Name: Roman NFAT2 hedef genleri kronik lenfositik lösemi olarak tanımlamak için bir kromatin Immunoprecipitation tahlil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Keşfedin kronik lenfositik lösemi hücrelerinde NFAT2 hedef genlerini belirlemek için kromatin immunoprecipitation yöntemini. Bu teknik, onkojenik mekanizmaları ve potansiyel tedavi stratejilerini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser DFG tarafından desteklenen MU 3340/1-1 ve Deutsche Krebshilfe vermek 111134 (her ikisi de M.R.M. için layık) verin. Elke Malenke mükemmel teknik destek için teşekkür ediyoruz).

İnsan malzeme ile yapılan tüm deneylerde Tübingen Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve Yazılı onam örnekleri bu çalışma için katkıda bulunan tüm hastalardan elde edildi.
1. izolasyon ve stimülasyon Jurkat hücreleri
Not: iletişim kuralı en iyi duruma getirmek için NFAT2 yüksek düzeyde ifade etmek için bilinen Jurkat hücre satırını kullanın. Tüm adımlar laminar akış başlık altında gerçekleştirilir.
<ol><li>RPMI su banyosu 37 ° C'de ısınma % 10 FCS ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş 1640 50 mL hazırlayın.</li>
	<li>Jurkat hücre için bir hücre kültür şişesi 37 ° C ve % 5 CO2 RPMI 1640 20 mL'de 1-2 d6 hücre/mL % 10 FCS ve % 1 penisilin/streptomisin yaklaşık 2 x 10 yoğunluğunun ile takıma Kültür (hücre Trypan ile sayılır mavi boyama ve bir Mikroskop altında Neubauer odası) ve bunları 200 x gde 5 min için centrifuging tarafından hasat.</li>
	<li>Bir pipet ile süpernatant kaldırmak ve RPMI % 10 FCS ve % 1 penisilin/streptomisin ile 1640 10 mL hücrelerde resuspend. Daha sonra bir geleneksel trypan mavi boyama ve mikroskop altında Neubauer odası içeren hücreleri saymak.</li>
	<li>Adım 1.3 200 x g de 5 min için hücrelerden santrifüj kapasitesi ve süpernatant aspirasyon tarafından kaldırın. Sonra 2 x 107 hücre/mL RPMI pipetting tarafından % 10 FCS ve % 1 penisilin/streptomisin ve transfer yeni bir konvansiyonel 5 mL tüp 1 mL ile takıma 1640 yoğunluğu, hücre resuspend.</li>
	<li>Hücreleri 32,4 nM phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) ve 1 µM ionomycin ekleyerek teşvik. 16 h 37 ° C ve % 5 CO2 açıldı tüp kapaklı için hücreleri kuluçkaya (kirlenmesini önlemek için mühürleme film için hava geçirgen kullanılabilir).</li>
</ol>2. izolasyon ve birincil CLL hücreleri insan hastalardan uyarılması
Not: Hasta numuneleri alındı ve yukarıda açıklanan7olarak uyarılmış. Tüm adımlar laminar akış başlık altında gerçekleştirilir.
<ol><li>Hastalardan kan ve bir yoğunluk gradient ayrılık gerçekleştirmek için gerekli donanımları hazırlamak: 21-G iğneler, turnike, NH4-heparin-koleksiyon şırınga (örneğin, S-monovettes), 1 x PBS ve yoğunluk gradient orta kan (Yoğunluk 1.077 g/mL) .</li>
	<li>İz kan şırınga CLL hastalarda (ca. 40 mL kan hasta başına) çizin. Ardından 50 mL konik tüp kan aktarın. 10 mL PBS şırınga yıkama ve kan-PBS-süspansiyon (kan kan hacmi tüpler sayısını ayarlamak) 50 mL tüpler havuz.</li>
	<li>15 mL taze 50 mL konik tüp yoğunluk gradient ortamda hazırlamak. Daha sonra 35 mL kan-PBS-süspansiyon dikkatle üzerinde yoğunluk gradient orta katman. Bu amaçla, tüp düz bir açıyla tutun ve yavaşça pipette kan-PBS-süspansiyon 50 mL konik tüp alt duvarına karşı. Daha fazla kan-PBS-süspansiyon biriken 50 mL konik Tüp, tüp dik açı kadar açısı artar. Kan-PBS-süspansiyon hacmine göre bu adımı yineleyin.</li>
	<li>Periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) içeren mononükleer hücre faz ayıklamak sonra 20 dk (olmadan fren) için Santrifüjü 560 x g de gerçekleştirmek. Bunu yapmak için 5 mL serolojik pipet ile yoğunluk gradient ayrılması beyaz interfaz topla ve bir yeni 50 mL konik tüp için transfer.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 50 ml PBS ve 360 x gde 5 dk santrifüj ile doldurun. Süpernatant aspirasyon tarafından kaldırın. 275 x gde 5 min için Santrifüjü ile bu adımı yineleyin. O zaman, PBS 5-10 mL 50 mL konik tüp içinde bir hastada hücrelerinin havuz.</li>
	<li>1. 3'açıklandığı gibi hücreleri saymak. Not: Hücreleri doğrudan bu yordam için kullanılabilir veya yapılacak bir B hücre izolasyon izole PBMCs hücrelerde CLL, Örneğin, manyetik hücre (Mac) sıralama yoluyla oranda bağlıdır. B hücre yalıtım önerilir ancak CLL hücre oranı toplam lenfositler (akış sitometresi ile saptanır) % 95'i yüksekse atlanabilir. CLL kan hastalar sabit ve üreticinin yönergelerine göre lysed. O zaman bir CD19-FITC ve CD5-PE antikorlar ile boyama üreticinin yönergelerine göre gerçekleştirilir ve hücreleri akış sitometresi ile analiz edilir. Bir örnek teşkil eden hasta CLL hücre oranı %89.03 olduğu Şekil 1' de gösterilmiştir. Böylece, B hücre izolasyon Bu hastada yapılması gerekiyor. Fizyolojik B hücreleri ihmal edilebilir (%3,72 örnekte) oranıdır.</li>
	<li>% 10 FCS, % 1 penisilin/streptomisin, 100 mM esansiyel olmayan amino asitler, 1 mM sodyum pyruvate ve 50 mM β-mercaptoethanol 200 x g de 5 min için önceden ısıtılmış (37 ° C) RPMI takıma 1640 10 mL hücrelerle yıkama ve süpernatant aspirasyon tarafından kaldırın.</li>
