Name: Tümör metastazı çalışmaya acellular ve hücresel akciğer modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Öğrenin, tümör metastazını incelemek için ekz vivo akciğer modeli kullanarak primer tümör ve dolaşan tümör hücrelerinin oluşumunu. Bu yöntem, kişiselleştirilmiş kanser tedavisi geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Min s. Kim ikinci John W. Kirklin Araştırma Bursu, torasik cerrahi, Graham Araştırma Vakfı, Houston Methodist özel Hekim Group Grant ve Michael M. ve Joann H. koni Araştırma Ödülü Amerikan Derneği hibe destek aldı. Ann Saikin dil yazması düzenleme için teşekkür ediyoruz.

Hayvan deneyleri protokollerde kurumsal hayvan bakım ve Houston Methodist Araştırma Enstitüsü'nde kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve bütün mevzuatı, yasalara, kurallara ve politikaları uygun olarak yürütülmektedir.
1. fare akciğer hasat
<ol><li>4 - için 6-hafta-yaşlı erkek Sprague-Dawley rat ketamin (100 mg/kg) ve xylazine (10 mg/kg) onun kanadını içinde bir mayi (IP) enjeksiyonla anestezi. Anestezi ne zaman hind bacak ayak forseps ile boğumlu bir devamsızlık hareketi için kontrol ederek emin olun.</li>
	<li>10 dk sonra göğüs ve karın tıraş ve deri bir klorheksidin bez ile silin.</li>
	<li>Cilt o forseps ile tespit ve tek kullanımlık neşterle incising kaldırın. Neşter ile incising tarafından göğüs boşluğuna açtıktan sonra ikili torakotomi sol göğüs kafesinin ön tarafında ve diyafram sağ tarafına makasla keserek gerçekleştirin. Not: Bu bir hayatta kalma sigara cerrahidir.</li>
	<li>Göğüs kafesi tutun ve 2 mL heparin (1000 adet/mL) 27 G iğne kullanarak kalbi sağ ventrikül enjekte. Not: Bu herhangi bir akciğer kan pıhtı oluşumunu engeller.</li>
	<li>Tamamen göğüs kafesi makasla çıkarın ve kan çıkana kadar bir 18 G iğne sol ventrikül bir havalandırma yerleştirin. Sonra heparinized fosfat tamponlu tuz (12.5 adet/mL; heparinized PBS) 15 mL 25 G iğne kullanılarak sağ ventrikül enjekte.</li>
	<li>İnferior ve superior vena kava, kalbin sağ tarafta iki büyük damarları keser ve akciğerler ile 27 G iğne kullanılarak sağ ventrikül heparinized PBS ek bir 10 mL sifonu. Not: İnferior vena kava kalbimle büyük bir gemi olarak altında görüntülenir kırmızı kan ile dolu. Benzer şekilde, üstün vena cava kalp üst kısmında büyük bir beden olarak görüntülenir.</li>
	<li>Trakea tiroid tabanında kesti. Hemiazygos ven ve dalları Aort kemer düzeyinde azalan aort dikkatli bir şekilde çıkarın.</li>
	<li>Göğüs boşluğuna ve vücudun kalan kısmına sıçan kalp-akciğer bloğundan çıkar.</li>
	<li>Sağ ve sol ventriküllerin yarısı keserek ventriculotomy gerçekleştirmek ve özel yapım bir doldurulmuş 18 G paslanmaz çelik iğne kanül ile sağ ventrikül ana pulmoner arter (PA) yerleştirin.</li>
	<li>Kanül ile 2-0 ipek kravat güvenli ve dikkatlice sağ ventrikül ve atrium bulaşmasına neden.</li>
	<li>Bir kadın radarı bölme içinde sol ventrikül yerleştirin ve 2-0 ipek kravat ile sabitleyin.</li>
	<li>PA kanül aracılığıyla heparinized PBS kalp-akciğer bloğu ile 20 mL sifonu ve kültür ortamı veya heparinized PBS içeren bir 50 mL tüp içinde yerleştirin. Not: adım biyoreaktör ayarlamak için 3.1 hücresel bir modeli için gidin. Bir acellular modeli için adım 2.1 decellularization için devam edin.</li>
</ol>2. akciğer Decellularization
<ol><li>
Decellularization birim hazırlanması
	<ol>
<li>Her decellularization odası/şişe şişe kapağı iki delik delme ve delik (Şekil 1A ve 1B) bir kadın radarı yakalamaya hazırlayın. Diğer tarafta bir siyah naylon halka ile güvenli. Benzer şekilde, başka bir şişe kapağı intravenöz set eki (Şekil 1 c) için tek bir delik matkap. Not: İki farklı taraf aynı şişe kapağıyla Şekil 1A ve 1B vardır. 2.1.1. adımda yukarıda belirtildiği gibi tek bir delik ile farklı bir kap Şekil 1 c olduğunu.</li>
		<li>Şişe kapakları (Şekil 1A ve 1B) içinde kadın bir radarı (at pulmoner arter veya PA bitiş) 0.5-inç tüp ve 6 inçlik tüpler (Şekil 1J) ekleyin ve bir erkek radarı kilit biter takın. 500 mL şişe ile kilit decellularization odası/şişe ayarlayın.</li>
		<li>Pompa baş (1E rakam ve 1F) bir kadın radarı bir kartuşla (Şekil 1G) tarafından bağlı olduğu pompa tüp (Şekil 1 H), her iki ucunun (hangi erkek radarı kilit ile bağlı) 2 2 ft tüp bir ucunu takın kilit (Şekil 1I).</li>
