Name: Kimyasal epigenetik değiştiriciler ile hücresel makine yeniden yönlendirerek Gen transkripsiyonu bastırmak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Öğrenin, kimyasal epigenetik değiştiriciler kullanarak kromatin modifikasyon makinelerini gen-spesifik olarak yeniden yönlendirme ve gen transkripsiyonunu geri dönüşümlü olarak bastırma yöntemini. Bu teknik, epigenetik alanında gen düzenleme mekanizmalarını incelemek için önemli bir ilerlemedir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Hathaway ve Jin laboratuarlar için onların yararlı tartışmalar üyeleri teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar da Dan Crona ve Ian MacDonald el yazması onların eleştirel okuma için teşekkür. Bu eser kısmen Grant R01GM118653 üzerinden ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (için N.A.H.); tarafından desteklenen ve R01CA218600 ve R01HD088626 gelen ABD Ulusal hibe R01GM122749 tarafından Enstitüleri sağlık (JJ için). Bu eser de bir katmanı tarafından desteklenen 3 ve bir öğrenci vermek yenilik için UNC Eshelman Enstitüsünden (N.A.H ve A.M.C, sırasıyla). Ek T-32 GM007092 (A.M.C) finansman bu çalışmaları destekledi. Akış Sitometresi veri UNC akış sitometresi çekirdek bir P30 CA016086 Kanser Merkezi çekirdek destek hibe için UNC Lineberger kapsamlı Kanser Merkezi tarafından finanse edilen tesisinde elde edildi.