	<li>2 x 107 hücre/mL RPMI % 10 FCS, % 1 penisilin/streptomisin, 100 mM esansiyel olmayan amino asitler, 1 mM sodyum pyruvate ve 50 mM β-mercaptoethanol (37 ° C) ve dolgu hücre süspansiyon 1 mL 5 mL tüp içine takıma 1640 hücrelere ayarlayın. Not: ß-mercaptoethanol oksidatif stres önlemek için istihdam edilmektedir.</li>
	<li>Hücreleri 32,4 nM PMA ve 1 µM ionomycin ekleyerek teşvik. 16 h 37 ° C ve % 5 CO2 açıldı tüp kapaklı için hücreleri kuluçkaya (kirlenmesini önlemek için mühürleme film için hava geçirgen kullanılabilir). Not: stres düzeyini azaltmak için hücreleri 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçka stimülasyon 16 h önce 1 h için dinlenmiş.</li>
</ol>3. fiksasyon, hücre lizis ve Kromatin yamultma
Not: Hasta numuneleri ve Jurkat hücreleri sabit ve7daha önce açıklandığı gibi değişiklikler ile üretici yönergelerine göre piyasada bulunan bir çip seti ile lysed. Fiksasyonun laminar akış başlık altında gerçekleştirilir.
<ol><li>1 mL % 37 formaldehit, 1.25 M glisin 1 mL ile 1,5 mL Tüp, 4 mL 1 x PBS ile 5 mL tüp ve buz ile bir kutu ile 1,5 mL tüp hücreleri fiksasyonu için hazırlayın.</li>
	<li>Hücrelerin uyarılması için adım 1.5 ya da 2.9 ilgili kuluçka zamanında sonra 200 x g 5 min için de 5 mL tüpler spin ve PBS 500 µL 5 mL tüpler hücrelerde resuspend.</li>
	<li>340 µM formaldehit (13.5 µL % 37 formaldehit) hücrelere ekleme. Dikkatli bir şekilde yukarı ve aşağı pipetting tarafından kısa karıştırdıktan sonra 2.5 dk (Jurkat hücreleri) veya oda sıcaklığında 5 dk (hasta örnek) süspansiyon kuluçkaya. Not: Uzun süreli fiksasyon zaman primer hücre için en uygun kesme sağlamak gereklidir.</li>
	<li>Fiksasyonun durdurmak ve hemen sonra buz ve 4 ° C'de 5 min için 500 x g , santrifüj hücrelerdeyse koymak başka bir 5 dakika süreyle kuluçkaya 125 mM glisin (1.25 M glisin 57 µL) Ekle Süpernatant aspirasyon tarafından kaldırın.</li>
	<li>İki kez 200 x g 4 ° C'de 5 min için de buz gibi PBS 1 mL içeren hücreleri yıkama ve süpernatant her zaman aspirasyon tarafından kaldırın. Not: fiksasyon sonra protokol duraklatılmış. Sabit hücreleri-80 ° C'de muhafaza edilmelidir Aşağıdaki protokol kullanmak amacıyla antikor epitope fiksasyon ile maskeli değil eğer test için ek örnekler üzerinden SDS-sayfa Jel Elektroforez ve Western blot analizi için kullanılabilir. Bu adımlar protein üreticinin yönergelerine uygun 100 µg ile gerçekleştirilir. Tüm αNFAT2 antikorlar 1: 1000, GAPDH antikor 1:10000 seyreltme, seyreltme kullanılmaktadır. Uygun ve uygun olmayan antikorlar ile Jurkat hücrelerden sabit örnekleri örnek bir görüntü Şekil 2' de gösterilmiştir.</li>
	<li>Hücre Pelet yukarı ve aşağı pipetting tarafından ticari olarak mevcut lizis arabellek 1 5 mL resuspend. Sonra bir shaker buz örnekleri yer ve onlara sallayarak süre 10 dakikadır kuluçkaya. Not: lizis önce hücreleri için 10 dağıldı s sıvı azot. Bu Jurkat hücreler için yararlıdır ama birincil hasta örnekleri kaçınılmalıdır. Dağılma için 5 mL tüpler için 5 yer s 5-10 ml sıvı azot içinde belirli bir kapsayıcı. Koruyucu gözlük ve uygun Emanet eldiven giymek.</li>
	<li>Daha sonra 500 x g 4 ° C'de 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi ve süpernatant dikkatlice sökün pipetting tarafından.</li>
	<li>Yukarı ve aşağı pipetting tarafından ticari olarak mevcut lizis arabelleğinin 2 5 mL hücrelerde homojenize ve sallayarak süre 10 dakika buz üzerinde kuluçkaya. Sonra 500 x g 4 ° C'de 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi ve süpernatant dikkatlice sökün pipetting tarafından.</li>
	<li>Hücre Pelet 500 µL (Jurkat hücreleri) resuspend veya yamultma, 140 µL (hasta numuneleri) arabellek içeren 1 proteaz inhibitörü x 1 (5 µL veya 1.4 µL, sırasıyla) ve karışımı 10 dakika buz üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>Kromatin yamultma için 140 µL hücre süspansiyon (hava kabarcıkları ve tekrar bu adım numune hacmi nedeniyle gerekirse üreten önlemek) sonicator tüpler içine adım 3.9 aktarın. Tüpler odaklanmış ultra-sonicator 200-500 bp DNA parçalarının elde etmek için Ortalama bir olay gücü olan 9.375 W 7 ° C ve kayma 10 dk (hücre kültürünü) veya 7.5 dak (hasta numuneleri) bir ısıda yerleştirin.</li>
	<li>Son olarak, vasıl 15700 x g küçük santrifüj 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant yeni 1,5 mL tüp içinde toplamak.</li>
	<li>Uygun parça boyutları için test etmek için jel-elektroforez % 1.5 TBE özel jel içinde via yamultulmuş kromatin 20 µL analiz. İyi ve kötü kalite Jurkat hücrelerden yamultulmuş kromatin örnek bir görüntü Şekil 3' te gösterilmiştir. Bu noktada, protokol potansiyel olarak duraklatılmış. Yamultulmuş kromatin-80 ° C'de muhafaza edilmelidir</li>
</ol>4. kromatin Immunoprecipitation
Not: Kromatin immunoprecipitation değişiklikler7ile üretici yönergelerine göre piyasada bulunan bir çip seti ile gerçekleştirildi.
<ol><li>İmmunoprecipitations (70 µL (Jurkat hücreleri) veya 15 µL (hasta numuneleri) yamultulmuş kromatin artı bir antikor) sayısını hesaplamak ve protein kaplı A boncuk 1,5 mL tüp yağış başına 20 µL hazırlamak. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından boncuk 1 ChIP arabellek yağış 1 x 40 µL yıkayın, boncuk bir manyetik raf için 1 dk içinde dinlenmek ve süpernatant pipetting tarafından kaldırmak izin. Bu adımı, toplam dört kez tamamlayın. Sonunda, 1 x yonga arabelleği 1 ile özgün birimdeki boncuk resuspend.</li>
