Tümör metastazı çalışmaya acellular ve hücresel akciğer modeli

Bu yöntem, tümör ilerlemesi ile ilgili önemli soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Ex vivo aselüler ve hücresel akciğer modeli, zamanla büyüyen ve dolaşımdaki tümör hücreleri ve metastatik lezyonlar oluşturan primer tümör oluşumuna izin verir. Bu tekniğin temel avantajı, kanserin ilerlemesinin kısaltılmış bir sürede incelenmesine ve farklı kanser hücrelerinin büyümesine izin vermesidir.

Bu tekniğin etkileri, hastalardan alınan tümör hücreleri, bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere terapötik ilaçların etkinliğini değerlendirmek için modelde kullanılabildiğinden, kişiselleştirilmiş tedavimize kadar uzanır. Derin anestezi uygulanmış bir sıçan ile başlayın. Göğsü ve karnı tıraş edin ve cildi klorheksidin bir çubukla silin.

Göğüs boşluğunu açtıktan sonra diyaframın sağ tarafında solda göğüs kafesinin ön tarafını keserek bilateral torakotomi yapın. Göğüs kafesini yukarıda tutun ve akciğerde kan pıhtılarının oluşmasını önlemek için 27 gauge iğne kullanarak atan kalbin sağ ventrikülüne mililitre başına 1000 birim heparin enjekte edin. Göğüs kafesini çıkardıktan sonra, kanın dışarı çıkmasına izin vermek için sol ventriküle havalandırma deliği olarak 18 gauge iğne yerleştirin, ardından sağ ventriküle mililitre başına 15 mililitre 12.5 birim enjekte etmek için 25 gauge iğne kullanın.

Daha sonra, tiroidin tabanındaki trakeayı kesin ve inen aortu hemiazigos veni seviyesinde ve aortun kemerdeki dalları seviyesinde dikkatlice çıkarın. Kalp-akciğer bloğunu göğüs boşluğundan çıkardıktan sonra, sağ ve sol ventriküllerin yarısını kesin ve ardından sağ ventrikülden ana pulmoner artere özel yapım 18 gauge paslanmaz çelik iğne kanülü yerleştirin. Kanülü 2-0 ipek kravat ile sabitleyin ve sağ ventrikül ve atriyumu dikkatlice ortaya çıkarın.

Heparinize PBS'yi, hücre giderme ünitesinin şişesine serbestçe akana kadar 30 milimetre cıvalık fizyolojik perfüzyon basıncında çalıştırarak başlayın, ardından kalp-akciğer bloğunu pulmoner arter kanülü yoluyla pulmoner arter ucundaki decellularizasyon ünitesine takın. Heparinize PBS ile 15 dakika yıkadıktan sonra, heparinize PBS şişesini% 0.15 sodyum dodesil sülfat ve deiyonize su içeren bir şişeyle değiştirin ve hücreden arındırma için akciğeri iki saat boyunca perfüze edin. Hücre gidermeden sonra, perfüz deiyonize otoklavlanmış suyu akciğer iskelesinden 15 dakika boyunca geçirdikten sonra 10 dakika boyunca deiyonize su içinde %1 iyonik olmayan deterjan uygulayın.

Son olarak, şişeyi antibiyotiklerle desteklenmiş 500 mililitre otoklavlanmış PBS ile değiştirin. Pompayı dakikada altı mililitrede çalıştırın ve akciğerleri 72 saat boyunca perfüze edin, bu sürenin sonunda aselüler akciğer hemen kullanıma hazırdır. Pompa kartuşuna %70 etanol püskürtün ve oksijenatörün çıkış ucunu pompa borusuna ve diğer ucunu biyoreaktördeki 1,5 fitlik bir tüpe bağlayarak oksijenatörü kurun.

Biyoreaktör şişesini aseptik koşullar altında bir biyogüvenlik kabinine kurun. Pulmoner arterden geçen akışı kontrol etmek için bir dişi Luer kilidinin başına üç bir musluk takın, ardından trakeadan hücre tohumlamak için tek yönlü bir musluğu başka bir dişi Luer kilit bölmesine bağlayın. Ortamı dolaştırmak için şişenin dışına iki inçlik boruyu ve içine altı inçlik boruyu bağlayın.

