Periferik kan ve lenf dokusu birincil insan T hücre sinaptik arabirimi değerlendirilmesi
July 30th, 2018
Protokol düzlemsel lipid bilayers kullanarak sinaptik arabirimleri oluşturmak için birincil poliklonal insan T hücreleri yeteneklerini çalışmaya bir teknik anlatılmaktadır. İnsan birincil T hücreler lenf düğümleri ve periferik kan elde fark synapse oluşumu yeteneğini göstermek için bu tekniği kullanın.
Bugün bahsedeceğimiz yaklaşım, doku kaynaklı ve periferik kan T hücrelerinin özelliklerini ve fonksiyonel aktivitelerini karşılaştırmak için türetilmiştir. Konunun önemi, periferik kan T hücrelerinin bir vücuttaki toplam T hücrelerinin sadece% 20'sini temsil ettiği gerçeğiyle örneklendirilmektedir. Az sayıda doku kaynaklı T hücresini inceleyebilmek çok önemlidir ve tam olarak bunu başardık.
Bu tekniğin temel avantajı, geleneksel tekniklere göre daha az sayıda hücre ve daha küçük hacimlerde reaktif gerektirmesidir. Cam lamelleri 25 ila 30 dakika boyunca taze hazırlanmış asidik pirana çözeltisine batırmak için polipropilen makas tipi forseps kullanarak başlayın. Yıkamanın sonunda, lamelleri her yıkama için taze hacimde ultra saf suda yedi kez durulayın.
Ardından, kalan suyun temiz camdan akmasına izin vermek için ıslak lamelleri bir kenara koyun. Lameller kuruduğunda, steril bir akış başlığı içindeki kendinden yapışkanlı bir kayar kanalın tam ortasına son lipozom karışımından iki mikrolitre alikot edin. Ve hemen, ancak dikkatli bir şekilde, temiz ve kuru bir lamel ile hizalayın, böylece lamel slaytın yapışkan tarafına nazikçe indirilmesini sağlayın.
Ve lamel ile çevresel temasına hafif bir basınç uygulamak için polipropilen makas tipi forsepsin dış halkasını kullanın ve sızıntıyı önlemek için kaymanın sürgüye sıkıca takıldığından emin olun. Ardından sürgüyü ters çevirin ve kayar düzeneğin dış tarafındaki çift katmanın etrafına dört nokta çizmek için kalıcı bir işaretleyici kullanın. İlk enjeksiyondan önce, kanalın bir portunu giriş portu ve diğerini çıkış portu olarak belirleyin ve bu tanımlamayı deney boyunca koruyun.
Kabarcık oluşumunu önlemek için, pipet ucunun ucunu, kayar kanalın lastik contasının uçla delindiğini hissedene kadar doğrudan giriş portuna sokun. Kanalı yavaşça 50 mikrolitre ılık tahlil tamponu ile doldurun. Kazein bloke edici çözelti içinde 200 mikrolitre nikel (II) klorür giriş portuna enjekte edin.
Ve 50 mikrolitre tamponu çıkış portundan çıkarın. 45 dakikalık bir inkübasyondan sonra, fazla kazein çözeltisini çıkış portundan çıkarın. Oda sıcaklığında 45 dakikalık bir inkübasyon için streptavidin çözeltisinde 100 mikrolitre ICAM-1'i giriş portuna enjekte edin.
Kuluçka işleminin sonunda, fazla protein çözeltisini çıkış portundan çıkarın. Ve çift tabakayı yıkama başına 100 mikrolitre tahlil tamponu ile iki kez yıkayın. Daha sonra çift katmanları oda sıcaklığında 45 dakika boyunca 100 mikrolitre floro-4 konjuge anti-CD3 antikoru ile etiketleyin.
Ardından, gösterildiği gibi yıkama başına 100 mikrolitre tahlil tamponunda iki yıkama yapılır. T hücresi çift katmanlı etkileşimleri görüntülemek için, slaytı toplam iç yansıma floresansının veya TIRF mikroskobunun 37 santigrat derece ısıtılmış aşamasına yerleştirin. Ve çift katmanı 100 güçlü objektifin üzerine ortalamak için mürekkep işaretlerini kullanarak sahneyi ayarlayın.
Granül salınımlı görüntüleme için, CD4 T hücre süspansiyonuna floresan konjuge anti-CD107A antikor FAB fragmanları ekleyin. Ve etiketli hücreleri, slayt kanalının giriş portuna enjeksiyon için 50 mikrolitre tahlil tamponunda yeniden süspanse edin. Ardından uygun sayıda deney alanı seçin ve enjeksiyondan sonraki 30 dakika boyunca her alanın görüntülerini dakikada bir kaydedin.
Bu temsili deneyde, akış hücresinde veya çok kanallı akış slaytında yerleşik lipid çift tabakaları üzerinde klasik immünolojik sinapslar oluşturan CD8 T hücreleri arasında hiçbir fark gözlenmedi. Lipid çift tabakalı etkileşim üzerine, CD4 T hücreleri olgun immün sinapslar oluşturdu, ancak granülleri serbest bırakır veya serbest bırakmaz, olgun sinaps oluşumu olmadan granülleri serbest bırakır veya ne sinaps oluşturur ne de granülleri serbest bırakır. Dikkat çekici bir şekilde, periferik kan mononükleer hücre türevli CD4 T hücreleri, lenf nodu kaynaklı CD4 hücrelerine göre neredeyse iki kat daha hızlı granül salmaya başlayabilir.
