Name: Hassas ölçüm Mitophagy floresan muhabir akış sitometresi kullanarak pH bağımlı mt-Keima tarafından (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Öğrenin, akış sitometresi kullanarak mitofaji aktivitesini hızlı ve hassas bir şekilde ölçme yöntemini. Canlı hücrelerde ek boyama gerektirmeden HeLa hücrelerinde mitofajiyi değerlendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser (J. U. için) Ulusal Araştırma Vakfı Kore'den (2016R1D1A1B03931949), bir hibe ve Kore (NMG) hibe (için J.Y Kore government(MSIT) (No. 2016R1A2B2008887, No. 2016R1A5A2007009) tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir .)

1. nesil HeLa hücreleri mito-Keima (mt-Keima) ifade
<ol><li>
Mt-Keima lentivirus hazırlanması
	<ol>
<li>2 mL % 0.001 poli-L-lizin/fosfat-tamponlu tuz (PBS) ekleyerek bir 100-mm Kültür yemek kat ve oda sıcaklığında 5 min için stand sağlar.</li>
		<li>Bir vakum için bağlı bir cam pipet kullanarak poli-L-lizin çözümü kaldırmak ve 2 mL 1 x PBS ekleyerek kültür bulaşık yıka.</li>
		<li>Plaka 1.5 x 106 HEK293T hücreleri kaplamalı kültür üzerine 10 mL % 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin içeren DMEM ile yemek ve CO2 doku kültürü kuluçka 37 ° C'de hücreler kültür için bir günü.</li>
		<li>Mt-Keima lentiviral plazmid29 DNA 2 µg DNA'lar (psPAX 2 µg ve pVSVG 0,25 µg) paketleme ile birlikte transfect için üreticinin yönergelerine göre 8 h transfection reaktif kullanarak.</li>
		<li>Transfection ortamını çıkarın ve 8 mL taze medya ekleyin.</li>
		<li>Viral parçacıkların 48 saat sonra içeren medya toplamak. Santrifüjü 500 x g 5 min için de tarafından toplanan medyadan hücresel enkaz kaldırmak ve bir 0.45 µm şırınga filtre ile. Not: Uzun vadeli kullanım için aliquots lentiviral parçacıkların yapmak ve örnekleri-80 ° C'de depolayın Donma-çözülme döngüsü için etkili viral enfeksiyon için viral örnekleri tabi kaçının.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mt-Keima lentivirus ile Parkin HeLa hücreleri bulaşmasını
	<ol>
<li>Plaka 5 x 104 HeLa hücreleri 60 mm kültür tabağına 4 mL % 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin 37 ° C'de mt-Keima lentivirus hasat önce bir gün içeren DMEM ile Parkin (HeLa-Parkin) ifade. Not: Endojen Parkin ifade HeLa hücreleri30, burada daha fazla açıkça göstermek CCCP kaynaklı mitophagy için kullanılan HeLa-Parkin hücre yokluğu nedeniyle. Bu yordamı ayrıca diğer birincil veya ölümsüzleştirdi hücrenin satırlarına uygulanır.</li>
		<li>Ertesi gün büyüme orta kaldırın ve 1 mL mt-Keima lentiviral medya ekleyin. Büyüme orta 3 µL polybrene hisse senedi çözüm (8 mg/mL distile su) içeren bir ek 2 mL ekleyin. Bir gün bir CO2 doku kültürü kuluçka için kuluçkaya.</li>
		<li>Mt-Keima lentiviral karışımı ertesi gün kaldırmak ve hücreleri iki kez 1 x PBS ile yıkayın. Büyüme orta 4 mL ekleyin ve iki gün boyunca 2 µg/mL puromisindir hücrelerle tedavi.</li>
		<li>İki gün sonra puromisindir seçimi, büyüme orta kaldırmak ve hücreleri iki kez 1 x PBS ile yıkayın. Büyüme orta ekleyin ve hücreleri bir CO2 kuluçka kadar kullanmak kültür. Not: Bu yöntem stabil mt-Keima diğer hücre satırları ve primer hücre de dahil olmak üzere, hızlı hücreler üretmek için uygulanabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. inducing CCCP tedavi kullanarak ve FACS örnekleri hazırlama mitophagy
<ol style="margin-left: 40px;"><li>MT-Keima 60 mm Kültür ifade plaka 5 x 104 HeLa-Parkin hücreleri 4 mL % 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin içeren DMEM ile bulaşık ve onları bir gün bir CO2 doku kültürü kuluçka 37 ° C'de için kültür.</li>
	<li>Ertesi gün büyüme orta kaldırmak ve taze DMEM 10 µM karbonil siyanür m-chlorophenylhydrazone (CCCP) içeren 4 mL ekleyin. HeLa-Parkin-mt-Keima hücreleri bir CO2 doku kuluçka 6 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Büyüme orta 6 h daha sonra kaldırmak ve 2 mL 1 x PBS hücrelerle yıkayın. Hücreleri tripsin/EDTA çözüm ile tedavi bunları ayırmak ve tripsin büyüme orta % 10 içeren ekleyerek devre dışı bırakın FBS. Hücreleri 15 mL konik tüp içine aktarın.</li>
	<li>500 x g 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Dikkatli aspirasyon tarafından büyüme orta kaldırmak ve 1 mL soğuk 1 x PBS hücrelerle resuspend.</li>
	<li>Hücreler uygun FACS tüp içine aktarmak ve buza koyun. Not: Bulaşmamış HeLa hücreleri bir negatif kontrol hazırlayın. Not: Buzda birkaç saat için uygun hücrelerdir ve mt-Keima floresan sinyallerini de kararlı kalır.</li>
</ol>3. FACS Analizi mitophagy
Not: Bu çalışmada, hücreleri 405 nm ve 561-nm lazer ile donatılmış bir akış sitometresi ile analiz edildi. Hücreleri bir menekşe lazer ile heyecan (405 nm) 610 ± 10 nm sarı-yeşil lazer ile BV605 dedektörü ile tespit emisyon ile (561 nm) ile 610 ± 10 nm'de aynı anda bir PE-CF594 dedektörü tarafından algılanan emisyon (Şekil 1).
<ol><li>
Perdeleme canlı hücreleri
	<ol>
<li>Akış Sitometresi ve bilgisayarı açın ve analiz yazılımı oturum.</li>
		<li>Yeni bir deneme oluşturmak veya varolan bir deney çoğaltabilirsiniz. Violet ile hücreleri heyecanlandırmak için (405 nm) ve sarı-yeşil (561 nm) lazerler ve emisyon 610 ± 10 nm dedektörü, algılamak, ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) gerekli fluorophores ise parametre penceresinde ek olarak BV605 ve PE-CF594 seçin. Not: Tüm fluorophores doğrusal bir modda eklenmelidir.</li>
		<li>Girdap kısaca hücre dağıtmak için her hücre örnek toplar.</li>
		<li>Mt-Keima lentivirus örnek enjeksiyon portu ile enfekte olmayan bir denetim HeLa-Parkin hücre örnek içeren tüpü yerleştirin ve sitometresi üzerinde "Çalıştır" düğmesine basın.</li>
		<li>FSC SSC karşı nokta mezarlığına hücreleri nokta Arsa ortasına yerleştirmek için FSC ve SSC gerilim ayarlayın.</li>
		<li>Canlı hücrelerin etrafında Çokgen simgesini kullanarak bir P1 kapı çizmek ve ölü hücreleri ve hücre artıkları (Şekil 2A) ortadan kaldırmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mor ve yeşil lazer gerilimleri ayarlamak
	<ol>