	<li>İmmunoprecipitation kendisi için αNFAT2 antikor (7A6) 10 µg NFAT2 onun ilişkili hedef sıralarıyla yakalamak için kullanın. Bir tavşan IgG antikor (DA1E), 2,5 µg bir IgG denetimi olarak kullanın. Taze 1,5 mL tüpler reaksiyonlar Tablo 1' de belirtildiği şekilde hazırlayın. Not: Kimin epitope fiksasyon bu protokol sırasında maskeli değil yüksek benzeşimli monoklonal antikor kullanmak önemlidir. Poliklonal antikorlar ek bir düzeyi önemli ölçüde daha uygun şekilde alınan sonuçları yorumlamak zor hale varyasyon tanıtmak.</li>
	<li>6 rpm'de dönen bir tekerlek basamakta 4.2 gecede 4 ° C'de karışım kuluçkaya.</li>
	<li>Ertesi gün spin tüpler için 5 s 7000 x g küçük santrifüj, onları bir manyetik raf için 1 dk içinde kuluçkaya ve süpernatant aspirasyon tarafından kaldırın. Boncuk her yıkama arabellekleri 1, 2, 3 ve 4 ile bir kez arka arkaya yıkayın.</li>
	<li>Bunu yapmak için boncuk yıkama arabellek 350 µL içinde resuspend ve onları 6 rpm'de dönen bir tekerlek üzerinde 4 ° C'de 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Bundan sonra tüpler 5 için spin küçük santrifüj 7000 x g s. Sonra onları manyetik bir rafa 1 dk. için yer, süpernatant kaldırın ve sonraki yıkama arabellek ekleyin.</li>
	<li>Son yıkama adım sonra süpernatant kaldırmak pipetting göre elüsyon arabelleği 1 100 µL boncuk almak ve onları 6 rpm'de dönen bir tekerlek üzerinde 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Tüpler kısa bir süre spin (5 küçük santrifüj 7000 x g , s) ve 1 dk. için manyetik bir rafa koyun.</li>
	<li>Sonra yeni bir 1,5 mL tüp pipetting tarafından süpernatant transfer ve 4 µL elüsyon arabelleğinin 2 ekleyin.</li>
	<li>Giriş denetimi oluşturmak için 1 µL yamultulmuş kromatin elüsyon arabellek 1 ve 4 µL elüsyon arabelleğinin 2 99 µL ile karıştırın (Bu kurulum, hasta başına üç tüpler vardır: bir giriş denetimi, bir IgG-denetim ve bir αNFAT2 örnek).</li>
	<li>Örnekleri 4 h 65 ° c ve bir 1,5 mL tüp Shaker 1300 rpm için kuluçkaya. 100 µL % 100 isopropanol, girdap ve spin eklemek örnekleri 5 için küçük santrifüj 7000 x g s.</li>
	<li>Kullanılabilir manyetik boncuklar iyice vortexing tarafından resuspend, boncuk 10 µL her örnek için eklemek ve 6 rpm'de dönen bir tekerlek üzerinde oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Kuluçka sonra tüpler 5 için spin 7000 x g küçük s santrifüj kapasitesi ve manyetik bir rafa 1 dk. için koyun. Süpernatant aspirasyon tarafından kaldırın.</li>
	<li>Boncuk yıkama arabellek 1 100 µL içinde resuspend. Mix ve 6 rpm'de dönen bir tekerlek üzerinde oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya tüplere tersine çevirin.</li>
	<li>Tüpler 5 için spin küçük santrifüj 7000 x g s için 1dk manyetik bir rafa koyun ve süpernatant pipetting tarafından kaldırın. Yıkama arabelleği 2 ile 4.13-4.14 adımları yineleyin.</li>
	<li>Daha sonra yıkama arabellek aspirasyon tarafından kaldırmak, boncuk elüsyon arabellek 55 µL içinde resuspend ve 15 dakika oda sıcaklığında zarlarını DNA elute için 6 rpm'de dönen tekerlek üzerinde kuluçkaya. Son olarak, tüpler 5 için spin küçük santrifüj 7000 x g s için 1dk manyetik bir rafa koyun ve süpernatant yeni 1,5 mL tüpler içine aktarmak. Not: Burada protokol potansiyel olarak duraklatılmış. Eluted DNA sonra-20 ° C'de muhafaza edilmelidir</li>
</ol>5. NFAT hedef genlerin CLL hücrelerdeki tespiti.
<ol><li>QRT-PCR reaksiyonu her örnek için yinelenen Tablo 2' de gösterildiği gibi yapmak. Not: hedef genlerin tespiti için nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) ticari olarak mevcut qRT-PCR karışımı ile gerçek zamanlı PCR enstrüman kullanarak yapılır.</li>
	<li>Beyaz 96-iyi tepki plakaları tepkiler ve RT-PCR enstrüman için kullanın. Bisiklet koşullarını aşağıdaki gibidir: 30 95 ° C s, [95 ° C 5 s, 30 60 ° C s] x 40 döngüleri. Not: Giriş (su katılmamış veya sulandırılmış 1:10, 1: 100 ve 1: 1000 su nükleaz içermeyen) bir seri seyreltme göreli zenginleştirme hesaplamak için kullanılır. Jurkat hücrelerde IL-2 olumlu denetim32kullanıldı. CD40L, NFAT2 B hücreleri, iyi bilinen bir hedef, NFAT2 bir roman hedef gen CLL33,34için örnek olarak CLL hücrelerinde ve LCK pozitif kontrol olarak kullanıldı. CD40L, IL-2 ve LCK organizatörü bölge için astar belirli reaktifler ve ekipman tabloda açıklanmıştır.</li>
</ol>6. normalleştirme ve veri analizi
Not: İlgi (IL-2, CD40L veya LCK) göreli zenginleştirme organizatörü bölgeler için normalleştirme için IgG-denetim kullanılarak hesaplanır.
<ol><li>Öncelikle, giriş seri seyreltme, IL-2, CD40L ve LCK organizatörü bölge qRT-PCR verilerden değerlendirme yazılımı aracılığıyla Ct (eşik döngüsü) değerlerini belirleyin.</li>
	<li>Konsantrasyonları ile giriş seri seyreltme için standart bir eğri tanımlayın. Bu standart eğri ile konsantrasyon için IL-2, CD40L ve LCK organizatörü bölge her örnek her kopyası için hesaplar.</li>
	<li>Daha sonra çoğaltmaları ortalamasını hesaplamak. Sonra IgG immunoprecipitation örnek bir başvuru oluşturun. Bu örnek için göreli zenginleştirme 1.0 tanımlamak ve diğer örnek (NFAT2 immunoprecipitation) Bu başvuru için karşılaştırın.</li>
	<li>Son olarak, göreli zenginleştirme örnekleri konsantrasyon IgG başvuru konsantrasyon tarafından bölünmesi ile hesaplayın.</li>
</ol>

