Name: Tüberküloz Mycobacterium marinum enfekte yetişkin zebra balığı içinde modelleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Keşfedin, Mycobacterium marinum ile yetişkin zebra balığında tüberküloz modellemesi yapmayı. Bu yöntem, bakteri yükü ve bağışıklık yanıtını aynı bireyden ölçerek hastalık patogenezini incelemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Fin Kültür Vakfı (H.L. tarafından), Tampere tüberküloz Vakfı (H.L., L.-M.V., M.M.H., milletvekili), Finlandiyalı Anti-tüberküloz Derneği (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., temeli desteklenen M.M.H., milletvekili), Sigrid Jusélius Vakfı (milletvekili), Emil Aaltonen Vakfı (M.M.H.), Jane ve fotograf Erkko Vakfı (milletvekili) ve Finlandiya Akademisi (milletvekili). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo ve Jenna Ilomäki teknik yardım kabul vardır. Yazarlar Tampere zebra balığı Laboratuvar Hizmetleri için kabul.

Tüm zebra balığı deneylerin hayvan deney kurulu Finlandiya (ESAVI/8245/04.10.07/2015) tarafından onaylanmıştır. Yöntemleri Yasası (497/2013) ve Finlandiya bilimsel veya eğitim amacıyla kullanılan hayvanların korunması hükümet Kararnamesi (564/2013) göre gerçekleştirilir.
1. kültür, Mycobacterium marinum
Not: Mycobacterium marinum bir patojen yüzeysel enfeksiyon insanlarda neden yeteneğine olduğundan, bu bakteri ile çalışmaya başlamadan önce biohazard atık bertaraf ve kişisel güvenliği yerel yönergeleri öğrenin.
<ol><li>Kültür M. marinum 7 H 10 üzerinde plaka en az 5 gün için OADC (oleik asit, albümin, dekstroz, katalaz) zenginleştirme ve % 0,5 v/v gliserol 29 ° c, % 10 ile desteklenmiştir. M. marinum kültürler taze bakteri dondurucudan alarak her iki hafta ve her hafta yeni bir tabağa aktarma korumak. Not: M. marinum sucul türler bulaşmasını doğal balık patojen ve zebra balığı stokları bakteri ile kontamine değil için önlemler almak önemlidir. Virüslü zebra balığı ve bakteri ile kontamine öğeleri yetiştirme tesislerinden ayrı tutulması gerek.</li>
	<li>Steril 1 µL aşılama döngü aseptik bir loopful M. marinum bakteri kütlesinin 7 H 9 10 mL içeren bir hücre kültür şişesi aktarmak için kullanmak % 10 ADC (albumin, dekstroz, katalaz) zenginleştirme, %0,2 v/v polysorbate 80 ve %0,2 v/v ile orta gliserol. Kültür yaklaşık bir OD600 (optik yoğunluk) 0.7 sallayarak olmadan karanlıkta 29 ° C'de 3-4 gündür. Kap gevşek bırakın veya bir filtre kapağı gazlar yeterli alışverişi için izin vermek için kullanın. Not: Polysorbate 80 toplama bakterilerin önlemek için orta olarak eklenir. Buna ek olarak, ışığa maruz kalma fenotipik değişiklikler bakteri kolonileri (Örneğin, beyaz sarı renk değişiklikleri) yol açar. Bunu önlemek için kültürler karanlıkta bırakın.</li>
	<li>OD600değeri ile spektrofotometre ölçmek. 0,07 – 0,09, OD600 sıvı kültür sulandırmak ve sallayarak olmadan karanlıkta 29 ° C'de 2 gün boyunca kültür devam edin. Kap gevşek bırakın. Not: Bu iki gün boyunca, yaklaşık 0,5 karşılık gelen erken bir log fazı için bir OD600bakteriyel süspansiyon ulaşacak.</li>
</ol>2. yetişkin zebra balığı bulaşmasını için hazırlanması bakteriyel çözüm
<ol><li>Bakteriyel süspansiyon büyük bir steril küvet veya bir 15 mL tüp aktarmak ve en büyük kümeleri yerleşmek izin vermek 15 dakika oda sıcaklığında karanlıkta yerleştirin.</li>
	<li>En iyi 5 – 7 mL süspansiyon temiz bir tüp veya bir küvet aktarmak ve OD600ölçmek. Bu üst aşama süspansiyon enfeksiyonlar için kullanın.</li>
	<li>M. marinum kültürünün 1 mL taze tüp ve 10.000 x gde 3 dk santrifüj içine toplamak. Süpernatant kaldırmak ve pelet 1 mL steril 1 x PBS resuspend.</li>