		<li>2 ft tüpler (2.1.3. adımdaki) her kadın radarı kilit kafasına decellularization odası/şişe kapağı (Şekil 1 L) için diğer ucunu bağlayın.</li>
		<li>Ters bir şişe şişe kapağı ve decellularization c bağlı 2 ft tüp yerine distal son eklenen bir intravenöz set (Şekil 1 d) proksimal ucu olan bir stand üzerinde asılı tarafından PBS şişeyle (PBS 200 mL) 250 mL kurmak heparinized hamber/şişe PA sonunda (Şekil 1B). Bu 2 ft tüp atma biberondan bağlayın. Not: resim 1 Kiçinde gösterildiği gibi karton, şişeleri ayarlanır. İntravenöz tüpler reaktifler akciğer iskele içinde dağıtmak için asılı şişe çıkması.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Akciğer decellularization işlemi
	<ol>
<li>Decellularization odası/şişe içinde serbestçe akar kadar 30 mm Hg (Şekil 1 K) bir fizyolojik perfüzyon basıncı heparinized PBS'yi çalıştırmak ve sonra kalp-akciğer bloğu PA kanül PA sonuna ekleyin.</li>
		<li>Herhangi bir aşırı arabellek/çözüm decellularization odası/şişe içinde atılan böylece pompa sürekli olarak çalışır durumda tutun.</li>
		<li>PA, perfüzyon basıncı 30 mm Hg (Şekil 1 K) ilk yıkama için 15 dakika ile heparinized PBS'yi çalıştırmak.</li>
		<li>Deiyonize su % 0,1 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) heparinized PBS şişe yerine ve decellularization için 2 h için akciğer sıvı.</li>
		<li>Decellularization sonra 15 dk akciğer iskele deiyonize suyla autoclaved su sıvı.</li>
		<li>Sonra %1 non-iyonik deterjan 10 dk deiyonize su sıvı.</li>
		<li>Decellularization odası/şişe 500 mL autoclaved PBS 1 x antibiyotik (penisilin-streptomisin amfoterisin) ile desteklenmiş asılı akciğer içinde şişe kapağı ile olduğu gibi tutmak yerine.</li>
		<li>Ayarlama, decellularization odası pulmoner arter sonuna geri atarak kapsayıcıya bağlı 2 ft tüpü yerleştirmek ve 6 mL/dk (Şekil 1 L) pompa çalıştırmak Intravenous atmak.</li>
		<li>Akciğerler için 72 h sıvı ve antibiyotik her 12 h PBS değişen tutmak. Not: Acellular akciğer hemen kullanıma hazırdır. İhtiyaç kadar-80 ˚C depolanabilir. Akciğer lobları pembe lekeler veya kan pıhtıları açıkça görüntülenmeyecektir Eğer akciğer atmak. Rastgele DNA ve histopatoloji için test etmek mümkündür. Tam bir acellular akciğer hücreleri ve DNA'ın % 99.9 yıkanması göstermez. Not: bir hücresel akciğer modeli ile çalışırken, decellularization atlayın. Hasat akciğer (adım 1) doğrudan biyoreaktör ayarlayabilirsiniz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. biyoreaktör Set-up
<ol><li>Biyoreaktör şişe ve kurulum için gereken maddeleri hazır olun.<ol>
<li>Bir 500 mL şişe kapağı eşit uzaklıkta, üç delik ve bir kadın radarı siyah naylon halkalar (Şekil 2A ve 2B) kullanarak tüm üç delik olarak düzeltin. Not: bir ucunu şişenin iç yüzleri ise iki delik radarı kilit yüz dışı sona erer.</li>
		<li>6 pompa Tüp, 2 tüp, Tüp, 1,5 ft Tüp, 2 ft tüp ve 10 ft oxygenator tüp 6 biyoreaktör kesilmiş.</li>
		<li>18 G paslanmaz çelik iğne kesin ve tekrar, trakeal kanül biyouyumlu boruları ile biter takın.</li>
		<li>Oxygenator tüp radarı kilit konektörler otoklav bantlar (Şekil 2C) kullanarak bir solenoid hasır üstünde belgili tanımlık etraf ile sarın.</li>
		<li>Otoklav yukarıda bahsedilen öğeleri ve UV 10 dakikadır ışık tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Normal hücre kültür inkübatör (37 ° C, % 5 CO2) içinde pompa ile kolayca 500 mL şişe sığdırmak için tepsiler arasındaki uygun aralığı ayarlayın.</li>
	<li>% 70 etanol pompası çıkarma, sprey ve pompa boru dişi radarı kilit konektörler pompa her iki ucundaki ile bağlayın.</li>
	<li>Pompa tüp ve biyoreaktör 1,5 ft tüp ile diğer ucunu bir ucunu (çıkış) oxygenator bağlanarak solenoid tel örgü hücre kültür inkübatör içinde sarılı oxygenator ayarlayın.</li>
	<li>Bir Biyogüvenlik biyoreaktör şişede aseptik koşullar ile kabine ayarlayın.<ol>
<li>PA üzerinden akışını denetlemek için kadın yapma biri kafasına bir 3-yönlü stopcock (sarı) eklemek</li>
		<li>Tek yönlü stopcock (mavi) başka bir kadın radarı kilit bölme trakea (Şekil 2F) tohum hücre için bağlayın.</li>
		<li>2. Boru dış bağlanmak (beyaz) ve medya dışarı dolaşmaya şişe içine tüp 6. Erkek radarı kilit 2 ft tüp için uygun ve bir kadın radarı lug stil eklemek veya bir şey kaldırmak için erişilebilirlik sağlamak için Tee ekleyebilirsiniz.</li>
