Periferik kan ve lenf dokusu birincil insan T hücre sinaptik arabirimi değerlendirilmesi
30 Temmuz 2018
Protokol düzlemsel lipid bilayers kullanarak sinaptik arabirimleri oluşturmak için birincil poliklonal insan T hücreleri yeteneklerini çalışmaya bir teknik anlatılmaktadır. İnsan birincil T hücreler lenf düğümleri ve periferik kan elde fark synapse oluşumu yeteneğini göstermek için bu tekniği kullanın.
Bugün bahsedeceğimiz yaklaşım, doku kaynaklı ve periferik kan T hücrelerinin özelliklerini ve fonksiyonel aktivitelerini karşılaştırmak için türetilmiştir. Konunun önemi, periferik kan T hücrelerinin bir vücuttaki toplam T hücrelerinin sadece% 20'sini temsil ettiği gerçeğiyle örneklendirilmektedir. Az sayıda doku kaynaklı T hücresini inceleyebilmek çok önemlidir ve tam olarak bunu başardık.
Bu tekniğin temel avantajı, geleneksel tekniklere göre daha az sayıda hücre ve daha küçük hacimlerde reaktif gerektirmesidir. Cam lamelleri 25 ila 30 dakika boyunca taze hazırlanmış asidik pirana çözeltisine batırmak için polipropilen makas tipi forseps kullanarak başlayın. Yıkamanın sonunda, lamelleri her yıkama için taze hacimde ultra saf suda yedi kez durulayın.
Ardından, kalan suyun temiz camdan akmasına izin vermek için ıslak lamelleri bir kenara koyun. Lameller kuruduğunda, steril bir akış başlığı içindeki kendinden yapışkanlı bir kayar kanalın tam ortasına son lipozom karışımından iki mikrolitre alikot edin. Ve hemen, ancak dikkatli bir şekilde, temiz ve kuru bir lamel ile hizalayın, böylece lamel slaytın yapışkan tarafına nazikçe indirilmesini sağlayın.
Ve lamel ile çevresel temasına hafif bir basınç uygulamak için polipropilen makas tipi forsepsin dış halkasını kullanın ve sızıntıyı önlemek için kaymanın sürgüye sıkıca takıldığından emin olun. Ardından sürgüyü ters çevirin ve kayar düzeneğin dış tarafındaki çift katmanın etrafına dört nokta çizmek için kalıcı bir işaretleyici kullanın. İlk enjeksiyondan önce, kanalın bir portunu giriş portu ve diğerini çıkış portu olarak belirleyin ve bu tanımlamayı deney boyunca koruyun.
Kabarcık oluşumunu önlemek için, pipet ucunun ucunu, kayar kanalın lastik contasının uçla delindiğini hissedene kadar doğrudan giriş portuna sokun. Kanalı yavaşça 50 mikrolitre ılık tahlil tamponu ile doldurun. Kazein bloke edici çözelti içinde 200 mikrolitre nikel (II) klorür giriş portuna enjekte edin.
Ve 50 mikrolitre tamponu çıkış portundan çıkarın. 45 dakikalık bir inkübasyondan sonra, fazla kazein çözeltisini çıkış portundan çıkarın. Oda sıcaklığında 45 dakikalık bir inkübasyon için streptavidin çözeltisinde 100 mikrolitre ICAM-1'i giriş portuna enjekte edin.
Kuluçka işleminin sonunda, fazla protein çözeltisini çıkış portundan çıkarın. Ve çift tabakayı yıkama başına 100 mikrolitre tahlil tamponu ile iki kez yıkayın. Daha sonra çift katmanları oda sıcaklığında 45 dakika boyunca 100 mikrolitre floro-4 konjuge anti-CD3 antikoru ile etiketleyin.
Ardından, gösterildiği gibi yıkama başına 100 mikrolitre tahlil tamponunda iki yıkama yapılır. T hücresi çift katmanlı etkileşimleri görüntülemek için, slaytı toplam iç yansıma floresansının veya TIRF mikroskobunun 37 santigrat derece ısıtılmış aşamasına yerleştirin. Ve çift katmanı 100 güçlü objektifin üzerine ortalamak için mürekkep işaretlerini kullanarak sahneyi ayarlayın.
