Name: Düşük yoğunluklu nötrofil tarafından oluşturulan nötrofil hücre dışı tuzakları Peritoneal lavaj sıvı aracılık tümör hücre büyümesini ve eki elde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Keşfedin düşük yoğunluklu nötrofillerin tümör hücrelerini yakalayan hücre dışı tuzaklarını. Bu yöntem, peritoneal lavaj sıvısından LDN izolasyonu yaparak tümör metastazındaki rolü görselleştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bayan J. Shinohara ve ı. Nieda teknik ve idari personel çalışma için teşekkür ederiz. Ayrıca, biz Drs. Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina ve Kazuya Takahashi ameliyathane örnek edinme için işbirliği için teşekkür ederiz. Bu eser bir Grant-in-Aid tarafından Milli Eğitim Bakanlığı, bilim, spor ve kültür Japonya ve Japonya Derneği bilimsel araştırma bilim promosyon (17 K 10606) için destek verdi.

LDN Bu çalışmada kayıtlı hastalardan elde edilmiştir ve kurumsal İnceleme Kurulu, Jichi tıbbi üniversite tarafından kabul edildi.
1. yalıtım LDN karın boşluğu Lavages ve NET algılama
<ol><li>Örnek alma<ol>
<li>1000 mL normal steril serum doğrudan gastrointestinal malignite nedeniyle karın ameliyatı geçiren hastalarda yara kapatma önce karın boşluğu içine süzülür. Not: Örnekleri gastrektomi, kolektomi veya yaşında yaş veya cinsiyet dayalı önyargı olmadan yapılan hastalarda elde edilmiştir. Serum fizyolojik bir konteyner içine transfer ve bir dakika içinde tüm karın dökülür. Bu rutin bir ameliyat sonrası periton yıkama hasta üzerinde önemli etkisi olmadan olarak gerçekleştirilir.</li>
		<li>Lavaj en az 1 dk. için kapsamlı bir şekilde karın boşluğu. Not: Bu örnekleri tek tip olması infüzyon sıvı yavaş yavaş cerrahın elleri ile karıştırılır tavsiye edilir.</li>
		<li>Lavaj sıvı dört 50 mL şırınga ile 200 mL kurtarmak. Not: Bazen bir lastik bağlayıcı sıvılar çekmek için kullanılır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Arıtma periton LDN granülosit belirli mAb, CD66b16kullanarak gerçekleştirin. Not: yoğunluk gradient Santrifüjü sonra ara katman birçok mononükleer hücreler içerdiğinden, polimorf nötrofil CD66b mAb kullanma olumlu seçimi gerçekleştirildi.<ol>
<li>Peritoneal lavaj sıvı bir 50 mL tüp aktarın. Not: Bu adımda, sıvılar kirleri çıkarmak için bir 100 µm naylon filtreden geçmek.</li>
		<li>270 x g 7 dk RT. az için peritoneal sıvı santrifüj kapasitesi</li>
		<li>Granül PBS %0.02 EDTA ile 5 ml resuspend.</li>
		<li>Dikkatli bir şekilde hücre süspansiyon 3 mL yoğunluk gradient çözüm üzerinde 5 mL yerleşimi.</li>
		<li>1.700 x g RT, 15dk sınırlarında olmadan için santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Bir pipet kullanarak ara Katmanlar (Şekil 1A) içeren çözüm ~ 2-3 mL hasat ve PBS %0.02 EDTA ile 10 mL ile karıştırın.</li>
		<li>RT, 7 dk 400 x g, peritoneal sıvı santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
		<li>PBS %0.02 EDTA ve santrifüj ile başka bir 10 mL 270 x g RT. atma süpernatant 7 dakika için ekleyin.</li>
		<li>Hücre Pelet (1 x 107) arabelleği için manyetik hücre ayrılık teçhizat 60 µL geçiyoruz.</li>
		<li>Fc blok 20 µL için granül ekleyin ve 4 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya</li>
		<li>Anti-CD66b 20 µL lastikteki ile Birleşik ve ek bir 10 min 4 ° C'de için kuluçkaya ekleyin</li>
		<li>Yıkama ve granül MAC'ler arabellek 500 µL içinde yeniden askıya alma.</li>
		<li>Hücre süspansiyon uygun manyetik ayırıcı manyetik alan manyetik bir sütun için geçerli ve sütun arabellek 15 mL ile yıkayarak akışı aracılığıyla içeren CD66b(-) hücreleri toplamak.</li>
		<li>Sütun manyetik ayırıcıyı kaldırmak ve hemen sıkıca sütuna pistonu iterek manyetik olarak etiketli CD66b(+) hücreleri floş. Not: CD66b(+) hücre nüfus çoğunlukla nötrofil gösteren FACS analiz tarafından belirlenen oluşur > CD66(+) kesir % 95'i CD11b, CD15 ve CD16 olumlu ama CD14 için negatif.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nesil ağlar<ol>