<ol><li>Byrd, J. C., Jones, J. J., Woyach, J. A., Johnson, A. J., Flynn, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entering+the+Era+of+Targeted+Therapy+for+Chronic+Lymphocytic+Leukemia%3A+Impact+on+the+Practicing+Clinician%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician.</a> Journal of Clinical Oncology. 32 (27), 3039-3047 (2014).</li>
<li>Woyach, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+the+weak+%28signalers%29%3A+anergy+in+CLL%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Survival of the weak (signalers): anergy in CLL.</a> Blood. 121 (19), 3781-3783 (2013).</li>
<li>Hallek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+diagnosis%2C+indications+for+treatment%2C+response+assessment+and+supportive+management+of+chronic+lymphocytic%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic.</a> Blood. , (2018).</li>
<li>Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+by+calcium%2C+calcineurin%2C+and+NFAT%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT.</a> Genes and Development. 17 (18), 2205-2232 (2003).</li>
<li>Macian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFAT+proteins%3A+key+regulators+of+T-cell+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function.</a> Nature Reviews Immunology. 5 (6), 472-484 (2005).</li>
<li>Muller, M. R., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFAT%2C+immunity+and+cancer%3A+a+transcription+factor+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">NFAT, immunity and cancer: a transcription factor comes of age.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (9), 645-656 (2010).</li>
<li>Marklin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFAT2+is+a+critical+regulator+of+the+anergic+phenotype+in+chronic+lymphocytic+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">NFAT2 is a critical regulator of the anergic phenotype in chronic lymphocytic leukaemia.</a> Nature Communications. 8 (1), 755(2017).</li>
<li>Geertz, M., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+strategies+for+studying+transcription+factor-DNA+binding+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities.</a> Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).</li>
<li>Slattery, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+a+simple+code%3A+how+transcription+factors+read+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Absence of a simple code: how transcription factors read the genome.</a> Trends in Biochemical Sciences. 39 (9), 381-399 (2014).</li>
<li>Cumbo, F., Vergni, D., Santoni, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+transcription+factor+synergism+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Research%22%5BJournal%5D)">Investigating transcription factor synergism in humans.</a> DNA Research. , (2017).</li>
<li>Gade, P., Kalvakolanu, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Immunoprecipitation+Assay+as+a+Tool+for+Analyzing+Transcription+Factor+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin Immunoprecipitation Assay as a Tool for Analyzing Transcription Factor Activity.</a> Methods in molecular biology. 809, Clifton, N.J. 85-104 (2012).</li>
<li>Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ChIP-seq+in+the+discovery+of+transcription+factor+binding+sites%2C+differential+gene+regulation+mechanism%2C+epigenetic+marks+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond.</a> Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).</li>
<li>Flores, E., Picossi, S., Valladares, A., Herrero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+development+in+heterocyst-forming+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of development in heterocyst-forming cyanobacteria.</a> Biochimica et Biophysica Acta. , (2018).</li>
<li>Callens, C., Tucker, M. R., Zhang, D., Wilson, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+role+of+MADS-box+genes+in+monocot+floral+development+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Dissecting the role of MADS-box genes in monocot floral development and diversity.</a> Journal of Experimental Botany. 69 (10), 2435-2459 (2018).</li>
<li>Shen, Q., Toulabi, L. B., Shi, H., Nicklow, E. E., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forkhead+transcription+factor+UNC-130%2FFOXD+integrates+both+BMP+and+Notch+signaling+to+regulate+dorsoventral+patterning+of+the+C.+elegans+postembryonic+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The forkhead transcription factor UNC-130/FOXD integrates both BMP and Notch signaling to regulate dorsoventral patterning of the C. elegans postembryonic mesoderm.</a> Developmental Biology. 433 (1), 75-83 (2018).</li>
<li>Tang, X., Zhao, Y., Buchon, N., Engstrom, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+POU%2FOct+Transcription+Factor+Nubbin+Controls+the+Balance+of+Intestinal+Stem+Cell+Maintenance+and+Differentiation+by+Isoform-Specific+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The POU/Oct Transcription Factor Nubbin Controls the Balance of Intestinal Stem Cell Maintenance and Differentiation by Isoform-Specific Regulation.</a> Stem Cell Reports. , (2018).</li>
<li>Bertacchi, M., Parisot, J., Studer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pleiotropic+transcriptional+regulator+coup-tfi+plays+multiple+roles+in+neural+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The pleiotropic transcriptional regulator coup-tfi plays multiple roles in neural development and disease.</a> Brain Research. , (2018).</li>
<li>Aronson, B. E., Stapleton, K. A., Krasinski, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+GATA+factors+in+development%2C+differentiation%2C+and+homeostasis+of+the+small+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of GATA factors in development, differentiation, and homeostasis of the small intestinal epithelium.</a> American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (6), G474-G490 (2014).</li>
<li>Fernandez, L. P., Lopez-Marquez, A., Santisteban, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+transcription+factors+in+development%2C+differentiation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Thyroid transcription factors in development, differentiation and disease.</a> Nature Reviews: Endocrinology. 11 (1), 29-42 (2015).</li>
<li>Jiang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+role+of+Forkhead+box+O+4+transcription+factor+in+cancer%3A+bringing+out+the+good+or+the+bad%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel role of Forkhead box O 4 transcription factor in cancer: bringing out the good or the bad.</a> Seminars in Cancer Biology. , (2018).</li>
<li>Daniel, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+Activation+in+Neural+Stem+Cells+Drives+Tumorigenesis+which+can+be+Ameliorated+by+Targeting+the+cAMP+Response+Element+Binding+%28CREB%29+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">PI3K Activation in Neural Stem Cells Drives Tumorigenesis which can be Ameliorated by Targeting the cAMP Response Element Binding (CREB) Protein.</a> Neuro-Oncology. , (2018).</li>
<li>Chen, W. T., Chen, Y. K., Lin, S. S., Hsu, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperforin+Suppresses+Tumor+Growth+and+NF-kappaB-mediated+Anti-apoptotic+and+Invasive+Potential+of+Non-small+Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Hyperforin Suppresses Tumor Growth and NF-kappaB-mediated Anti-apoptotic and Invasive Potential of Non-small Cell Lung Cancer.</a> Anticancer Research. 38 (4), 2161-2167 (2018).</li>
<li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22">Current protocols in molecular biology</a>. , Wiley & sons. (1994).</li>
<li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions%3A+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Research. 9 (13), 3047-3060 (1981).</li>
<li>Fujita, T., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+Analysis+of+Genome+Functions+Using+Locus-Specific+Chromatin+Immunoprecipitation+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Regulation+and+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Biochemical Analysis of Genome Functions Using Locus-Specific Chromatin Immunoprecipitation Technologies.</a> Gene Regulation and Systems Biology. 10 (Suppl 1), 1-9 (2016).</li>
<li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12893176">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31 (1), 76-82 (2003).</li>
<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+protein-DNA+interactions+in+vivo%3A+distribution+of+RNA+polymerase+on+specific+bacterial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (14), 4275-4279 (1984).</li>
<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li>
<li>Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+protein-DNA+interactions+in+vivo+with+formaldehyde%3A+evidence+that+histone+H4+is+retained+on+a+highly+transcribed+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene.</a> Cell. 53 (6), 937-947 (1988).</li>
<li>Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+cellular+regulation+by+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery of cellular regulation by protein degradation.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34469-34489 (2008).</li>
<li>Hebbes, T. R., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+link+between+core+histone+acetylation+and+transcriptionally+active+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin.</a> EMBO Journal. 7 (5), 1395-1402 (1988).</li>
<li>Decker, E. L., Skerka, C., Zipfel, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+growth+response+protein+%28EGR-1%29+regulates+interleukin-2+transcription+by+synergistic+interaction+with+the+nuclear+factor+of+activated+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The early growth response protein (EGR-1) regulates interleukin-2 transcription by synergistic interaction with the nuclear factor of activated T cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (41), 26923-26930 (1998).</li>
<li>Grammer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD40+ligand+expressed+by+human+B+cells+costimulates+B+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The CD40 ligand expressed by human B cells costimulates B cell responses.</a> Journal of Immunology. 154 (10), 4996-5010 (1995).</li>
<li>Pham, L. V., Tamayo, A. T., Yoshimura, L. C., Lin-Lee, Y. C., Ford, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+NF-kappaB+and+NFAT+activation+in+aggressive+B-cell+lymphomas+synergistically+activates+the+CD154+gene+and+maintains+lymphoma+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Constitutive NF-kappaB and NFAT activation in aggressive B-cell lymphomas synergistically activates the CD154 gene and maintains lymphoma cell survival.</a> Blood. 106 (12), 3940-3947 (2005).</li>
<li>Zhou, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acid-sensing+ion+channel%2C+ASIC2%2C+promotes+invasion+and+metastasis+of+colorectal+cancer+under+acidosis+by+activating+the+calcineurin%2FNFAT1+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+and+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The acid-sensing ion channel, ASIC2, promotes invasion and metastasis of colorectal cancer under acidosis by activating the calcineurin/NFAT1 axis.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 130(2017).</li>
<li>Estrada-Aviles, R., Rodriguez, G., Zarain-Herzberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiac+calsequestrin+gene+transcription+is+modulated+at+the+promoter+by+NFAT+and+MEF-2+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">The cardiac calsequestrin gene transcription is modulated at the promoter by NFAT and MEF-2 transcription factors.</a> PloS One. 12 (9), e0184724(2017).</li>
<li>Kadziolka, B., Lesniak, W., Filipek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CacyBP%2FSIP+expression+by+NFAT1+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of CacyBP/SIP expression by NFAT1 transcription factor.</a> Immunobiology. 222 (8-9), 872-877 (2017).</li>
<li>Lieb, J. D., Liu, X., Botstein, D., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-specific+binding+of+Rap1+revealed+by+genome-wide+maps+of+protein-DNA+association%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Promoter-specific binding of Rap1 revealed by genome-wide maps of protein-DNA association.</a> Nature Genetics. 28 (4), 327-334 (2001).</li>
<li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+location+and+function+of+DNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide location and function of DNA binding proteins.</a> Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).</li>
<li>Iyer, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+binding+sites+of+the+yeast+cell-cycle+transcription+factors+SBF+and+MBF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic binding sites of the yeast cell-cycle transcription factors SBF and MBF.</a> Nature. 409 (6819), 533-538 (2001).</li>
<li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
<li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).</li>
<li>Schmid, C. D., Bucher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Seq+data+reveal+nucleosome+architecture+of+human+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ChIP-Seq data reveal nucleosome architecture of human promoters.</a> Cell. 131 (5), author reply 832-833 831-832 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Başarılı bir çip tahlil yapmak kritik uygun bir antikor yelpazesi ve kesme işlemi25kromatin optimizasyonu adımlardır. ΑNFAT2 antikor seçimini bu protokolü geliştirilmesi sırasında özellikle zor olduğu ortaya çıktı. Birkaç αNFAT2 antikorlar piyasada bulunan ve western Blot için bu inşaat para cezası ve diğer uygulamaların çoğunluğu olmakla birlikte, klon 7A6 başarıyla ChIP7için kullanılan tek antikor yapıldı. Hatta sözde aynı 7A6 antikorlar, farklı üreticilerin çip performan...

