Name: Fotodinamik Tedavi bir Vitro yaklaşım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: Öğrenin fotodinamik tedavi protokolünü in vitro cilt kanseri araştırmaları için hücre apoptozisi üzerindeki etkileri incelemek amacıyla. Bu yöntem yeni tedavi stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar hiçbir katkıda bulunanlar var.

1. hücre hazırlanması
<ol><li>20.000 hücre kültür orta 2 ml steril tekniği kullanarak bir Biyogüvenlik kabini 6-şey plaka her kuyuya plaka.</li>
	<li>6-iyi plakaları hücrelere plakaları için uygun izin vermek 24 h için oksijen kuluçka (37 ° C, % 5 CO2) yerleştirin.</li>
</ol>2. hücre tedavisi için Photosensitizer hazırlanması
<ol><li>Kültür orta 0.5, 1 ve 2 mM 5-ALA çözümlerinde hazırlayın. Fetal Sığır serum (FBS) kültür ortamının bir madde ise, hazırlamak ve 5-ALA % 0.1 ile kültür orta çözümde hücrelerle tedavi FBS incubations için. 11 , 12 5-ALA sığır hipofiz özü ve epidermal büyüme faktörü ile doğrudan keratinosit serum-Alerjik orta için ekledim bu durumda, SCC-13 hücreleri FBS, gerek yoktur.</li>
	<li>Kültür orta Aspire edin ve en az 2 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) hücrelerle yıkayın.</li>
	<li>PBS Aspire edin ve 2 mL 0, 0.5, 1 veya 2 mM 5-ALA çözümleri ayrı levhalar veya kuyu ekleyin.</li>
	<li>0, 0.5, 1 hücrelerle kuluçkaya veya 2 mM 5-ALA bir 36-37 ° c blok 30 dakika süreyle Isıtma alüminyum folyo kullanarak kuluçka sırasında ışık pozlama hücreleri korumak.</li>
	<li>0, 0.5, 1 ve 2 mM 5-ALA çözümler Aspire edin ve PBS 2 mL hücrelerle yıkayın.</li>
	<li>PBS Aspire edin ve kültür orta mavi ışık ışınlama için 2 mL ekleyin.</li>
</ol>3. mavi ışık fototerapi
<ol><li>Hücreleri irradiating önce mavi ışık aygıtı (Örneğin, ışık yayan diyot, floresan veya halojen ışık) açın ve bir döngüsü için çalıştırın (1000 s) aygıtı ısıtmak için. Mavi ışık aygıt-meli-si olmak bir çıkış dalga boyu 417 +/-5 nm. Cihazın tedaviler önce bir döngüsü için çalıştırmak izin veren mavi ışık dalga boyu ve olma photoactivation aşaması boyunca tutarlı olmasını sağlar.</li>
	<li>Bir foto ölçüler olma hücre yüzeyinde ölçmek için kullanın. Mavi ışık olma hücre yüzeyinde 10 mW/cm2olmalıdır. Işık ve hücreleri arasındaki mesafe bir olma 10 mW/cm2 ışık kaynağı yoğunluğuna bağlı olarak elde etmek için ayarlanması gerekebilir.</li>
	<li>ALA tedavi grupları 0, 0.5, 1 ve 2 mM mavi ışık kaynağı altında siyah bir yüzey üzerine yerleştirin. Mavi ışık 1.000 için hücrelerle ışınlatayım s (16 dk ve 40 s) için toplam bir dozda 10 J/cm2. Mavi ışık photoactivation, analiz için hazır hücrelerdir.</li>
</ol>4. toplama ve boyama
<ol><li>Akış arabellek ( Tablo malzemelerigörmek) üretici esaslarına göre hazırlayın.</li>
	<li>Kültür orta ve PBS 2 mL yıkama hücreleri Aspire edin.</li>
	<li>1 mL % 0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve yaklaşık 3-5 min için ayırmak hücreleri. Hücreleri hücre dekolmanı onaylamak için mikroskop altında incelendiğinde.</li>
	<li>Kültür orta (veya PBS) 1 mL tripsin devre dışı bırakmak için % 10 fetal Sığır serum ile ekleyin.</li>
	<li>Hücre süspansiyon etiketli 5 mL akışı tüpler içine toplamak.</li>
	<li>5 mL akış tüp içinde vasıl 201 x g santrifüj 5 dk. aspiratı çözüm için hücre Pelet kaldırmadan spin.</li>
	<li>Akış arabellek konjuge annexin-V antikor (annexin-v akış arabellek 39 µL başına 1 µL) ile 200 µL her örnek için ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri resuspend ve annexin-V bağlantısına izin 20 dk da kuluçka makinesine (37 ° C, % 5 CO2) yerleştirin.</li>
	<li>7-AAD 3 µL her örnek için ekleyin. Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
</ol>5. akış sitometrik çözümlemesi
<ol><li>Kurulum için akış sitometresi üretici yönergeleri takip ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Toplamak ve örneklerini akış sitometresi ile. 13
</li>
	<li>Tedavi ve varyans analizi (ANOVA)14kullanarak denetim grupları istatistiksel karşılaştırma gerçekleştirir. Denetim ortalaması tedavi gruplarına araçlarının bir Dunnett'ın test post hoc analizi için karşılaştırın.</li>
</ol>