1) Lentivirus üretimi için hücre satırı kültürü
<ol><li>Taze, düşük-geçiş (geçit 30 daha az) büyümek 293T insan embriyonik böbrek (HEK) hücrelerinde yüksek glikoz Dulbecco kartal modifiye'nın orta (DMEM) temel medya % 10 fetal Sığır serum ile (FBS), 10 mM HEPES, 1 x esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), kalem takıma'nın / Strep, 2-mercaptoenthanol 37 ° C kuluçka %5 CO2. Her 3-5 d hücreleri bölme ve > %95 birleşmesi önce olurlar.</li>
	<li>Geçit 293T HEK hücreleri ile 18 x 10 cm 15 cm tabak (bir 15 cm tabak için üretilen her virüs)6 .<ol>
<li>15 cm biçimi için eski medya Aspire edin, 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x 10 mL ekleyin, PBS Aspire edin ve 3 mL % 0.05 tripsin ekleyin. Tripsin için 8 dk. 37 ° C'de sallanan ve hücreleri kuluçka yarım dokunarak, hücrelerde kuluçkaya. Not: Bu adımın amacı hücreleri tek hücre süspansiyon elde etmektir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücreleri % 60-%80 confluency ertesi gün ulaştınız, 13,5 µg ile bir polyethylenimine (PEI) transfection psPAX2 plazmid, pMD2.G plazmid 4,5 µg, uyumlu lentiviral teslim vektör 18 µg gen ilgi ile gerçekleştirin (yani , FKBP-Gal4), 108 µL PEI ve transfection medya 1,8 mL.<ol>
<li>Yavaşça DNA, PEI ve transfection medya 15 mL konik tüp içinde karıştırın, örnek 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya ve dropwise 15 cm plakasına eklemek. Not: lütfen kullanın uygun güvenlik önlemleri ve tüm kurumsal izleyin ve laboratuvar güvenlik prosedürleri Bu adım sonra tüm reaktifler olarak canlı bir virüs içerir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>16 h transfection ve % 5 CO237 ° C Kuluçka kuluçka sonra medya Aspire edin ve yavaşça 15 cm tabak taze 293 HEK medya (37 ° C su banyosunda prewarmed) ekleyin. Medya değiştirdikten sonra bir 37 ° C Kombine Kuluçka makinesi %5 CO2 ile 48 h için hücrelerde kuluçkaya. Virüs o zaman hasat hazırdır.</li>
</ol>2) enfeksiyon, fare embriyonik kök hücreleri (mESC) ile Lentivirus
<ol><li>Düşük-geçiş (geçit 35 daha az) büyümek, besleyici-Alerjik adapte CIA mESCs yüksek glikoz DMEM temel medya ESC-grade FBS, 10 mM HEPES % 20 ile desteklenmiş, 37 ° C kuluçka % 5 ile 1 x NEAA, kalem/Strep, 2-mercaptoenthanol ve 1:500 lösemi engelleyici faktör (LIF) CO2. Not: LIF süpernatant toplu iş iş işlemde toplanan ve-80 ° C'de dondurulmuş COS LIF üreten hücrelerin elde edilir<ol>
<li>1-3 h 1 x PBS içinde % 0,1 jelatin ile preincubated, ve daha sonra 1 x PBS ile yıkanmış plakaları hücrelerin büyümesine. Hücreleri günlük yem ve onları kendi yoğunluğu bağlı olarak her 2-3 d bölünmüş. Not: Morfolojik, embriyonik kök hücre (ES) kolonileri küçük, yuvarlak ve birbirinden farklı olmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MESC 12-şey plaka biçime (100.000 hücreler/de) 1 d enfeksiyon önce geçiş.<ol>
<li>Bir hemasitometre içeren hücreleri saymak. 10 cm biçiminde yetiştirilen hücrelerin, eski medya Aspire edin, 5 mL 1 x PBS ekleyin, PBS Aspire edin ve % 0.25 tripsin 1 mL ekleyin. Tripsin için 8 dk. 37 ° C'de sallanan ve hücreleri kuluçka yarım dokunarak, hücrelerde kuluçkaya. Bu adımın amacı hücreleri tek hücre süspansiyon elde etmektir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>293T15-cm viral medya değiştirdikten sonra 48 h ve süpernatant 50 mL konik tüp transfer çıkarın adım 1.4, hücrelerden ambalaj.</li>
	<li>300 x g hücre artıkları cips 5 min için de süpernatant santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant 0.45 µm membran aracılığıyla filtre. Not: bazı diğer malzemeler virüs muhafaza ve verimleri önemli ölçüde azaltmak gibi selüloz asetat (SFCA) yüzey aktif-Alerjik membranlar, kullandığınızdan emin olun.</li>
	<li>Bir SW32 rotor, bir santrifüj kullanarak ultrasantrifüj, virüsle konsantre ve 20.000 rpm (~ 72,000 x g) 4 ° C'de 2,5 h için spin</li>
	<li>Virüs ultrasantrifüj altında yoğunlaşmaktadır iken, CIA mESCs 12-şey plaka 5 µg/mL polybrene de içeren taze ES medya ile tedavi.</li>
	<li>Virüs konsantrasyon tamamlandığında, dikkatle süpernatant Aspire edin ve virüs pelet 1 x PBS 100 µL içinde askıya alma (aşırı kabarcıklar önlemek).</li>
	<li>Virüs ve 1 x PBS 1.5 mL microfuge tüp ekleyin. Girdap/sallamak vasıl 300 g x (veya en düşük ayarda) tüp tam olarak virüs askıya almak için. Spin aşağı kabarcıklar kaldırmak 5-10 s için bir mini masa üstü santrifüj tüpü.</li>
	<li>Virüsün 30 µL 12-şey plaka her şey için ekleyin. Girdap plaka ve plaka 1000 x g 20 dk için de santrifüj kapasitesi. Not: Eklendi virüs miktarı ters teslim yapı boyutu için ilgili viral titresi bağlı olarak farklı olabilir.<ol>
<li>Alternatif olarak, flash virüs sıvı azot ile dondurma ve-80 ° C'de depolayın Ancak, virüs buz gibi viral titresi düşürecektir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>12-şey plaka 37 ° C kuluçka makinesine koyun ve medya (2.1 adımda anlatıldığı gibi) ertesi sabah (~ 16 h) daha sonra taze ES medya ile değiştirin.</li>
	<li>Enfeksiyon 48 saat sonra uygun antibiyotik (yani, 1,5 µg/mL puromisindir, 10 µg/mL blasticidin, vb) ekleyerek viral plazmid entegre hücreleri seçin. Medya günlük değiştirmek ve yüzer/ölü hücreleri çoğu Eğer 1 x PBS hücrelerle yıkayın. 72-96 h için hücreleri seçimi medyada 37 ° C kuluçka %5 CO2ile devam et.</li>
</ol>3) kimyasal epigenetik değiştiriciler (CEM) s hazırlık ve tedavi
<ol><li>Toz CEM dimetil sülfoksit (DMSO) 1 mM hisse senedi bir konsantrasyon ve 100 µM bir çalışma konsantrasyonu için askıya alma.</li>
