Düşük yoğunluklu nötrofil tarafından oluşturulan nötrofil hücre dışı tuzakları Peritoneal lavaj sıvı aracılık tümör hücre büyümesini ve eki elde

Bu yöntem, tümör immünolojisinde nötrofil alt popülasyonlarının rolü hakkında, özellikle tümör metastazında nötrofil hücre dışı tuzakların veya NET'lerin mekanik rolü hakkında önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, tümör hücrelerinin sağlam NET'lerle olan adeziv etkileşimlerinin görüntülenmesine olanak sağlamasıdır. Bu tekniğin etkileri kanser tedavisine kadar uzanır.

Spesifik nötrofil alt kümelerinden türetilen NET'ler tümör metastazı teşvik edebilir. Prosedürü göstermek laboratuvarımızdan Junko Shoniohara olacak. Nötrofilleri elde etmek için, önce yara kapanmadan hemen önce bir litre normal steril salini doğrudan gastrointestinal malignite nedeniyle karın ameliyatı geçirmiş bir hastanın karın boşluğuna infüze edin ve karın boşluğunu en az bir dakika boyunca yoğun bir şekilde lavaj yapın.

Daha sonra tuzlu suyu boşluk içinde karıştırın ve dört adet 50 mililitrelik şırınga ile 200 mililitre lavajlı sıvıyı geri kazanın. Laboratuvarda, periton lavaj sıvısını 100 mikrometrelik bir naylon filtreden santrifüjleme için ayrı ayrı 50 mililitrelik tüplere aktarın. Peletleri% 0.02 EDTA ile desteklenmiş 5 mililitre PBS içinde yeniden süspanse edin ve her hücre süspansiyonunu üç mililitre yoğunluk gradyan çözeltisi üzerine dikkatlice yerleştirin.

Yoğunluk gradyanı ayrılmasından sonra, her tüpten iki ila üç mililitre ara tabaka hasat edin ve periton sıvısı örneklerini tüp başına 10 mililitre taze PBS artı EDTA ile yıkayın. Ek bir yıkama için peletleri 10 mililitre taze PBS artı EDTA'da toplayın ve hücreleri, 60 mikrolitre manyetik aktif hücre sıralama veya MACS, tampon konsantrasyonu başına bir kez 10 ila yedinci hücreye seyreltin. Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 20 mikrolitre Fc bloğu ile spesifik olmayan herhangi bir bağlanmayı bloke edin ve ardından 20 mikrolitre anti-CD66b manyetik boncuk ekleyin.

Dört santigrat derecede 10 dakika sonra, hücreleri 500 mikrolitre MACS tamponunda yıkayın ve yeniden süspanse edin ve hücreleri uygun bir manyetik ayırıcının manyetik alanı içinde uygun boyutta bir manyetik sütuna ekleyin. Tüm CD66b negatif hücreleri kolondan geçtiğinde, kolon rezervuarına 15 mililitre taze MACS tamponu ekleyin ve kolonu, manyetik ayırıcıdan yeni bir konik tüpe aktarın. Ardından, manyetik olarak etiketlenmiş CD66b pozitifini tüpe akıtmak için sütunu hemen daldırın.

Santrifüjlemeden sonra, izole edilmiş düşük yoğunluklu nötrofilleri, FBS konsantrasyonu ile desteklenmiş RPMI1640 ortamın mililitresi başına beş kez 10 ila altıncı hücrede yeniden askıya alın ve altı kuyulu poli-L-lizin kaplı plaka üzerinde oyuk başına 1 mililitre nötrofil tohumlayın. İki saat sonra, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte, her bir oyuktaki hücreleri, üreticinin talimatlarına göre uygun bir floresan membran, geçirimsiz nükleer ve kromozomal boya ile boyayın ve hemen floresan mikroskobu ile NET'lerin morfolojisini gözlemleyin. Tümör hücresinin NET'lere yapışmasını değerlendirmek için RPMI1640,% 0.1 sığır serum albümin konsantrasyonu ile desteklenmiş, mililitre başına 10 ila altıda bir kez 10 ila altıda bir kez kontrast floresan boya ile boyanmış mide tümörü hücrelerini yeniden askıya alın ve düşük yoğunluklu nötrofil kültürlerinin her bir oyuğuna bir mililitre tümör hücresi ekleyin.