		<li>Tek yönlü bir stopcock üç yönlü konnektör (kadın radarı lug tarzı Tee) açıklıklar birine iliştirin.</li>
		<li>Erkek radarı kilit ve kadın radarı kilit 2 ft tüpler için ekleyin.</li>
		<li>RPMI1640 200 mL % 10 FBS ve % 1 antibiyotik hücre kültür (hücre şartının değişir) orta ile ekleyin ve biyoreaktör kuluçka makinesi için transfer. Oxygenator tüp iki açık ucu için (tek yönlü stopcock ve Tee bağlayıcı) kapalı çevrim biyoreaktör sağlamak üzere bağlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>O hiçbir hava kabarcıkları boru içinde pompa 6 mL/dk içinde hücre kültür kuluçka hücre kültür oxygenator ve tüpler, doldurmak için medya ile önceden çalıştırın.</li>
	<li>Tüpler ile dolu bir kez medya, stopcock kapatın ve biyoreaktör şişe biyoreaktör şişe her iki ucunda Oksijenatörler keserek kuluçka makinesi kaldırın.</li>
	<li>Biyoreaktör şişe içinde Biyogüvenlik kabini koymak, Kültür medya stopcock yoluyla geçmek ve akciğer iskele (acellular veya hücresel) PA kanül stopcock erkek radarı Bağlayıcısı aracılığıyla ekleyin. Not: Burada (decellularization süreç sonrasında) acellular modeli veya taze hasat kalp-akciğer bloğu kullanmak mümkün (yani, hücresel modeli, o kadar yerli fare hücreleri korur).</li>
	<li>Kültür medya yoluyla herhangi bir hava kaldırmak ve trakea ipek iplik tarafından trakeal kanül kravat tek yönlü bir stopcock geçmek.</li>
	<li>Herhangi bir PA ve trakea büküm önlemek emin olun. Yakın biyoreaktör şişe kapağı ile akciğer içinde İskele yapısı ve, tekrar, aseptik biyoreaktör kuluçka makinesi için aktarmak ve 6 mL/dk hızında pompa başlatın.</li>
	<li>Kültür medya tüm lob şişirilmiş ve iyi durumda (Şekil 2 g) akciğer görünüyor emin olmak 10-15 dk için çalıştırın.</li>
</ol>4. metastaz modeli ve hücre tohumlama
Not: Yukarıdaki akciğer modeli için bir birincil tümör büyüme çalışma ile tohum hücre geçin. Akciğer İskele yapısı-İskele (acellular veya hücresel) metastatik modeli için aşağıdaki gibi değiştirin.
<ol><li>Biyoreaktör ile akciğer iskele kuluçka makinesi üzerinden çıkar ve biyogüvenlik kabine koymuştum.</li>
	<li>Nefes borusu yoluyla kültür ortamının 5 mL geçmek ve biyoreaktör kap asarak da açmak için bir radarı kilit şırınga kullanın akciğer İskele yapısı-İskele (Şekil 2F).</li>
	<li>Bu adımda, bir kişi daha akciğer değişiklik metastatik manken için yardımcı olmak için gereklidir.</li>
	<li>İpek 2-0 açısal forseps trakea geçmekle çatallanma noktada yapmak için kullanın ve hazır olsun.</li>
	<li>Sağ akciğer çatallanma noktada olacak trakea kravat ve kültür ortamı geçirerek medya Sol akciğer için nefes borusu yoluyla serbest akışını kontrol edin. Not: trakea çatallanma noktada bağlı sonra nefes borusu seribaşı hücreleri otomatik olarak tohum sol lob için yönlendirilirsiniz. Bu hücreleri tohum önce nefes borusu yoluyla bastırıyor Kültür medya tarafından test edilebilir. Metastatik modelinde, medya sadece, şişirmek, sol lob ve sağ lob10hareket edecek.</li>
	<li>20 mL radarı kilit şırınga trakeal kanül üstüne ayarlayın ve RPMI1640 komple Kültür Medya (Şekil 2F) 50 mL ATCC akciğer kanseri hücreleri (A549, H1299) ekleyin.</li>
	<li>Biyogüvenlik kabini tohum hücre gerçekleştirin. Hücre 15 mL şırıngada ekleyin ve yerçekimi tarafından akciğer loblar geçmek. Herhangi bir hava kabarcıkları ile geçirmeden hücreleri geri kalanını ekleyin.</li>
	<li>Acellular akciğer tohum, biyoreaktör şişede damlama perfused medya toplamak ve nefes borusu tekrar 3 x geçmek izin. Not: Perfused medya bazen numaralı seribaşı kanser hücreleri vardır. Bu nedenle, verimli tohum için medya tekrar borusunda şırınga yerine koy.</li>
	<li>Seribaşı sonra şırınga kaldırmak için 15 dakika bekleyin, taze medya eklemek ve biyoreaktör kuluçka geri dönmek. Herhangi bir hava kabarcıkları boru içinde kaldırın.</li>
	<li>6 mL/dk medya sıvı pompa başlatın.</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Statistics%2C+2017%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer Statistics, 2017.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).</li>
<li>Torre, L. A., Siegel, R. L., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+Cancer+Statistics%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Lung Cancer Statistics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 893, 1-19 (2016).</li>