<li>Mt-Keima lentivirus üzerinde örnek enjeksiyon ile enfekte içeren HeLa-Parkin hücreleri port ve sitometresi üzerinde "Çalıştır" düğmesine basın tüpü yerleştirin.</li>
		<li>BV605 nokta Arsa (405 nm) mt-Keima ifade HeLa-Parkin mt-Keima (Şekil 2B) ifade değil Denetim hücrelerden açıkça ayırt edici hücrelerdir BV605 gerilim SSC karşı ayarlayın.</li>
		<li>PE-CF594 nokta Arsa (561 nm) mt-Keima ifade HeLa-Parkin hücreleri kontrol hücreleri (Şekil 2B) açıkça ayırt edici SSC karşı PE-CF594 gerilim ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mitophagy hücrelerde yüzdesi değerlendirmek
	<ol>
<li>BV605 PE-CF594 nokta Arsa doğrusal bir ölçek kullanarak karşı kazanmak. Mt-Keima ifade hücrelerin etrafında Çokgen simgesini kullanarak bir kapı çizin ve mt-Keima (Şekil 3A) ifade değil hücreleri ortadan kaldırmak. Mt-Keima floresan pozitif hücre nüfus "mt-Keima" kapısı olarak adlandırılır.</li>
		<li>BV605 PE-CF594 tek "mt-Keima" gösterilen karşı olan başka bir nokta çizim oluşturma-hücrelere geçişli. Bu nokta mezarlığına tedavi edilmezse mt-Keima pozitif hücrelerin etrafında bir kapı çizin. Bazal mitophagy aktivite kontrol HeLa hücreleri düşük ve PE-CF594/BV605, emisyon oranını 1'den. Bu kapı, böylece, "düşük" kapısı olarak adlandırılır.</li>
		<li>"Düşük" kapısının yukarıdaki bölge içeren başka bir kapı çizin. Hücreleri emisyon PE-CF594/BV605 (Şekil 3B), yüksek bir oranı yüksek mitophagy etkinliği ile diğer bir deyişle, hücreler içerdiğinden bu kapı "yüksek" kapısı olarak adlandırılır.</li>
		<li>"Yüksek" gate hücrelerde yüzdesini hesaplamak için "Nüfus hiyerarşi göster" menü. "Üst yüzde" (% üst) değerinin mt-Keima pozitif halk arasında "yüksek" gate hücrelerde yüzdesini temsil eder.</li>
		<li>"Mt-Keima" durdurma kapıda kaydetmek ve her örneği çalıştırmak için en az 10.000 olayları ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+More+than+just+a+powerhouse%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: More than just a powerhouse.</a> Current Biology. 16 (14), R551-R560 (2006).</li>
<li>Zorov, D. B., Krasnikov, B. F., Kuzminova, A. E., Vysokikh, M., Zorova, L. D. Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Bioscience Reports. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZorov%2C+DB+%22Bioscience+Reports%22">Bioscience Reports</a>. 17 (6), 507-520 (1997).</li>
<li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).</li>
<li>Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+control+of+cellular+life%2C+stress%2C+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial control of cellular life, stress, and death.</a> Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).</li>
<li>Kang, D., Hamasaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+mitochondrial+DNA+in+common+diseases+and+disease+states%3A+aging%2C+neurodegeneration%2C+heart+failure%2C+diabetes%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Alterations of mitochondrial DNA in common diseases and disease states: aging, neurodegeneration, heart failure, diabetes, and cancer.</a> Current Medicinal Chemistry. 12 (4), 429-441 (2005).</li>
<li>Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26942670">The mitochondrial basis of aging.</a> Molecular Cell. 61 (5), 654-666 (2016).</li>
<li>Wallace, D. C., Brown, M. D., Melov, S., Graham, B., Lott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+biology%2C+degenerative+diseases+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22BioFactors%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial biology, degenerative diseases and aging.</a> BioFactors. 7 (3), 187-190 (1998).</li>
<li>Yun, J., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitohormesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitohormesis.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 757-766 (2014).</li>
<li>Ashrafi, G., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathways+of+mitophagy+for+quality+control+and+clearance+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria.</a> Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).</li>
<li>Clark, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+pink1+is+required+for+mitochondrial+function+and+interacts+genetically+with+parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin.</a> Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+Drosophila+PINK1+mutants+is+complemented+by+parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin.</a> Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).</li>
<li>Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+is+recruited+selectively+to+impaired+mitochondria+and+promotes+their+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy.</a> The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).</li>
<li>Zhu, J., Wang, K. Z., Chu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((After+the+banquet%3A+Mitochondrial+biogenesis%2C+mitophagy%2C+and+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">After the banquet: Mitochondrial biogenesis, mitophagy, and cell survival.</a> Autophagy. 9 (11), 1663-1676 (2013).</li>
<li>Um, J. H., Yun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+mitophagy+in+human+diseases+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">Emerging role of mitophagy in human diseases and physiology.</a> BMB Reports. 50 (6), 299-307 (2017).</li>
<li>Al Rawi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postfertilization+autophagy+of+sperm+organelles+prevents+paternal+mitochondrial+DNA+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Postfertilization autophagy of sperm organelles prevents paternal mitochondrial DNA transmission.</a> Science. 334 (6059), 1144-1147 (2011).</li>
<li>Kim, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SESN2%2Fsestrin2+suppresses+sepsis+by+inducing+mitophagy+and+inhibiting+NLRP3+activation+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">SESN2/sestrin2 suppresses sepsis by inducing mitophagy and inhibiting NLRP3 activation in macrophages.</a> Autophagy. 12 (8), 1272-1291 (2016).</li>