<li>270 x g RT, 7 dk de aralıklarla sonra izole LDN yeniden askıya alma (5 x 106) RPMI1640% 10 FCS ile 1 ml.</li>
		<li>LDN tabakta 6-şey poli-L-lizin kaplı (6 cm çapında) %5 CO237 ˚C 2 h için kültür.</li>
		<li>Yeşil flüoresan counterstain (çekirdek ve kromozomlar leke geçirmez membran bir boya) 5 mikron son konsantrasyonu ekleyin.</li>
		<li>Hemen ağlar (LDN floresans mikroskobu altında ihraç ekstraselüler DNA bileşenleri) morfoloji gözlemlemek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. tümör hücreleri kırmızı floresan hücre bağlayıcı boya boyama
<ol><li>İnsan kanser hücre hatları MKN45, NUGC ve OCUM-1 hazırlayın.</li>
	<li>1 x 107 hücreleri PBS + 15 mL tüp ve 270 x g, santrifüj RT. 7 min için %0,02 EDTA ile yıkayın</li>
	<li>Çözüm için granül boyama boya için 1 mL ekleyin ve hafifçe pipet.</li>
	<li>Kırmızı floresan hücre bağlayıcı boya boyama için çözüm 1 ml 4 µL dağıtılması ve hücre süspansiyon adım 2.2 ile karıştırın.</li>
	<li>Granül RT., 4 dk için kuluçkaya</li>
	<li>DMEM 4 mL ekleyin (% 10 FBS) boyama reaksiyonu durdurmak için.</li>
	<li>270 x g 7 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
	<li>2.6 ve 2.7 adımları iki kez tekrarlayın.</li>
	<li>Kontrol floresan mikroskop (uyarma 551 = nm, yayan 567 = nm) tümör hücreleri kırmızı lekeli.</li>
</ol>3. tümör hücre adezyon Nets Analizi
<ol><li>RPMI % 0.1 BSA ile desteklenmiş 1640 1 ml kırmızı floresan lekeli tümör hücreleri (1 x 106) yeniden askıya alma.</li>
	<li>1.3. adımda açıklandığı gibi ağlar üretilen LDN kültür tümör hücreleri ekleyin.</li>
	<li>NETs başvurmanız tümör hücreleri sağlar 37 ˚C, 5 min için kuluçkaya. Not: Uzun bir kuluçka tümör hücre adezyon LDN veya plakaları neden olmaktadır.</li>
	<li>Orta kaldır ve yavaşça kuyuları prewarmed medya (% 0,1 BSA + RPMI 1640) 2 mL ekleme ve çanak dönen yıkayın.</li>
	<li>Adım 3.4 çamaşır yordamda iki kez tekrarlayın. Not: Beri ağları zayıf plakasına eklemek, çamaşır temizleme ağlarının kendilerini önlemek için mümkün olduğunca yavaşça yapılmalıdır.</li>
	<li>Çekirdeği ve kromozom 5 µg/mL NETs görselleştirme için son bir konsantrasyon, boyama için yeşil flüoresan boya ekleyin.</li>
	<li>NETs gözlemlemek ve tümör hücreleri uygun filtreleri kullanarak bağlı (yeşil, uyarma 504 = nm, yayan 523 = nm; kırmızı, uyarma 551 = nm, yayan 567 = nm).</li>
	<li>Ağlar tarafından tuzağa tümör hücreleri göstermek için rakamlar birleştirme. Not: Bazı deneylerde DNA bozulması enzim 5 dk önce 5 min için ortak kuluçka LDN Kültür (son konsantrasyon 100 U/mL) eklenmiştir.</li>
</ol>4. zaman atlamalı Video analiz kapana kısılmış tümör hücrelerinin
<ol><li>Kültür bir 35 mm periton LDN çanak poli-L-lizin 1.3 adımda anlatıldığı gibi ile kaplı yuvarlak.</li>
	<li>Çekirdeği ve kromozomlar 1.3 adımda anlatıldığı gibi ağlar görselleştirmek için boyama için yeşil flüoresan boya ekleyin.</li>
	<li>1 dk, kuluçka sonra medyayı çıkarın ve 2 mL % 0,1 BSA + RPMI 1640 ekleyin.</li>
	<li>Medyayı çıkarın ve günahı 1 x 106 MKN45 hücreleri % 0,1 askıya BSA + RPMI 1640 ekleyin. Dik, 5 min için kuluçkaya</li>
	<li>3.4. adımda açıklandığı gibi yavaşça yıkayarak herhangi bir bekâr tümör hücreleri kaldırın ve DMEM 100 u/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ile % 10 FCS ile ekleyin.</li>
	<li>Kültür çanak bir bütün-görünümü hücresi gözlem sistemi monte ve hangi tümör hücreleri ağlar tarafından tuzak vardır uygun alanı seçin.</li>
	<li>Bir ek 2 gün ortak kültür ve her 6 dk normal ışık ve MKN45 hücreleri ve ağlar, sırasıyla algılar floresans altında alanın sürekli fotoğraf çekmek devam edin.</li>
	<li>Görüntüleri her timepoint, üst üste ve hızlandırılmış videoları Image Viewer yazılımı kullanarak oluşturur.</li>
</ol>