<ol><li>Morton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((European+Dermatology+Forum+guidelines+on+topical+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">European Dermatology Forum guidelines on topical photodynamic therapy.</a> European Journal of Dermatology. 25 (4), 296-311 (2015).</li>
<li>Ozog, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy%3A+A+clinical+consensus+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Surgery%3A+Official+Publication+for+American+Society+for+Dermatologic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy: A clinical consensus guide.</a> Dermatologic Surgery: Official Publication for American Society for Dermatologic Surgery. 42 (7), 804-827 (2016).</li>
<li>Abrahamse, H., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+photosensitizers+for+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">New photosensitizers for photodynamic therapy.</a> Biochemical Journal. 473 (4), 347-364 (2016).</li>
<li>Josefsen, L. B., Boyle, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+and+the+development+of+metal-based+photosensitisers%5BTitle%5D)+AND+%22Metal-Based+Drugs%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy and the development of metal-based photosensitisers.</a> Metal-Based Drugs. 2008, 276109(2008).</li>
<li>Ohgari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+involved+in+%CE%B4-aminolevulinic+acid+%28ALA%29-induced+photosensitivity+of+tumor+cells%3A+Relation+of+ferrochelatase+and+uptake+of+ALA+to+the+accumulation+of+protoporphyrin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms involved in δ-aminolevulinic acid (ALA)-induced photosensitivity of tumor cells: Relation of ferrochelatase and uptake of ALA to the accumulation of protoporphyrin.</a> Biochemical pharmacology. 71 (1-2), 42-49 (2005).</li>
<li>Kessel, D., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+photodamage+and+PDT-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology+B%3A+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial photodamage and PDT-induced apoptosis.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 42 (2), 89-95 (1998).</li>
<li>Goldberg, D. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18940541">Photodynamic therapy in skin rejuvenation.</a> Clinics in Dermatology. 26 (6), 608-613 (2008).</li>
<li>Sakamoto, F. H., Lopes, J. D., Anderson, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+for+acne+vulgaris%3A+A+critical+review+from+basics+to+clinical+practice%3A+Part+I.+Acne+vulgaris%3A+When+and+why+consider+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Academy+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy for acne vulgaris: A critical review from basics to clinical practice: Part I. Acne vulgaris: When and why consider photodynamic therapy.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 63 (2), 183-193 (2010).</li>
<li>Boen, M., Brownell, J., Patel, P., Tsoukas, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+photodynamic+therapy+in+acne%3A+An+evidence-based+review%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Dermatology%22%5BJournal%5D)">The role of photodynamic therapy in acne: An evidence-based review.</a> American Journal of Clinical Dermatology. 18 (3), 311-321 (2017).</li>
<li>Allison, R. R., Moghissi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncologic+photodynamic+therapy%3A+Clinical+strategies+that+modulate+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+and+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">Oncologic photodynamic therapy: Clinical strategies that modulate mechanisms of action.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 10 (4), 331-341 (2013).</li>
<li>Koo, E., Austin, E., Mamalis, A., Jagdeo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+ultra+short+photodynamic+therapy%3A+heating+fibroblasts+during+sub-30-minute+incubation+of+5-aminolevulinic+acid+increases+photodynamic+therapy-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Surgery%3A+Official+Publication+for+American+Society+for+Dermatologic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Thermal ultra short photodynamic therapy: heating fibroblasts during sub-30-minute incubation of 5-aminolevulinic acid increases photodynamic therapy-induced cell death.</a> Dermatologic Surgery: Official Publication for American Society for Dermatologic Surgery. , (2017).</li>
<li>Koo, E., Austin, E., Mamalis, A., Jagdeo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+ultra+short+sub-30+minute+incubation+of+5-aminolevulinic+acid+photodynamic+therapy+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Efficacy of ultra short sub-30 minute incubation of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy in vitro.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 49 (6), 592-598 (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5650/annexin-v-and-propidium-iodide-labeling">Cell Biology. Annexin V and Propidium Iodide Labeling.</a> JoVE. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li>Mamalis, A., Koo, E., Sckisel, G., Siegel, D., Jagdeo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-dependent+impact+of+thermal+aminolaevulinic+acid+photodynamic+therapy+on+apoptosis+and+reactive+oxygen+species+generation+in+human+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Temperature-dependent impact of thermal aminolaevulinic acid photodynamic therapy on apoptosis and reactive oxygen species generation in human dermal fibroblasts.</a> British Journal of Dermatology. 175 (3), 512-519 (2016).</li>
<li>Gilaberte, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+intrinsic+factors+involved+in+the+resistance+of+squamous+cell+carcinoma+to+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Cellular intrinsic factors involved in the resistance of squamous cell carcinoma to photodynamic therapy.</a> Journal of Investigative Dermatology. 134 (9), 2428-2437 (2014).</li>
<li>Yoon, H. K., et al. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cm403505s">Nanophotosensitizers engineered to generate a tunable mix of reactive oxygen species, for optimizing photodynamic therapy, using a microfluidic device.</a> Chemistry of Materials. 26 (4), 1592-1600 (2014).</li>
<li>Chen, Y. -C., Lou, X., Zhang, Z., Ingram, P., Yoon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cancer+cell+sphere+formation+for+characterizing+the+efficacy+of+photo+dynamic+therapy+in+3D+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput cancer cell sphere formation for characterizing the efficacy of photo dynamic therapy in 3D cell cultures.</a> Scientific Reports. 5, 12175(2015).</li>
<li>Campos, C., Inada, N., Kurachi, C. <a target="_blank" href="https://www.spiedigitallibrary.org/conference-proceedings-of-spie/10476/104760S/Low-dose-PDT-on-breast-cancer-spheroids/10.1117/12.2290915.short?SSO=1">Low-dose PDT on breast cancer spheroids.</a> Optical Methods for Tumor Treatment and Detection: Mechanisms and Techniques in Photodynamic Therapy XXVII. , (2018).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+temperature+on+5-aminolevulinic+acid-based+photodynamic+reaction+in+keratinocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Photodermatology%2C+Photoimmunology+%26+Photomedicine%22%5BJournal%5D)">The influence of temperature on 5-aminolevulinic acid-based photodynamic reaction in keratinocytes in vitro.</a> Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (2), 83-88 (2010).</li>
<li>Juzeniene, A., Juzenas, P., Kaalhus, O., Iani, V., Moan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+effect+on+Accumulation+of+protoporphyrin+IX+after+topical+application+of+5-aminolevulinic+acid+and+its+methylester+and+hexylester+derivatives+in+normal+mouse+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Temperature effect on Accumulation of protoporphyrin IX after topical application of 5-aminolevulinic acid and its methylester and hexylester derivatives in normal mouse skin.</a> Photochemistry and Photobiology. 76 (4), 452-456 (2002).</li>
<li>Novak, B., Heesen, L., Schary, N., Lubbert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+different+illumination+parameters+on+protoporphyrin+IX+induced+cell+death+in+squamous+cell+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+and+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">The influence of different illumination parameters on protoporphyrin IX induced cell death in squamous cell carcinoma cells.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 21, 385-392 (2018).</li>
</ol>