	<li>Sonra hücre seçimi için 72-96 h, 100.000 hücreler/iyi bir 12-şey biçimiyle mESCs bölünmüş uğramıştır. Daha sonra bir 37 ° C Kombine Kuluçka makinesi %5 CO2 24 h için hücrelerde kuluçkaya, 100 medya çözeltisi hazırlamak nM CEM ile ES kitle iletişim araçları. Bu ortamı kullanmak için CIA mESC 1 mL ile besleme/iyi. Bir denetimi hizmet için herhangi bir ek CEMs olmayan hücreler bir kuyu saklayın.<ol>
<li>Medya eski medya alıyorum ve 1 mL ekleyerek/de medyanın taze hazırlanmış CEM içeren veya ES CEM ücretsiz bir deneme süresi için her 24 h değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4) ifade tarafından mikroskobu ve Akış Sitometresi Analizi
<ol><li>CEM tedavisi olmayan hücreler ve 100 ile tedavi hücreleri CEM tedavi 48 saat sonra görüntü nM floresan mikroskop kullanarak CEM. MESC morfoloji 20 X büyütme, kaydetmek için faz veya aydınlık alan kullanarak temsilcisi görüntüleri almak; hücreleri bir kaç farklılaşmış hücreler yuvarlak koloniler oluşturdular. FITC floresans kanal altında hücre koşulların her ikisi de görüntü.</li>
	<li>Denetim ve CEM tedavi hücreler için akış sitometresi medya aspirating, 1 mL 1 x PBS hücrelerle yıkama, PBS aspirating ve % 0.25 tripsin EDTA ile 8-10 min için 0.25 mL ekleyerek izole etmek.</li>
	<li>Hücreleri artık büyük kümeleri içinde mikroskop bakarak olduğundan emin olun. 20 X büyütme kullanın. Hücreleri tek hücre süspansiyon içinde olmak gibi görünüyorsa, yavaşça yukarı ve aşağı bir P1000 pipet ile tam hücreleri trypsinize pipet.</li>
	<li>Tripsin 1 mL taze medya ile gidermek ve serolojik pipet ile yüksek hızda hücre resuspend (ya da bir P1000 pipet ve ipucu kullanarak) kadar bir tek hücre süspansiyon hücrelerdir.</li>
	<li>Spin aşağı vasıl 300 x g 5 dk. aspiratı süpernatant hücreleri. 1 x PBS ile yıkama ve hücreleri recentrifuge. PBS süpernatant Aspire edin.</li>
	<li>Hücre Pelet FACS arabellek (1 mM ethylenediaminetetraacetic asit [EDTA], 1 x PBS ve % 0,2 sığır serum albümin [BSA]) 200 mL resuspend.<ol>
<li>FACS arabellek hacmi kaç hücre mevcut, bağlı olacaktır ama konsantrasyon 1000-3000 hücreleri olmalıdır / µL. hücre 3 örnekleri sayısı sayısı ve hücre konsantrasyon ortalama. Daha fazla FACS arabellek gerekirse ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Akış Sitometresi > 50.000 hücreleri değil çözümlenmekte zaman buz üzerinde hücreleri tutarak askıya alınan hücrelerle gerçekleştirin. (FITC, AF488, GFP, vb) 530/40 filtre ifadesinde değişiklikleri kaydetmek için kullanın. Tedavi edilmeyen denetim hücre örneği kullanarak uygun floresan gerilim belirlemek ve kaydedilen yoğunluğu yelpazenin ortasında olmak floresan zirve için gerilim küme. Örnekleri kılıf yaklaşık 5000 hücre/s hızında çalışır.</li>
	<li>Verileri verme ve ilk geçişi ileri dağılım vs yan dağılım canlı hücreler için ve daha sonra ileri dağılım yüksekliği vs. alan gömlek için bir akış sitometresi program (Örneğin, FlowJo) üzerinde FCS dosyaları çözümle. O zaman, GFP kanal veri göreli GFP ifadede hedef belirlemek ve denetlemek için bir çubuk grafik üzerinde görselleştirmek nüfus.</li>
</ol>5) kromatin kromatin Immunoprecipitation (ChIP) takip qPCR Analizi
<ol><li>MESCs bir 10 cm tabak 3 milyon hücrelerle ve ES medya 10 mL bölme (her biri için bir 10 cm tabak deneysel veya kontrol durumu). Ertesi gün, CEM içeren ya da CEM-özgür medya 10 mL ekleyin. CEM tedavi 48 saat sonra eski medya Aspire edin. Yıkama ve 5 mL 1 x PBS de içeren hücreleri Aspire edin. Ardından, % 0.25 tripsin hücrelerle ayırmak ve tripsin ES medya 10 mL ile gidermek. Saymak ve koşul başına 10 milyon hücre örneği yalıtır.</li>
	<li>Spin aşağı her 300 x g 5 min için de 10 milyon hücre örnekleri.</li>
	<li>Her Pelet 10 mL 1 x PBS resuspend ve 300 x g 5 min için de hücreleri recentrifuge.</li>
	<li>Her Pelet CIA düzeltme arabellek 10 mL resuspend (50 mM pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 0,5 mM etilen glikol-bis [ß-aminoethyl eter]-N, N, N', N'-tetraacetic asit [EGTA] pH 8 ve 100 mM sodyum klorür [NaCl]). 1 mL % 11 Formaldehit Çözeltisi ekleyin ve hemen x - 10 x 5 örnekleri tersine çevirin. Örnek 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>2.5 M glisin 0.5 mL ekleyin. Örnekleri hemen ters çevir ve örnek 5 min için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>1200 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi Süpernatant Aspire edin.</li>
	<li>Pelet CIA durulama 1 10 mL resuspend (50 mM HEPES pH 8, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8, % 10 gliserol, %0,5 Nonidet P-40 [NP40] ve % 0.25 Triton X100). 10 dk santrifüj kapasitesi için o vasıl 1200 x g 4 ° C'de 5 min için örnek buz üzerinde kuluçkaya</li>
	<li>Pelet CIA durulama 2 (10 mM tris [hydroxymethyl] aminomethane [Tris] pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 0,5 mM EGTA pH 8 ve 200 mM NaCl) 10 mL resuspend. 1200 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Yavaşça 5 mL tuz Pelet aksatmadan yıkamak için arabellek (% 0,1 SDS, 1 mM EDTA ve 10 mM Tris pH 8) konik tüp kenarlarında yamultma CIA de ekleyin. Örnek vasıl 1200 x g 4 ° C'de 3 dk santrifüj kapasitesi Yıkama adımı yineleyin.</li>
	<li>Pelet 90 µL CIA kesme arabellek ve taze proteaz inhibitörleri (leupeptin, chymostatin ve pepstatin A karışımı birlikte 10 mg/mL her bir 1.000 x 10 µg/mL nihai bir konsantrasyon yapma hisse senedi çözüm yapmak DMSO çözünmüş. kullanım) resuspend. Her şey buz13,14tarihinde tutarken sonication arttırıcı nanodroplets 10 µL ekleyin.</li>
	<li>Bir cam tüp 100 µL çözümün transfer ve tüp kap.</li>
	<li>Örnekleri 3,5 dk için solüsyon içeren temizleyicide (belirlenen hücre satır ve hücre sayısı dayalı). Örnekleri ısınmayı önlemek için toplam sonication saat 2 dk. aşarsa örnekleri 2-min-maksimum çevrim süreleri içinde işlemek. Not: Odaklı ultrasonicator burada yüksek frekansta (500 kHz) işlevleri kullanılan. 55 W. akustik bir gücü makine çalıştırmak Sonication süresi her bireysel lab tarafından önceden belirlenmiş.</li>
