teknik, mitofaj aktivitesinin çok hızlı ve kolay bir şekilde ölçülmesini sağlar.
Bu tekniğin temel avantajı, herhangi bir ek boyama olmadan canlı hücrelerdeki mitofaj aktivitesini hassas bir şekilde ölçebilmenizdir. Bu nedenle, bu teknik sonuçta mitofilin mekanizmasını ve fizyolojik rolünü anlamada yardımcı olabilir. Prosedürü göstermek için laboratuvarımdan Jee-Hyun Um ve Young Yeon Kim olacak.
Bu prosedüre, Keima lentivirüsünü hedefleyen bir mitokondri olan mt-Keima'yı hazırlayarak başlayın. İlk olarak, HEK293T hücreleri poli-L-lizin kaplı bir kültür kabına tohumlayın ve bir gün boyunca bir doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede kültürleyin. Ertesi gün, mt-Keima lentiviral DNA ile HEK293T hücrelerini transfekte edin ve üreticinin talimatlarına göre bir transfeksiyon reaktifi kullanarak DNaz'ı paketleyin.
Sekiz saatlik transfeksiyondan sonra, transfeksiyon ortamını çıkarın ve sekiz mililitre taze medya ekleyin. Viral partiküller içeren ortamları 48 saat sonra toplayın ve santrifüjleme ile hücresel kalıntıları uzaklaştırın. Daha sonra virüs içeren ortamı 0.45 mikrometre şırınga filtresi ile filtreleyin.
HeLa-Parkin hücrelerini, mt-Keima lentivirüsünü hasat etmeden bir gün önce 60 milimetrelik bir kültür kabına yerleştirin ve hücreleri bir inkübatörde 37 santigrat derecede bir gün boyunca dört mililitre büyüme ortamı ile kültürleyin. Ertesi gün, büyüme ortamını çıkarın, bir milimetre mt-Keima virüs ortamı ekleyin, 3 mikrolitre polibren stok çözeltisi içeren iki mililitre büyüme ortamı ekleyin ve hücreleri bir CO2 inkübatöründe bir gün inkübe edin. Enfeksiyondan 24 saat sonra, virüs ortamını çıkarın, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve dört mililitre büyüme ortamı ekleyin.
Enfekte olmayan hücreleri çıkarmak için, hücreleri iki gün boyunca mikrolitre puromisin başına iki mikrogram ile tedavi edin. 10 mikromolar CCCP içeren taze ortam hazırlayın. Kültürlenmiş ortamı çıkarın ve CCCP içeren dört mililitre taze büyüme ortamı ekleyin.
Hücreleri 37 santigrat derecede bir CO2 inkübatörde altı saat boyunca inkübe edin. Büyüme ortamını çıkarın ve hücreleri bir kez PBS ile yıkayın. Tripsin EDTA çözeltisi ile muamele ederek hücreleri ayırın.
Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. Hücreleri bir FACS tüpüne aktarın ve buzun üzerine yerleştirin. Akış sitometrisi için akış sitometresini açın ve analiz yazılımını başlatın.
Yeni bir deney oluşturun ve parametre penceresinde mor lazer için BV605'i ve sarı-yeşil lazer için PE-CF594'ü seçin. İlk olarak, mt-Keima lentivirüsü ile enfekte olmayan hücrelerin bir kontrol örneğini çalıştırın. İleri saçılma ve yan saçılma grafiğinde, çokgen simgesini kullanarak canlı hücrelerin etrafına bir kapı çizin ve ölü hücreleri ve hücre kalıntılarını ortadan kaldırın.
Daha sonra mt-Keima lentivirüsü ile enfekte olmuş HeLa-Parkin hücrelerini çalıştırın. BV605'in yan saçılmaya karşı nokta grafiğinde, voltajı, mt-Keima'yı ifade eden HeLa-Parkin hücreleri, mt-Keima'yı ifade etmeyen kontrol hücrelerinden açıkça ayırt edilecek şekilde ayarlayın. PE-CF594'ün yan saçılmaya karşı nokta grafiğinde daha sonra, voltajı, mt-Keima'yı ifade eden HeLa-Parkin hücreleri kontrol hücrelerinden açıkça ayırt edilecek şekilde ayarlayın.