<li>Lallo, A., Schenk, M. W., Frese, K. K., Blackhall, F., Dive, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+and+CDX+models+as+a+tool+for+preclinical+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Lung+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells and CDX models as a tool for preclinical drug development.</a> Translational Lung Cancer Research. 6 (4), 397-408 (2017).</li>
<li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).</li>
<li>Bissell, M. J., Hines, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+don%27t+we+get+more+cancer%3F+A+proposed+role+of+the+microenvironment+in+restraining+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Why don't we get more cancer? A proposed role of the microenvironment in restraining cancer progression.</a> Nature Medicine. 17 (3), 320-329 (2011).</li>
<li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lung+cancer+cells+grown+in+an+ex+vivo+3D+lung+model+produce+matrix+metalloproteinases+not+produced+in+2D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Human lung cancer cells grown in an ex vivo 3D lung model produce matrix metalloproteinases not produced in 2D culture.</a> PloS One. 7 (9), e45308(2012).</li>
<li>Vishnoi, M., Mishra, D. K., Thrall, M. J., Kurie, J. M., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+from+a+4-dimensional+lung+cancer+model+are+resistant+to+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells from a 4-dimensional lung cancer model are resistant to cisplatin.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 148 (3), discussion 1063-1064 1056-1063 (2014).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profile+of+A549+cells+from+tissue+of+4D+model+predicts+poor+prognosis+in+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer.+Journal+International+du+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gene expression profile of A549 cells from tissue of 4D model predicts poor prognosis in lung cancer patients.</a> International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. , (2013).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+four-dimensional+lung+cancer+model+mimics+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Ex vivo four-dimensional lung cancer model mimics metastasis.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 99 (4), 1149-1156 (2015).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lung+cancer+cells+grown+on+acellular+rat+lung+matrix+create+perfusable+tumor+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Human lung cancer cells grown on acellular rat lung matrix create perfusable tumor nodules.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 93 (4), 1075-1081 (2012).</li>
<li>Pence, K. A., Mishra, D. K., Thrall, M., Dave, B., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+cells+form+primary+tumors+on+ex+vivo+four-dimensional+lung+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Breast cancer cells form primary tumors on ex vivo four-dimensional lung model.</a> Journal of Surgical Research. 210, 181-187 (2017).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Lung+Fibroblasts+Inhibit+Non-Small+Cell+Lung+Cancer+Metastasis+in+Ex+Vivo+4D+Model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Human Lung Fibroblasts Inhibit Non-Small Cell Lung Cancer Metastasis in Ex Vivo 4D Model.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 100 (4), discussion 1174 1167-1174 (2015).</li>
<li>Mishra, D. K., Miller, R. A., Pence, K. A., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+cell+and+non+small+cell+lung+cancer+form+metastasis+on+cellular+4D+lung+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Small cell and non small cell lung cancer form metastasis on cellular 4D lung model.</a> BMC Cancer. 18 (1), 441(2018).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Ex vivo 4-D akciğer tümör büyüme ve metastaz bir laboratuvar tuzak içinde çalışma olanağı sağlar. Bir yerel akciğer matris normal doku için destek sağlar ve hücre-hücre etkileşimleri, hücre-matris etkileşimleri, hücresel başkalaşım ve doku organizasyon korur karmaşık bir sistemdir. Tümör büyüme üzerindeki etkileri ve diğer hücreleri ile etkileşim çalışmaya herhangi bir tümör microenvironment bileşenleri eklemek için bir fırsat sağlar.
Akciğer hasat ex vivo 4-D akciğer modeli ...