	<li>Her sonicated kromatin örnek için yeni bir 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın. Tüpler 8.000 x g 4 ° C'de 2 min için de spin</li>
	<li>Kesme verimliliği çözümlemek ve kromatin göreli miktarını ölçmek için çip seti üreticisinin Protokolü izleyin. Not: spectrophotometrically DNA konsantrasyonu belirlemek (DNA nanodrop enstrüman kullanarakÖrneğin,), ve koşmak ~ 200 kromatin boyutu kabaca basepairs (bp) 200-500 için sonicated doğrulamak için % 1'özel jel üzerinde DNA'ın ng.</li>
	<li>İmmunoprecipitation gerçekleştirmek ve kromatin yalıtmak için çip seti üreticisinin Protokolü izleyin. Not: İmmunoprecipitation daha yüksek DNA konsantrasyonları ile örnekleri için 37 ° C'de elüsyon arabellek sıcak ve örnekleri 2 elute x 30 µL elüsyon arabelleği (dönmesi 1 dk. için her zaman) ile.</li>
	<li>QPCR gerçekleştirmek için bir 384-şey plaka reaktifleri yükleyin. Eklemek 2 x asimetrik siyanür boya ana karışımı 5 µL, her biri 2.5 µM astar, su ve 0.1 - 10 her reaksiyon için DNA'ın ng.<ol>
<li>50-100 bp amplicons ve CT değerlerini yükseltmek için tasarım astar bir ev tutma gen intracisternal A tipi parçacıklar (IAP) normalleştirilmiş. Not: daha fazla qPCR için kit üreticinin iletişim kuralı bkz. Oct4 odağı hedef için kullanılan astar kuruldu: (F) CACATGAAGCAGCACGACTT; (R) CCTTGAAGAAGATGGTGCGC. Hedef IAP için kullanılan Ayarla denetim astar oldu: (F) ATTTCGCCTAGGACGTGTCA; (R) ACTCCATGTGCTCTGCCTTC.</li>
		<li>Astar ve 60 ° C bir tavlama sıcaklığı 40 çevrimleri için 1 dk ile qPCR çalıştırmak istediğiniz ürün dayalı. Not: Elde edilen veri örnekleri, IAP üzerinde normalize CiA:Oct4 ile arasındaki delta delta Ct karşılaştırmaları kullanarak quantitated. Son tahlilde sonuçları onaylatılacak deneysel örneklerinin ortalama standart sapma ortalamasını temsil hata ile görüntülenir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22358331">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).</li>
<li>Venkatesh, S., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+exchange%2C+chromatin+structure+and+the+regulation+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).</li>
<li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
<li>Gräff, J., Tsai, L. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation%3A+molecular+mnemonics+on+the+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).</li>
<li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((50+years+of+protein+acetylation%3A+from+gene+regulation+to+epigenetics%2C+metabolism+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).</li>
<li>Hathaway, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+memory+of+heterochromatin+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics and memory of heterochromatin in living cells.</a> Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).</li>
<li>Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethering+of+Lsh+at+the+Oct4+locus+promotes+gene+repression+associated+with+epigenetic+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes.</a> Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).</li>
<li>Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smarca4+ATPase+mutations+disrupt+direct+eviction+of+PRC1+from+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin.</a> Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).</li>
<li>Koh, A. S., Miller, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+chromatin+repression+by+Aire+provides+precise+control+of+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance.</a> Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).</li>
<li>Chen, T., Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+Controlled+Epigenome+Editing+through+an+Inducible+dCas9+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).</li>
<li>Braun, S. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reversible+epigenome+editing+by+endogenous+chromatin+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators.</a> Nature Communications. 8 (1), 560(2017).</li>
<li>Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Gene+Repression+Using+Novel+Bifunctional+Molecules+to+Harness+Endogenous+Histone+Deacetylation+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).</li>
<li>Kasoji, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavitation+Enhancing+Nanodroplets+Mediate+Efficient+DNA+Fragmentation+in+a+Bench+Top+Ultrasonic+Water+Bath%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath.</a> PLoS ONE. 10 (7), 0133014(2015).</li>
<li>Chiarella, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavitation+enhancement+increases+the+efficiency+and+consistency+of+chromatin+fragmentation+from+fixed+cells+for+downstream+quantitative+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications.</a> Biochemistry. 57 (19), 2756-2761 (2018).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+transcriptional+modulation+with+orthogonal+and+inducible+dCas9+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators.</a> Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, biz gen ekspresyonu ve kromatin çevre belirli bir gen, bir doz bağımlı şekilde düzenleyen uygulanan son zamanlarda geliştirilen CEM sistem nitelendirdi. Biz dinamikleri dahil belirli endojen kromatin düzenleyici proteinler seçici alımı yoluyla Gen ifadesinin düzenlenmesine çalışmak için bir yöntem sağlar. Bu uygulanabilir son derece modüler bir teknolojidir ne kadar farklı protein - ve kromatin-modifiye araştırmak için düzgün dysregulated, bu işlemler ile nasıl gidiyor çalışma olarak kromatin çevre düzenlenmesi i...