DUSA/güneş ilaç 5-ALA ve BLU-U ışık cihaz sağladı. Bu el yazması Dr. Jagdeo'nın artık tarafından desteklenen fon. İçeriği US Department of Veterans Affairs veya Amerika Birleşik Devletleri hükümetinin görüşlerini temsil etmemektedir.

SCC-13 apoptosis 30 dk incubations 0.5, 1 ve 2 mM 5-ALA 1.000 tarafından takip takip önemli bir artış oldu s mavi ışık. Bu sonuçlar 5-ALA incubations 30 dk mavi ışık etkinleştirme tarafından takip apoptosis12geçiren fibroblast hücreleri yüzdesi doz bağımlı artışa yol gösteren bizim daha önce yayınlanan araştırma ile uyumludur, 14.
Eğitim PDT için deneysel bu yaklaşımın avantajları ve sınırlamalar vardır. Ve klinik pratikte piyasada bulunan bir PS olarak açıklanan yöntemleri uygun ışık kaynağı kullanılmıştır. Araştırmacılar yöntemleri farklı hücre tipleri, PSs, ışık kaynakları ve ışınlama parametreleri ile özelleştirebilirsiniz. Ancak, bu iletişim kuralı bir monolayer kültürlü yapışık hücreleri için tasarlandığı gibi bu yaklaşımın sınırlamalar vardır. Klinik uygulamada, doku mimarisi veya hastalık patoloji (Yani, Hiperkeratoz veya fibrozis) farklılıkları PS absorpsiyonu azalabilir veya hafif penetrasyon15. Sonuç olarak, tedavi doz ve deneysel bulgular doğrudan klinik uygulamaya karşılık gelmeyebilir. Küresel tümör modelleri ve mikrosıvısal çip daha yakından tümör microenvironments16,17,18çoğaltmak için yöntemleri olarak incelenmiştir. Pulcuklarının differentially dezenfeksiyon dahil ve türdeş olmayan tümör mimari temsil eden iç ve dış hücresel nişler vardır. Diğer araştırmacılar mikrosıvısal çip ekran tedavi koşulları ve dezenfeksiyon vasküler teslim için kullanmışlardır. Ancak, mikrosıvısal çip geliştirmek için pahalı veya tekniği ile yabancı araştırmacılar için uygulamak zor olabilir. Ayrıca, pulcuklarının ve mikrosıvısal çip dezenfeksiyon doğrudan damar yayma olmadan tümör yüzeye uygulanma deri kanserlerinin klinik tedavi yansıtmaz. Araştırmacılar artılarını ve eksilerini monolayer kültür, küresel tümör modelleri ve mikrosıvısal çip için eğitim PDT farklı hastalık sistemlerinde değerlendirmek gerekir. Olarak orada hiçbir bağışıklık hücreleri veya hücre dışı matriks, PDT karmaşık hücre-hücre etkileşimleri etkilemesi belirlemek mümkün değil. Araştırmacılar hayvan modelleri ve klinik kullanarak vitro deney sonuçları onaylamak gerekir. Yüksek arası test geçerlilik elde etmek için tutarlı kuluçka ve ışık parametreleri vitro PDT deneyler yaparken sağlamak önemlidir.
Sıcaklık PDT19etkinliği değiştirmek için bilinir. Bir çalışmada hücre ölümü, 5-ALA alımı, PP-IX oluşumu ve sitokin sürüm 5-ALA sıcaklıklarda hücrelerle kadar 44 ° C19' a kuluçka tarafından gelişmiş olabilir olduğunu gösterdi. 44 ° C üzerindeki sıcaklıklarda kuluçka termal indüklenen hücre ölüme neden olabilir ve kuluçka 20 ° C'den düşük sıcaklıklarda önemli 5-ALA alımı ve birikimi19yol değil. Araştırmacılar için potansiyel olarak termal etkileri semptomlarıdır denetlemek için sabit bir sıcaklık bir sıcaklığı ayarlanabilir ısıtma blok üzerinde PS incubations gerçekleştirmenizi öneririz. Ayrıca, photosensitizer PP-IX 5-ala dönüşüm için izin vermek için yeterli bir süre için kuluçkaya önemlidir. Bu protokol için SCC-13 hücreleri 5-ALA başarıyla indüklenen hücre apoptosis 30 dk ile inkübe. Biz daha önce bir 10 min kuluçka 5-ala apoptosis fibroblast tedavi edilmemiş kontrol fibroblastlar11,14' e göre önemli ölçüde artmamıştır gösterdi. 5-ALA 37 ° C'de 6 dakikadır kuluçka sonra fare ciltte biriken PP-IX başlar Bu nedenle, 5-ALA kuluçka on dakika sonra olabilir yeterli birikimi hücre apoptosis20ikna etmek için s-IX. 20-30 dk en az kuluçka süresi 5-ALA bizim önceki çalışmalar11,14üzerinde dayalı için tavsiye ediyoruz. Araştırmacılar kuluçka süresi ayarlama, faiz, hücre tipi ve klinik belirti photosensitizer laboratuar tabanlı en iyi duruma getirmek gerekir. Antikor titrasyonu ve optimizasyon deneyler üreticileri yönergeleri kullanarak en iyi sonuçlar için gerçekleştirilebilir. Diğer deneyleri ilgi mavi ışık photoactivation dihydroethidium akış sitometrik miktar ROS, dahil olmak üzere aşağıdaki gerçekleştirilebilir. 14
Yüzey alanı (Yani, olma) birim varyasyon ışık miktarında teslim ve toplam ışınlama dozu (Yani, akım) photoactivation aşamasında ROS oluşumu ve hücre apoptosis21etkileyebilir. Akım, olma ve zaman arasındaki ilişki Aşağıdaki denklemle tanımlanabilir:
Akım (J/cm2) olma (W/cm2) = x zaman (s)
Akım zamanında bağımlı olduğu için uzatma veya photoactivation aşamaları kısaltmak tedavi etkinliği değişebilir. Olma, ışık kaynağı ve hedef doku kare mesafe orantılıdır. Sonuç olarak, ışık çok uzakta ise, olabilir yeterli ışık enerjisi heyecanlandırmak için hedeflenen doku teslim PS. olma çevre yüzeyleri yansıtan ışık tarafından alternatif olarak, artırılabilir. Bu nedenle, ışık yansıması önlemek için siyah bir yüzey üzerine yerleştirilir hücre kültür plakalı hafif irradiations yapmak tavsiye. Araştırmacılar ticari olarak kullanılabilir veya FDA onaylı mavi ışık - yayan diyotlar ve PDT deneylerde kullanılacak floresan aygıtları elde edebilir ama bu cihazlar farklı güç çıkışları ve ışık alan homojenlik olabilir. Bir dalga boyu özgü fotometre hücre yüzeyine ve ışık alan her deneme tutarlı sonuçlar için önce tekdüzelik olma ölçmek için kullanılır. Piyasada bulunan bir difüzör gerekirse alan tekdüzelik, geliştirmek için kullanılabilir.
Özetle, biz teorisi, deneysel yöntemleri, sınırlamalar, olası tehlikelere ve optimizasyonu için öneriler ayrıntılı PDT araştıran bir vitro yaklaşım anlatmıştık. PDT yararlı bir klinik yordam ve vitro araştırmalar yeni PSs, iletişim kuralları ve PDT için yeni göstergeler duruma getirilmesi gelişimi için izin olduğunu.