<li>Kim, M. J., Yoon, J. H., Ryu, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy%3A+A+balance+regulator+of+NLRP3+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitophagy: A balance regulator of NLRP3 inflammasome activation.</a> BMB Reports. 49 (10), 529-535 (2016).</li>
<li>Sandoval, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+for+Nix+in+autophagic+maturation+of+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Essential role for Nix in autophagic maturation of erythroid cells.</a> Nature. 454 (7201), 232-235 (2008).</li>
<li>Sato, M., Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+paternal+mitochondria+by+fertilization-triggered+autophagy+in+C.+elegans+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Degradation of paternal mitochondria by fertilization-triggered autophagy in C. elegans embryos.</a> Science. 334 (6059), 1141-1144 (2011).</li>
<li>Geisler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1%2FParkin-mediated+mitophagy+is+dependent+on+VDAC1+and+p62%2FSQSTM1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">PINK1/Parkin-mediated mitophagy is dependent on VDAC1 and p62/SQSTM1.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 119-131 (2010).</li>
<li>Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1+stabilized+by+mitochondrial+depolarization+recruits+Parkin+to+damaged+mitochondria+and+activates+latent+Parkin+for+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).</li>
<li>Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+iron+triggers+PINK1%2FParkin-independent+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy.</a> EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).</li>
<li>Chu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+externalization+to+the+outer+mitochondrial+membrane+acts+as+an+elimination+signal+for+mitophagy+in+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).</li>
<li>Kubli, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1+Is+dispensable+for+mitochondrial+recruitment+of+Parkin+and+activation+of+mitophagy+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">PINK1 Is dispensable for mitochondrial recruitment of Parkin and activation of mitophagy in cardiac myocytes.</a> PloS One. 10 (6), e0130707(2015).</li>
<li>Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+and+techniques+to+measure+mitophagy+using+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy.</a> Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).</li>
<li>Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC3%2C+an+autophagosome+marker%2C+can+be+incorporated+into+protein+aggregates+independent+of+autophagy%3A+caution+in+the+interpretation+of+LC3+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization.</a> Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).</li>
<li>Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+quantitative+technique+for+detecting+autophagic+events+based+on+lysosomal+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery.</a> Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).</li>
<li>Lee, I. H., Yun, J., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+links+between+sirtuins+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The emerging links between sirtuins and autophagy.</a> Methods in Molecular Biology. 1077, 259-271 (2013).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26549682">Measuring In vivo Mitophagy.</a> Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).</li>
<li>Denison, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+common+fragile+site+gene+Parkin+in+ovarian+and+other+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Alterations in the common fragile site gene Parkin in ovarian and other cancers.</a> Oncogene. 22 (51), 8370-8378 (2003).</li>
<li>Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+Basic+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: Basic principles and applications.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).</li>
<li>Bingol, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+deubiquitinase+USP30+opposes+parkin-mediated+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy.</a> Nature. 510 (7505), 370-375 (2014).</li>
<li>Burbulla, L. F., Kruger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+primary+human+fibroblasts+for+monitoring+mitochondrial+phenotypes+in+the+field+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The use of primary human fibroblasts for monitoring mitochondrial phenotypes in the field of Parkinson's disease.</a> Journal of Visualized Experiments. 68, e4228(2012).</li>
<li>Di Sante, G., Casimiro, M. C., Pestell, T. G., Pestell, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+video+microscopy+for+assessment+of+EYFP-Parkin+aggregation+as+a+marker+for+cellular+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Time-lapse video microscopy for assessment of EYFP-Parkin aggregation as a marker for cellular mitophagy.</a> Journal of Visualized Experiments. 111, e53657(2016).</li>
<li>Fang, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+detection+of+mitophagy+in+human+cells%2C+C.+Elegans%2C+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. Elegans, and mice.</a> Journal of Visualized Experiments. 129, e56301(2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, mt-Keima ifade hücreleri hücresel mitophagy etkinliğini ölçmek için akış sitometresi kullanmanın hızlı ve hassas yöntemi mevcut. Mitophagy yüksek düzeyde geçiren hücreleri sergi PE-CF594 artan bir oranını (561 nm) / BV605 (405 nm) uyarma. Böylece, mitophagy etkinlik 561/405 oranı yüksek sergilenmesi hücre yüzdesi olarak ifade edilebilir. PE-CF594 bir nokta arsa üzerinde "yüksek" kapısı bölgesinde hücre yüzdesi hesaplanan (561 nm) BV605 karşı (405 nm), ve CCCP ile tedavi mitophagy HeLa-Parkin hücrelerinde artış in...

