Large-scale tarımı plaka tabanlı Caenorhabditis elegans: diyabet metabolik değişiklikler çalışma için numune hazırlama
24 Ağustos 2018
Bu iletişim kuralı bir yöntem Caenorhabditis elegans büyük ölçekli ekimi için katı medyada açıklar. Sıvı kültür alternatif, bu protokol parametreleri farklı ölçeklerde plaka tabanlı ekilen almak sağlanır. Bu sonuçlar karşılaştırılabilir sıvı ve katı Medya kültürü arasındaki morfolojik ve metabolik farklar ihmal olarak artırır.
C.elegans alanında, bu yöntem, plaka kültürü kullanılarak büyük nematod popülasyonlarının ve örneklerinin üretilmesini gerektiren temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu protokolün temel avantajları, kolay kurulması ve tuzaklar ve uygulamalar da dahil olmak üzere açıklama kolaylığıdır. Senkronize bir nematod popülasyonu elde ettikten sonra, plakalara yaklaşık bir mililitre M dokuz tampon ekleyin ve plakaları sallayarak tamponu dikkatlice dağıtın.
Bundan sonra, nematodları 15 mililitrelik bir tüpte toplayın. Şimdi, tüpü ters çevirin ve nematodların yoğunluğunu değerlendirmek için bir mikroskop kullanın. Süspansiyonun yoğunluğunu gerektiği gibi ayarlayın ve mikroskop altında değerlendirmeye devam edin.
150 mikrolitre süspansiyonu modifiye edilmiş pipet uçları ile doğrudan plakalara uygulayın. Nematodların plakalar arasında eşit dağılımını sağlamak için, süspansiyon tüpünü düzenli aralıklarla ters çevirin. İlk olarak, nematodları yaklaşık 500 mikrolitre M dokuz tampon ile modifiye edilmiş bir pipet ucu kullanarak yıkayın.
Aynı tamponu kullanarak, hayvanların çoğu süspansiyon halinde toplanana kadar nematodları ayırmaya devam edin. Daha sonra, nematodları modifiye edilmiş bir pipet ucu ile alın ve OP50 içeren bir plakaya aktarın. Modifiye edilmiş pipet uçları, daha büyük bir çap nedeniyle kayma gerilimini ve nematodların zarar görmesini azaltır.
Ardından plakanın kurumasını bekleyin. Numuneleri toplamadan önce, toplanan nematodları dondurmak için sıvı nitrojen hazırlayın. Ardından, M dokuz tamponunu buzun üzerine yerleştirin.
Her plakaya bir mililitre M dokuz tampon uygulayın ve her plakayı yıkamak için hafifçe döndürün. Ardından, M dokuz tamponunun hacmini alın ve yeni 15 mililitrelik tüplere aktarın. M dokuz tamponunun çoğunu çıkarmadan önce tüpü 800 kez g'de kısa bir süre santrifüjleyin.
Daha sonra, herhangi bir bakteriyi uzaklaştırmak için numuneleri 10 mililitre M dokuz tampon ile üç kez yıkayın. Bir cam pipet kullanarak, her peleti 1,5 mililitrelik boş bir tüpe aktarın. Nematodları pipet duvarından durulamak için ikinci 1,5 mililitrelik tüpten bir mililitre M dokuz tampon almak için cam pipeti kullanın.
Daha sonra 15 mililitrelik tüplerden kalan nematodları yıkayın ve numune tüplerine aktarın. Daha sonra, numune tüplerini bir dakika boyunca 19.000 kez g'de santrifüjleyin ve mümkün olduğunca fazla süpernatan çıkarın. Ardından, her tüpü parafin film ile kapatın ve hemen sıvı nitrojen içinde dondurun.
Tüpleri lizat hazırlanana kadar eksi 80 derecede saklayın. Her donmuş numuneye aynı hacimlerde 0.5 milimetre zirkonyum oksit boncuk ve proteinaz inhibitörü kokteyli ile iki kat daha fazla lizat tamponu ekleyin. Ardından, tüpleri dokuzuncu hızda bir dakika boyunca bir homojenizatöre koyun.