Fotodinamik Tedavi (PDT) bir exogenously uygulanan photosensitizer (PS), hücre apoptosis ikna etmek için görünür ışık photoactivation tarafından takip kuluçka içerir tıbbi bir işlemdir. Federal İlaç İdaresi (FDA) PDT aktinik keratoz (AK) tedavisi için onaylanmış ve belirli olmayan Melanom deri kanserlerinin ve akne vulgaris1,2için bir tedavi olarak PDT klinik yönergeleri öneririz. Gelişmekte olan dermatolojik sigara kullandığı PDT için tedavi gastrointestinal, prostat ve jinekolojik kanserler3içerir. Düşük maliyetli, non-invaziv ve en az istenmeyen olaylar ve skarlasma2ile ilişkili olarak PDT avantajlı bir tedavi yöntemi vardır.
PDT ilk adımda bir PS uygulanan ve2intracellularly birikmesine izin. Amerika Birleşik Devletleri'nde, topikal 5-aminolevulinik asit (5-ALA) yaygın olarak AKs tedavisinde kullanılır. Kuluçka sırasında protoporfirin IX (PP-IX) yolu ile heme biyosentezi yolu eklenen hücreleri3faz, 5-ALA dönüştürülür. Kanser ve öncesi kanser hücreleri protoporfirin IX (PP-IX), son ürün haline dönüştürür, ferrokelataz etkinlik azalma hem. Sonuç olarak, kanser hücreleri PP-IX normal hücreleri4,5' e göre birikir. PP-IX bu birikimi kanser ve öncesi kanser hücrelerini çevreleyen doku göre en az olumsuz olayların hedefli bir yaklaşımla olmak PDT sağlar. Işık ışınlama reaktif oksijen türleri (ROS) üretimi ne zaman oksijen PP-IX heyecanlı elektron kabul eder yol açar. PP-IX mavi ve kırmızı ışık2de dahil olmak üzere görünür ışık spektrumu boyunca küçük tepeler ile mor ötesi spektrumda en yüksek emme vardır. ROS oluşumuna sonuçta hücre apoptosis, membran bozulma, mitokondrial hasar, bağışıklık modülasyonu, keratinosit yayılması ve kollajen ciro6,7,8,9 yol açabilir , 10.
PDT 1970'lerde geliştirildi ve gelişen bir tedavi yöntemi3. 5-ALA cilt kuluçka 14-18 h için AKs tedavisinde FDA onaylı Protokolü önerir, ancak 1-2 h incubations klinik pratikte2' de yaygın olarak kullanılır. İn vitro, biz daha kısa 15 dk 5-ALA incubations fibroblast hücre apoptosis tedavi edilmezse fibroblastlar11,12' ye göre artabilir göstermiştir. Ayrıca, roman chlorin, ftalosiyanin ve nanoparçacık tabanlı PSs PDT etkinliği3geliştirmek için okudu. Burada, biz bir yapisan Skuamöz Hücre Karsinomu PDT çalışmada vitro yöntemine hücreleri mevcut. Bu protokol için SCC-13 hücreleri ile 0, 0,5, 1,0 ve 2 mM 5-30 dk ve photoactivated ALA 417 nm mavi ışık için 1.000 ile inkübe s. Birincil sonuç apoptozis ve nekroz, annexin-V ve 7-aminoactinomycin D (7-AAD) akış sitometresi tarafından ölçülen ölçüsüdür. Bu tedavi protokolü PDT taklit etmek için tasarlanmıştır ve PDT kullanımı diğer hücre hatları, dezenfeksiyon, kuluçka sıcaklıklarda veya photoactivation dalga boyu ile eğitim için ayarlanabilir. Ek denetim grupları hazırlanması günahı, tek fluorophore de dahil olmak üzere lekeli, negatif ve pozitif denetimleri akış sitometresi için gerekli olabilir. Teori, protokolleri, deneysel tasarım ve Apoptozis/nekroz akış sitometresi için geçişi kapsamlı bir incelemesini13başka bir yerde bulunabilir.