Biyoreaktör şişesini oksijenatöre bağlamak için hortumu hazırlayın. İki ayaklı bir tüpe bir erkek Luer kilidi takın ve erişilebilirlik sağlamak için bir dişi Luer pabucu stili T takın ve iki ayaklı tüpe bir erkek Luer kilidi ve bir dişi Luer kilidi takın. Hücre kültürü ortamı ekleyin ve biyoreaktörü inkübatöre aktarın.

Kapalı döngü bir biyoreaktör yapmak için oksijenatör tüpünü iki açık uca bağlayın. Oksijenatörü ve tüpleri kültür ortamıyla doldurmak için pompayı dakikada altı mililitre hızında önceden çalıştırın, böylece boruda hava kabarcığı kalmaz. Tüpler ortamla doldurulduktan sonra, vanayı kapatın ve oksijenatörleri biyoreaktör şişesinin her iki ucundan ayırın.

Biyoreaktör şişesini biyogüvenlik kabinine koyun, kültür ortamını musluktan geçirin ve akciğer iskelesinin pulmoner kanülünü takın. Hücresel akciğer modeliyle çalışıyorsanız, hücre çözmeyi atlayın. Hasat edilen akciğer, biyoreaktörde ikili olarak ayarlanabilir.

Havayı çıkarmak için kültür ortamını tekrar tek yönlü musluktan geçirin ve trakeal kanülü ipek bir iplikle trakeaya bağlayın, ardından biyoreaktör şişe kapağını kapatın. Biyoreaktörü inkübatöre aktarın ve pompayı çalıştırın. Tüm lobların şişirildiğinden ve akciğerin iyi durumda göründüğünden emin olmak için kültür ortamını 10 ila 15 dakika çalıştırın.

Metastatik model için aselüler veya hücresel akciğer iskelesini aşağıdaki gibi değiştirin. Asılı akciğer iskelesi ile biyoreaktör kapağını açın ve trakeadan beş mililitre kültür ortamı geçirmek için bir Luer kilit şırıngası kullanın. Çatallanma noktasında trakeadan 2-0 ipek geçirmek için açısal forseps kullanın.

Sağ akciğere giden trakeayı bifurkasyon noktasında bağlayın ve kültür ortamını geçirerek soluk borusundan sol akciğere serbest medya akışını kontrol edin. RPMI 1640 tam kültür ortamında mililitre başına iki ila üç milyon hücre konsantrasyonunda A549 veya H1299 gibi 50 mililitrelik bir akciğer kanseri hücresi hazırlayın. Trakeal kanülün üzerine 20 mililitrelik bir Luer kilit şırıngası yerleştirin ve şırıngaya 15 mililitre hücre ekleyin.

Hücre süspansiyonunun yerçekimi ile akciğer loblarından geçmesine izin verin. Herhangi bir hava kabarcığı geçmeden önce hücrelerin geri kalanını ekleyin. Tohumlandıktan sonra şırıngayı çıkarın ve 15 dakika bekleyin, ardından biyoreaktöre taze ortam ekleyin.

İnkübatöre geri koyun ve hava kabarcıklarını çıkardıktan sonra, akciğer iskelesini dakikada altı mililitre perfüze edin. Sağlam bir akciğerin histopatolojisi alveolleri ve pnömositleri gösterir. Burada görüldüğü gibi, decellularizasyon akciğer hücrelerinin tamamen çıkarılmasına yol açar ve aselüler akciğerlerin histopatolojisi sağlam bir bazal membranı ortaya çıkarır.

Deselüler bir akciğerin Movat pentakrom ve elastin boyası, sağlam vaskülatür ve bronş ile kollajen, fibrin ve elastin varlığını ortaya çıkarır. Hücreden arındırılmış akciğerin DNA analizi, DNA içeriğinde %99'dan fazla bir azalma gösterir Aselüler akciğer, hücre kültürü için doğrudan biyoreaktörde kullanılabilir. Histolojik bir analiz, tümör büyümesinin varlığını gösterir.

Bu prosedürü denerken, heparini kalbin sağ ventrikülüne enjekte etmeyi unutmamak önemlidir. Bu gelişmeden sonra bu teknik, kanser araştırmaları alanındaki araştırmacıların akciğer kanserinde tümör hücrelerinin metastaz yapmasına yol açan genetik ve epigenetik değişiklikleri keşfetmelerinin önünü açmıştır.