37 santigrat derecede beş dakika sonra, süpernatanı her bir oyuktan çıkarın ve hücreleri, yıkama başına BSA ile desteklenmiş 2 mililitre önceden ısıtılmış RPMI1640 ortamı ile iki kez nazikçe yıkayın. Beş dakikalık bir inkübasyon, NET'e özgü bağlamayı algılamak için yeterince uzundur. Isıtılmış ortamı her bir kuyucuğun yan tarafına ekleyin, plakayı yavaşça hafifçe döndürün ve süpernatanı bir aspiratör ile çıkarın.

NET'ler ve bağlı tümör hücreleri daha sonra floresan mikroskobu ile gözlemlenebilir. Sıkışan tümör hücrelerinin hızlandırılmış video analizi için, peritoneal düşük yoğunluklu nötrofilleri 35 milimetrelik bir tabakta, poli-L-lizin kaplı bir tabakta kültürleyin ve boyayın, ardından gösterildiği gibi iki mililitre% 0.1 BSA artı RPMI1640'de kısa bir yıkama yapın. Ortamı, oda sıcaklığında beş dakikalık bir inkübasyon için BSA ile desteklenmiş iki mililitre RPMI içinde süspanse edilen bir kez 10 ila altıncı boyanmamış mide tümörü hücresi ile değiştirin.

İnkübasyonun sonunda, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca BSA ile desteklenmiş iki mililitre taze RPMI içinde durulayın, ardından bağlanmamış tümör hücrelerini çıkarmak için hafifçe döndürün. Daha sonra süpernatanı FBS ve antibiyotiklerle takviye edilmiş DMEM ile değiştirin ve NET'ler tarafından tümör hücresi sıkışmasının hızlandırılmış analizi için çanağı tam bir görünüm hücresi gözlem sistemine monte edin. İki saatlik kültürden sonra, periton lavaj sıvısından türetilen CD66b pozitif, düşük yoğunluklu nötrofiller, yeşil floresan, nükleer ve kromozomal boyama ile sicim yapıları sergilerken, CD66b negatif mononükleer hücreler göstermez.

Bununla birlikte, düşük yoğunluklu nötrofil kültürleri, mililitre DNAse I başına 100 birim ile ön işleme tabi tutulduğunda, karakteristik yapılar yok edilir, bu da yapıların nötrofillerden atılan hücre dışı DNA'dan oluştuğunu gösterir. Düşük yoğunluklu nötrofiller kaplanmamış plastik plakalar üzerinde kültürlendiğinde, tabağın dibine bağlı birkaç NET ile ortam içinde yüzen birçok NET kümesi gözlemlenebilir. Floresan olarak işaretlenmiş bir mide tümörü hücre hattı ile beş dakikalık inkübasyondan sonra, birçok tümör hücresi NET'ler içindeki nötrofillere bağlanır, bu durum DNAse I ile ön tedaviden sonra gözlenmeyen bir fenomendir.

OKUM-1 ve NUGC-4. İlginç bir şekilde, NET'ler uzun süreli tümör hücresi ko-kültüründen birkaç saat sonra yavaş yavaş kaybolurken, NET'ler tarafından yakalanan tümör hücreleri, NET salınımından sonra güçlü bir şekilde çoğalmaya başlar. Bu prosedür sırasında, NET'ler plakaya zayıf bir şekilde yapıştığından, yıkama ve bulaşık transfer işlemlerinin özellikle dikkatli bir şekilde yapılması gerektiğini unutmamak önemlidir.

Geliştirilmesinden sonra bu teknik, biyomedikal biliminin çeşitli alanlarındaki araştırmacıların, NET'lerin tromboz, sistemik inflamatuar yanıt sendromu ve otoimmün hastalıklar gibi çeşitli hastalıklarla nedensel ilişkisini keşfetmelerinin yolunu açmaktadır.