CD19, CD23 ve CD5 ayrı birikimi sergilenmesi olgun B ifade1hücreleri, Batı ülkelerinde erişkinlerde en sık görülen lösemi kronik lenfositik lösemi (CLL) temsil eder. Hastaların çoğunda uzun yıllar özel tedavi gerektiren değil bir tembel hastalığı kursu sergi. Buna ek olarak, bazı hastalarda acil tedavi müdahaleler bağışıklık-kemoterapi veya diğer hedefli tedaviler2,3ile gerektiren hızlı ilerleme göster. Nükleer faktör aktive T hücrelerinin (NFAT) transkripsiyon faktörleri çeşitli gelişim kontrol ve harekete geçirmek oluşum içinde çok sayıda hücre türleri4,5,6bir ailedir. Biz son zamanlarda overexpression ve anayasal NFAT2 CLL hücrelerin aktivasyonu hastaların tembel hastalığı7ile gösterdi. Burada, B hücre reseptörü stimülasyon anerji7adı verilen yanıt vermeyen bir durumuna düzenlemektedir. NFAT2 ve lenfosit özel protein Tirozin kinaz (LCK) organizatörü için bağlar LCK ifade insan hücrelerinde CLL, belirli kromatin immunoprecipitation tahlil düzenleyen göstermek için (ChIP) geliştirilen istihdam ve.
Çip transkripsiyon faktörleri gen ifade8' rolünü araştırmak için çeşitli teknikler biridir. Gen ifadesinin sıkıca çok karmaşık bir şekilde çeşitli düzenleyici kurumlar tarafından bu işlemi9,10,11,12' yeri doldurulamaz bir katılan transkripsiyon faktörleri ile orkestra. Zamansal ve mekansal bağlamda Gen ifadesinin düzenlenmesine transkripsiyon faktörleri çok sayıda türü (Örneğin, kalkınma ve farklılaşma)13,14,15'tespit edilmiştir, 16,17,18. Transkripsiyon faktörleri içeren karmaşık denetimi düzenekleri hataları patolojik süreçler kanser19,20de dahil olmak üzere çeşitli için yol açabilir. Bu nedenle, transkripsiyon faktörleri ve ilgili hedeflerine kimliği roman tedavi caddeleri21,22sunabilir. Bu ilginç alan araştırmak için çeşitli yöntemler çip, elektroforetik hareketlilik üst karakter tahlil (Emsan), çeşitli DNA açılan deneyleri ve muhabir-deneyleri8,11,12, gibi kullanılabilir 23 , 24.
Belirli bir transkripsiyon faktörü genom belirli bölgeleri ile etkileşim içinde vivo çip bir ideal tekniği25olduğunu göstermektir. Bu amaçla, DNA ve ilişkili proteinler canlı hücreler arasında UV ışınlama veya formaldehit (çapraz bağlı çip, XChIP) kullanarak çapraz bağlı. Bu adım daha iyi DNA ve protein kurtarma sözde yerli çip (NChIP)26içinde elde etmek için atlanır. DNA-protein kompleksleri daha sonra yaklaşık 200-500 baz çifti (bp) ve immunoprecipitated ilgi transkripsiyon faktörü karşı spesifik bir antikor kullanarak hücre artıkları üzerinden parçalara sonication tarafından nın yaşadığı. İlişkili DNA parçalarının sonra saf ve PCR, moleküler klonlama ve sıralama ile karakterize. İmmunoprecipitated DNA analiz için microarrays (ChIP-on-Chip) veya yeni nesil sıralama (ChIP-Seq) alternatif tekniklerini kullanın.
Çip Gilmour tarafından tanıtılan ilk ve ne zaman onlar kullanılan UV 1984 Lis ışık kovalent kullandığında DNA ve yaşam bağlı proteinler bakteriler27. Hücre lizis ve bakteriyel RNA polimeraz immunoprecipitation bilinen genlerin belirli probları RNA polimeraz yoğunluğu ve in vivo dağıtım eşlemek için kullanılmıştır. Yöntemi daha sonra aynı müfettişler tarafından ökaryotik RNA polimeraz II Isı şok protein genlerinde Drosophila28tarihinde dağıtım analiz etmek için kullanıldı. XChIP tahlil daha fazla Varshavsky ve histon H4 Derneği Isı şok protein genler29,30ile çalışmaya cross-linking formaldehit ilk kullanan iş arkadaşlarınızla tarafından rafine. Doğal olarak sağlam epitopları yüzünden daha iyi bir DNA ve protein kurtarma avantajı taşıyan NChIP yaklaşım ve bu nedenle, daha fazla antikor özgüllük, ilk açıklanan Hebbes ve 198831meslektaşları tarafından.
Çip DNA-protein etkileşimleri analiz etmek için diğer teknikleri ile karşılaştırıldığında aslında, transkripsiyon faktörü gerçek etkileşim incelenen vivo içinde ve hiçbir sondalar olabilir veya yapay koşullar arabellekleri veya jeller tarafından oluşturulan avantajdır 8,11,12istihdam. ChIP yeni nesil sıralama ile birleştirerek, birden çok hedef aynı anda belirlenebilir.
Bu tekniğin büyük sınırlamalar olduğu gibi organizmalar25büyük ölçekli deneyleri kendi sınırlı uygulanabilirliği vardır. Fark gen ifade desenleri analiz de ilgili proteinler düşük seviyelerde sadece ya da dar zaman pencereleri sırasında gösterilir Eğer çip teknikleri kullanarak zor olabilir. Başka bir potansiyel olarak sınırlayıcı faktör çip11için uygun uygun bir antikor durumu olduğunu.
Burada sunulan çip Protokolü hedef genlerin transkripsiyon faktörü in vivo tanımlanması için nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) tarafından istihdam edilecek. Özellikle, yeni hedef genler CLL NFAT2 tanımlamak için hedefi oldu. Çip doğrudan NFAT2 bağlama organizatörü bölgelere farklı hedef genlerin insan CLL hasta hücrelerinde doğal koşullar altında göstermek için potansiyel nedeniyle seçildi.