	<li>Seyreltik steril 1 kullanarak istenen bakteriyel toplama ulaşmak için PBS 0.3 mg/mL fenol kırmızı bir izleyici olarak x. Seyreltilmiş süspansiyon üç aliquots bölün. Not: CFU (koloni oluşturan birimler) vs önceden belirlenmiş bir OD600 kullanın / µL eğrisi seyreltme tahmin etmek için gerekli içinde 5 µL enjeksiyon cilt34aranan bakteri sayısını bulmak için. OD600 ve bakteriyel süspansiyon konsantrasyon arasındaki ilişkiyi gerçek enfeksiyon deneyler başlamadan önce doğrulanması gerekiyor. Bu doğrulama veri toplamak için iki hafta saklıdır.</li>
	<li>1 mL şırınga kullanarak, yavaş yavaş çekme yoluyla 27 G süspansiyon iğne 3 x. Her aliquot için kullanmadan önce bu adımı gerçekleştirin. Not: aynı bakteriyel çözüm daha 2 h için kullanmayın.</li>
</ol>3. deneysel mayi enjeksiyon ile M. marinum enfeksiyon
<ol><li>Parafilm film bir parça üzerine bakteriyel seyreltilmiş çözeltinin 5 µL damlacık pipette ve damlacık 30 G insülin iğne çek.</li>
	<li>5-8 ay kullanın-eski vahşi tipli balık ve deney için rag1−/−hu1999 mutant balık. Tank su %0.02 3-aminobenzoic asit etil ester (pH 7,0) ile yetişkin zebra balığı anestezi. Balık ventral tarafta bir yarık nemli bir köpük plastik üzerinde içine konumlandırın. Not: bez-/- mutant balık somatik rekombinasyon geçmesi ve fonksiyonel T ve B hücreleri üretmek mümkün değildir.</li>
	<li>İğne pelvik yüzgeçleri arasında enjekte bir yaklaşık 45 derecelik açıyla. Yukarı doğru tüm açılış karın boşluğu içinde gözlemlemek için iğne açılış tutun. Yavaş yavaş bakteriyel süspansiyon enjekte ve iğne dikkatli bir şekilde çıkarın. Not: kırmızı izleyici enjeksiyon üzerine balık dışarı sızması durumunda, deneyden balık hariç.</li>
	<li>Hemen sonra enjeksiyon, balık taze tank su ile bir kurtarma tankı içine aktarın.</li>
	<li>7H 10 bakteriyel uzaklaştırılmış örnekleri almak her 15dk kullanımda aliquot bakteriyel üzerinden tabaklar ve bakteri 29 ° C'de 5 gün kuluçkaya ve enfeksiyon doz plakaları kolonileri sayarak doğrulayın.</li>
	<li>Balık iyi olmak düzenli olarak kontrol edin ve herhangi bir balık üzerinde %0,02 ile enfeksiyon belirtileri olan ötenazi 3-aminobenzoic asit etil ester (pH 7,0) konsantrasyon. Not: Yaklaşık olarak, Yetişkin zebra balığı % 7'si ile 34 ± 15 CFU enfekte ve zebra balığı % 30'u 709 CFU 2029 ± ile enfekte belirtiler tarafından 8 hafta19sahip olmuş olacak. Semptomlar anormal yüzme, dokunmatik, nefes nefese, ödem veya gözlemlenebilir boşa yanıt eksikliği yer alabilir.</li>
	<li>Zebra balığı ortak standartlar35göre korumak.</li>
</ol>4. iç organları topluluğu
<ol><li>3-aminobenzoic asit etil ester (üzerinde %0,02 konsantrasyon, pH 7,0) su tankı içinde aşırı dozda ile zebra balığı ötenazi.</li>
	<li>Bir PIN posterior branchiostegal ışınları ve başka kuyruk platformu üzerine balık çakmak için aracılığıyla ekleyin.</li>
	<li>Bütün karın boşluğu neşterle açmak ve iç organların küçük kaşık ve keskin uçlu cımbız kullanarak toplama. Yürekten başlayıp kuyruk bir blok tüm iç organlar ayırmak için doğru omurga boyunca çalışın. Not: tüm böbrek doku sırt boyunca kaşıkla kazıma toplamak emin olun.</li>
	<li>Son olarak, cımbız gut lağım yanındaki bağlantısını kesin ve organları altı 2.8 mm seramik boncuklar ile 1,5 mL homojenizasyon tüp içine aktarmak için kullanın. Hemen kuru-örnek dondurmak için buza koyun. Örnek-80 ° homojenize oluncaya kadar C saklanır.</li>
	<li>% 70 etanol bireyler arasındaki aletlerimle durulayın.</li>
</ol>5. homojenizasyon ve RNA bir organ blok çıkarma.
Not: Yöntem Stanford Üniversitesi iletişim kuralları36değiştirilir.