<table><tbody><tr><td>Keratinosit serum içermeyen ortam&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>17005042</td><td>SSC-13 hücreleri için kültür ortamı</td></tr><tr><td>DMEM düşük glikozlu glutamax</td><td>Thermofisher</td><td>10567022</td><td>Diğer hücre tipleri için olası kültür</td></tr><tr><td>ortamı 6 kuyucuklu kültür plakaları</td><td>Thermofisher</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermofisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>%0.25 Tripsin-EDTA</td><td>Thermofisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavi Çözelti, %0.4</td> <td>Thermofisher</td><td>15250061</td><td>Hücre sayımı ve kaplaması için&nbsp;</td></tr><tr><td>BLU-U ışık&nbsp;</td><td>DUSA</td><td>Üreticiden talep</td><td>Diğer mavi LED, floresan veya halojen lambalar kullanılabilir&nbsp;</td></tr><tr><td>5-ALA</td><td>DUSA</td><td>Üreticiden</td><td></td></tr><tr><td>talep FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>C17032</td><td></td></tr><tr><td>FlowCellect Annexin Red Kit</td><td>Millipore Sigma&nbsp;</td><td>FCCH100108&nbsp;</td><td>Propidyum iyodür 7-AAD'nin yerini alabilir. Annexin-V, 7-AAD ve akış tamponu</td></tr><tr><td>FACSCanto II</td><td>BD</td> ile birlikte gelir <td>Üreticiden talep</td><td>Herhangi bir akış sitometresi kullanılabilir&nbsp;</td></tr><tr><td>Sayma Odası</td><td>Hausser</td><td>3120</td><td>Hücre sayımı ve kaplaması için&nbsp;</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>Üreticiden talep</td><td>Akış sitometrisi analiz yazılımı</td></tr></tbody></table>

fotodinamik tedavi bir vitro yaklaşım

An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

Fotodinamik Tedavi (PDT) bir exogenously uygulanan photosensitizer (PS), hücre apoptosis ikna etmek için görünür ışık photoactivation tarafından takip kuluçka içerir tıbbi bir işlemdir. Federal İlaç İdaresi PDT aktinik keratoz tedavisinde onayladı ve belirli olmayan Melanom deri kanserlerinin ve akne vulgaris için bir tedavi olarak PDT klinik yönergeleri öneririz. Gibi düşük maliyetli, non-invaziv ve en az istenmeyen olaylar ile ilişkili ve korkutuyorsun PDT avantajlı bir tedavi yöntemi vardır. PDT ilk adımda bir PS uygulanan ve intracellularly birikmesine izin. Sonraki ışık ışınlama sonuçta hücre apoptosis, membran bozulma, mitokondrial hasar, bağışıklık modülasyonu, keratinosit yayılması ve kollajen ciro yol açabilecek reaktif oksijen türlerin oluşumu neden olmaktadır. Burada, biz bir yapisan hücre kültürünü PDT çalışmada vitro yöntemine mevcut. Bu tedavi protokolü PDT taklit etmek için tasarlanmıştır ve PDT kullanımı çeşitli hücre hatları, dezenfeksiyon, kuluçka sıcaklıklarda veya photoactivation dalga boyu ile eğitim için ayarlanabilir. Skuamöz Hücre Karsinomu Hücre 0, 0,5, 1,0 ve 2 mM 5-aminolevulinik asit (5-ALA) ile 30 dk ve photoactivated 417 nm mavi ışık için 1.000 ile inkübe s. Birincil sonuç apoptozis ve nekroz, annexin-V ve 7-aminoactinomycin D akış sitometresi tarafından ölçülen ölçüsüydü. 5-ala otuz dakikalık kuluçka takip hücre apoptosis bir doz bağımlı artış oldu Yüksek arası test geçerlilik elde etmek için tutarlı kuluçka ve ışık parametreleri vitro PDT deneyler yaparken sağlamak önemlidir. PDT yararlı bir klinik yordam ve vitro araştırmalar yeni PSs, iletişim kuralları ve PDT için yeni göstergeler duruma getirilmesi gelişimi için izin olduğunu.