<table><tbody><tr><td>1 X PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL tüp çalkalayıcı Themomixer konfor</td><td>Eppendorf</td><td>5355 000.011</td><td>Benzer aletlerle ikame edilebilir</td></tr><tr><td>10X Cıvata Numune Azaltıcı</td><td>Ajan Thermo Scientific</td><td>B0009</td><td></td></tr><tr><td>20X Cıvata MES SDS Çalışan Tampon</td><td>Thermo Scientific</td><td>B0002</td><td></td></tr><tr><td>%37 Formaldehit pa, ACS</td><td>Roth</td><td>4979.1</td><td></td></tr><tr><td>4X Bolt LDS Numune Tamponu</td><td>Thermo Scientific</td><td>B0007</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NFAT2 antikoru</td><td>Alexis</td><td>1008505</td><td>Klonu 7A6</td></tr><tr><td>Anti-NFAT2 antikoru</td><td>Hücre Sinyali</td><td>8032S</td><td>Klon D15F1</td></tr><tr><td>Anti-NFAT2 antikoru ChIP Sınıfı</td><td>Abcam</td><td>ab2796</td><td>Klon 7A6</td></tr><tr><td>büyük Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>Benzer aletlerle ikame edilebilir</td></tr><tr><td>CD19-FITC fare Anti-insan</td><td>BD Biosciences</td><td>555412</td><td>Klon HIB19</td></tr><tr><td>CD5-PE fare Anti-insan CD5</td><td>BD Biosciences</td><td>555353</td><td>Klon UCHT2</td></tr><tr><td>Yoğunluk gradyan ortamı Biocoll (Yoğunluk 1,077 g / ml)</td> <td>Merck</td><td>L 6115</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Tüpü 1.5 mL</td><td>eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>FBS üstün</td><td>Merck</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>Akış Sitometresi</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td>Benzer aletlerle ikame edilebilir</td></tr><tr><td>Halt Proteaz ve Fosfataz İnhibitörü Kokteyli (100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 Jel Transfer Cihazı</td><td>Thermo Scientific</td><td>IB21001</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 Transfer Yığınları, nitroselüloz, normal boy</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td>IB23001</tr><tr>Histonlar <td>Diagenode</td><td>C01010059</td><td></td>İyonomisin kalsiyum tuzu<td>için iDeal ChIp-seq kiti</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3909</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680LT Eşek anti-Tavşan IgG (H + L), 0.5 mg</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68023</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Keçi anti-Fare IgG (H + L), 0.1 mg</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>925-32210</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey Kızılötesi Görüntüleme Sistemi</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>B446</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Çok Kuyulu Plaka 96, beyaz</td><td>Roche</td><td>4729692001</td><td>Farklı gerçek zamanlı PCR cihazlarında diğer plakalarla ikame edilebilir</td></tr><tr><td>Lysing Solution OptiLyse B</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1400</td><td></td></tr><tr><td>M220 AFA sınıfı su</td><td>Covaris 520101</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M220 Odaklanmış ultrasonicator</td><td>Covaris</td><td>500295</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik raf, DynaMag-15 Mıknatıs</td><td>Thermo Scientific</td><td>12301D</td><td>Benzer aletlerle ikame edilebilir</td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler Çözeltisi 100X</td><td>Thermo Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskobu Axiovert 25</td><td>Zeiss</td><td>451200</td><td>Benzer aletlerle</td></tr> <tr><td>ikame edilebilirmicroTUBE AFA Fiber Ön Yarık Geçmeli Kapak 6x16mm</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer geliştirilmiş sayma haznesi</td><td>Karl Hecht GmbH & &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Co KG</td><td>40442012</td><td>Benzer aletlerle ikame edilebilir</td></tr><tr><td>NH4 Heparin Monovette</td><td>Sarstedt</td><td>02.1064</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>Promega</td><td>P1193</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE %4-12 Bis-Tris Protein Jelleri, 1.0 mm, 15 oyuklu</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey&reg; Engelleme Tamponu (TBS) 500 mL</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>927-50000</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin 100X</td><td>Merck</td><td>A2213</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR Green FastMix</td><td>Quanta Bio</td><td>95072-012</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Primer CD40L promotor bölge ileri</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>5'- ACTCGGTGTTAGCCAGG-3'</td></tr><tr><td>Primer CD40L promotor bölgesi ters</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>5'-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3'</td></tr><tr><td>Primer IL-2 promotor bölgesi ileri</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>5'-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3'</td></tr><tr><td>Primer IL-2 promotor bölgesi ters</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>5'-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3'</td></tr><tr><td>Primer LCK promotor bölgesi forvet</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>5'-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3'</td></tr><tr><td>Astar LCK promotor bölgesi ters</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>5'-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3'</td></tr><tr><td>Tavşan mAb IgG XP İzotip Kontrol</td><td>Hücresi Sinyalizasyonu</td> <td># 3900S</td><td>Klon DA1E</td></tr><tr><td>Gerçek zamanlı PCR cihazı</td><td>Roche</td><td>LightCycler 480</td><td>Benzer aletlerle ikame edilebilir</td></tr><tr><td>Silindirli karıştırıcılar</td><td>Phoenix Instrument</td><td>RS-TR 5</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Orta, GlutaMAX Takviyesi</td><td>Thermo Scientific</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Güvenlik-Multifly-iğne 21G</td><td>Sarstedt</td><td>851638235</td><td></td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 Önceden Boyanmış Protein Standardı</td><td>Thermo Scientific</td><td>LC5925</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalayıcı Duomax 1030</td><td>Heidolph Aletleri</td><td>543-32205-00</td><td>Benzer aletlerle değiştirilebilir</td></tr><tr><td>küçük Santrifüj</td><td>Termo Bilimsel</td><td>Heraeus Fresk 17</td><td>Benzer aletlerle ikame edilebilir</td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat</td><td>Termo Bilimsel</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-Merkaptoetanol</td><td>Termo Bilimsel</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Tris Tamponlu Salin (TBS-10X)</td> <td>Hücre Sinyalizasyonu</td> <td># 12498</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93595-50ML</td><td></td></tr></tbody></table>