Mitokondri hücre çoğalması ve Fizyoloji için gerekli olan organelleri vardır. Mitokondri ATP tedarik Oksidatif fosforilasyon üzerinden % 80'den fazla oluşturmaktan sorumlu vardır ve onlar da biyosentezi ve metabolizma1,2için çeşitli metabolik ara ürün sağlamak. Enerji arzı ve metabolizma rolleri yanı sıra, mitokondri reaktif oksijen türleri (ROS) üretimi, hücre ölümü ve intrasellüler Ca2 + dynamics3 düzenlenmesi de dahil olmak üzere birçok diğer önemli süreçlerinde, merkezi rol oynarlar . Mitokondriyal işlevde değişiklik kanser, diyabet ve çeşitli nörodejeneratif hastalıklar4,5de dahil olmak üzere insan hastalıkları ile ilişkili bulunmuştur. Artan mitokondrial disfonksiyon ve mitokondriyal DNA mutasyonlar da normal yaşlanma süreçlerini6,7,8' e katkıda düşünülmektedir. Bu nedenle, kalite kontrol mitokondri içinde çok önemli bir konudur. Mitokondri sürekli uzun ağlar ve kısa, parçalanmış bir form arasında kendi şeklini değiştirebilirsiniz son derece dinamik organelleri vardır. Mitokondri dynamics mitokondri yanı sıra onların yıkımı ile mitophagy9fonksiyonu korumada önemli bir rol oynar.
Mitophagy bütün mitokondri autophagy makine kullanarak Seçmeli bozulma içerir bir mekanizmadır. Mitophagy ilke mekanizması temel mitokondrial ciro ve zarar görmüş veya işlevsiz mitokondri kaldırılması olduğunu. Bu süreçte, mitokondri ilk organellerin hydrolytic Bozulması9ile sigorta autophagosomes oluşumu sonuçlanan bir zar çevrilidir. Önceki genetik çalışmalarda Drosophila iki önerilen Parkinson hastalığı ile ilgili genleri, sözde kinaz PTEN kaynaklı 1 (PINK1) (PARK6) ve Parkin (PARK2), aynı yolu10,11' işlev. Strüktür çalışmaları PINK1-Parkin yolu bozuk mitokondri ortadan kaldırılması için sorumludur ve işlevsel olmayan mitophagy bu yolu sonuç kusurları ve insan hastalıkları12,13için katkıda bulunabilir göstermiştir. Hatalarına mitophagy süreçlerde son zamanlarda çeşitli insan hastalıkları, kanser, kalp hastalığı, karaciğer hastalıkları ve nörodejeneratif hastalık 14gibi bulduk. Buna ek olarak, son yıllarda yapılan çalışmalarda da bu mitophagy ayırt etme, geliştirme ve bağışıklık yanıtı15,16,17,18 gibi birçok fizyolojik süreçleri için çok önemlidir göstermiştir ,19o mitophagy hücre fonksiyonları kontrol daha aktif bir rol oynamak düşündüren,.
Mitophagy mitokondri her iki kalite kontrol önemli bir rol oynar ve insan hastalık, mitophagy temel moleküler mekanizmaları kalır kötü son onay rağmen anladım. Her ne kadar mitophagy ile ilgili mekanizmalar sistematik olarak Maya incelenmiştir, mitophagy ile ilgili mekanizmalar memeli hücrelerinde keşfetmek yönelik çalışmaları esas olarak PINK1-Parkin yolu üzerinde odaklanmıştır. Önceki çalışmalar PINK1-Parkin yolu öncelikle mitophagy12,20,21üzerinden hasarlı mitokondri seçici kaldırılması için sorumludur kurduk. Ancak, son yıllarda yapılan çalışmalarda bazı modelleri mitophagy fonksiyonel PINK122,23,24olmadığında da etkinleştirilebilmesi için bildirdin. Bu sonuçlar PINK1-Parkin yolu ek olarak, orada mitophagy etkinleştirebilirsiniz ek bir tanımlanamayan yolu göstermektedir.
Mitophagy etkinliğini değerlendirmek için uygun bir yöntem mitophagy ve patofizyolojik olaylarda rolü düzenleyen yollar keşfetmek için büyük bir engel bulunmamasıdır. Elektron mikroskobu doğrudan autophagosome yuttu mitokondri görselleştirmek için güçlü bir araçtır. Ancak, elektron mikroskobu mitophagy aktivite miktarının içinde sınırlamalar vardır. Her ne kadar Mikrotubul ilişkili protein-1 kullanmak stratejileri zinciri 3 (LC3) ışık-GFP-LC3 gibi konjuge floresan problar vardır şu anda en çok kullanılan yaklaşımlar25, LC3 tabanlı sinyal geçici doğasını ve onun yüksek oranda yanlış sinyalleri mitophagy hücreleri26algılama hassasiyeti sınırlayın. Mitokondrial protein seviyesi, Mitokondrial DNA ve floresan mikroskopi analiz mitokondri ya autophagosomes ya da organellerin ile colocalize için miktar ölçmek için western Blot bir arada değerlendirmek için iyi bir yaklaşım olurdu mitophagy. Ancak, miktar kısıtlamaları ve uygunluk-in mevcut metodolojiler eksikliği yeni yaklaşımlar için çağrı. Giriş bir yeni pH bağımlı floresan protein, mitokondrial hedef Keima (mt-Keima), mitophagy27algılama yeteneğini büyük ölçüde geliştirilmiş. Sitokrom c oksidaz alt birim VIII (COX VIII) Keima içine mitokondrial hedefleme dizisi eritme tarafından mt-Keima mitokondrial matris yönlendirilir. 440 büyük vardiya Keima uyarma tepe içinde nm 586 (pH 7 ve pH 4, sırasıyla karşılık) nm olabilir kullanılan hassas in vitro ve in vivo deneyler28,29 iyilikle mitophagy değerlendirmek için . Daha da önemlisi, mt-Keima lizozomal bozulması için direnç organellerin mitophagy aktivite kolay nicel ölçüm için izin, mt-Keima sinyal entegrasyonu neden olur. Mt-Keima içinde oluşur floresans değişikliği her iki confocal mikroskobu kullanılarak analiz veya akış sitometresi28,29. Ancak, mt-Keima kullanarak mitophagy etkinliğini ölçmek için akış sitometresi tabanlı yöntemi ayrıntılı tarihi için sağlanmış olan değil.
Burada, mt-Keima kullanarak hücreleri mitophagy etkinliğini ölçmek için akış sitometresi tabanlı tekniği için detaylı bir protokol açıklayın. Her ne kadar biz burada Akış Sitometresi Analizi HeLa hücreleri Parkin ifade başarıyla CCCP kaynaklı mitophagy tespit göstermiştir, bu teknik çok çeşitli hücre tipleri için uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü >REAKTİFLER< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>penisilin / streptomisin</td><td>kuyu geni</td><td>LS202-02</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hiplon</td><td>SH30013.02</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Turbofect</td><td>Termos bilimsel</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>0.45 & mu; m şırınga filtresi</td><td>sartorius</td><td>16555</td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>polibren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>8 mg / ml</td></tr><tr><td>puromisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>2 mg / ml & nbsp;</td></tr><tr><td>Karbonil siyanür m-klorofenil hidrazin (CCCP)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C2759</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>tripsin-EDTA</td><td>kuyu geni</td><td>LS015-01</td><td></td></tr> <tr><td><güçlü > EKİPMANLAR< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD Bioscience</td><td>LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>FACSDIVA BD Bioscience</td><td></td><td>FACSDIVA (v8.0.1)</td><td></td></tr></tbody></table>