Numuneleri dört santigrat derecede 30 dakika ve 19.000 kez g santrifüjleyin. Son olarak, süpernatanı buz üzerinde yeni bir tüpe aktarın ve gelecekteki deneyler için eksi 80 santigrat derecede saklayın. Bu protokolde, diyabet araştırmalarındaki uygulamalar için büyük miktarlarda C.elegans kültüre edildi.
Toplanan nematod sayısı, lizatın protein verimi ile ilişkili olup, bu protokol kullanılarak tekrarlanabilir kantitatif protein izolasyonunun elde edilebileceğini göstermiştir. Metilglioksal maruziyeti ile oluşan reaktif metabolit metilglioksal ve ileri glikasyon son ürünlerinin kütle spektrometrik analizleri burada gösterilmektedir. Glukoz ile muamele edilen nematodlar ve kontroller karşılaştırıldı.
Nematodların pipet yoluyla aktarılması, nematodlara potansiyel olarak zarar veren kayma gerilimi oluşturabilir. Pipetlenmiş nematodlardaki oksidatif stres seviyeleri ve metal bir tel ile aktarılan nematodlar bu protokol kullanılarak farklılık göstermedi. Bu prosedürü takiben, proteomikte ek soruları yanıtlamak için western blot gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.
Bu protokol aynı zamanda birden fazla parametreyi aynı popülasyonla ilişkilendiren deneyleri de kolaylaştırır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, Caenorhabditis elegans'ın katı besiyerlerinde büyük ölçekli kültivasyonu için bir yöntem tanımlamaktadır. Bu yaklaşım, büyük nematod popülasyonlarının ve örneklerinin üretilmesini kolaylaştırarak sonuçların karşılaştırılabilirliğini artırır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Gelişimsel Biyoloji
- Mikrobiyoloji
Arka Plan
- Caenorhabditis elegans yaygın olarak kullanılan bir model organizmadır.
- Plaka bazlı kültüre alma, sıvı kültüre göre avantajlar sunar.
- Nematod popülasyon dinamiklerini anlamak, çeşitli araştırma uygulamaları için kritik öneme sahiptir.
- Bu yöntem, C. elegans alanındaki temel sorulara yanıt vermektedir.
Çalışmanın Amacı
- C.elegans'ın katı besiyerlerinde kültüre edilmesi için güvenilir bir protokol oluşturmak.
- Senkronize nematod popülasyonlarının üretimine olanak sağlamak.
- Geniş örneklem boyutları gerektiren deneyleri kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Nematod popülasyonlarının senkronizasyonu.
- Plakalara M nine tamponu uygulanması.
- Nematod yoğunluğunun mikroskobik değerlendirmesi.
- Süspansiyon yoğunluğunun gerektiğinde ayarlanması.
Temel Sonuçlar
- Büyük ölçekli nematod kültürlerinin başarıyla oluşturulması.
- Plaka tabanlı kültüre alma sonuçlarının karşılaştırılabilirliğinin artırılması.
- Protokoldeki potansiyel hataların belirlenmesi.
- Çeşitli araştırma bağlamlarındaki uygulamalar.
Sonuçlar
- Bu protokol, C.elegans kültürü için sağlam bir yöntem sunmaktadır.
- Geniş ölçekli deneyler yürütme kapasitesini artırır.
- Yöntem basit ve tekrarlanabilirdir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Alanları
C. elegans'ın büyük ölçekli kültürü, diyabetle ilişkili biyobelirteç keşfi için tekrarlanabilir kantitatif protein izolasyonuna olanak tanıyarak nörodejeneratif komplikasyonlarda hedef doğrulamayı destekler. Bu yöntem, AGE'ler ve ROS'ların proteomik analizi için ölçeklenebilir ve kayma gerilimi minimize edilmiş bir iş akışı sağlayarak, erken evre ilaç keşfindeki mekanistik risk azaltma süreçlerine doğrudan uygulanabilir. Kontrollü koşullar altında senkronize popülasyon hazırlığını kolaylaştırarak, diyabetik patolojinin preklinik modellerindeki öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Nöronal modellerde glukoz maruziyetini AGE ve ROS oluşumuna bağlayan terapötik hipotezlerin sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: Nematod sayıları ile protein verimi arasındaki tekrarlanabilir korelasyon aracılığıyla fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Öngörücü Değer: Diyabet komplikasyon yolaklarında öncü bileşiklerin belirlenmesi için kantitatif proteomik veriler sağlayarak portföy önceliklendirmesini kolaylaştırır.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Sonraki western blot ve kütle spektrometrisi uygulamaları için valide edilmiş biyolojik sistemleri hazırlar.