roman nfat2 hedef genleri kronik lenfositik lösemi olarak tanımlamak için bir kromatin immunoprecipitation tahlil

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Kronik Lenfositik Lösemi (CLL) Malign B hücre klonlar genişlemesi ile karakterize ve Batı ülkelerinde en sık görülen lösemi temsil eder. CLL hastaların çoğu hastalığın bir tembel seyrini yanı sıra bir anergic fenotip onların lösemi hücrelerinin dış uyarmaya yanıt vermeyen bir B hücre reseptörü atıfta göster. Biz son zamanlarda transkripsiyon faktörü NFAT2 anerji CLL içinde çok önemli bir regülatör olduğunu göstermiştir. Farklı hastalıkların bir transkripsiyon faktör rol analizinde büyük bir sorun, belirli hedef genlerin tanımlamasıdır. Aydınlatma meydana mekanizmaları ve potansiyel terapötik müdahaleler için çok önemli bu. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) protein-DNA etkileşimleri göstermek için klasik bir tekniktir ve bu nedenle, doğrudan hedef genlerin transkripsiyon faktörlerin memeli hücreleri tanımlamak için kullanılabilir. Burada, çip doğrudan hedef gen NFAT2 insan CLL hücrelerinde, LCK tanımlamak için kullanıldı. DNA ve ilişkili proteinler formaldehit kullanarak çapraz ve daha sonra yaklaşık 200-500 baz çifti (bp) DNA parçaları içine sonication tarafından sheared. NFAT2 ile ilişkili çapraz bağlı DNA parçalarının çoğu o zaman seçime bağlı olarak bir αNFAT2 antikor kullanarak hücre artıkları üzerinden immunoprecipitated. Arıtma sonra ilişkili DNA parçalarının nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) yolu ile tespit edilir. DNA dizileri belirgin zenginleştirme ile genom NFAT2 vivo içindetarafından hedef bölgeleri temsil eder. DNA ve gerekli antikor seçimi uygun kesme için bu yöntemin uygulama başarılı özellikle çok önemli. Bu iletişim kuralı NFAT2 doğrudan etkileşim hedef genleri olan gösteri için idealdir. Büyük ölçekli deneyleri birden fazla transkripsiyon faktörleri bozulmamış canlıda hedef genlerin Analizi çip istihdam için zorluk onun büyük kısıtlamadır.

Şekil 1 CD19-FITC ve CD5-PE antikorlar ile boyama sonra gerçekleştirilen bir CLL hasta bir örnek Akış Sitometresi Analizi gösterir. Şekil 1a lenfositler, perdeleme CLL hastaların kan hücrelerinde çoğunluğu temsil eden gösterir. Şekil 1b gösterir CD19 oranı+/CD5+ <stro...

Kronik Lenfositik Lösemi (CLL) Batı dünyasında en sık görülen lösemi var. NFAT transkripsiyon faktörleri önemli düzenleyiciler geliştirme ve harekete geçirmek içinde çok sayıda hücre tipleri vardır. Burada, NFAT2, roman hedef genlerin tanımlamak için insan CLL hücrelerinde kromatin immunoprecipitation (ChIP) kullanımı için bir iletişim kuralı mevcut.

Roman NFAT2 hedef genleri kronik lenfositik lösemi olarak tanımlamak için bir kromatin Immunoprecipitation tahlil

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Bu yöntem, potansiyel terapötik müdahaleler geliştirmek için putatif hedef genlerin ve patojenik mekanizmaların belirlenmesi gibi onkoloji alanında önemli bilgilerin sağlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, NFAT2 ve diğer transkripsiyon faktörlerinin bilinen ve yeni hedef genlerle etkileşimini saptayabilmedir. Optimal fiksasyon ve kesme koşulları kurmak zor olduğundan genellikle bu yönteme yeni bireyler mücadele edecek.1.5 mililitrelik bir tüpü %37 formaldehit mililitre ile doldurmaya başlamak için. Daha sonra başka bir 1.5 mililitrelik tüpü, beş mililitrelik bir tüpte 1,25 molar glisin mililitresi ve dört mililitre PBS doldurun. Daha sonra, hücrelerin uyarılmasından sonra metin protokolüne göre hücreleri döndürür ve hücreleri 500 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alır ve tüpü buz dolu bir kutuya yerzein.Hücrelere 13,5 mikrolitre %37 formaldehit ekleyin ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın. Sonra oda sıcaklığında süspansiyon kuluçka. Bundan sonra, fiksasyon durdurmak için 1.25 molar glisin 57 mikrolitre ekleyin.Ve süspansiyonun oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatmasını bekleyin. Kuluçka periyodundan hemen sonra hücreleri buza yerve hücreleri

a-chromatin-immunoprecipitation-assay-to-identify-novel-nfat2-target

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu protokol, kromatin immunoprecipitation (ChIP) bir sinyal iletim yolu ile indüklenen transkripsiyonu düzenleyen kromatin şablon dinamik değişiklikleri incelemek için nasıl kullanıldığını açıklar.