<ol><li>Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+neutrophils+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%2C+rheumatoid+arthritis%2C+and+acute+rheumatic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever.</a> Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).</li>
<li>Denny, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+subset+of+proinflammatory+neutrophils+isolated+from+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+induces+vascular+damage+and+synthesizes+type+I+IFNs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs.</a> The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).</li>
<li>Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increase+of+low+density+subpopulations+and+CD10+%28CALLA%29+negative+neutrophils+in+severely+infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery+Today%22%5BJournal%5D)">The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients.</a> Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).</li>
<li>Schmielau, J., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+granulocytes+and+granulocyte-derived+hydrogen+peroxide+are+the+underlying+mechanism+of+suppression+of+t-cell+function+in+advanced+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients.</a> Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).</li>
<li>Brandau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+in+the+peripheral+blood+of+cancer+patients+contain+a+subset+of+immature+neutrophils+with+impaired+migratory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties.</a> Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).</li>
<li>Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+granulocytes%3A+a+distinct+class+of+neutrophils+in+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity.</a> Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).</li>
<li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage%2C+infiltrate+tissues%2C+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Demers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancers+predispose+neutrophils+to+release+extracellular+DNA+traps+that+contribute+to+cancer-associated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).</li>
<li>Cools-Lartigue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+and+promote+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2013).</li>
<li>Tohme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Promote+the+Development+and+Progression+of+Liver+Metastases+after+Surgical+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress.</a> Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).</li>
<li>Monti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-dependent+cell+adhesion+to+neutrophil+extracellular+traps+through+engagement+of+fibronectin+in+neutrophil-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+One%22%5BJournal%5D)">Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells.</a> Public Library of Science One. 12 (2), e0171362(2017).</li>
<li>Najmeh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+via+beta1-integrin+mediated+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions.</a> International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).</li>
<li>Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+Human+Neutrophil+Extracellular+Traps+%28NETs%29+Isolation+and+Handling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).</li>
<li>Kanamaru, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+neutrophils+%28LDN%29+in+postoperative+abdominal+cavity+assist+the+peritoneal+recurrence+through+the+production+of+neutrophil+extracellular+traps+%28NETs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs).</a> Scientific Reports. 8 (1), 632(2018).</li>
<li>Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+transgenic+for+the+human+CGM6+gene+express+its+product%2C+the+granulocyte+marker+CD66b%2C+exclusively+in+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes.</a> Blood. 91 (2), 663-672 (1998).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+induce+metastasis-supporting+neutrophil+extracellular+DNA+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps.</a> Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138(2016).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Önceki çalışmalarda tümör hücreleri dolaşan NET yüzeylerde vivo içinde10,11tarafından kapana olduğunu bildirdi. Metastatik meme kanseri hücrelerinin nötrofil uyarmak ve hangi tümör hücre büyümesini hedef organ17yardımcı olur ağlar, oluşumu teşvik gösterilmiştir. Buna ek olarak, biz kısa vadeli kültürleri LDN ameliyat sonrası lavaj sıvı üzerinden verimli bir şekilde tümör hücreleri daha fazla stimülasyon15ol...