<ol><li>Guanidin thiocyanate-fenol çözüm nükleik asit çıkarma (Tablo reçetesi) için kullanılan bir toplam hacmi 1500 µL. için üst kısmında örnek eklemek örnek en fazla toplam hacminin % 10 kapsar emin olun. Dikkat: Beklenen hasat doku 100 µL. guanidin thiocyanate-fenol çözüm toksik içerir ve rahatsız edici maddeler ve birleşimler ve koruyucu giysiler, nitril eldiven ve bir duman mahallede çalışma gerektirir birimdir. Bu zehirli gazlar oluşumuna neden olur gibi çamaşır suyu ile birleştirmek değil. Malzeme güvenlik veri sayfaları (MSDS) kullanmadan önce okuyun.</li>
	<li>Boncuk atan homogenizer 3 kez 40 için kullanarak örnekleri homojenize 3200 devirde s. Serin buz 30 s döngüleri arasında. Homojenize örnekleri 9 min için bir su banyosunda solüsyon içeren temizleyicide.</li>
	<li>12.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de örnekler santrifüj kapasitesi ve temizlenen homogenate 1000 µL taze microcentrifuge tüp içine taşıyın.</li>
	<li>Kloroform 200 µL eklemek, hemen 15 vortexing tarafından mix s ve oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya. Dikkat: Kloroform bir toksik ve tahriş edici bileşik Eğer inhale, yuttu ya da cilt veya gözlerle temas. Bir duman mahallede iş ve kişisel koruma için gerekli güvenlik donanımları kullanabilirsiniz. Malzeme güvenlik veri sayfaları (MSDS) kullanmadan önce okuyun.</li>
	<li>12.000 x g 4 ° C'de sulu ve organik aşamaları ayırmak için 15 dakika, santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Dikkatle, üst aşaması 500 µL RNA kirletici önlemek için taze bir tüp aktarın. Çıkarın ve sulu faz (~ 100 µL) geri kalanını atmak ve interfaz ve Organik faz 4 ° C'de DNA ekstraksiyon için saklayın. Not: Üst aşama RNA içerir.</li>
	<li>2-propanol 500 µL ve hemen vortexing tarafından RNA çökelti 15 s. Incubate için oda sıcaklığında 10 dakika karıştırın.</li>
	<li>12.000 x g 4 ° C'de RNA cips için 10 dk de santrifüj kapasitesi. Süpernatant pipetting tarafından kaldırın.</li>
	<li>% 75 etanol ve girdap 10 için 1 mL ekleyin s. Not: Burada protokol duraklatılmış ve örnekleri gecede 4 ° C'de muhafaza</li>
	<li>4 ° C'de 5 min için 7.500 x g , santrifüj Süpernatant pipetting tarafından kaldırın.</li>
	<li>5.9-5.10 yıkama adımları yineleyin. Süpernatant dikkatli bir şekilde çıkarın pipetting tarafından ve izin Pelet kuruması duman mahallede.</li>
	<li>RNA Pelet 500 µL nükleaz ücretsiz su içinde dağıtılması ve buz üzerinde örnekleri tutmak. Konsantrasyonları microvolume Spektrofotometre ile veya eşdeğer ekipman ile ölçmek. RNA-80 ° C'de depolayın</li>
</ol>6. ortak ayıklanan zebra balığı ve Mikobakteriyel DNA saflaştırılması
<ol><li>Guanidin thiocyanate (son konsantrasyonu 4 M), 118.2 g sodyum sitrat 3.68 g çözülerek tekrar ayıklama arabellek (Larabida) hazırlamak (son konsantrasyonu 50 mM) ve 30.29 g Tris ücretsiz Bankası (son konsantrasyonu 1 M) 120 mL su (Bu Mayıs nükleaz ücretsiz'çalışma gecede karıştırma gerektirir). Su nükleaz içermeyen bir son toplam hacmi 250 mL ve filtre çözümü sterilize etmek için ekleyin. Not: Bu arabellek oda sıcaklığında 6 aya kadar muhafaza edilebilir. Hidroklorik asit ve hidrojen siyanür gibi zehirli gazlar üretmek için tepki olarak Larabida çamaşır suyu ile birleştirmek değil.</li>
	<li>Interphase ve örnek Organik faz Mikobakteriyel DNA ayıklamak için kullanın. Larabida 500 μL her tüp için ekleyin. Oda sıcaklığında INVERSION tarafından kapsamlı bir şekilde 10 dakika karıştırın.</li>
	<li>12.000 x g için oda sıcaklığında 30 dk de tüpler santrifüj kapasitesi ve dikkatli bir şekilde yeni bir tüp için DNA içeren üst sulu faz 500 µL aktarın.</li>