hassas ölçüm mitophagy floresan muhabir akış sitometresi kullanarak ph bağımlı mt-keima tarafından

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy seçici autophagy makine kullanarak hasarlı ya da gereksiz mitokondri kaldırılması işlemidir. Yakın bağları arızalı mitophagy ve nörodejeneratif hastalıklar, kanser ve metabolik hastalıklar da dahil olmak üzere çeşitli insan hastalıkları arasında bulunmuştur. Buna ek olarak, son yıllarda yapılan çalışmalarda bu mitophagy normal hücresel süreçler, başkalaşım ve gelişimi gibi ilgilenmektedir göstermiştir. Ancak, kesin rolü ve moleküler mekanizmaları mitophagy altında yatan daha fazla çalışma gerektirir. Bu nedenle, bu değişiklikler mitophagy etkinliğini ölçmek için sağlam ve uygun bir yöntem geliştirmek için önemlidir. Burada, mitophagy etkinlik mitokondri hedefli floresan protein Keima (mt-Keima) kullanarak akış sitometresi ile kantitatif değerlendirilmesi için detaylı bir protokol açıklayın. Bu akış sitometresi tahlil daha hızlı ve hassas Yöntemler konvansiyonel mikroskopi veya immunoblotting göre daha mitophagy etkinliğini çözümleyebilirsiniz. Bu iletişim kuralı çeşitli hücre tiplerinin mitophagy etkinliğini çözümlemeye uygulanabilir.