Polimorf nükleer nötrofiller kan dolaşan içinde genelde yoğunluk gradient hazırlama yöntemi mononükleer hücreler ayrılır. Ancak, bazı nötrofil düşük yoğunluklu nötrofil (LDN), CD11b(+), CD15(+), CD16(+) ve CD14(-) fenotipleri ile bilinen mononükleer hücreler ile birlikte saf. LDN göreli sayısı otoimmün hastalıklar1,2, sepsis3ve kanser4,5de dahil olmak üzere çeşitli patolojik koşullarında önemli ölçüde artırır. Önceki çalışmalarda LDN nötrofil6phenotypically ve işlevsel olarak ayrı bir sınıf olduğunu göstermiştir. Bu unutulmamalıdır ki kan dolaşan içinde LDN nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar) normal yoğunluk nötrofil2,7' den üretmek olasılığı vardır. Ağlar nükleik asitler, histon, proteaz ve taneli ve sitozolik protein oluşan web benzeri yapılar, ve verimli bir şekilde tuzağa ve patojenler8yok.
Son zamanlarda, NETs sadece mikroplar, ama aynı zamanda trombosit ve dolaşan trombus olgusu oluşumu9 ve tümör Metastazlari10,11' yardımcı olabilir tümör hücreleri yakalamak için gösterilmiştir. Ancak, ağlar ve trombosit veya tümör hücreleri arasındaki yapışkan etkileşimler arkasında moleküler mekanizmaları hala pek açık değildir. Son zamanlarda, bir vitro yapışma tahlil myeloid lösemi hücreleri (K56212) ve Akciğer Karsinomu Hücre (A54913) ağlar için β1 ve β3 integrinler yolu ile atamanız da ortaya koydu. Yazarlar nötrofil izole ve phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) olarak yapışma substrat14tarafından aktive NET stok kullanılır. Bu tahlil NET bileşenleri ile gerçek etkileşim tespiti nötrofil yokluğunda sağlar, "hücre-ücretsiz NET hisse senedi" ile yüksek hızlı Santrifüjü izole moleküler yapısı içinde üretilen Nets aynı olup olmadığı korur tartışılabilir olsa da Vivo. Son zamanlarda, sonra karın ameliyatı büyük ağlar oluşturulan ve periton Metastazlari15neden tümör hücrelere bağlı olan birçok olgun LDN bulunan peritoneal lavaj sıvıyı bulduk. Bu çalışmada, başarılı bir şekilde herhangi bir fiziksel manipülasyon olmadan sağlam Nets tümör hücrelerinin yapışma inceledi. İşte, ağlar ve ücretsiz tümör hücreleri arasındaki yapışkan etkileşimler algılamak için bir teknik ayrıntılarını göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare, İSVEÇ</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>StraightFrom&trade; Tam Kan CD66b MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Almanya</td><td>130-104-913</td><td></td></tr><tr><td>Fc blok</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Almanya</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>MACS Durulama Solüsyonu</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Almanya</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Stok Çözümü</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Almanya</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>LS Sütunları</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Almanya</td><td>130-041-306</td><td></td></tr><tr><td>MACS Manyetik Ayırıcı</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Almanya</td><td>130-042-501</td><td></td></tr><tr>DMSO <td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,</td><td>ABD'de SYTOX yeşil nükleik asit lekesi 5mM çözeltisi</td> Genel Hücre Zarı Etiketleme için <td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 Kırmızı Floresan Hücre Bağlayıcı Kiti</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ABD</td><td>P9691</td><td></td></tr><tr><td>Seyreltici C</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ABD</td><td>CGLDIL</td><td></td></tr> RPMI1640 <tr><td>Orta</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ABD</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Eagle Orta-yüksek glikoz (DMEM)</td> <td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ABD</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Salin (DPBS)</td> <td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ABD</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.5mol / l-EDTA Çözeltisi (pH 8.0)</td> <td>nacalai tesque, Japonya</td><td>06894-14</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu, nitelikli, USDA onaylı bölgeler</td><td>gibco by life technologies, Meksika</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin liyofilize toz, & % 96 (agaroz jel elektroforezi)</td> <td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ABD</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin</td><td>Yaşam Teknolojileri Japonya</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Plazmosin Profilaktik</td><td>InvivoGen, San Diego, CA-ABD</td><td>ant-mpp</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington, Lakewood NJ)</td><td>LS002138</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lizin Kaplı MİKROPLAKA 6Well</td><td>IWAKI, Japonya</td><td>4810-040</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lizin Kaplı MİKROPLAKA 24Well</td><td>IWAKI, Japonya</td><td>4820-040</td><td></td></tr><tr><td>floresein stereomikroskop</td><td>BX8000, Keyence, Osaka Japonya</td><td>BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>Tam görünüm hücresi gözlem sistemi</td><td>Nikon, Kanagawa, Japonya</td><td>BioStudio (BS-M10)</td><td></td></tr><tr><td>MKN45 insan mide kanseri hücre hattı</td><td>Riken, Tukuba Japonya</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NUGC-4 insan mide kanseri hücre hattı</td><td>Riken, Tukuba Japonya</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>OCUM-1 insan mide kanseri hücre hattı</td><td>Osaka City Üniversitesi, Japonya</td><td>N/A</td><td>Dr. M.Yashiro'dan Hediye</td></tr></tbody></table>

düşük yoğunluklu nötrofil tarafından oluşturulan nötrofil hücre dışı tuzakları peritoneal lavaj sıvı aracılık tümör hücre büyümesini ve eki elde