	<li>2-propanol 400 μL ekleyin. Ters çevirme tarafından mix ve oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.</li>
	<li>Örnekleri, 12.000 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi DNA içeren bir Pelet bu noktada görünür olmalıdır. Dikkatli bir şekilde süpernatant pipetting tarafından çıkarın.</li>
	<li>% 70 etanol 800 μL ekleyin. Pelet INVERSION tarafından yıkayın. Genomik DNA kolayca yıkar değil girdap örnekleri bu noktada, yap.</li>
	<li>Örnekleri, 12.000 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant pipetting tarafından kaldırın. Etanol yıkama (adım 6,6 ve 6.7) yineleyin.</li>
	<li>Etanol pipetting tarafından dikkatli bir şekilde çıkarın. 5-10 dk. dağıtılması için 200 μL nükleaz ücretsiz su Pelet örnekleri kurumasına izin verin.</li>
	<li>DNA konsantrasyonları microvolume Spektrofotometre ile veya eşdeğer ekipman ile ölçmek. DNA 4 ° C'de veya uzun süreli depolama için-20 ° C'de muhafaza edilebilir.</li>
</ol>7. kantitatif PCR Mikobakteriyel yükler ölçmek için
<ol><li>QPCR reaksiyon karışımları ile no-ROX (carboxy-X-rodamine) M. marinum iç kopya etmek rondela (ITS) arasında 16S-23S ITS MMITS1 astar (Tablo 1) ile üretici yönergelerine göre karşı hazırlamak. Reaksiyon mix pipette ve çoğaltmaları 96-şey tabakta qPCR için uygun olarak dilutions örnek. Bilinen bir miktar bakterilerin DNA Standart seyreltme dizi her vadede içerir. Not: Beklenen M. marinum yük balık başına 1.000.000 CFU 4 TEFE, 0 CFU aralığı. QPCR tahlil da diğer qPCR kitleri ile gerçekleştirilir ama tavlama sıcaklığı astar için yeniden en iyi duruma getirilmiş olmalı.</li>
	<li>Optik şeffaf bir film ile plaka mühür ve 2.000 x g 4 ° C'de 2 min için plaka santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Tablo 2' de gösterilen qPCR programını çalıştırın.</li>
	<li>Standart eğri kullanarak, tüm balık bakteriler sayısını hesaplayın.</li>
</ol>8. DNaz tedavi RNA örnekleri
<ol><li>Herhangi bir olası kalan iz genomik DNA RNA kaldırmak için yürütmek DNaz ben tedavi. RNA örnekleri buz çözme. Not: yalnızca RNase free ekipman ve çözümleri kullanın ve çalışma yüzeyi ve Pipetler ile çalışmaya başlamadan önce RNases (Malzeme tablo) ortadan kaldırarak bir dekontaminasyon reaktif emin olun. Uzun kollu önlük ve örneklerini korumak için eldiven giymek.</li>
	<li>10 μL hazırlamak DNaz ben buz üretici yönergelerine göre reaksiyon karışımları. En fazla 1 μg RNA'ın da dahil olmak üzere, 10 DNaz arabellek x 1 μL ve RNA'ın 8 μL örnek DNaz karışım 1 μL.</li>
	<li>Yavaşça reaksiyonlar (vortexing) mix ve 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya</li>
	<li>Isı-inactivation önce 50 mm EDTA 1 µL 10 µL örnekleri ekleyin. EDTA eklenmezse, RNA ısıtıldığında kimyasal bozulması geçirecek.</li>
	<li>10 dk 65 ° c ısı-ı. DNaz devam doğrudan cDNA sentezi için devre dışı bırakın veya-80 ° C'de DNaz tedavi RNA saklamak için kuluçkaya</li>
</ol>9. cDNA sentezi
<ol><li>Tüm reaktifler ve buz üzerinde örnekleri tutmak ve üreticinin yönergelerine göre reaksiyon karışımları hazırlamak. 5 μL tepki karışımı için Ters transkripsiyon Master Mix 1 μL dahil, 3 μL nükleaz ücretsiz su ve 1 μL DNaz tedavi RNA.</li>
	<li>Karışımı yavaşça ters transkripsiyon reaksiyonlar ve kısaca Tüp, gerekirse spin.</li>
	<li>Örnekleri bir PCR makine ve Tablo 3' te gösterilen programı kullanın.</li>
	<li>CDNA nükleaz ücretsiz su qPCR 2.5 ng/μL, maksimum konsantrasyon için gerekirse sulandırmak. cDNA-20 ° C'de depolanan</li>
</ol>10. ölçüm zebra balığı gen ekspresyonu kantitatif PCR ile