Kanser metastaz çoğu kanser ölümler arkasında suçlu olduğunu ve son meydan kanser mücadele çalışmalarında teşkil etmektedir. Bu yöntem genel amacı yanı sıra üç boyutlu (3-b) hücre büyüme akışının bir boyut olan bir dört boyutlu (4 D) hücre kültürü için bir protokol tasarlamaktır. Metastaz işlemi [yani, tümör hücreleri (CTCs) ve metastatik lezyonlar dolaşan birincil tümörün] üç farklı aşamalarında temsil eder.
Son üç yılda dünya çapında bilim geliştirilmiş bir tedavi mi, yoksa ilerleme-Alerjik yaşam beklentisi farklı kanser metastatik ilerlemesinde temel mekanizmaları anlamak için bilgi benzersiz bir zenginlik vermiştir. Meme kanseri gibi bazı kanser türleri klinik yönetiminin1önemli ölçüde geliştirilmiş; Ancak, akciğer kanseri gibi bazı kanser türleri hala zavallı hayatta kalma2var. Vitro ve in vivo hayvan modelleri yeni görüşler hastalık gelişimi destekleyecek mekanizmalar oluşturmak için vesile olmuştur. Son birkaç yıl içinde xenografts (CDX) satır elde edilen hücre ve hasta elde edilen xenografts (PDX) birincil insan tümör3, büyüme kinetik gibi birçok ilgili özellikleri histolojik özellikleri, davranış korumak gibi daha fazla ilgi olmuştur özellikleri ve tedaviye yanıt. Ancak, her model CTC oluşumu ve metastaz uzak organ4,5,6mekanizmasını anlamak için kendi sınırlamaları vardır.
Son zamanlarda, organ yeniden yapılanma ve perfüzyon tabanlı hücre kültürü kavramı kullanarak bir 4-D ex vivo akciğer kanseri modeli geliştirdik. Zaman içinde kanser salgılanan benzer bir insanla büyümek perfusable tümör nodüller oluşturarak insan akciğer kanser büyüme taklit eden protein üretim7. Kanserli hastalarda zavallı hayatta kalma öngörür ve ayrıca sisplatin tedavisi8,9üzerine tümör regresyon tarafından tedavi edici bir yanıt gösteren gen ifade imza temsil eder. Metastatik lezyonlar oluşturabilir böylece akciğer modeli daha da güncellenmiştir. CTCs birincil tümör ve intravasate damarlara geliştirmek ve metastatik lezyonlar10kurmaya kontralateral akciğer extravasate. Gen ifadesi çalışmaları birincil tümör, CTCs ve metastatik lezyonlar farklı ifade profil ve fenotip10için gerekli genler alt kümesini upregulation öneririm. Kanserli hastalarda görülen biyolojik koşulların varlığı nedeniyle metastatik bu işlem gerçekleşir. Bu modelin avantajı, doğal bir matris ve mimari varlığı ve tümör nodüller oluşumuna yol açar bir perfüzyon besin olduğunu. Buna ek olarak, aynı zamanda farklı bileşenleri tümör microenvironment veya uyuşturucu etkileri, tümör gelişimi zaman içinde çalışma olanağı sağlar. Bu model bir Aralık kanser hücrelerinin (akciğer kanseri, meme kanseri, sarkom vb) bir laboratuvar kurulumu büyümeye kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Sprague Dowley sıçan</td><td>Harlan</td><td>206M</td><td>Erkek</td></tr><tr><td>Klorheksidin sürüntü</td><td>Prevantics, NY, ABD</td><td>NDC 10819-1080-1</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, ABD</td><td>NDC 25021-400-10</td><td></td></tr><tr><td>18 gauge iğne</td><td>McMaster Carr, ABD</td><td>75165A249</td><td></td></tr><tr><td>2-0 ipek kravat</td><td>Ethicon, San Angelo, TX, ABD</td><td>A305H</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S pompa</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, ABD</td><td>EW-07554-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S pompa kafası</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, ABD</td><td>EW-07519-05</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S pompa kartuşu</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, ABD</td><td>EW-07519-70</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tüpü</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, ABD</td><td>14171211</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex Pompa tüpü</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, ABD</td><td>06598-16</td><td></td></tr><tr><td>Dişi luer kilit konektörleri</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, ABD</td><td>45508-34</td><td>75165A249</td></tr><tr><td>Erkek luer kilit konektörleri</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, ABD</td><td>45513-04</td><td></td></tr><tr><td>siyah naylon yüzük</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, ABD</td><td>EW-45509-04</td><td></td></tr><tr><td>İntravenöz set</td><td>CareFusion</td><td>41134E</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>CAS151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotikler</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Silikon oksijenatör</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, ABD</td><td>ABW00011</td><td>Saint-GoBain-Tel</td></tr> <tr><td>örgü</td><td>1164610105</td><td>Lowes</td><td>New York Tel</td></tr><tr><td>Dişi luer Pabuç Stili TEE</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, ABD</td><td>45508-56</td><td></td></tr><tr><td>200series Barb</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, ABD</td> için erkek luer entegre kilit halkası <td>45518-08</td><td></td></tr><tr><td>Dişi luer iplik stili kuplör</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, ABD</td><td>45508-22</td><td></td></tr><tr><td>Clave konektörü</td><td>ICU Medical</td><td>11956</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Flo ve ticaret; 4 Musluk w / döner erkek luer kilit</td><td>smith Tıbbi</td><td>MX9341L</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex Pompa tüpü</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, ABD</td><td>06598-13</td><td>kanül için</td></tr></tbody></table>