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Hangi yakalayabilir ve mikroplar yok nötrofil yayın nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar), aktif. Son yıllarda yapılan çalışmalarda NETs, otoimmün hastalığı, kan pıhtılaşması ve tümör Metastazlari gibi çeşitli hastalık süreçlerini katılmaktadırlar öneririz. İşte, bindirme ağları için ek sonra büyümek ücretsiz tümör hücrelerinin sırasında NET faaliyet algılamak için detaylı vitro tekniği göstermektedir. İlk olarak, biz düşük yoğunluklu nötrofil (LDN) laparotomies yapılan hastaların postoperatif peritoneal lavaj sıvı toplanan. Kısa vadeli LDN kültür yeşil floresan nükleer ve kromozom counterstain ile görüntülenmiştir büyük NET oluşumu sonuçlandı. Sonra eş kuluçka insan mide kanseri hücre hatların MKN45, OCUM-1 NUGC-4 ağları ile birçok tümör hücreleri ağlar tarafından kapana kısıldın. Daha sonra ek tamamen DNaz ı. Time-lapse video ağları tarafından tuzağa tümör hücreleri ölmek ortaya ağlar bozulması tarafından kaldırıldı ama bunun yerine şiddetle sürekli bir kültürde büyüdüm. Bu yöntemler ağlar ve hücreleri ve materyaller çeşitli yapışkanlı Hofstede tespiti için uygulanabilir.

2 saatlik kültüründe CD66b(+) peritoneal lavaj sıvı gösterdi dize yapılardan türetilmiş LDN lekeli yeşil-floresan boya için nükleer ve kromozom (Şekil 1B), mononükleer hücreler vermedi CD66b(-) ise (Şekil 1 c). LDN kültürleri ile ön işleme Ancak, 100 U/mL DNaz olduğumu karakteristik yapısı (Şekil 1 d), yok ekstraselüler DNA nötrofil ihraç oluşan olduklarını gösteren. LDN kültürlü zaman plastik tabakl...

Burada, postoperatif peritoneal lavaj sıvı, kurtarılan insan düşük yoğunluklu nötrofil (LDN), büyük nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar) üretmek ve verimli bir şekilde daha sonra grow ücretsiz tümör hücreleri tuzak bir yöntem mevcut.

Düşük yoğunluklu nötrofil tarafından oluşturulan nötrofil hücre dışı tuzakları Peritoneal lavaj sıvı aracılık tümör hücre büyümesini ve eki elde