CCCP kaynaklı mitophagy HeLa-Parkin hücrelerdeki Akış Sitometresi Analizi örneği Şekil 4' te gösterilmiştir. Yukarıda açıklanan Akış Sitometresi Analizi yöntemi kullanılarak, biz "yüksek" gate mitophagic hücrelerde dramatik bir artış algılayabilir. "Yüksek" gate hücrelerinin yüzde 10 kat daha fazla tedavi edilmemiş kontrol hücreleri (Şekil 4A) ile karşılaştırıldığında yükseltilmiştir. Mitophagy aktivite bu artış tamamen bafilomyc...

Mitophagy, mitokondri, seçici bozulması mitokondrial homeostazı karıştığı ve çeşitli insan hastalıklarda deregüle. Ancak, mitophagy etkinliğini ölçmek için uygun deneysel yöntemleri çok sınırlıdır. Burada, biz hassas bir tahlil akış sitometresi kullanarak mitophagy etkinliğini ölçmek için sağlar.

Hassas ölçüm Mitophagy floresan muhabir akış sitometresi kullanarak pH bağımlı mt-Keima tarafından

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Bu prosedürün genel amacı, akış sitometrisi kullanarak hücresel mitofaji aktivitesini ölçmek için hassas bir teknik sağlamaktır. Burada, bu yöntemin, bir mitokondriyal birleştirici olan CCCP ile tedaviden sonra HeLa hücre mitofajisindeki dramatik artışı değerlendirmek için başarıyla kullanıldığını gösteriyoruz. Bu teknik, mitofaj aktivitesinin çok hızlı ve kolay bir şekilde ölçülmesini sağlar.Bu tekniğin temel avantajı, herhangi bir ek boyama olmadan canlı hücrelerdeki mitofaj aktivitesini hassas bir şekilde ölçebilmenizdir. Bu nedenle, bu teknik sonuçta mitofilin mekanizmasını ve fizyolojik rolünü anlamada yardımcı olabilir. Prosedürü göstermek için laboratuvarımdan Jee-Hyun Um ve Young Yeon Kim olacak.Bu prosedüre, Keima lentivirüsünü hedefleyen bir mitokondri olan mt-Keima'yı hazırlayarak başlayın. İlk olarak, HEK293T hücreleri poli-L-lizin kaplı bir kültür kabına tohumlayın ve bir gün boyunca bir doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede kültürleyin. Ertesi gün, mt-Keima lentiviral DNA ile HEK293T hücrelerini transfekte edin ve üreticinin talimatlarına göre bir transfeksiyon reaktifi kullanarak DNaz'ı paketleyin.Sekiz saatlik transfeksiyondan sonra, transfeksiyon ortamını çıkarın ve sekiz mililitre taze medya ekleyin. Viral partiküller içeren ortamları 48 saat sonra toplayın ve santrifüjleme ile hücresel kalıntıları uzaklaştırın. Daha sonra virüs içeren ortamı 0.45 mikrometre şırınga filtresi ile filtreleyin.HeLa-Parkin hücrelerini, mt-Keima lentivirüsünü hasat etmeden bir gün önce 60 milimetrelik bir kültür kabına yerleştirin ve hücreleri bir inkübatörde 37 santigrat derecede bir gün boyunca dört mililitre büyüme ortamı ile kültürleyin. Ertesi gün, büyüme ortamını çıkarın, bir milimetre mt-Keima virüs ortamı ekleyin, 3 mikrolitre polibren stok çözeltisi içeren iki mililitre büyüme ortamı ekleyin ve hücreleri bir CO2 inkübatöründe bir gün inkübe edin. Enfeksiyondan 24 saat sonra, virüs ortamını çıkarın, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve dört mililitre büyüme ortamı ekleyin.Enfekte olmayan hücreleri çıkarmak için, hücreleri iki gün boyunca mikrolitre puromisin başına iki mikrogram ile tedavi edin. 10 mikromolar CCCP içeren taze ortam hazırlayın. Kültürlenmiş ortamı çıkarın ve CCCP içeren dört mililitre taze büyüme ortamı ekleyin.Hücreleri 37 santigrat derecede bir CO2 inkübatörde altı saat boyunca inkübe edin. Büyüme ortamını çıkarın ve hücreleri bir kez PBS ile yıkayın. Tripsin EDTA çözeltisi ile muamele ederek hücreleri ayırın.Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. Hücreleri bir FACS tüpüne aktarın ve buzun üzerine yerleştirin. Akış sitometrisi için akış sitometresini açın ve analiz yazılımını başlatın.Yeni bir deney oluşturun ve parametre penceresinde mor lazer için BV605'i ve sarı-yeşil lazer için PE-CF594'ü seçin. İlk olarak, mt-Keima lentivirüsü ile enfekte olmayan hücrelerin bir kontrol örneğini çalıştırın. İleri saçılma ve yan saçılma grafiğinde, çokgen simgesini kullanarak canlı hücrelerin etrafına bir kapı çizin ve ölü hücreleri ve hücre kalıntılarını ortadan kaldırın.Daha sonra mt-Keima lentivirüsü ile enfekte olmuş HeLa-Parkin hücrelerini çalıştırın. BV605'in yan saçılmaya karşı nokta grafiğinde, voltajı, mt-Keima'yı ifade eden HeLa-Parkin hücreleri, mt-Keima'yı ifade etmeyen kontrol hücrelerinden açıkça ayırt edilecek şekilde ayarlayın. PE-CF594'ün yan saçılmaya karşı nokta grafiğinde daha sonra, voltajı, mt-Keima'yı ifade eden HeLa-Parkin hücreleri kontrol hücrelerinden açıkça ayırt edilecek şekilde ayarlayın.Ardından, BV605'in PE-CF594'e karşı nokta grafiğinde, çokgen simgesini kullanarak bir kapı çizerek mt-Keima-pozitif hücre popülasyonunu seçin. Ardından, yalnızca mt-Keima kapılı hücreleri gösteren PE-CF594'e karşı BV605'in başka bir nokta grafiği oluşturun. Bu nokta grafiğinde, tedavi edilmemiş mt-Keima-pozitif hücrelerin etrafına bir kapı çizin.Bu kapı alçak kapı olarak adlandırılır. Ardından, alçak kapının üzerindeki bölgeyi içeren başka bir kapı çizin. Bu kapı, yüksek mitofaji aktivitesine sahip hücreler içerdiği için yüksek kapı olarak adlandırılır.Ardından Nüfus Hiyerarşisini Göster menüsünü seçin. Ana değerin Yüzdesi, mt-Keima pozitif popülasyon arasındaki yüksek kapıdaki hücrelerin yüzdesini temsil eder. Şimdi her örneği çalıştırın ve mt-Keima durdurma kapısında en az 10.000 olay kaydedin.mt-Keima'yı eksprese eden tedavi edilmemiş HeLa hücrelerinin akış sitometrisi analizi, düşük mitofaji seviyesi gösterdi. CCCP tedavisi, yüksek kapıdaki mitofaji hücrelerinde dramatik bir artışa neden oldu. Mitofaji hücrelerinin yüzdesi, CCCP tedavisinden altı saat sonra 10 kattan fazla artmıştır.CCCP tedavisi ile mitofajideki bu artış, bafilomisin A ile birlikte tedavi ile tamamen ortadan kaldırılmıştır.Mito-Keima eksprese eden hücreler hazır olduğunda, akış sitometrisi kullanılarak mitofaj ölçümü, uygun şekilde hazırlanırsa bir saat içinde gerçekleştirilebilir. Akış sitometrisi ile doğru mitofaj analizi için doğru yüksek ve alçak kapıların ayarlanması önemlidir. Yeni hücre türlerini analiz ederken, HeLa hücreleri gibi iyi bilinen hücreleri kontrol olarak kullanmak gerekir.Ek olarak, mitofajın, mitokondriyal proteinde bir azalma ve mitokondriyal DNA'da bir azalma gibi ek özelliklerle tam olarak doğrulanması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu teknik çok çeşitli hücre tiplerine uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, akış sitometrisi ile mitofajın nasıl analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

sensitive-measurement-mitophagy-flow-cytometry-using-ph-dependent

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bozulma ve geri dönüşüm için maya vakuol asidik lümen organelleri teslim izlemek için sağlam bir yaklaşım açıklanmıştır. Bu yöntem, genetik olarak kodlanmış çift emisyon floresan pH biyosensör ve floresan mikroskobu kullanarak tek tek hücrelerin görselleştirme hedef organellerin özel etiketleme dayanmaktadır.

Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae

Burada açıklanan tespit ve akış sitometrisi ile analiz kemirgen doku ve izole mitokondri immün ile mitokondriyal dış membran proteinleri ölçmek için bir yöntemdir. Bu yöntem, mitokondriyal alt popülasyonlarının fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için genişletilebilir.

İzole Mitokondri Akış Sitometrisi ile Dış Zar Proteinleri imüno

Burada, hasarlı mitokondrinin seçici olarak uzaklaştırılması sırasında EYFP-Parkin'in zamansal alımını ölçmek için hızlandırılmış bir video mikroskobu yaklaşımını ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Hasarlı mitokondrinin EYFP-Parkin'e bağlı olarak uzaklaştırılmasının bu dinamik süreci, farklı deneysel koşullar altında hücresel sağlığın bir göstergesi olarak kullanılabilir.

Hücresel Mitophagy için bir Marker olarak EYFP-Parkin Toplama Değerlendirme Time-Lapse video Mikroskopi

Burada, otofajiyi objektif, kantitatif ve istatistiksel olarak sağlam bir şekilde ölçmek için, 3 autofagy markörün parlak detaylı görüntülerini karşılaştıran ve LC3 nokta sayımı ile birlikte lokalizasyonunu niceleyen analitik bir özelliğe sahip multispektral görüntüleme akış sitometrisi kullanılmıştır.

Multifektral Görüntüleme Akış Sitometrisi Kullanılarak LC3, p62 ve LAMP1 Birlikte Lokalizasyonu Ölçülerek Otofajik Fluxın Değerlendirilmesi

Mitophagy, takas zarar mitokondri, süreci mitokondrial homeostazı ve sağlık bakım için gereklidir. Bu makale en son mitophagy bazılarını algılama yöntemleri insan hücreleri, Caenorhabditis elegansve fareler sunar.

Vitro ve In Vivo insan hücreleri, C. Elegansve fareler Mitophagy tespiti

Bu makalede mitokondri veya canlı hücrelerde organellerin ölçmek için güçlü bir yöntem gösterilmektedir. Primer hücre kullanarak doku örnekleri, hasat gibi karma hücre nüfus bu organelleri miktar lysosome veya mitokondri özel boyalar yüzey işaretleyicileri karşı fluorescently konjuge antikorlar ile kombinasyonu sağlar çok renkli akış sitometresi.

Çok renkli akış sitometresi tabanlı Quantification mitokondri ve T hücrelerde organellerin

Xenobiotic "effluks" pompalar son derece hematopoetik kök ve progenitör hücreleri (hspcs) ve neden ekstrüzyon TMRM, bir mitokondriyal membran potansiyel floresan boya aktif. Burada, bir "effluks" pompa inhibitörü verapamil varlığında TMRM tarafından hspcs 'de mitokondriyal membran potansiyelini doğru ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Efflux pompaları Inhibisyonu Ile hematopoetik kök ve progenitor hücrelerde mitokondriyal membran potansiyelinin akış Cytometrik değerlendirilmesi doğruluğu iyileştirilmesi

Mitofaji, mitokondriyal kalite kontrolünün birincil mekanizmasıdır. Bununla birlikte, in vivo mitofajinin değerlendirilmesi, güvenilir kantitatif tahlillerin eksikliği nedeniyle engellenmektedir. Burada, hücre pervasıtalı yeşil-floresan mitokondri boyası ve kırmızı-floresan lizozom boyası kullanılarak canlı hücrelerde mitofajinin gözlemlenmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Mitokondri ve Lizozom için Floresan Boyalarla Mitopajinin Görselleştirilmesi

Mitofaji'yi elektron mikroskobu, genetik sensörler ve immünofloresan yoluyla keşfetmek, pahalı ekipman, yetenekli personel ve önemli bir zaman yatırımı gerektirir. Burada, ticari bir floresan boya kitinin hem Caenorhabditis elegans hem de bir karaciğer kanseri hücre hattındaki mitopaji sürecini ölçmedeki etkinliğini gösteriyoruz.

Caenorhabditis elegans ve Memeli Hücrelerinde Mitopajinin Organele Özgü Boyalar Kullanılarak Saptanması

Bu protokol, pankreas β hücrelerinde mitofajinin kantitatif analizi için iki yöntemi özetlemektedir: birincisi, hücre geçirgen mitokondriye özgü boyaların bir kombinasyonu ve ikincisi, genetik olarak kodlanmış bir mitofaji raporlayıcısı. Bu iki teknik tamamlayıcıdır ve belirli ihtiyaçlara göre konuşlandırılabilir, bu da mitokondriyal kalite kontrolünün nicel olarak ele alınmasında esneklik ve kesinlik sağlar.

Pankreas β Hücrelerinde Mitofaji Akısını Sorgulamak İçin Tamamlayıcı Yaklaşımlar

Öğrenin, akış sitometresi kullanarak mitofaji aktivitesini hızlı ve hassas bir şekilde ölçme yöntemini. Canlı hücrelerde ek boyama gerektirmeden HeLa hücrelerinde mitofajiyi değerlendirin.

Hassas ölçüm Mitophagy floresan muhabir akış sitometresi kullanarak pH bağımlı mt-Keima tarafından

Daha fazla video keşfet