Kromatin Immunoprecipitation İnsan Hücrelerinde Aktif Gen İfadesi Testi Dinamik Histon Modifikasyon (ChIP)

Bu videoda, mikrokokal nükleaz enzimatik sindirimi kullanarak kromatin kesme protokolü açıklanmaktadır. Kromatin kesme, insan kronik miyeloid lösemi hücrelerinde protein-DNA etkileşimini araştırmaya yardımcı olan Kromatin immünopresipitasyonu veya ChIp iş akışında önemli bir adımdır. Özellik protokolünde kromatin kesme, sonikasyon kullanılarak gerçekleştirilir.

Kromatin kesme: Enzimatik sindirim kullanarak kromatin parçaları oluşturmak için bir yöntem

Bu video, protein-DNA etkileşimlerini göstermek için klasik bir teknik olan kromatin immünopresipitasyon (ChIP) testi için protokolü açıklar. Bu teknik, insan kronik lenfositik lösemi hücrelerindeki hedef genleri tanımlamak için kullanılır.

Kromatin İmmünopresipitasyon Deneyi: Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimlerini İncelemek İçin Bir Teknik

Bu videoda, proteine bağlı kromatin fragmanlarının seçici immünopresipitasyonu yoluyla oligodendrosit öncü hücrelerinin genomik DNA'sının belirli bölgelerindeki protein bağlanma bölgelerini tanımlamak için kromatin immünopresipitasyon tekniğini gösteriyoruz. Bu yöntem, gen regülasyonunda yer alan transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere çeşitli düzenleyici proteinlerin etkileşimini incelemeye yardımcı olur.

Genomik DNA Üzerindeki Hedef Protein Bağlanma Bölgelerini Belirlemek için Kromatin İmmünopresipitasyonu

Biz primer T hücreleri kullanarak kromatin immunoprecipitation için bir sağlam bir yöntem tarif. Metodu standart yaklaşımlar üzerine kurulmuştur, ama hücrelerin sınırlı bir miktarda için verimliliği artırmak koşulları ve reaktifler belirli bir kümesi kullanır edilir. Önemli olarak, veriler analiz aşaması bölgesinin, bir ayrıntılı bir açıklama sunulmaktadır edilir.

Biyokütle Limit Tutarlar kullanarak Verimli Kromatin Immunoprecipitation

Burada, iki çift proteomik teknikleri, yani Elektroforez (2DE) ve kütle spektrometrisi (MS) 2 boyutlu, diferansiyel primer örnekleri, iki veya daha fazla grup arasından / translasyon sonrası modifiye edilmiş proteinler olarak ifade teşhis edilmesi için bir protokol açıklar. Bu yaklaşım, birbirine işlevsel deneyler ile, prognostik parametreler / terapötik hedeflerin tanımlanması ve karakterizasyonu sağlar.

Protein fonksiyonu için bir 2DE-Jel Spot: Kronik Lenfositik Lösemide HS1 öğrendim Ders

Burada açıklanan protokol, farklı koşullar altında kültürlenen kronik lenfositik lösemi (KLL) hücrelerinde pürin metabolizmasını ölçmek için ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (RP-HPLC) kullanan kolay ve tekrarlanabilir bir yöntemi temsil eder.

HPLC tabanlı Testi İnsan Kronik Lenfositik Lösemi Hücrelerinde Ekstraselüler Nükleotid / Nükleozid Metabolizması Monitör

Bu çalışma, kronik lenfositik lösemi (KL) hastalarında farklı şekilde metilasyona uğramış CpG bakımından zengin bölgelerin tanımlanması için optimize edilmiş bir metil-CpG-bağlanma alanı (MBD) sıralama protokolünü ve bir hesaplama hattını açıklamaktadır.

Kronik Lenfositik Lösemi Hastalarında Metil-CpG-Bağlayıcı Alan Yakalamaya Dayalı Bir Yöntem Kullanarak Kapsamlı DNA Metilasyon Analizi

Burada genom çapında bağlamasında oligodendrocyte transkripsiyon faktörü 2 (Olig2) Akut arıtılmış beyin oligodendrocyte öncü hücreleri (OPCs) düşük-hücre Kromatin immunoprecipitation (ChIP) gerçekleştirerek analiz etmek için tasarlanmış bir protokol mevcut , Kütüphane hazırlık, yüksek işlem hacmi sıralama ve bioinformatic veri analizi.

Transkripsiyon faktörü Olig2 genomik bağlayıcı siteleri içinde akut tanımlayan PDGFRα + hücreleri tarafından analiz sıralama düşük hücreli Kromatin Immunoprecipitation saf

Bu protokol, primer kronik lenfositik lösemi hücrelerinden nükleer ve sitoplazmik fraksiyonların optimizasyonu ve daha sonra verimli bir şekilde üretilmesini sağlar. Bu örnekler protein lokalizasyonunun yanı sıra hücre stimülasyonu ve ilaç tedavisi üzerine nükleer ve sitoplazmik bölmeler arasında gerçekleşen protein ticaretindeki değişiklikleri belirlemek için kullanılır.

Nükleer/Sitoplazmik Protein Ticaretini İzlemek Için Primer Kronik Lenfositik Lösemi Hücrelerinin Subsellüler Fraksiyonları

Bu el yazması, optimal nötrofil canlılığını ve yüksek kütüphane kalitesini garanti etmeyi amaçlayan, murin kemik iliğinden nötrofillerden oluşan bir ATAC-seq kütüphanesi hazırlamak için bir protokolün ana hatlarını çizmektedir. BMC hazırlama, immünomanyetik sıralama ve kütüphane yapımı hakkında adım adım talimatlar sunarak, özellikle nötrofilleri incelemeye yeni başlayanlar için değerli bir rehber görevi görür.

Murin Kemik İliği Kaynaklı Nötrofillerin ATAC-Seq Kütüphanesi Hazırlanması

Keşfedin kronik lenfositik lösemi hücrelerinde NFAT2 hedef genlerini belirlemek için kromatin immunoprecipitation yöntemini. Bu teknik, onkojenik mekanizmaları ve potansiyel tedavi stratejilerini anlamaya yardımcı olur.

Roman NFAT2 hedef genleri kronik lenfositik lösemi olarak tanımlamak için bir kromatin Immunoprecipitation tahlil

Daha fazla video keşfet