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

Bu yöntem, tümör immünolojisinde nötrofil alt popülasyonlarının rolü hakkında, özellikle tümör metastazında nötrofil hücre dışı tuzakların veya NET'lerin mekanik rolü hakkında önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, tümör hücrelerinin sağlam NET'lerle olan adeziv etkileşimlerinin görüntülenmesine olanak sağlamasıdır. Bu tekniğin etkileri kanser tedavisine kadar uzanır.Spesifik nötrofil alt kümelerinden türetilen NET'ler tümör metastazı teşvik edebilir. Prosedürü göstermek laboratuvarımızdan Junko Shoniohara olacak. Nötrofilleri elde etmek için, önce yara kapanmadan hemen önce bir litre normal steril salini doğrudan gastrointestinal malignite nedeniyle karın ameliyatı geçirmiş bir hastanın karın boşluğuna infüze edin ve karın boşluğunu en az bir dakika boyunca yoğun bir şekilde lavaj yapın.Daha sonra tuzlu suyu boşluk içinde karıştırın ve dört adet 50 mililitrelik şırınga ile 200 mililitre lavajlı sıvıyı geri kazanın. Laboratuvarda, periton lavaj sıvısını 100 mikrometrelik bir naylon filtreden santrifüjleme için ayrı ayrı 50 mililitrelik tüplere aktarın. Peletleri% 0.02 EDTA ile desteklenmiş 5 mililitre PBS içinde yeniden süspanse edin ve her hücre süspansiyonunu üç mililitre yoğunluk gradyan çözeltisi üzerine dikkatlice yerleştirin.Yoğunluk gradyanı ayrılmasından sonra, her tüpten iki ila üç mililitre ara tabaka hasat edin ve periton sıvısı örneklerini tüp başına 10 mililitre taze PBS artı EDTA ile yıkayın. Ek bir yıkama için peletleri 10 mililitre taze PBS artı EDTA'da toplayın ve hücreleri, 60 mikrolitre manyetik aktif hücre sıralama veya MACS, tampon konsantrasyonu başına bir kez 10 ila yedinci hücreye seyreltin. Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 20 mikrolitre Fc bloğu ile spesifik olmayan herhangi bir bağlanmayı bloke edin ve ardından 20 mikrolitre anti-CD66b manyetik boncuk ekleyin.Dört santigrat derecede 10 dakika sonra, hücreleri 500 mikrolitre MACS tamponunda yıkayın ve yeniden süspanse edin ve hücreleri uygun bir manyetik ayırıcının manyetik alanı içinde uygun boyutta bir manyetik sütuna ekleyin. Tüm CD66b negatif hücreleri kolondan geçtiğinde, kolon rezervuarına 15 mililitre taze MACS tamponu ekleyin ve kolonu, manyetik ayırıcıdan yeni bir konik tüpe aktarın. Ardından, manyetik olarak etiketlenmiş CD66b pozitifini tüpe akıtmak için sütunu hemen daldırın.Santrifüjlemeden sonra, izole edilmiş düşük yoğunluklu nötrofilleri, FBS konsantrasyonu ile desteklenmiş RPMI1640 ortamın mililitresi başına beş kez 10 ila altıncı hücrede yeniden askıya alın ve altı kuyulu poli-L-lizin kaplı plaka üzerinde oyuk başına 1 mililitre nötrofil tohumlayın. İki saat sonra, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte, her bir oyuktaki hücreleri, üreticinin talimatlarına göre uygun bir floresan membran, geçirimsiz nükleer ve kromozomal boya ile boyayın ve hemen floresan mikroskobu ile NET'lerin morfolojisini gözlemleyin. Tümör hücresinin NET'lere yapışmasını değerlendirmek için RPMI1640,% 0.1 sığır serum albümin konsantrasyonu ile desteklenmiş, mililitre başına 10 ila altıda bir kez 10 ila altıda bir kez kontrast floresan boya ile boyanmış mide tümörü hücrelerini yeniden askıya alın ve düşük yoğunluklu nötrofil kültürlerinin her bir oyuğuna bir mililitre tümör hücresi ekleyin.37 santigrat derecede beş dakika sonra, süpernatanı her bir oyuktan çıkarın ve hücreleri, yıkama başına BSA ile desteklenmiş 2 mililitre önceden ısıtılmış RPMI1640 ortamı ile iki kez nazikçe yıkayın. Beş dakikalık bir inkübasyon, NET'e özgü bağlamayı algılamak için yeterince uzundur. Isıtılmış ortamı her bir kuyucuğun yan tarafına ekleyin, plakayı yavaşça hafifçe döndürün ve süpernatanı bir aspiratör ile çıkarın.NET'ler ve bağlı tümör hücreleri daha sonra floresan mikroskobu ile gözlemlenebilir. Sıkışan tümör hücrelerinin hızlandırılmış video analizi için, peritoneal düşük yoğunluklu nötrofilleri 35 milimetrelik bir tabakta, poli-L-lizin kaplı bir tabakta kültürleyin ve boyayın, ardından gösterildiği gibi iki mililitre% 0.1 BSA artı RPMI1640'de kısa bir yıkama yapın. Ortamı, oda sıcaklığında beş dakikalık bir inkübasyon için BSA ile desteklenmiş iki mililitre RPMI içinde süspanse edilen bir kez 10 ila altıncı boyanmamış mide tümörü hücresi ile değiştirin.İnkübasyonun sonunda, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca BSA ile desteklenmiş iki mililitre taze RPMI içinde durulayın, ardından bağlanmamış tümör hücrelerini çıkarmak için hafifçe döndürün. Daha sonra süpernatanı FBS ve antibiyotiklerle takviye edilmiş DMEM ile değiştirin ve NET'ler tarafından tümör hücresi sıkışmasının hızlandırılmış analizi için çanağı tam bir görünüm hücresi gözlem sistemine monte edin. İki saatlik kültürden sonra, periton lavaj sıvısından türetilen CD66b pozitif, düşük yoğunluklu nötrofiller, yeşil floresan, nükleer ve kromozomal boyama ile sicim yapıları sergilerken, CD66b negatif mononükleer hücreler göstermez.Bununla birlikte, düşük yoğunluklu nötrofil kültürleri, mililitre DNAse I başına 100 birim ile ön işleme tabi tutulduğunda, karakteristik yapılar yok edilir, bu da yapıların nötrofillerden atılan hücre dışı DNA'dan oluştuğunu gösterir. Düşük yoğunluklu nötrofiller kaplanmamış plastik plakalar üzerinde kültürlendiğinde, tabağın dibine bağlı birkaç NET ile ortam içinde yüzen birçok NET kümesi gözlemlenebilir. Floresan olarak işaretlenmiş bir mide tümörü hücre hattı ile beş dakikalık inkübasyondan sonra, birçok tümör hücresi NET'ler içindeki nötrofillere bağlanır, bu durum DNAse I ile ön tedaviden sonra gözlenmeyen bir fenomendir.OKUM-1 ve NUGC-4. İlginç bir şekilde, NET'ler uzun süreli tümör hücresi ko-kültüründen birkaç saat sonra yavaş yavaş kaybolurken, NET'ler tarafından yakalanan tümör hücreleri, NET salınımından sonra güçlü bir şekilde çoğalmaya başlar. Bu prosedür sırasında, NET'ler plakaya zayıf bir şekilde yapıştığından, yıkama ve bulaşık transfer işlemlerinin özellikle dikkatli bir şekilde yapılması gerektiğini unutmamak önemlidir.Geliştirilmesinden sonra bu teknik, biyomedikal biliminin çeşitli alanlarındaki araştırmacıların, NET'lerin tromboz, sistemik inflamatuar yanıt sendromu ve otoimmün hastalıklar gibi çeşitli hastalıklarla nedensel ilişkisini keşfetmelerinin yolunu açmaktadır.