Ardından, BV605'in PE-CF594'e karşı nokta grafiğinde, çokgen simgesini kullanarak bir kapı çizerek mt-Keima-pozitif hücre popülasyonunu seçin. Ardından, yalnızca mt-Keima kapılı hücreleri gösteren PE-CF594'e karşı BV605'in başka bir nokta grafiği oluşturun. Bu nokta grafiğinde, tedavi edilmemiş mt-Keima-pozitif hücrelerin etrafına bir kapı çizin.
Bu kapı alçak kapı olarak adlandırılır. Ardından, alçak kapının üzerindeki bölgeyi içeren başka bir kapı çizin. Bu kapı, yüksek mitofaji aktivitesine sahip hücreler içerdiği için yüksek kapı olarak adlandırılır.
Ardından Nüfus Hiyerarşisini Göster menüsünü seçin. Ana değerin Yüzdesi, mt-Keima pozitif popülasyon arasındaki yüksek kapıdaki hücrelerin yüzdesini temsil eder. Şimdi her örneği çalıştırın ve mt-Keima durdurma kapısında en az 10.000 olay kaydedin.
mt-Keima'yı eksprese eden tedavi edilmemiş HeLa hücrelerinin akış sitometrisi analizi, düşük mitofaji seviyesi gösterdi. CCCP tedavisi, yüksek kapıdaki mitofaji hücrelerinde dramatik bir artışa neden oldu. Mitofaji hücrelerinin yüzdesi, CCCP tedavisinden altı saat sonra 10 kattan fazla artmıştır.
CCCP tedavisi ile mitofajideki bu artış, bafilomisin A ile birlikte tedavi ile tamamen ortadan kaldırılmıştır.Mito-Keima eksprese eden hücreler hazır olduğunda, akış sitometrisi kullanılarak mitofaj ölçümü, uygun şekilde hazırlanırsa bir saat içinde gerçekleştirilebilir. Akış sitometrisi ile doğru mitofaj analizi için doğru yüksek ve alçak kapıların ayarlanması önemlidir. Yeni hücre türlerini analiz ederken, HeLa hücreleri gibi iyi bilinen hücreleri kontrol olarak kullanmak gerekir.
Ek olarak, mitofajın, mitokondriyal proteinde bir azalma ve mitokondriyal DNA'da bir azalma gibi ek özelliklerle tam olarak doğrulanması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu teknik çok çeşitli hücre tiplerine uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, akış sitometrisi ile mitofajın nasıl analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, akış sitometrisi kullanarak hücresel mitofaji aktivitesini ölçmek için hassas bir teknik sunmaktadır. Yöntem, ilave boyama gerektirmeden canlı hücrelerde mitofajinin hızlı ve kolay değerlendirilmesine olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre biyolojisi
- Nörobilim
- Hücresel metabolizma
Arka Plan
- Mitofaji, mitokondrilerinin seçici yıkımıdır.
- Mitokondriyel homeostazın korunmasında kritik bir rol oynar.
- Mitofajinin düzensiz düzenlenmesi çeşitli insan hastalıkları ile ilişkilidir.
- Mitofajinin ölçülmesi için mevcut yöntemler sınırlıdır.
Çalışmanın Amacı
- Mitofajik aktiviteyi ölçmek için hassas bir yöntem sağlamak.
- Akış sitometrisi tekniğinin etkinliğini göstermek.
- Mitofajinin fizyolojik rolü hakkındaki anlayışımızı artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Mitofajik aktiviteyi ölçmek için akış sitometrisi.
- CCCP tedavisi sonrası HeLa hücre mitofajisinin değerlendirilmesi.
- Ek boyama olmadan mitofajinin ölçülmesi.
- Araştırmacılar Jee-Hyun Um ve Young Yeon Kim tarafından gösterildi.
Ana Sonuçlar
- HeLa hücrelerinde artan mitofajinin başarılı bir şekilde değerlendirilmesi.