SCC-13 sonra hücreler için 0, 0.5, 1 ve 2 mM 5-ALA 30 dk inkübe ve 1.000 ile ışınlanmış s mavi ışık, hücre apoptosis bir doz bağımlı artış oldu. Toplam apoptosis (ortalama ortalama ± standart hatası) yapıldı 3,94 ± 0.34, 7,90 ± 0,52, 23.86 ± 0,52 ve 38.33 ± 1,81, kuluçka 0, 0.5, 1 ve 2 mM 5-ALA, 30 dk sonra sırasıyla ve mavi 1000 saniye açık (Şekil 1). Apoptotik hücre 0, 0.5, 1 ve 2 mM 5-ALA ANOVA ile inkübe grupları arasında ortalama yüzde karşılaştırıldı. 1 ve 2 mM 5-ALA ile tedavi hücreleri hücre apoptosis 0 mM 5-ALA tedavi hücrelere kıyasla önemli bir artış var. Şekil 2A temsilcisi akış sitometrik yan dağılım (SSC) 0, 0.5, 1 ve 2 mM 5-ala ile inkübe SCC-13 hücreler için karşı ileri dağılım (FSC) geçişi gösterir Daire çoğunluğuna SCC-13 hücre nüfus içine alır. Bu deneme için 7500 olaylar toplanmıştır ve SCC-13 hücre nüfus kapısı olayları en az yüzde 90'ını ele geçirdi. Şekil 2B x ekseni ve y ekseni üzerinde annexin-V 7-AAD temsilcisi bir arsa gösterir. Hücre popülasyonlarının dört çeyrek daire geçişli (Q1 Q4 için) apoptotik hücreler ayırımcılık için. Q1 (yüksek annexin-v, düşük 7-AAD) temsil hücreleri erken apoptozis geçiyor. Q2 (yüksek annexin-v, yüksek 7-AAD) temsil hücreleri geç apoptosis veya nekroz geçiyor. Q3 (düşük annexin-v, yüksek 7-AAD) temsil hücre nekroz geçiyor. Q4 (düşük annexin-v, düşük 7-AAD) temsil hücreleri değil geçiren apoptosis veya nekroz. Apoptozis geçiren hücreleri yüzdesini hesaplamak için biz Q1 ve Q2 hücre yüzdesi ekledi. 5-ALA kuluçka dönem uzunluğu, inkübasyon sıcaklığı veya photoactivation ışınlama doz tutarsızlık PDT etkinliğini değiştirebilir. Şekil 3 gösterir bir temsilcisi annexin-V ve 7-AAD akış sitometrik Arsa inkübasyon sıcaklığı çeşitli zaman (Yani, 27, 36 veya 42 ° C). Apoptozis sıcaklık bağımlı artış oldu.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig1.jpg"> Şekil 1: 5-ala otuz dakikalık kuluçka sonra apoptosis artış doz bağımlı 5-ALA otuz dakika 1000 tarafından takip 36 ° C'de inkübe s SCC-13 hücrelerdeki mavi ışık. Çubuklar her tedavi ve kontrol grubu ortalama yüzde annexin-V pozitif hücreleri gösterir. Deneyler teknik nüsha gerçekleştirilmiştir. İstatistiksel anlamlılık p ile ANOVA, kararlı &lt; yıldız işareti (*) ile belirtilen 0,05. Hata çubukları ortalama ortalama ± standart hatasını temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58190/58190fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig2.jpg"> Şekil 2: temsilcisi Flow Cytometry arsalar. (A)temsilcisi ileri dağılım vs yan dağılım sitometresi araziler içinde rasgele birimleri (AU) için x - ve y - ekseni 0, 0.5, 1 ve 2 mM 5-ALA inkübe hücreler için. Bu deneme için 7500 olaylar toplanmıştır ve SCC-13 hücre nüfus kapısı olayların % 90'ı ele geçirdi. (B) temsilcisi annexin-V vs 7-AAD akış sitometresi AU için x - ve y - ekseni 0, 0.5, 1 ve 2 mM 5-ALA inkübe hücreler için çizer. S1: erken apoptotik hücreler, Q2: geç apoptotik/nekrotik hücre, Q3: nekrotik hücre ve Q4: hücrelerin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58190/58190fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig3.jpg"> Şekil 3: 5-ALA farklı sıcaklıklarda kuluçka PDT etkinliği değiştirmek. 7-AAD akış sitometresi temsilcisi annexin-V vs AU için x - ve y - ekseni 0,5 mM 5-ALA 27, 36 ve 42 ° c ile inkübe SCC-13 hücreler için arsalar S1: erken apoptotik hücreler, Q2: geç apoptotik/nekrotik hücre, Q3: nekrotik hücre ve Q4: hücrelerin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58190/58190fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Fotodinamik Tedavi (PDT) apoptosis ikna etmek için görünür ışık photoactivation tarafından izlenen bir exogenously uygulanan photosensitizer (PS) kuluçka içerir tıbbi bir işlemdir. Biz PS kuluçka ve ışık tedavisi parametreleri farklılıklar çalışmaya kullanılabilir PDT benzetimini yapmak için tasarlanmış bir vitro PDT iletişim kuralı mevcut.