Kromatin DNA buna sarılarak çekirdek nucleosome parçacık histon octamer proteinleri oluşur. Kromatin sıkıştırma düzenlenmesi için uygun DNA tamir, çoğaltma ve ifade1,2,3temel bir mekanizmadır. Hücreleri sıkıştırma düzeyini kontrol bir ek veya çeşitli post-translational histon kuyruk değişiklikler kaldırılması yoludur. İki tür değişiklikler en çok gen harekete geçirmek ile ilişkilidir, (1) lizin asetilasyon ve gen harekete geçirmek ya da baskı, amino asit bağlama ile ilişkili olabilir (2) lizin metilasyonu içerir. Kaldırma işareti histon uyku (HDACs) ve histon demethylases (HDMs yapılır ise asetilasyon ve metilasyonu işaretleri ilavesi histon acetyltransferases (şapka) ve histon methyltransferases (HMTs), sırasıyla, katalizlenir ), sırasıyla4,5. Bu proteinler varlığını nasıl kromatin değiştirme makine işleri düzgün Gen ifadesinin düzenlenmesi için tanımlanması gereken kalır yıllardır, çeşitli mekanizmalar bilinmektedir rağmen. Kromatin düzenleyici işlemler dysregulated birçok insan hastalıkları içinde olduğundan, yeni mekanik anlayışlar gelecekteki tedavi uygulamaları için neden olabilir.
Kromatin vivo içinde tahlil (CIA) yakınlık (CIP) kimyasal bir uyarıcı kromatin değiştirme makine işe alım denetlemek için belirli locus6kullanan son zamanlarda açıklanan bir tekniktir. Bu teknoloji kromatin dinamikleri histon-modifiye proteinleri, kromatin remodelers ve transkripsiyon faktörleri6,7,8,9dahil olmak üzere, genişleyen bir listesini incelemek için kullanılmaktadır. CIP tabanlı kromatin exogenously ifade proteinlerin hayvan zinciri de CIA sigara değiştiren genetik loci modüle tarafından devre dışı bırakılmış kümelenmiş düzenli olarak Interspaced kısa palindromik yinelenen denetim CRISPR ilişkili protein (dCas9) ile kullanmak uzatıldı 10 , 11. CIA sisteminde mESCs GFP muhabir gen Oct4 odağı, son derece ifade ve kesinlikle düzenlenmiş alan mESC genom kopyası, hızlı şekilde değiştirilmiştir. Daha önce bu sistem exogenously ifade heterochromatin protein 1 (HP1), H3K9me3 bağlar ve baskıcı işaretleri (Örneğin, H3K9me3) yayar bir enzim doz bağımlı ve tersinir alımı açıklamak için uygulanan ve DNA metilasyon6. İşe alım stratejisi bu tür yapmak için mESCs bir Gal4 bağlama dizi GFP muhabir için akıntıya karşı bağlar bir DNA-protein çapa bir Gal4 bağlı bir FK506-bağlayıcı protein (FKBP) ifade eder bir plazmid ile bulaşmış. Hücreleri de HP1 için bağlı bir FKBP-rapamycin-bağlayıcı etki (FRB) ile bulaşmış. MESCs CIP konsantrasyonları düşük nanomolar maruz kaldığında, rapamycin, FRB ve FKBP, bir araya getirdi hedef odağı. Gün rapamycin tedavisi içinde ifade hedef Gen tarafından floresans mikroskobu ve akış sitometresi kanıtladığı gibi bastırılmış ve çip ve bisülfit sıralamanın tarafından gösterilen histon asetilasyon azalır. Geliştirme ve doğrulama Bu yaklaşımın kromatin araştırma ve düzenleme alanında önemli gelişmeler olmuştur iken, bir dezavantajı gerekli eksojen kromatin değiştirme ifadesidir makine.
Sadece endojen fizyolojik ilgili enzimler işe üzerinde esaslı teknoloji yapmak ve bir daha modüler sistem yapmak için tasarlanmış ve CEMs (Şekil 1)12olarak adlandırdığı yeni bifonksiyonel molekülleri ile karakterizedir. CEMs bir bileşeni içerir hangi, rapamycin için benzer sıkı ve özellikle bağlar FK506 FKBP için. Böylece, CEMs hala CIA mESCs Oct4 odağı için alınacaktır. Diğer CEMs endojen kromatin değiştirme makine bağlar bir yan bileşenidir. Bir pilot çalışmada, HDAC inhibitörleri içeren CEMs test ettik. HDACs işe almak için bir inhibitörü kullanarak kavramı karşı sezgisel görünüyor olsa da, engelleyici yine de HDAC etkinliği ilgi gen için recruit yapabiliyor. Bu (1) HDAC odağı, enzim, serbest ve alan ve (2) bakımı HDAC inhibisyon odağı, un Inhibe HDACs yoğunluğu artan ama Inhibe HDACs bağlamak baskıcı kompleksleri işe yönlendirme tarafından gerçekleştirilir, veya (3) her ikisinin bir birleşimi. Bir önceki çalışmada, biz CEMs başarıyla GFP muhabir bir doz ve zaman bağımlı şekilde, hem de hızla geri dönüşümlü bir şekilde bastırmak mümkün olduğunu gösterdi (yani, 24 saat içinde)12. Biz burada ChIP-qPCR6kullanarak kromatin ortamını denetlemek için floresans mikroskobu, akış sitometresi ve yetenek kullanarak denetim gen ekspresyonu için sunulan CEM teknoloji yeteneği ile karakterizedir. Burada, biz kullanarak ve kromatin Biyoloji ile ilgili ek sorularınız cevaplamak için bu sistem adaptasyonu kolaylaştıracaktır CEMs karakterize bir yöntem açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013CV</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (doku kültürü için)</td> <td>Corning</td><td>25-060-Cl</td><td></td></tr><tr><td>BME (2-Merkaptoetanol)</td> <td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlantic Biologicals</td><td>S11550</td> Kaliteli Covaris tüpleri <td>için test edilen bireysel lotlar</td></tr><tr><td></td><td>ThermoScientific</td><td>C4008-632R</td><td></td></tr><tr><td>Covaris kapakları</td><td>ThermoScientific</td><td>C4008-2A</td><td></td></tr><tr><td>PEI (polietilenimin)</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>Transfeksiyon ortamı (Opti-mem)</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Virüs santrifüj tüpleri</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Virüs filtre membranı</td><td>Corning</td><td>431220</td><td></td></tr><tr><td>Polibren</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC134220 EDTA'lı</td><td></td></tr> %<tr><td>0,25 Tripsin</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>%0,05 Tripsin</td><td>Gibco</td><td>25400-054</td><td>EDTA'lı</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr</td> Blasticidin InvivoGen ant-bl <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green Master Mix (asimetrik siyanin boyası))</td><td>Roche</td><td>4913914001</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab4729</td><td></td></tr> <tr><td>(ChIP kiti) ChIP-IT Yüksek Hassasiyet Kiti</td><td>Aktif Motif</td><td>53040</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Covaris</td><td>E110</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj</td><td>Optima</td><td>XPN-80</td><td></td></tr><tr><td>SW-32 santrifüj rotoru</td><td>Beckman Coulter</td><td>14U4354</td><td></td></tr><tr><td>SW-32 Ti santrifüj kovaları</td><td>Beckman Coulter</td><td>130.2</td><td></td></tr><tr><td>LentiX 293 İnsan Embriyonik Böbrek</td><td>Clontech</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP9700</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher</td><td>G33-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>Roche</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>MP Biyomedikal</td><td>807426</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Fisher</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>TE tamponu</td><td>Fisher</td><td>BP2474-1</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (ChIP için)</td><td>Fisher</td><td>BP310-100</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Akış sitometresi, Attune NxT</td><td>Thermo Fisher</td><td>A24858</td><td></td></tr><tr><td>FKBP-Gal4 plazmit</td><td>Addgene</td><td>44245</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2 plazmit</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G plazmid</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Nanodamlacıklar</td><td>MegaShear</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DNA Nanodrop Thermo</td><td>Fisher</td><td>ND1000</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörleri (Leupeptin)</td><td>Calbiochem/EMD</td><td>108975</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörleri (Chymostatin)</td><td>Calbiochem/EMD</td><td>230790</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörleri (Pepstatin)</td><td>Calbiochem/EMD</td><td>516481</td><td></td></tr><tr><td>CiA:Oct4 mESC</td><td>G. Crabtree'nin</td><td></td> nazik hediyesi<td></td></tr><tr><td>Lif-1C-alfa - üreten Cos hücreleri</td><td>J. Wysocka'nın</td><td></td><td></td> nazik hediyesi</tr></tbody></table>