- Tekrarlanabilirlik: Fizyolojik etkiyi minimize etmek ve tutarlı proteomik çıktılar sağlamak için örnek hazırlama sürecini standartlaştırır.
- Ölçeklenebilirlik: Yüksek kapasiteli tarama uyumluluğu için birden fazla analizin aynı kültür koşulları altında entegrasyonuna olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgililik: Vasküler karıştırıcı faktörlerden bağımsız olarak AGE ve ROS birikimi sergileyen C. elegans modelleri aracılığıyla diyabetik komplikasyonların incelenmesini destekler.
- Translasyonel Süreklilik: Deneysel koşullar genelinde tutarlı örnek hazırlamaya olanak tanıyarak keşif aşamasını preklinik doğrulamaya bağlar.
- Risk Ayarlı İlerleme: Biyobelirteç analizi için güvenilir lizatlar sağlayarak hedef önceliklendirmedeki yanlış pozitifleri azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem; hipotez testinden öncü bileşik tanımlamaya ve preklinik doğrulamaya kadar uzanan keşif sürekliliği içerisinde yer alarak, özellikle diyabetle ilişkili nörodejenerasyon araştırmalarını desteklemektedir.
- Keşif Biyolojisi: Kantitatif protein ve metabolit analizi yoluyla diyabetteki metabolik değişimlere ilişkin hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Güvenilir bileşik değerlendirmesi için standardize yoğunluğa sahip ve minimum kayma stresine maruz kalmış, analize hazır örnekler sağlar.
- Analitikler: Metilgliyoksal ve AGE'lerin kütle spektrometrik ölçümüne olanak tanıyarak durum karşılaştırmaları için kantitatif veriler sunar.
- Translasyonel Araştırma: Tutarlı proteomik iş akışları aracılığıyla nöronal fenotip keşfini preklinik sürekliliğe bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Diyabetle ilgili çok sayıda çalışma genelinde büyük ölçekli nematod kültivasyonu için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Diyabetik komplikasyon modellerindeki mekanistik belirsizliği azaltarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Lizat hazırlamadaki değişkenliği minimize ederek proteomik iş akışlarında standardizasyon ve tekrarlanabilirlik sağlar.
- Stratejik Değer: Güvenilir biyobelirteç verileri aracılığıyla devam/dur kararlarını iyileştirir ve diyabet programlarındaki geç aşama biyolojik riskleri azaltır.
- Portföy Etkisi: Tekrarlanabilir AGE ve ROS modülasyon verilerine dayalı olarak hedeflerin risk ayarlı önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- C. elegans tutma ve senkronizasyon teknikleri konusunda uzmanlık gerektirir.
- Numune işleme için santrifüjlere, homojenizatörlere ve sıvı azota erişim gereklidir.
- Süspansiyon yoğunluğu değerlendirmesi ve yıkama protokollerinin ekipler arası standartlaştırılmasını gerektirir.
- Farklı deneysel koşullara sahip plakalar arasında aktarım yapılırken adaptasyon hususlarını içerir.
- Pipetleme adımları sırasında kayma stresinin azaltılmasıyla ilgili, modifiye uçlar aracılığıyla çözülen pratik sınırlamaları içerir.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Title
0:27
Large Scale Culture on Plates
1:15
Transfer of Large Amounts of Caenorhabditis elegans
1:52
Harvest of a Large Caenorhabditis elegans Sample
3:20
Protein Isolation for Mass Spectrometry
3:56
Results: Reproducible Quantitative Protein Isolation and Further Applications of Large-scale C. elegans Culture
4:47
Conclusion