Fotodinamik Tedavi bir Vitro yaklaşım

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light ...

Bu yöntem, PDT olarak da bilinen fotodinamik terapi ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu yöntem kullanılarak cevaplanabilecek sorular arasında bir ışığa duyarlılaştırıcının inkübasyon süresi veya deneyde hücreleri ısıtarak veya soğutarak sıcaklığın değiştirilmesi gibi farklı parametrelerin kullanılması yer alır. Bu teknik, PDT için yeni ışığa duyarlılaştırıcıların, protokollerin ve endikasyonların in vitro geliştirilmesini kolaylaştırmaya yardımcı olabilir.37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 24 saatlik bir inkübasyon için steril teknik kullanarak altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna iki mililitre kültür ortamında iki kez 10 ila dördüncü hücre kaplayarak başlayın. Ertesi gün, hücreleri en az iki mililitre PBS ile yıkayın ve kültürleri sıfır, sıfır nokta beş, bir veya iki milimetre taze hazırlanmış 5-ALA seyreltmeleri ile muamele edin. Ardından plakayı ışıktan koruyarak 30 dakika boyunca 36-37 santigrat derecelik bir ısıtma bloğuna yerleştirin.Prosedür sırasında, inkübasyon aşamasında, araştırmacıların inkübasyon süresi boyunca tutarlı bir sıcaklık elde etmek için bir ısıtma bloğu kullanmalarını öneririz. Ek olarak, ışığa duyarlılaştırıcının earl aktivasyonunu önlemek için inkübasyon süresi boyunca hücrelerin alüminyum folyo ile kaplanmasını öneririz. İnkübasyonun sonunda, her bir kuyucuktaki hücreleri iki mililitre PBS ile yıkayın.Ve mavi ışık ışınlaması için kültürleri iki mililitre taze kültür ortamı ile yenileyin. Hücreleri ışınlamadan önce, mavi ışık cihazını 1.000 saniyelik bir döngü için 417 nanometre çıkış dalga boyunda ısıtın ve hücre yüzeyindeki ışınımı ölçmek için bir fotometre kullanın, uygun ışınımı elde etmek için ışığın mesafesini ayarlayın. Daha sonra 5-ALA ile muamele edilmiş hücreleri, santimetre kare başına toplam 10 jul akıcılık için 1.000 saniye boyunca mavi ışık altında siyah bir yüzeye yerleştirin.Foto aktivasyon sırasında, ışık yansımasını ve tutarsız dozlamayı önlemek için hücreleri siyah bir yüzeye yerleştirmenizi öneririz. Fototerapi tedavisinin sonunda, her bir oyuktaki hücreleri iki mililitre PBS ile yıkayın ve hücreleri kuyucuk başına bir mililitre% 0.25 tripsin-EDTA ile ayırın. Üç ila beş dakika sonra, ayırmayı onaylayın ve% 10 FBS ve PBS ile tripsini devre dışı bırakın.Hücreleri her bir kuyucuktan ayrı ayrı beş mililitrelik akış tüplerine aktarın ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Her numuneye konjuge annexin-V antikoru içeren 200 mikrolitre akış tamponu ekleyin. Hücreleri yeniden askıya alın ve ekin-V bağlanmasına izin vermek için tüpleri 20 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin.İnkübasyonun sonunda, her numuneye üç mikrolitre 7-AAD ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca tekrar inkübe edin, ardından standart akış sitometrik analiz protokollerine göre yapılan bir numune analizi yapın. Beş ALA ve mavi ışık fototerapi tedavisinden sonra, hücre apoptozunda doza bağlı bir artış gözlenir. Apoptoz geçiren hücrelerin yüzdesini hesaplamak için, annexin-V yüksek, 7-AAD düşük ve annexin-V yüksek, 7-AAD yüksek kadranlardaki hücrelerin yüzdesi eklenir.Beş ALA inkübasyon süresi uzunluğu, inkübasyon sıcaklığı veya fotoaktivasyon ışınlama dozundaki tutarsızlıklar, fototerapi etkinliğini değiştirebilir ve örneğin apoptozda sıcaklığa bağlı bir artışa neden olabilir. Bu prosedürü takiben, PDT'nin gen ekspresyonunu ve protein aktivitesini nasıl değiştirdiğini belirlemek için RTQPCR ve western blot gibi diğer teknikler uygulanabilir. Bu yöntem, fotodinamik terapi ile ilgilenen araştırmacıların cilt kanseri hücreleri ve diğer cilt hastalıkları üzerindeki etkilerini in vitro olarak keşfetmelerini sağlar.

an-in-vitro-approach-to-photodynamic-therapy

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Fotodinamik tedavi (PDT), akciğer kanseri tedavisi için non-invaziv ve cerrahi olmayan bir yöntemdir. Işığa duyarlılaştırıcılar seçici olarak tümör dokusunda birikir ve oksijen ve uygun dalga boyundaki ışığın varlığında tümör hücresi ölümüne yol açar. Bu protokol videosunda, akciğer kanseri hücrelerinde potansiyel bir ışığa duyarlılaştırıcının fototoksik potansiyelini değerlendirmek için PDT tabanlı yöntem kullanılmıştır.