<ol><li>QPCR ana karışımı buz üreticinin yönergelerine uygun olarak hazırlamak ve ışıktan korumak. Tablo 1' de tanıtılan astar kullanın. Not: kapaðý indüksiyon her gen için hesaplamak için Ayrıca bir havuza alınan temel örnek 6 sağlıklı zebra balığı çıkarılan ifadeden ölçün.</li>
	<li>Her örnek çoğaltır hazırlamak ve qPCR plaka üzerine reaksiyon karışımları pipette. Optik şeffaf bir film ile plaka mühür ve plaka 2000 x g 4 ° C'de 2 min için de çalışma başlamadan önce santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>QPCR çalıştırmak kullanılan astar çift bağlı olarak tavlama sıcaklığı ile Tablo 4 gösterilen program (Tablo 1).</li>
	<li>Bir ev tutma gene (loopern437) ile karşılaştırıldığında gen ifade oranı denklemi kullanarak ΔCt yöntemi ile analiz: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58299/58299eq1.jpg">
</li>
</ol>

<ol><li>Zhao, S., Huang, J., Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fresh+look+at+zebrafish+from+the+perspective+of+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+%26+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research.</a> Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 34, 80(2015).</li>
<li>Bournele, D., Beis, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27503203">Zebrafish models of cardiovascular disease.</a> Heart failure reviews. 21 (6), 803-813 (2016).</li>
<li>Torraca, V., Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Infection%3A+From+Pathogenesis+to+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology.</a> Trends in cell biology. 28 (2), 143-156 (2018).</li>
<li>Varela, M., Figueras, A., Novoa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+viral+infections+using+zebrafish%3A+Innate+immune+response+and+antiviral+research%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Modelling viral infections using zebrafish: Innate immune response and antiviral research.</a> Antiviral Research. 139, 59-68 (2017).</li>
<li>Goody, M. F., Sullivan, C., Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+immune+response+to+human+viral+infections+using+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+and+comparative+immunology%22%5BJournal%5D)">Studying the immune response to human viral infections using zebrafish.</a> Developmental and comparative immunology. 46 (1), 84-95 (2014).</li>
<li>Thisse, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis--heart+and+blood+formation+from+the+zebrafish+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis--heart and blood formation from the zebrafish point of view.</a> Science. 295 (5554), 457-462 (2002).</li>
<li>Eimon, P. M., Rubinstein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+in+vivo+zebrafish+assays+in+drug+toxicity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The use of in vivo zebrafish assays in drug toxicity screening.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (4), 393-401 (2009).</li>
<li>Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+for+drug+toxicity+screening%3A+bridging+the+in+vitro+cell-based+models+and+in+vivo+mammalian+models%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).</li>
<li>Wittamer, V., Bertrand, J. Y., Gutschow, P. W., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+mononuclear+phagocyte+system+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization of the mononuclear phagocyte system in zebrafish.</a> Blood. 117 (26), 7126-7135 (2011).</li>
<li>Harvie, E. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+host+defense%3A+new+insights+from+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish.</a> Journal of leukocyte biology. 98 (4), 523-537 (2015).</li>