Granül salınımlı görüntüleme için, CD4 T hücre süspansiyonuna floresan konjuge anti-CD107A antikor FAB fragmanları ekleyin. Ve etiketli hücreleri, slayt kanalının giriş portuna enjeksiyon için 50 mikrolitre tahlil tamponunda yeniden süspanse edin. Ardından uygun sayıda deney alanı seçin ve enjeksiyondan sonraki 30 dakika boyunca her alanın görüntülerini dakikada bir kaydedin.
Bu temsili deneyde, akış hücresinde veya çok kanallı akış slaytında yerleşik lipid çift tabakaları üzerinde klasik immünolojik sinapslar oluşturan CD8 T hücreleri arasında hiçbir fark gözlenmedi. Lipid çift tabakalı etkileşim üzerine, CD4 T hücreleri olgun immün sinapslar oluşturdu, ancak granülleri serbest bırakır veya serbest bırakmaz, olgun sinaps oluşumu olmadan granülleri serbest bırakır veya ne sinaps oluşturur ne de granülleri serbest bırakır. Dikkat çekici bir şekilde, periferik kan mononükleer hücre türevli CD4 T hücreleri, lenf nodu kaynaklı CD4 hücrelerine göre neredeyse iki kat daha hızlı granül salmaya başlayabilir.
Bu prosedürü denerken, kabarcık oluşmaması için sabit sıcaklığı korumak ve pipeti yavaşça tutmak önemlidir. Bir T hücresi çift katmanlı arayüzünü araştırma yeteneklerimize ek olarak, bu yaklaşım aynı zamanda çift katmana dokunan T hücrelerinin hücreler arası bir boyamasını gerçekleştirmemize de izin verecektir. Bu, lenfoid dokudan veya diğer dokulardan türetilen belirli T hücrelerini tanımlamak için kullanılabilecek bir miktar bilgiyi önemli ölçüde kolaylaştıracaktır.
Piranha çözeltisi ile çalışmanın son derece tehlikeli olduğunu ve bu prosedürü denerken uygun KKD giymenizin çok önemli olduğunu unutmayın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, düzlemsel lipid çift katmanlar kullanarak primer poliklonal insan T hücrelerinin sinaptik arayüz oluşturma yeteneklerini incelemek için bir tekniği ana hatlarıyla açıklamaktadır. Çalışma, lenf düğümlerinden türetilen T hücreleri ile periferik kandan türetilenlerin sinaps oluşumu arasındaki farkları vurgulamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- İmmünoloji
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Periferik kan T hücreleri, vücuttaki toplam T hücrelerinin yalnızca %20'sini oluşturur.
- Doku kaynaklı T hücrelerinin incelenmesi, bağışıklık yanıtlarının anlaşılması için kritik öneme sahiptir.
- Bu teknik, geleneksel yöntemlere kıyasla daha az hücre ve reaktif ile analiz yapılmasına olanak tanır.
- Planar lipid çift katmanlar, hücre etkileşimlerini incelemek için bir model sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Doku kaynaklı ve periferik kan T hücrelerinin sinaps oluşturma yeteneklerini karşılaştırmak.
- Analiz için daha az hücre gerektiren bir yöntem geliştirmek.
- T hücrelerinin farklı ortamlardaki işlevselliğine dair anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Asidik piranha çözeltisi kullanılarak cam lamellerin hazırlanması.
- Lamellerin ultra saf su ile durulanması.
- T hücresi etkileşim çalışmaları için düzlemsel lipid çift katmanlarının kullanımı.
- T hücreleri ve lipid çift katmanları arasında sinaptik arayüz oluşumunun değerlendirilmesi.
Temel Sonuçlar
- Farklı kaynaklardan gelen T hücrelerinin farklı sinaps oluşturma yetenekleri gösterilmiştir.
- Tekniğin küçük hücre popülasyonlarını incelemedeki etkinliği doğrulanmıştır.
- Çeşitli dokulardaki T hücrelerinin fonksiyonel aktivitelerine dair içgörüler sağlanmıştır.
- Deneysel düzeneklerde daha az reaktif kullanmanın avantajları vurgulanmıştır.
Sonuçlar
- Protokol, T hücresi sinaps oluşumunun incelenmesine başarıyla olanak tanır.
- T hücresi işlevselliğini inceleyen araştırmacılar için değerli bir araç sunar.