kimyasal epigenetik değiştiriciler ile hücresel makine yeniden yönlendirerek gen transkripsiyonu bastırmak

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Düzenleme, kromatin sıkıştırma daha yüksek ökaryotlarda gen ekspresyonu yöneten önemli bir süreçtir. Kromatin sıkıştırma ve gen ifade düzenlemesi yaygın birçok hastalıklarda kesintiye rağmen çalışma ve mekanizmaların eylem kontrol odağı özgü, endojen ve tersinir bir yöntem eksik edilmiştir. Bu sorunu gidermek için biz geliştirdik ve gen düzenleyen yeni bifonksiyonel molekülleri ile karakterizedir. Böylece bir formda özel locus alınacaktır bifonksiyonel molekülünün bir bileşeni bir DNA-protein çapa bağlar. Başka bir bileşen bu proteinler bir gen ilgi için işe endojen hücresel kromatin değiştirme, iş makineleri yürütmektedir. Bu küçük moleküllerin kimyasal epigenetik değiştiriciler (CEMs) denilen, gen ekspresyonu ve kromatin çevre doz bağımlı ve geri dönüşümlü bir şekilde kontrol yeteneğine sahiptirler. Burada, CEM yaklaşım ve gen ekspresyonu ve histon kuyruk asetilasyon Oct4 locus fare embriyonik kök hücreler (mESCs) içinde yer alan yeşil flüoresan Protein (GFP) gazeteci, azaltmak için uygulama ayrıntılı. Biz kurşun karakterize floresan mikroskopisi, akış sitometresi ve kromatin immunoprecipitation (ChIP), CEM (CEM23) takip nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) tarafından. Bu sistemin gücü Oct4 odağı kavramsal olarak gösterilmiştir, CEM teknoloji modüler ve diğer hücre tipleri ve diğer genomik loci uygulanabilir.