tümör metastazı çalışmaya acellular ve hücresel akciğer modeli

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Tümör hücrelerinin tümör progresyon farklı noktalarda ayırmak zordur. Biz tümör hücreleri doğal bir matris ile etkileşim ve besin sürekli akışı gösterebilir bir ex vivo akciğer modeli, hem de tümör hücreleri normal hücresel bileşenleri ile etkileşim ve doğal bir matris gösterir bir model oluşturdu. Acellular ex vivo akciğer modeli bir sıçan kalp-akciğer bloğu izole edip decellularization işlemini kullanarak tüm hücreleri çıkarmadan oluşturulur. Sağ ana bronş kapalı bağladılar ve tümör hücreleri borusunda bir şırınga tarafından yerleştirilir. Hücreleri taşımak ve sol akciğer doldurmak. Akciğer sonra nerede bir kapalı devre içinde sürekli bir akış medya, pulmoner arter alır bir biyoreaktör yerleştirilir. Sol akciğer yetiştirilen birincil tümör tümördür. Dolaşımdaki medyada izole tümör hücrelerinin tümör hücreleri dolaşan vardır ve sağ akciğer tümör hücrelerinde metastatik lezyonlar vardır. Hücresel ex vivo akciğer modeli decellularization işleminin atlayarak oluşturulur. Her model farklı araştırma soruları cevaplamak için kullanabilirsiniz.

Sıçan gelen hasat akciğer sağlam damarlara ve alveoller11 (Şekil 3A ve 3B) tutar. Decellularization, kolajen, fibronektin ve elastin, gibi bir acellular akciğer hücre dışı matriks bileşenlerinin11 (Şekil 3 c, 3D, 3Eve 3F) korunur. Decellularization yerli fare hücreleri mevcut Hematoksilen ve eozin (H &amp; E) tarafı...

Burada, tümör hücreleri ve metastatik lezyonlar dolaşan bir protokol tümör progresyon adımları taklit eder ve birincil tümörün izole etmek için yardımcı olan bir ex vivo akciğer kanseri modeli için mevcut.