<li>Yoshida, N., Frickel, E., Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-Microbe+interactions%3A+Lessons+from+the+Zebrafish+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage-Microbe interactions: Lessons from the Zebrafish Model.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1703(2017).</li>
<li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+T+cell+development%2C+ablation%2C+and+engraftment+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7369-7374 (2004).</li>
<li>Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+antigen+presenting+cells+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+and+comparative+immunology%22%5BJournal%5D)">Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish.</a> Developmental and comparative immunology. 46 (1), 63-73 (2014).</li>
<li>Hu, Y., Xiang, L., Shao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+novel+immunoglobulin+Z+isotype+in+zebrafish%3A+Implications+for+a+distinct+B+cell+receptor+in+lower+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+immunology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a novel immunoglobulin Z isotype in zebrafish: Implications for a distinct B cell receptor in lower vertebrates.</a> Molecular immunology. 47 (4), 738-746 (2010).</li>
<li>Danilova, N., Bussmann, J., Jekosch, K., Steiner, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunoglobulin+heavy-chain+locus+in+zebrafish%3A+identification+and+expression+of+a+previously+unknown+isotype%2C+immunoglobulin+Z%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z.</a> Nature immunology. 6 (3), 295-302 (2005).</li>
<li>Zapata, A., Diez, B., Cejalvo, T., Frias, C. G., Cortes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+the+immune+system+of+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+%26+shellfish%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of the immune system of fish.</a> Fish & shellfish. 20 (2), 126-136 (2006).</li>
<li>Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).</li>
<li>Hammaren, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adequate+Th2-Type+Response+Associates+with+Restricted+Bacterial+Growth+in+Latent+Mycobacterial+Infection+of+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish.</a> Plos Pathogens. 10 (6), e1004190(2014).</li>
<li>Parikka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+marinum+Causes+a+Latent+Infection+that+Can+Be+Reactivated+by+Gamma+Irradiation+in+Adult+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium marinum Causes a Latent Infection that Can Be Reactivated by Gamma Irradiation in Adult Zebrafish.</a> PLoS Pathog. 8 (9), 1-14 (2012).</li>
<li>Tobin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Genotype-Specific+Therapies+Can+Optimize+the+Inflammatory+Response+to+Mycobacterial+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Host Genotype-Specific Therapies Can Optimize the Inflammatory Response to Mycobacterial Infections.</a> Cell. 148 (3), 434-446 (2012).</li>
<li>Lesley, R., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+early+mycobacterial+pathogenesis+from+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish.</a> Current opinion in microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).</li>
<li>Berg, R. D., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+tuberculosis+from+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Insights into tuberculosis from the zebrafish model.</a> Trends in molecular medicine. 18 (12), 689-690 (2012).</li>