İn Vitro Fototoksisite Deneyi: Akciğer Kanseri Hücrelerinde Bir Fotosensitizörün Fototoksik Potansiyelini Değerlendirmek için PDT Tabanlı Bir Yöntem

Bu video, yakın kızılötesi fotoimmünoterapi yoluyla karışık bir 3D hücre kültüründen belirli hücrelerin seçici olarak çıkarılması için bir tekniği göstermektedir. Bu yöntemde, hedeflenen hücreler, bir NIR fotoemici ile konjuge edilmiş bir antikor kullanılarak doğru bir şekilde tanımlanır. Kızılötesi ışıkla müteakip ışınlama, hücre ölümünü indükleyerek hedeflenen hücreleri 3D kültürden etkili bir şekilde ortadan kaldırır.

Karışık 3D Kültürlerde Hedeflenen Hücre Eliminasyonu için Yakın Kızılötesi Fotoimmünoterapi

Burada bildirilen protokol sağlar: fotodinamik hücre hatlarında tedavi (PDT) ve hayvan modellerinde tedavi uygulamadan önce PDT ayarlarının optimizasyonu etkinliğinin değerlendirilmesi.

Osteosarkom Hücrelerde Fotodinamik Tedavi sitotoksik etkinliği<em&gt; In Vitro</em

Bu protokol, fulleren ile harmanlanmış iletken polimer nanopartiküllerin üretimi için bir yöntemi tanımlar. Bu nanopartiküller, Fotodinamik Terapi (PDT) için yeni nesil ışığa duyarlılaştırıcılar olarak potansiyel kullanımları açısından araştırıldı.

Karma Polimer / Fulleren Nanopartikül photosensitizers Şefliği ile Fotodinamik Tedavi

Belirli hücreleri diğer hücrelere zarar vermeden ortadan kaldırmak, özellikle kurulu dokularda son derece zordur, ancak doku mühendisliği alanında acil bir hücre eliminasyon yöntemine ihtiyaç vardır. Burada, yakın kızılötesi fotoimmünoterapi (NIR-PIT) kullanarak karışık bir 3D hücre kültüründen spesifik hücre eliminasyonu için bir yöntem sunuyoruz.

Bir Yakın Kızılötesi Photoimmunotherapy Tekniği Karışık 3D Kültür seçici hücre Eliminasyon

Yakın kızılötesi fotoimmünoterapi (NIR-PIT), kanser hücrelerini yok etmek için antikor-fotoabsorber (IR700Dye) konjuge ve NIR ışığı kullanan gelişmekte olan bir kanser terapötik stratejisidir. Burada, nir-PIT'in antitümör etkisini biyolüminesans görüntüleme kullanarak plevral yaygın akciğer kanseri ve malign plevral mezotelioma fare modelinde değerlendirmek için bir yöntem sunuyoruz.

Plevral Yayılım Fare Modelleri için Yakın Kızılötesi Fotoimmünoterapi

Burada, iki boyutlu HeLa hücre kültürü ve verteporfin kullanarak in vitro fotodinamik terapi (PDT) testlerini başarılı bir şekilde gerçekleştirmek için yeni, basit ve düşük maliyetli bir cihazı fotosensitizör olarak tanımladık.

2D Hücre Kültürü Modelinde Verteporfin Sitotoksisitesini Arttırmak için Şirket İçi İnşa Edilmiş ve Işık Yayan Diyot Tabanlı Fotodinamik Terapi Cihazı

Bu protokol, bu tür bileşiklerin klinik öncesi taramasında kullanılabilecek fotoanahtarlanabilir antikanser peptitlerinin değerlendirilmesi için benimsenen bir dizi deney sunmaktadır. Bu, 2D ve 3D hücre kültürlerinde sitotoksisite değerlendirmesini, ex vivo (model doku) fotoizomerizasyon etkinliğinin değerlendirilmesini ve in vivo etkinliği içerir.

Fotokontrollü Biyolojik Olarak Aktif Bileşiklerin İn Vitro ve İn Vito Değerlendirilmesi - Kanser Fotofarmakolojisi için Potansiyel İlaç Adayları

Bu protokol, bir LED panel ışık kaynağı ile birleştirilmiş 96 oyuklu bir plaka formatı kullanarak, antibakteriyel fotodinamik inaktivasyonda (aPDI) potansiyel ışığa duyarlılaştırıcıların etkinliğini değerlendirmek için basit ve ekonomik bir yöntemi açıklar. Bu yaklaşım, farklı konsantrasyonlar, bileşikler ve bakteri suşları dahil olmak üzere birden fazla deneysel koşulun aynı anda test edilmesini sağlar.

Bakteriyel Fotodinamik İnaktivasyonda Fotoaktif Moleküllerin Değerlendirilmesi için LED Tabanlı İn Vitro Tarama

Bu el yazması, Rose Bengal aracılı fotodinamik terapiyi in vitro incelemek için yeni, yenilikçi bir 3D baskılı aydınlatma cihazı sunmaktadır.

Rose Bengal ile Fotodinamik Terapinin İn Vitro Uygulanması için Yenilikçi LED Tabanlı Aydınlatma Cihazının Geliştirilmesi

Öğrenin fotodinamik tedavi protokolünü in vitro cilt kanseri araştırmaları için hücre apoptozisi üzerindeki etkileri incelemek amacıyla. Bu yöntem yeni tedavi stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

Fotodinamik Tedavi bir Vitro yaklaşım

Daha fazla video keşfet