neutrophil-extracellular-traps-generated-low-density-neutrophils

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET), patojen bakteriler, mantarlar ve parazitler mücadele için önemli bir doğuştan gelen bağışıklık mekanizması. Burada insan kan nötrofil granülositler izole etmek ve NET'ler oluşturmak için bunları etkinleştirmek yöntemleri açıklanmaktadır. Biz ışık ve elektron mikroskobu NET'ler görselleştirmek için hazırlama teknikleri mevcut.

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar: Onları nasıl oluşturun ve görselleştirin için

Bu videoda, düşük yoğunluklu nötrofillerin veya LDN'lerin ameliyat sonrası bir insan hastanın periton lavaj sıvısından izole edilmesi prosedürünü açıklıyoruz. Bu şekilde elde edilen LDN'ler, tümör büyümesi ve ilerlemesindeki rollerini anlamak için daha sonraki aşağı akış deneylerinde kullanılabilir.

Peritoneal Düşük Yoğunluklu Nötrofil İzolasyonu: Manyetik Aktif Hücre Sıralaması Kullanılarak Peritoneal Lavaj Sıvısından Düşük Yoğunluklu Nötrofiller Elde Etme Tekniği

Bu video, nötrofiller tarafından dışarı atılan hücre dışı DNA bileşenleri olan nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) floresan boyanmasını göstermektedir. Bu teknik, kanser hücreleri ve NET'ler arasındaki yapıştırıcı etkileşiminin görselleştirilmesini sağlar.

Nötrofil hücre dışı tuzakların veya NET'lerin floresan mikroskobu: kanser hücreleri ve NET'ler arasındaki yapışkan etkileşimi gözlemlemek için bir teknik

Bu videoda, düşük yoğunluklu nötrofiller ve mide kanseri hücrelerini birlikte kültürleyerek nötrofil hücre dışı tuzaklarda (NET'ler) hapsolmuş kanser hücrelerinin yapışma sonrası davranışını analiz ediyoruz. Hızlandırılmış video analizi, çeşitli hücresel olayların izlenmesine ve NET'lerin patolojik durumlardaki rolünün incelenmesine yardımcı olur.

Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların veya NET'lerin Hızlandırılmış Floresan Mikroskobu: Kanser Hücreleri ve NET'ler Arasındaki Yapışma Sonrası Etkileşimi Analiz Etmek İçin Bir Teknik

Bu videoda, nötrofil hücre dışı tuzakları (NET'ler) oluşturmak ve izole etmek için kullanılan bir in vitro teknik gösterilmektedir. Nötrofiller periferik kandan izole edilir ve NET üretmek için forbol miristat asetat (PMA) ile uyarılır. İnkübasyon sırasında, nötrofiller, granüler sitoplazmik proteinlerle karıştırılmış yoğunlaştırılmış kromatin içeren NET'leri serbest bırakmak için bir hücre ölümü (NETosis) sürecinden geçer.

