Nörojenez P19 embriyonal karsinom hücrelerini kullanarak

P19 hücre hattı nöronlar ayırt bilinmektedir. Ancak, P19 hücre hattının nöron farklılaşması için protokol bazen karmaşık. Bu yöntem, nörojenik deneyi kullanıcı dostu bir şekilde gerçekleştirmemize ve P19 hücre hattının gelecek için kullanım olasılığını genişletmemize olanak sağlar.

Başlamak için, bakım orta P19 hücreleri korumak, DMEM oluşan, glikoz litre başına 4.5 gram, ile takviye 10%fetal sığır serumu, mililitre penisilin başına 100 birim, ve mililitre streptomisin başına 100 birim. Hücreler yaklaşık% 80 konakıcı olana kadar 37 derece santigrat ve% 5 karbondioksit ortamında hücre kültürü kuluçka. Hücre kültürü şişesinden harcanan orta çıkarın ve kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS iki mililitre ile hücreleri yıkayın.

Hücrelerin monotabakasını tamamen kapsayacak şekilde %0,25 tripsin-EDTA'nın bir mililitresini ekleyin ve 2-3 dakika boyunca 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Mikroskop altında, tüm hücrelerin ayrılıp ayrılmadın mı kontrol edin. Tripsini nötralize etmek için dokuz mililitre bakım aracındaki hücreleri yeniden askıya alın.

Hücreleri 15 mililitrelik bir tüp ve santrifüj içine 200 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca hücreleri pelet için aktarın. Sonra, pelet rahatsız etmeden supernatant aspire. Peleti 10 mililitre taze bakım ortamında yeniden askıya alın ve hücre numarasını üreticinin talimatlarına göre belirlemek için bir hücre sayacı kullanın.

Yeni bir T-25 şişesinde santimetre kare başına 20,000 hücre tohumlayın ve 10 mililitreye kadar bakım ortamı ekleyin. 37 santigrat derecede kuluçka ya da %5 karbondioksit le 2-3 gün boyunca. Tripsin sindirimine başlamak için, önce süpernatantı yavaşça aspire edin ve hücreleri iki mililitre kalsiyum ve magnezyumsuz PBS ile yıkayın.

Daha sonra hücrelere bir mililitre 0.25 tripsin EDTA ekleyin ve 2-3 dakika boyunca 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit le inkübedin. Kuluçka dan sonra, tripsin nötralize etmek için, farklılaşma ortamının dokuz mililitre hücreleri resuspend, yüksek glikoz düzeyi ile DMEM oluşan ve% 5 fetal sığır serumu ile takviye, mililitre penisilin başına 100 adet, ve mililitre streptomisin başına 100 adet. Hücreleri 15 mililitrelik bir tüp ve santrifüj içine 200 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca hücreleri pelet için aktarın.

Daha sonra, yavaş yavaş supernatant aspire ve RA olmadan taze farklılaşma orta bir mililitre pelet resuspend. Hücre numarasını üreticinin talimatlarına göre belirlemek için bir hücre sayacı kullanın. Toplam nesil için, 100 mililitrelik, tedavi edilmeyen kültür yemeğine beş mikrolitre RA ile takviye edilmiş 10 mililitre farklılaştırma ortamı ekleyerek başlayın. Tohum kültür çanak bir milyon hücre ve kuluçka 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit iki gün boyunca amacıyla toplam oluşumunu teşvik etmek.

Kuluçkadan sonra, 10 mililitrelik pipetle, agregaları içeren ortamı aspire edin ve oda sıcaklığında 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Agregaların en alta yerleşmesi için 1,5 dakika bekleyin ve sonra supernatant atın. 0,5 mikromolar RA ile desteklenen taze farklılaşma orta 10 mililitre ekleyin. Agregaları 100 milimetrelik yeni bir kültür yemeğine yavaşça tohumlayın ve iki gün boyunca 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın.

Başlamak için, hücre agregalarını 15 mililitrelik bir tüpe aktarmak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın. Agregalar alt yerleşmek ve daha sonra supernatant atmak için oda sıcaklığında 1,5 dakika bekleyin. Agregaları serum ve antibiyotiksiz DMEM ile yıkayın.

Hücre agregalarının en alta yerleşmesini bekleyin, supernatant'ı atın ve %0,25 tripsin EDTA'nın iki mililitresini ekleyin. Tüpü 37 derecede 37 santigrat derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın, hücreleri süspansiyonda tutmak için her iki dakikada bir dokunun. Daha sonra, bir mililitrelik pipet kullanarak tripsin aktivitesini ve pipeti 20 kez yukarı ve aşağı durdurmak için dört mililitre bakım ortamı ekleyin.

Son olarak, hücreleri 200 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika santrifüj. Supernatant çıkarın ve bakım orta beş mililitre hücre pelet resuspend. Hücre numarasını belirlemek ve hücreleri kaplamaya devam etmek için bir hücre sayacı kullanın.

Plaka hücreleri için, ilk altı iyi bir kültür plakabakım orta kuyu başına üç mililitre ekleyin. Sonra, iyi başına 500, 000 yoğunluğunda hücreleri tohum. Plakayı 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın.

Altı kuyulu bir kültür tabağına kapak gözlük hücreleri tohum. %20 birleştiğinde Anti-MAP2 antikorile immünolemeye devam edin. Daha sonra, RNA'yı yalıtın ve MAP2, NueN, OCT4, NANOG ve GAPDH için ters transkripsiyon PCR gerçekleştirin.

Bu çalışmada nöronal farklılaşma için basitleştirilmiş bir yöntem sunulmuştur. P19 hücre hattı% 5 FBS ve 0.5 mikromolar RA ile tedavi edilmeyen bir kültür çanak kültürlü. Dört gün sonra, hücre agregaları tripsin ile ayrıştırılır ve sonraki dört gün boyunca bir yapışkan hücre kültür plakası üzerinde tohumlanır. Bu yöntemin etkinliği, farklılaşmamış bir durumda ve nörogenez sırasında P19 hücre hattının RTPCR analizi arasındaki karşılaştırma ile değerlendirilir.

Sonuçlar pluripotency genlerin ekspresyonunda hızlı bir düşüş göstermektedir, Ekim 4 ve NANOG gibi, ve nörnomal marker genlerin upregulation, MAP2 ve NeuN gibi. Bu çalışmada geliştirilen yöntemin basit olduğuna ve nörogenezin moleküler mekanizmalarının yanı sıra nörodejeneratif hastalıkların aydınlatılaç bir rol oynayacağına inanıyoruz.