Tümör metastazı çalışmaya acellular ve hücresel akciğer modeli

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Bu yöntem, tümör ilerlemesi ile ilgili önemli soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Ex vivo aselüler ve hücresel akciğer modeli, zamanla büyüyen ve dolaşımdaki tümör hücreleri ve metastatik lezyonlar oluşturan primer tümör oluşumuna izin verir. Bu tekniğin temel avantajı, kanserin ilerlemesinin kısaltılmış bir sürede incelenmesine ve farklı kanser hücrelerinin büyümesine izin vermesidir.Bu tekniğin etkileri, hastalardan alınan tümör hücreleri, bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere terapötik ilaçların etkinliğini değerlendirmek için modelde kullanılabildiğinden, kişiselleştirilmiş tedavimize kadar uzanır. Derin anestezi uygulanmış bir sıçan ile başlayın. Göğsü ve karnı tıraş edin ve cildi klorheksidin bir çubukla silin.Göğüs boşluğunu açtıktan sonra diyaframın sağ tarafında solda göğüs kafesinin ön tarafını keserek bilateral torakotomi yapın. Göğüs kafesini yukarıda tutun ve akciğerde kan pıhtılarının oluşmasını önlemek için 27 gauge iğne kullanarak atan kalbin sağ ventrikülüne mililitre başına 1000 birim heparin enjekte edin. Göğüs kafesini çıkardıktan sonra, kanın dışarı çıkmasına izin vermek için sol ventriküle havalandırma deliği olarak 18 gauge iğne yerleştirin, ardından sağ ventriküle mililitre başına 15 mililitre 12.5 birim enjekte etmek için 25 gauge iğne kullanın.Daha sonra, tiroidin tabanındaki trakeayı kesin ve inen aortu hemiazigos veni seviyesinde ve aortun kemerdeki dalları seviyesinde dikkatlice çıkarın. Kalp-akciğer bloğunu göğüs boşluğundan çıkardıktan sonra, sağ ve sol ventriküllerin yarısını kesin ve ardından sağ ventrikülden ana pulmoner artere özel yapım 18 gauge paslanmaz çelik iğne kanülü yerleştirin. Kanülü 2-0 ipek kravat ile sabitleyin ve sağ ventrikül ve atriyumu dikkatlice ortaya çıkarın.Heparinize PBS'yi, hücre giderme ünitesinin şişesine serbestçe akana kadar 30 milimetre cıvalık fizyolojik perfüzyon basıncında çalıştırarak başlayın, ardından kalp-akciğer bloğunu pulmoner arter kanülü yoluyla pulmoner arter ucundaki decellularizasyon ünitesine takın. Heparinize PBS ile 15 dakika yıkadıktan sonra, heparinize PBS şişesini% 0.15 sodyum dodesil sülfat ve deiyonize su içeren bir şişeyle değiştirin ve hücreden arındırma için akciğeri iki saat boyunca perfüze edin. Hücre gidermeden sonra, perfüz deiyonize otoklavlanmış suyu akciğer iskelesinden 15 dakika boyunca geçirdikten sonra 10 dakika boyunca deiyonize su içinde %1 iyonik olmayan deterjan uygulayın.Son olarak, şişeyi antibiyotiklerle desteklenmiş 500 mililitre otoklavlanmış PBS ile değiştirin. Pompayı dakikada altı mililitrede çalıştırın ve akciğerleri 72 saat boyunca perfüze edin, bu sürenin sonunda aselüler akciğer hemen kullanıma hazırdır. Pompa kartuşuna %70 etanol püskürtün ve oksijenatörün çıkış ucunu pompa borusuna ve diğer ucunu biyoreaktördeki 1,5 fitlik bir tüpe bağlayarak oksijenatörü kurun.Biyoreaktör şişesini aseptik koşullar altında bir biyogüvenlik kabinine kurun. Pulmoner arterden geçen akışı kontrol etmek için bir dişi Luer kilidinin başına üç bir musluk takın, ardından trakeadan hücre tohumlamak için tek yönlü bir musluğu başka bir dişi Luer kilit bölmesine bağlayın. Ortamı dolaştırmak için şişenin dışına iki inçlik boruyu ve içine altı inçlik boruyu bağlayın.Biyoreaktör şişesini oksijenatöre bağlamak için hortumu hazırlayın. İki ayaklı bir tüpe bir erkek Luer kilidi takın ve erişilebilirlik sağlamak için bir dişi Luer pabucu stili T takın ve iki ayaklı tüpe bir erkek Luer kilidi ve bir dişi Luer kilidi takın. Hücre kültürü ortamı ekleyin ve biyoreaktörü inkübatöre aktarın.Kapalı döngü bir biyoreaktör yapmak için oksijenatör tüpünü iki açık uca bağlayın. Oksijenatörü ve tüpleri kültür ortamıyla doldurmak için pompayı dakikada altı mililitre hızında önceden çalıştırın, böylece boruda hava kabarcığı kalmaz. Tüpler ortamla doldurulduktan sonra, vanayı kapatın ve oksijenatörleri biyoreaktör şişesinin her iki ucundan ayırın.Biyoreaktör şişesini biyogüvenlik kabinine koyun, kültür ortamını musluktan geçirin ve akciğer iskelesinin pulmoner kanülünü takın. Hücresel akciğer modeliyle çalışıyorsanız, hücre çözmeyi atlayın. Hasat edilen akciğer, biyoreaktörde ikili olarak ayarlanabilir.Havayı çıkarmak için kültür ortamını tekrar tek yönlü musluktan geçirin ve trakeal kanülü ipek bir iplikle trakeaya bağlayın, ardından biyoreaktör şişe kapağını kapatın. Biyoreaktörü inkübatöre aktarın ve pompayı çalıştırın. Tüm lobların şişirildiğinden ve akciğerin iyi durumda göründüğünden emin olmak için kültür ortamını 10 ila 15 dakika çalıştırın.Metastatik model için aselüler veya hücresel akciğer iskelesini aşağıdaki gibi değiştirin. Asılı akciğer iskelesi ile biyoreaktör kapağını açın ve trakeadan beş mililitre kültür ortamı geçirmek için bir Luer kilit şırıngası kullanın. Çatallanma noktasında trakeadan 2-0 ipek geçirmek için açısal forseps kullanın.Sağ akciğere giden trakeayı bifurkasyon noktasında bağlayın ve kültür ortamını geçirerek soluk borusundan sol akciğere serbest medya akışını kontrol edin. RPMI 1640 tam kültür ortamında mililitre başına iki ila üç milyon hücre konsantrasyonunda A549 veya H1299 gibi 50 mililitrelik bir akciğer kanseri hücresi hazırlayın. Trakeal kanülün üzerine 20 mililitrelik bir Luer kilit şırıngası yerleştirin ve şırıngaya 15 mililitre hücre ekleyin.Hücre süspansiyonunun yerçekimi ile akciğer loblarından geçmesine izin verin. Herhangi bir hava kabarcığı geçmeden önce hücrelerin geri kalanını ekleyin. Tohumlandıktan sonra şırıngayı çıkarın ve 15 dakika bekleyin, ardından biyoreaktöre taze ortam ekleyin.İnkübatöre geri koyun ve hava kabarcıklarını çıkardıktan sonra, akciğer iskelesini dakikada altı mililitre perfüze edin. Sağlam bir akciğerin histopatolojisi alveolleri ve pnömositleri gösterir. Burada görüldüğü gibi, decellularizasyon akciğer hücrelerinin tamamen çıkarılmasına yol açar ve aselüler akciğerlerin histopatolojisi sağlam bir bazal membranı ortaya çıkarır.Deselüler bir akciğerin Movat pentakrom ve elastin boyası, sağlam vaskülatür ve bronş ile kollajen, fibrin ve elastin varlığını ortaya çıkarır. Hücreden arındırılmış akciğerin DNA analizi, DNA içeriğinde %99'dan fazla bir azalma gösterir Aselüler akciğer, hücre kültürü için doğrudan biyoreaktörde kullanılabilir. Histolojik bir analiz, tümör büyümesinin varlığını gösterir.Bu prosedürü denerken, heparini kalbin sağ ventrikülüne enjekte etmeyi unutmamak önemlidir. Bu gelişmeden sonra bu teknik, kanser araştırmaları alanındaki araştırmacıların akciğer kanserinde tümör hücrelerinin metastaz yapmasına yol açan genetik ve epigenetik değişiklikleri keşfetmelerinin önünü açmıştır.

acellular-and-cellular-lung-model-to-study-tumor-metastasis

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu makale, insan kanser hücre hatları metastatik potansiyelini belirlemek için kullanılan deneysel bir metastaz testinin prosedürleri açıklamaktadır.