- Bulgular, sağlıklı durumlardaki ve hastalıklardaki bağışıklık yanıtlarının anlaşılması açısından önem taşıyabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulanabilirlik Özeti
Hem periferik kandan hem de lenfoid dokudan elde edilen primer insan T hücrelerindeki sinaptik arayüzlerin doğrudan değerlendirilmesi, translasyonel immünoloji ve hücre tedavisi Ar-Ge'sindeki kritik bir boşluğu doldurmaktadır. Bu teknik, minimum örnek girişi kullanarak nadir doku kaynaklı T hücresi popülasyonlarının fonksiyonel sorgulanmasına olanak tanıyarak mekanistik risk azaltma ve öngörüsel güven sağlamaktadır. Bu yaklaşım, immün modülasyon stratejileriyle ilgili T hücresi aktivasyonu ve granül salınım kinetiği hakkında kantitatif ve tekrarlanabilir veriler sunarak portföy kararlarını desteklemektedir.
Biyofarmasötik Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Hedef doğrulaması için doku ve kan kaynaklı T hücrelerinin doğrudan fonksiyonel karşılaştırmasına olanak tanır.
- Sinaps oluşumu ve granül salınım kinetiğindeki farklılıkları ortaya çıkararak mekanistik risk azaltma sürecini destekler.
- Primer insan örnekleri kullanılarak bağışıklık hücresi aktivasyon yolları üzerindeki hipotezlerin test edilmesini kolaylaştırır.
- Portföy önceliklendirmesi ve erken aşama karar verme süreçleri için kantitatif çıktılar sağlar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- T hücresi aktivasyonu ve efektör fonksiyonunun değerlendirilmesi için tekrarlanabilir, düşük girdili bir analiz platformu oluşturur.
- Hücre ve reaktif gereksinimlerini minimize ederek analiz standardizasyonunu ve ölçeklenebilirliğini destekler.
- Nadir veya sınırlı primer hücre popülasyonlarında fonksiyonel yanıtların taranmasını sağlar.
- Bileşik veya biyolojik ajan değerlendirmesine uygun, kantitatif ve zamana bağlı ölçümler sunar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel süreklilik için in vitro bulguları, hastalıkla ilgili doku T hücresi fenotipleriyle uyumlu hale getirir.
- Sağlık ve hastalık durumlarındaki fonksiyonel çıktıları karşılaştırarak riskle uyumlu ilerlemeyi mümkün kılar.
- Sinaptik arayüz dinamiklerini fonksiyonel granül salınımıyla ilişkilendirerek biyobelirteç keşfini destekler.
- Preklinik model seçimi ve validasyonuna temel oluşturacak mekanistik içgörüler sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hem kan hem de doku kaynaklarından primer T hücresi fonksiyonunun doğrudan ve kantitatif analizine olanak tanıyarak, erken dönem keşif ile translasyonel araştırma arasında bir köprü kurmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: T hücresi aktivasyonu ve sinaps oluşum mekanizmalarının hipotez odaklı incelenmesini destekler.
- Tarama: T hücresi yanıtlarının fonksiyonel taraması için standartlaştırılmış ve ölçeklenebilir bir analiz sunar.
- Analitikler: Granül salınımı ve sinaptik arayüz oluşumunun zaman çözünürlüklü, kantitatif ölçümlerini sağlar.
- Translasyonel Araştırma: In vitro bulguların hastalıkla ilişkili doku fenotipleriyle uyumlu hale getirilmesini kolaylaştırır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Farklı programlar genelinde çeşitli bağışıklık hücresi fonksiyonel çalışmaları için yeniden kullanılabilir bir platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: T hücresi fonksiyonel çalışmalarında öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Örnek ve reaktif gereksinimlerini minimize ederek, nadir veya sınırlı sayıdaki primer hücrelerle çalışmalar yapılabilmesini sağlar.
- Stratejik Değer: İş akışının erken aşamalarında sağlam ve kantitatif veriler sağlayarak, devam/durdur kararlarını ve sermaye verimliliğini geliştirir.
- Portföy Etkisi: İmmün modülasyon programlarının riske göre ayarlanmış önceliklendirmesini ve ilerletilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Primer hücre izolasyonu ve gelişmiş floresan mikroskopisi konusunda uzmanlık gerektirir.
- TIRF mikroskopisine ve hassas sıvı aktarım enstrümantasyonuna erişim gerektirir.
- Ekipler arası tekrarlanabilirlik için deney koşullarının standardizasyonu kritiktir.
- Farklı doku kaynakları veya T hücresi alt kümeleri için adaptasyon gerekebilir.
- Tehlikeli reaktiflerin dikkatli kullanımı ve güvenlik protokollerine kesin olarak uyulması esastır.