Bu prosedürü denerken, kabarcık oluşmaması için sabit sıcaklığı korumak ve pipeti yavaşça tutmak önemlidir. Bir T hücresi çift katmanlı arayüzünü araştırma yeteneklerimize ek olarak, bu yaklaşım aynı zamanda çift katmana dokunan T hücrelerinin hücreler arası bir boyamasını gerçekleştirmemize de izin verecektir. Bu, lenfoid dokudan veya diğer dokulardan türetilen belirli T hücrelerini tanımlamak için kullanılabilecek bir miktar bilgiyi önemli ölçüde kolaylaştıracaktır.
Piranha çözeltisi ile çalışmanın son derece tehlikeli olduğunu ve bu prosedürü denerken uygun KKD giymenizin çok önemli olduğunu unutmayın.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, düzlemsel lipid çift katmanları kullanarak primer poliklonal insan T hücrelerinin sinaptik arayüz oluşturma yeteneklerini araştırmak için bir teknik sunar. Çalışma, lenf nodlarından ve periferik kandan elde edilen T hücreleri arasındaki sinaps oluşumu farklılıklarını vurgulamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Immunoloji
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Periferik kan T hücreleri, vücuttaki toplam T hücrelerinin sadece %20'sini oluşturur.
- Dokudan elde edilen T hücrelerinin incelenmesi, bağışıklık tepkilerini anlamak için kritik öneme sahiptir.
- Teknik, geleneksel yöntemlere kıyasla daha az hücre ve reaktifle analiz yapmayı sağlar.
- Düzlemsel lipid çift katmanları, hücre etkileşimlerini incelemek için bir model sunar.
Çalışmanın Amacı
- Doku kaynaklı ve periferik kan T hücrelerinin sinaps oluşturma yeteneklerini karşılaştırmak.
- Analizler için daha az hücre gerektiren bir yöntem geliştirmek.
- Farklı ortamlardaki T hücre işlevselliği hakkındaki anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Asidik piranha çözeltisi kullanılarak cam kapakçıkların hazırlanması.
- Kapakçıkların ultra saf suda durulanması.
- T hücre etkileşim çalışmaları için düzlemsel lipid çift katmanlarının kullanılması.
- T hücreleri ve lipid çift katmanları arasındaki sinaptik arayüz oluşumunun değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Farklı kaynaklardan elde edilen T hücrelerinin farklı sinaps oluşturma yeteneklerini göstermiştir.
- Tekniğin küçük hücre popülasyonlarını incelemede etkinliğini doğrulamıştır.
- Çeşitli dokularda T hücrelerinin işlevsel aktiviteleri hakkında içgörüler sağlamıştır.
- Deneysel kurulumlarda daha az reaktifin kullanılmasının avantajlarını vurgulamıştır.
Sonuçlar
- Protokol, T hücresinin sinaps oluşumunun incelenmesine başarıyla izin verir.
- T hücre işlevselliğini inceleyen araştırmacılar için değerli bir araç sunar.
- Bulgular, sağlık ve hastalıktaki bağışıklık tepkilerini anlamak için önemli olabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Direct assessment of synaptic interfaces in primary human T cells from both peripheral blood and lymphoid tissue addresses a critical gap in translational immunology and cell therapy R&D. This technique enables mechanistic de-risking and predictive confidence by allowing functional interrogation of rare tissue-derived T cell populations using minimal sample input. The approach supports portfolio decisions by providing quantitative, reproducible data on T cell activation and granule release kinetics relevant to immune modulation strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct functional comparison of tissue- and blood-derived T cells for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by revealing differences in synapse formation and granule release kinetics.
- Facilitates hypothesis testing on immune cell activation pathways using primary human samples.
- Provides quantitative outputs for portfolio triage and early-stage decision making.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible, low-input assay platform for evaluating T cell activation and effector function.
- Supports assay standardization and scalability by minimizing cell and reagent requirements.
- Enables screening of functional responses in rare or limited primary cell populations.
- Delivers quantitative, time-resolved readouts suitable for compound or biologic evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant tissue T cell phenotypes for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement by comparing functional outputs across health and disease contexts.
- Supports biomarker discovery by correlating synaptic interface dynamics with functional granule release.
- Provides mechanistic insights to inform preclinical model selection and validation.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and translational research by enabling direct, quantitative analysis of primary T cell function from both blood and tissue sources.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of T cell activation and synapse formation mechanisms.
- Screening: Provides a standardized, scalable assay for functional screening of T cell responses.
- Analytics: Delivers quantitative, time-resolved measurements of granule release and synaptic interface formation.
- Translational Research: Facilitates alignment of in vitro findings with disease-relevant tissue phenotypes.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse immune cell functional studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in T cell functional studies.
- Operational Value: Minimizes sample and reagent requirements, enabling studies with rare or limited primary cells.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immune modulation programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation and advanced fluorescence microscopy.
- Demands access to TIRF microscopy and precise fluid handling instrumentation.
- Standardization of assay conditions is critical for reproducibility across teams.
- Adaptation may be needed for different tissue sources or T cell subsets.
- Careful handling of hazardous reagents and strict adherence to safety protocols are essential.