İnsan Nötrofil Hücre Dışı Tuzakları Oluşturmak için İn Vitro Teknik

Bu videoda, kanser hücrelerinin nötrofil hücre dışı tuzaklara (NET'ler) yapışmasını tespit etmek için floresan mikroskobu kullanan bir testi gösteriyoruz. Test kuyucuklarında, NET'lere yapışan floresan işaretli kanser hücrelerinin sayısında kayda değer bir artış olurken, DNaz ile muamele edilen kuyucuklar, NET'lere kanser hücresi yapışmasında azalma sergilemektedir.

Kanser Hücrelerinin Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklara Yapışmasını Tespit Etmek için İn Vitro Yapışma Testi

Nötrofiller sadece istilacı mikroorganizmalara karşı konak savunmasında değil, aynı zamanda tümör hücrelerinin immün sürveyansında da önemli bir rol oynarlar. Burada, anti-tümör özelliklere sahip nötrofillerin izolasyonu ile ilgili teknikleri ve in vitro ve in vivo olarak anti-tümör nötrofil fonksiyonunu izleme yöntemlerini açıklıyoruz.

Anti-tümör özelliklere sahip izole edilmesi ve nötrofil Karakterizasyonu

Burada in vitro nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) indüksiyonu ve analizi için bir protokol sunulmaktadır. DNA, katelisidin (LL37) ve enzim aktivitesinin nicelleştirilmesi, benzer kontrollü koşullar altında mikrobiyal ve kimyasal uyaranlar tarafından indüklenen NET'lerin bileşimindeki ve morfolojisindeki değişkenliği gösteren veriler vermiştir.

Mikrobiyal ve Kimyasal Uyaranlar Tarafından İndüklenen Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Morfolojik ve Bileşimsel Analizi

Canlı hücre analiz sistemini kullanarak nötrofil hücre dışı tuzaklarını (NET'ler) ölçmek için membran geçirgenliğine bağlı çift boya yaklaşımıyla birleştirilmiş otomatik bir yüksek verimli yöntem sunuyoruz.

İnsan Nötrofillerinde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Oluşumunu Ölçmek için Gerçek Zamanlı Yüksek Verim Tekniği

Bu tanımlanmış protokol, insan nötrofil hücre dışı tuzak (NET) salınımını in vitro olarak görselleştirmek ve ölçmek için gerçek zamanlı, yüksek verimli bir mikroskopi yaklaşımını tanımlar. Tekrarlanabilir yöntem, farklı NETosis indükleyicileri ile stimülasyon üzerine NET salınımının özelliklerinin ve kinetiğinin araştırılmasına olanak tanır ve NETosis antagonistlerinin farmakolojisinin değerlendirilmesini sağlar.

İnsan Nötrofil Hücre Dışı Tuzak Salınımının Gerçek Zamanlı, Yüksek Verimli Mikroskobik Miktar Tayini ve Antagonistlerin Farmakolojisinin Değerlendirilmesi

İnsan plazmasından düşük yoğunluklu lipoproteinin (LDL) izolasyonu, HL-60 hücrelerinin nötrofil benzeri hücrelere farklılaşması, LDL varlığında nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) hazırlanması ve insan aort endotel hücrelerinin NET'ler ve LDL karışımı ile uyarılması dahil olmak üzere bir dizi yöntem tanımlanmıştır.

Düşük Yoğunluklu Lipoprotein Varlığında Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklar Kullanılarak Vasküler Endotel Hücrelerinin Uyarılması

Keşfedin düşük yoğunluklu nötrofillerin tümör hücrelerini yakalayan hücre dışı tuzaklarını. Bu yöntem, peritoneal lavaj sıvısından LDN izolasyonu yaparak tümör metastazındaki rolü görselleştirir.

Düşük yoğunluklu nötrofil tarafından oluşturulan nötrofil hücre dışı tuzakları Peritoneal lavaj sıvı aracılık tümör hücre büyümesini ve eki elde (Video) | JoVE Journal

Düşük yoğunluklu nötrofil tarafından oluşturulan nötrofil hücre dışı tuzakları Peritoneal lavaj sıvı aracılık tümör hücre büyümesini ve eki elde

Daha fazla video keşfet