Deneysel metastaz Testi

Tümör hücrelerinin T hücre etkileşimi analizi için deneysel bir akciğer metastazı ve CTL immünoterapi fare...

Deneysel metastaz ve CTL Kabul edilmiş Transfer İmmünoterapi Fare Modeli

Bu protokolün amacı meme tümörigenezini incelemektir. Bu teknikle, fare meme tümörleri çıkarılır ve tümörlerden birincil hücreler hazırlanır. Akciğer metastazını incelemek için bir akciğer ekstraksiyon protokolü dahildir. Ayrıca, fare embriyosundan fare embriyonik fibroblastlarını analiz etmek için başka bir protokol dahil edilmiştir.

Primer Tümör ve Akciğer Metastazı Eğitim için MEF Hücre İzolasyonu

Bu el yazması tümör hücresi birikimi Akciğerlerde tümör metastazı, bir hayvan modeli ölçmek için bir yöntem açıklanır.

Akciğer tümör hücre işe alım tahlil

Farelerde floresan haberci kullanılarak, akciğer metastazı olan tümör hücre stromanın etkileşimleri ex vivo canlı görüntüleme için nispeten basit bir yöntem tarif eder. iplik disk konfokal mikroskopi kullanılarak, bu teknik, en az 4 saat boyunca canlı hücre görüntülenmesini sağlayarak ve diğer enflamatuar akciğer koşulları incelemek için adapte edilebilir.

Ex Akciğer Metastaz ve Bunların mikroçevresinin Canlı Görüntüleme vivo

Metastatik klonların uzak bölgeleri kolonize etme yeteneği, çoğalma kapasitelerine ve/veya önemli bir çoğalma olmaksızın konakçı mikro ortamda hayatta kalma yeteneklerine bağlıdır. Burada, metastatik klonlar tarafından her iki tip karaciğer kolonizasyonunun kantitatif olarak görselleştirilmesine izin veren bir hayvan modeli sunuyoruz.

İleri Hayvan Karaciğer Kolorektal Metastaz Model: Görüntüleme Teknikleri ve Metastatik Klonların Özellikleri

Bu makalede, pulmoner metastaz tahlil (PuMA) Protokolü'nün ayrıntılı bir açıklama sağlamak için hedeftir. Bu model araştırmacılar metastatik osteosarkom (OS) hücre büyümesini widefield floresan veya confocal mikroskop lazer tarama kullanarak akciğer dokusunda çalışmaya izin verir.

Metastatik akciğer kolonizasyon pulmoner metastaz tahlil kullanarak osteosarkom içinde eğitim pratik düşünceler

Bir hayvan modeli tümör hücreleri (CTCs) kanseri metastaz sırasında akciğer kolonizasyon teşvik dolaşan rolü deşifre için gereklidir. Burada kurduk ve başarıyla gerçekleştirilen bir vivo içinde tahlil özel olarak test etmek için gereksinimin akciğer kolonizasyon için CTCs polimer fibronektin (polyFN) Meclisi.

Tümör hücre görselleştirme akciğer dokusu içinde dolaşan bir akciğer kolonizasyon tahlil kurulması

Kanser hücrelerinin intravenöz enjeksiyonu genellikle metastaz araştırmalarında kullanılır, ancak metastatik tümör yükünü analiz etmek zor olabilir. Burada, metastazın kuyruk damarı enjeksiyon modelini gösteriyoruz ve ortaya çıkan metastatik akciğer tümörü yükünü analiz etmek için yeni bir yaklaşım içeriyoruz.

Tümör Hücrelerinin Lateral Kuyruk-Damar Enjeksiyonu Sonrasında Akciğer Metastazının Patolojik Analizi

Burada, akciğerin yüksek çözünürlüklü, intravital görüntülemesini sağlayan murine toraks için kalıcı olarak indwelling optik pencerenin cerrahi implantasyonu için bir protokol sunuyoruz. Pencerenin kalıcılığı, akciğerdeki dinamik hücresel süreçlerin, özellikle de yayılan tümör hücrelerinin metastatik ilerlemesi gibi yavaş gelişen süreçlerin incelenmesine çok uygun hale getirir.

Akciğere Kanser Metastazını Araştırmak İçin Kalıcı Bir Pencere

El yazması, ortotopik olarak enjekte edilen meme tümörlerinden spontan akciğer metastazının kurulması ve uzunlamasına büyüme izlemesi için metastatik kaskadının tüm aşamalarında müdahaleye uygun bir metodolojiyi açıklamaktadır.

In vivo (İn canlı) Ortotopik Olarak Enjekte Edilen Meme Tümörü Hücrelerinin Spontan Akciğer Metastazını Ölçmek için Görüntüleme

Öğrenin, tümör metastazını incelemek için ekz vivo akciğer modeli kullanarak primer tümör ve dolaşan tümör hücrelerinin oluşumunu. Bu yöntem, kişiselleştirilmiş kanser tedavisi geliştirmeye yardımcı olur.

Tümör metastazı çalışmaya acellular ve hücresel akciğer modeli

Daha fazla video keşfet