- Hızlı ve hassas ölçüm yeteneklerinin gösterilmesi.
- Tekniğin canlı hücrelerde uygulanabilirliğinin doğrulanması.
- Mitofajinin mekanizmaları hakkında içgörüler sağlandı.
Sonuçlar
- Akış sitometrisi tekniği, mitofajiyi ölçmek için etkilidir.
- Bu yöntem, mitokondriyal dinamikler hakkında daha fazla araştırmayı kolaylaştırabilir.
- Mitofaji ile bağlantılı çeşitli hastalıkları anlama potansiyeline sahiptir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of mitophagy is essential for de-risking mitochondrial-targeted therapeutic hypotheses in neurodegenerative and metabolic disease programs. The mt-Keima flow cytometry assay provides a rapid, quantitative readout that supports early-stage target validation by linking mitochondrial clearance to phenotypic outcomes. This enables predictive confidence in lead identification and prioritization of compounds modulating mitochondrial quality control.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring mitochondrial autophagic flux as a functional readout of pathway engagement.
- Operational Value: Enables rapid screening of genetic or pharmacological modulators without fixation or additional staining, preserving live-cell physiology.
- Predictive Value: Supports target de-risking by correlating mitophagy induction with known activators like CCCP and inhibition by bafilomycin A, establishing assay specificity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, flow-based percentages of mitophagy-active cells, enabling dose-response and kinetic analysis for hit confirmation.
- Operational Value: Compatible with high-throughput flow cytometry platforms, allowing standardized, reproducible measurements across cell lines and treatment conditions.
- Scalability: Lentiviral mt-Keima expression creates a stable reporter system reusable across multiple experiments, reducing assay development time.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Mitophagy activity measured in live cells aligns with disease-relevant models where mitochondrial dysfunction contributes to pathology.
- Preclinical Readiness: The assay’s sensitivity to lysosomal inhibition (e.g., bafilomycin A) supports mechanistic follow-up in autophagic flux studies.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of mitophagy flux with downstream biomarkers such as mitochondrial DNA loss or ROS production when combined with orthogonal assays.
Pipeline & Workflow Integration
The mt-Keima flow cytometry method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, providing a mechanistic biomarker for mitochondrial health interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of mitophagy regulators by quantifying flux changes in response to pathway modulators.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for assay standardization and inter-laboratory comparability.
- Analytics: Generates percentage-based readouts (high gate vs. mt-Keima-positive population) that enable statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by confirming target engagement in disease-relevant cellular models of mitochondrial stress.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable mitochondrial flux platform applicable across therapeutic areas involving neurodegeneration, metabolism, and aging.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial pathway modulation by providing direct, live-cell readouts of autophagic clearance.
- Operational Value: Eliminates need for fixation or permeabilization, enabling same-day analysis and reducing assay variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking compound effects to mitochondrial quality control, reducing late-stage attrition due to off-target mitochondrial toxicity.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on functional mitophagy modulation in human cell systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lentiviral transduction, flow cytometry compensation, and gating strategy design for dual-fluorescence reporters.
- Dependent on access to flow cytometers with violet (405 nm) and yellow-green (561 nm) laser lines and appropriate filters (BV605, PE-CF594).
- Necessitates standardization of mt-Keima expression levels and puromycin selection across cell lines to ensure consistent signal-to-noise ratios.
- Requires validation of mitophagy specificity using lysosomal inhibitors (e.g., bafilomycin A) and mitochondrial uncouplers (e.g., CCCP) as positive and negative controls.
- Limited to cells amenable to lentiviral transduction and puromycin selection; alternative delivery methods may be needed for primary or hard-to-transfect systems.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
1:02
Generation of Cells Expressing mt-Keima
3:25
Inducing Mitophagy using CCCP Treatment and Preparing FACS Samples
4:29
FACS Analysis of Mitophagy
7:16
Results: Analysis of CCCP-induced Mitophagy in HeLa-mt-Keima Cells by Flow Cytometry
7:55
Conclusion