Biz son zamanlarda CEMs geliştirdi ve bu teknoloji gen ekspresyonu ve kromatin çevrenin bir muhabir odağı, doz bağımlı ve geri dönüşümlü bir şekilde düzenlemek için uygulanabilir olduğunu gösterdi. Şekil 1' de, CEM, CEM23, manken müşteri adayının gösterilir. HDAC makine muhabir odağı olan, bu durumda, Oct4 odağı eklenen GFP muhabir HDAC inhibitörü tarafından oluşturulmuştur.
CIA mESCs O...

Kromatin çevre düzenlenmesi uygun gen ekspresyonu için gerekli temel bir işlemdir. Burada, biz gen ekspresyonu kromatin değiştirme alımı yoluyla kontrol etmek için bir yöntem tarif gene özgü ve geri dönüşümlü bir şekilde makine.

Kimyasal epigenetik değiştiriciler ile hücresel makine yeniden yönlendirerek Gen transkripsiyonu bastırmak

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Bu yöntem, gen düzenleme mekanizmaları ve farklı kromatin düzenleyici unsurlar arasındaki neden-sonuç ilişkileri gibi epigenetik alanındaki temel soruların yanıtalmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, ilk kez fizyolojik olarak ilgili endojen enzimlerle bir kromatin loci modülünün mümkün olmasıdır. Genellikle bu yönteme yeni yeni bireyler mücadele edecek, çünkü fare ESL kültürü teknikte eğitilemeyenler için doğal olarak zordur.Hücre viral enfeksiyon adımları öğrenmek zor olduğu gibi bu yöntemin daha fazla gösteri önemlidir. Araştırmacı hücre kültürünün iki ayrı satır zaman gerekir ve bu adımlar sırasında güvenlik dikkatle izlemek için gereklidir. Protokolü başlatmak için, 50 santimetre plaka başına 293T HEK hücrelerinin 18 milyon geçiş.Aspire eski medya ve bir X fosfat tamponlu salin veya PBS 10 mililitre ekleyin. PBS aspire ve 0.05% tripsin üç mililitre ekleyin. Hücreleri tripsin içinde 8 dakika 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Hücreyi küçmeden yarıyolda sallayıp dokunun. Ertesi gün, hücreler %60-80 biraraya geldiğinde, bir polietilenin veya PEI transfeksiyonu gerçekleştirin. Daha sonra, DNA, PEI ve transfeksiyon ortamını 15 mililitrelik konik bir tüpte hafifçe karıştırın.Numuneyi oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra çözeltiyi 15 santimetrelik plakaya damlacık ekleyin. Daha sonra, numuneyi %5 karbondioksitle 37 derece lik bir kantinde 16 saat kuluçkaya yatırın.Ertesi gün, medya aspire ve yavaşça önceden ısıtılmış ile değiştirin, taze 293 HEK medya 15 santimetre plakaları. Medya değişiminden sonra hücreleri 37 derece lik bir kantinde 48 saat boyunca %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Hücreleri hemositometreile say.Passage daha önce 12 iyi plaka formatında 12 iyi plaka formatında 100, 000 hücre başına iyi bir gün önce enfeksiyon. 10 santimetre formatında yetişen hücreler için, eski ortama aspire edin, bir X PBS beş mililitre ekleyin, PBS aspire, ve 0.25% tripsin bir mililitre ekleyin. Hücreleri 8 dakika boyunca tripsin'de 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve kuluçkanın yarısına kadar hücrelere dokunun.Medya değişiminden 48 saat sonra, 293T HEK hücrelerinin süpernatantını çıkarın ve 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücre enkazını peletlemek için süpernatant'ı 300 kez G'de beş dakika santrifüj edin. Daha sonra, 0,45 mikron membran üzerinden supernatant filtre.Bir SW32 rotor ile ultracentrifuge ile virüs konsantre ve dört santigrat derece iki buçuk saat için 72, 000 kez G örnek spin. Virüs ultracentrifugation altında yoğunlaşırken, 12 iyi plaka taze embriyonik kök veya ES media Polybrene mililitre başına beş mikrogram içeren CIA mESC tedavi. Virüs konsantrasyonu bittiğinde, dikkatle supernatant aspire ve dikkatle aşırı kabarcıklar önlemek için bir X PBS 100 mikrolitre virüs pelet askıya.1.5 mililitrelik Microfuge tüpüne virüs ve bir X PBS ekleyin. Virüsü tamamen askıya almak için tüpü en düşük ayarda girdap. Kabarcıkları kaldırmak için beş ila 10 saniye boyunca bir mini masa üstü santrifüj tüp aşağı spin.12 kuyu plakaher kuyuya virüs 30 mikrolitre ekleyin. Plakayı döndürün ve örnekleri 1000 kez G'de 20 dakika santrifüj edin. 12 kuyu plakasını bir gecede 37 derece lik kantine geri yerleştirin.Ertesi sabah, taze ES medya ile medya alışverişi ve enfeksiyon 48 saat boyunca gerçekleşmesine izin. Enfeksiyon 48 saat sonra, uygun antibiyotik ekleyerek viral plazmid entegre hücreleri için seçin. Medyayı her gün değiştirin.Seçim ortamını hücrelerde %5 karbondioksit içeren 37 derecelik bir kantinde 72 ila 96 saat boyunca saklayın. Toz CEM ve dimetil sülfatoksit veya DMSO'yu bir milimolar stok konsantrasyonuna ve 100 mikromolar çalışma konsantrasyonuna askıya alarak kimyasal epigenetik değiştirici veya CEM ile devam edin. Hücreler 72 ila 96 saat seçim yapıldıktan sonra, mmC's 12 iyi formatında 100, kuyu başına hücreleri ile bölün.Hücreleri 37 derece lik bir kuluçka makinesinde 24 saat boyunca %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra ES media ile 100 nanomolar CEM'lik bir ortam çözümü hazırlayın. CIA mESC'yi bir mililitre kuyuyla beslemek için medyayı kullanın.Herhangi bir cem olmadan hücrelerin bir kuyu tutun bir kontrol olarak hizmet vermektedir. Daha sonra, eski medyayı azarlayarak ve deney süresince her 24 saatte bir yeni hazırlanmış CEM içeren cem veya CEM içermeyen ES medyasından her bir mililitre ekleyerek ortamı değiştirin. 48 saatlik CEM tedavisinden sonra, 100 nanomolar CEM ile tedavi edilen hücrelerde CEM tedavisi olmayan hücreleri floresan mikroskop kullanarak görüntüleyin.mESC morfolojisini 10 ila 40 kat büyütme de kaydetmek için faz veya parlak alan kullanarak temsili görüntüler alın. Hücreler birkaç farklılaşmış hücre ile koloniler etrafında oluşmuş olmalıdır. FITC floresan kanalı altında, her iki hücre koşullarını görüntüleyin.Daha sonra, kontrol ve CEM gaz hücreleri akış sitometri sitometri için medya aspirating tarafından izole, bir X PBS bir mililitre ile hücreleri yıkama, PBS aspirating ve edta ile 0.25% 0.25 tripsin ekleyerek sekiz ila 10 dakika. Hücrelerin artık mikroskop aracılığıyla 20 kat büyütme kullanarak büyük kümeler halinde demetlenmediğini doğrulayın. Hücreler tek bir hücre süspansiyonunda görünmüyorsa, hücreleri tam olarak denemek için p1000 pipetle hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.Bir mililitre taze ortamla tripsini söndürün ve hücreler tek hücreli süspansiyona gelene kadar serolojik pipetle hücreleri yüksek hızda yeniden askıya alın. Daha sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca hücreleri 300 kez G'de aşağı doğru çevirin. Süpernatant aspire, bir X PBS ile hücreleri yıkayın ve hücreleri santrifüj.PBS supernatant aspire ve FACS tampon 200 mikrolitre hücre pelet resuspend. Askıda hücrelerle yaklaşık 50.000'den fazla hücre üzerinde akış sitometrisi yapın ve örnekleri saniyede yaklaşık 5.000 hücrelik bir kılıf hızında çalıştırın. Son olarak, daha fazla analiz için veri dışa aktarın.Oct4 locus ve CIA mESC'deki CEM sisteminin faz görüntüleri, 100 nanomolar CEM23 veya işlenmemiş hücrelerle 48 saatlik tedaviden sonra görüntülenir ve spesifik GFP baskısına işaret eder. Floresan görüntüler, kontrol hücrelerinde parlak bir GFP ifadesi ve MESC'nin CEM23 ile tedavi edilen gfp ifadesinde azaltılmış bir Ifade gösterir. Akış sitometrisi, CIA mESC'nin 48 saat boyunca 100 nanomolar CEM23 ile tedavi edilen GFP ekspresyonunda %30'dan fazla bir azalma olduğunu gösterdi.Kromatin immünopresipite, veya CHIP, cem23 100 nanomolar ile tedavi 48 saat kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında hedef lokus h3K27ac düzeyini azalttı reveled. Bu işlemi denerken, fare embriyonik kök hücreleri ile dikkatli olmak hatırlamak önemlidir. Protokol sırasında farklılaşırlarsa, sonuçlar geçersiz kılınur.Bu teknik, geliştirildikten sonra sentetik biyoloji alanındaki araştırmacıların memeli genomundaki in vivo mekanizmaları keşfetmelerinin önünü açmıştır.

repressing-gene-transcription-redirecting-cellular-machinery-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Burada, erişkin cilt fibroblastlarının insülin salgılayan hücrelere dönüştürülmesine izin veren yeni bir yöntem sunulmaktadır. Bu teknik epigenetik dönüşüme dayanır, retroviral vektörlerin kullanımını veya stabil bir pluripotent durumun elde edilmesini içermez. Bu nedenle translasyonel tıp uygulamaları için oldukça umut vericidir.

Yetişkin Cilt Fibroblastları gelen İnsülin salgılayan hücreler elde edilir Güvenli ve Basit Yöntem olarak epigenetik Dönüşüm

Memeli hücreleri kimyasal indüklenebilir DNA hydroxymethylation ve epigenetik remodeling için içine bir mühendislik Böl-TET2 enzim (elma şarabı) tanıtmak için detaylı protokolleri mevcuttur.

Kimyasal-indüklenebilir DNA Hydroxymethylation ve epigenetik Remodeling için bir mühendislik Split-TET2 enzim

Bu iletişim kuralı canlı hayvan veya gelişmiş lac önleyici ve/veya tet harekete geçirmek sistemleri kullanarak hücreleri içinde ilgi endojen bir gen transkripsiyonu koşullu olarak kontrol edilebilir bir modeli sistemi oluşturmak için gereken adımları açıklar.

Uzaktan kumandalı sistem in vivo uygulama için işleme endojen gen ekspresyonu

DNA epigenome temsil düzenleme güçlü bir tedavi yaklaşımı hedef. Bu iletişim kuralı üretim, arıtma ve toplama tüm-içinde-bir lentiviral vektörlerin İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSC)'epigenome düzenleme uygulamaları için CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene yataklık açıklar-nöronlar türetilmiş.

Pluripotent kök hücre kaynaklı hastalık modelleri lentiviral vektör platformu için Epigenome düzenleme araçları verimli bir şekilde teslim insan içine indüklenen

Burada, gen transfeksiyonuna veya retroviral vektörlere ihtiyaç duymadan, memeli pluripotent hücrelerini verimli bir şekilde üretmek için kimyasal epigenetik silme kullanımını mekanosensing ile ilgili ipuçlarıyla birleştiren bir yöntem sunuyoruz. Bu nedenle, bu strateji translasyonel tıp için umut vericidir ve kök hücre organoid teknolojisinde kayda değer bir ilerlemeyi temsil etmektedir.

Memeli Pluripotent Hücreleri Üretmek için Epigenetik Modifikasyonu ve Biyomekanik İpuçlarını Birleştiren İki Adımlı Bir Strateji

Burada, yüksek, uzun vadeli, kararlı, hedefe yönelik susturma verimliliğine ve düşük genom çapında, hedef dışı aktiviteye sahip tasarlanmış transkripsiyonel baskılayıcıların (ETR'ler) in vitro seçimi için bir protokol sunuyoruz. Bu iş akışı, aday ETR'lerin başlangıçtaki karmaşık repertuarını, terapötik olarak ilgili ortamlarda daha fazla değerlendirme için uygun olan kısa bir listeye indirgemeye olanak tanır.

In Vitro Hedeflenen Epigenetik Susturma için Tasarlanmış Transkripsiyonel Baskılayıcıların Seçimi

Protokol, plazmid DNA transfeksiyonu ve mRNA nükleofeksiyonu kullanılarak insan hücre hatlarında Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR) tabanlı epigenom düzenleme yöntemlerini açıklar.

Plazmid DNA Transfeksiyonu ve mRNA Nükleofeksiyon Dağıtımı Kullanılarak İnsan Hücrelerinde CRISPR Epigenom Düzenleme

Bu protokol, lokusa özgü DNA metilasyonunu hassas ve azaltılmış hedef dışı etkilerle indüklemek için dCas9-DNMT3A ve dCas9-HDAC1 efektörlerini spesifik sgRNA'larla birleştiren, K562 hücrelerinde hedeflenen epigenetik düzenleme için bütünleştirici olmayan, epizomal CRISPR/dCas9 tabanlı bir sistemi tanımlar.

K562 Hücrelerinin Epigenetik Mühendisliği: dCas9-DNMT3A ve -HDAC1 Füzyon Proteinleri Kullanılarak Stabil Hedefli DNA Metilasyonu için Çift Vektörlü Epizomal Strateji

Bu yazıda, akciğer doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ikamet ve polianhidrid nanopartiküller ile ko-kültür tepki olarak aktivasyon inceleyerek murin alveoler makrofaj, hasat için protokoller açıklanmaktadır.

Polianhidrid Nanopartiküller Bağlı Mürin Alveoler Makrofajlar Hasat ve Değerlendirme Hücresel Etkinleştirme

Bu yazıda, RAW 264.7 hücreleri tarafından polianhidrid nanopartiküller veya bakteri içselleştirilmesi ölçmek için multi-spektral görüntüleme sitometrisi kullanan bir metodu tanımlar.

Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi

Öğrenin, kimyasal epigenetik değiştiriciler kullanarak kromatin modifikasyon makinelerini gen-spesifik olarak yeniden yönlendirme ve gen transkripsiyonunu geri dönüşümlü olarak bastırma yöntemini. Bu teknik, epigenetik alanında gen düzenleme mekanizmalarını incelemek için önemli bir ilerlemedir.

Kimyasal epigenetik değiştiriciler ile hücresel makine yeniden yönlendirerek Gen transkripsiyonu bastırmak

Daha fazla video keşfet