<li>World Health Organization. WHO Global tuberculosis report 2017. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/tb/publications/global_report/en/">http://www.who.int/tb/publications/global_report/en/</a> (2017).</li>
<li>Ordonez, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+pulmonary+cavitary+tuberculosis+and+expression+of+matrix+metalloproteinase-9%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Mouse model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9.</a> Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 779-788 (2016).</li>
<li>Kramnik, I., Beamer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+human+TB+pathology%3A+roles+in+the+analysis+of+necrosis+and+the+development+of+host-directed+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of human TB pathology: roles in the analysis of necrosis and the development of host-directed therapies.</a> Seminars in Immunopathology. 38 (2), 221-237 (2016).</li>
<li>Manabe, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aerosol+rabbit+model+of+TB+latency%2C+reactivation+and+immune+reconstitution+inflammatory+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">The aerosol rabbit model of TB latency, reactivation and immune reconstitution inflammatory syndrome.</a> Tuberculosis. 88 (3), 187-196 (2008).</li>
<li>Pena, J. C., Ho, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monkey+Models+of+Tuberculosis%3A+Lessons+Learned%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Monkey Models of Tuberculosis: Lessons Learned.</a> Infection and immunity. 83 (3), 852-862 (2015).</li>
<li>Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in tuberculosis.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (11), 691-702 (2017).</li>
<li>Stinear, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+the+complete+genome+sequence+of+Mycobacterium+marinum+on+the+evolution+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Insights from the complete genome sequence of Mycobacterium marinum on the evolution of Mycobacterium tuberculosis.</a> Genome research. 18 (5), 729-741 (2008).</li>
<li>Swaim, L. E., Connolly, L. E., Volkman, H. E., Humbert, O., Born, D. E., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+marinum+infection+of+adult+zebrafish+causes+caseating+granulomatous+tuberculosis+and+is+moderated+by+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium marinum infection of adult zebrafish causes caseating granulomatous tuberculosis and is moderated by adaptive immunity.</a> Infection and immunity. 74 (11), 6108-6117 (2006).</li>
<li>Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+Breathes+new+Life+into+the+Study+of+Tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish Breathes new Life into the Study of Tuberculosis.</a> Frontiers in Immunology. 7, 196(2016).</li>
<li>Luukinen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming+of+Innate+Antimycobacterial+Immunity+by+Heat-killed+Listeria+monocytogenes+Induces+Sterilizing+Response+in+Adult+Zebrafish+Tuberculosis+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Priming of Innate Antimycobacterial Immunity by Heat-killed Listeria monocytogenes Induces Sterilizing Response in Adult Zebrafish Tuberculosis Model.</a> Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).</li>
<li>Sar, A. M., Abdallah, A. M., Sparrius, M., Reinders, E., Vandenbroucke-Grauls, C., Bitter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+marinum+strains+can+be+divided+into+two+distinct+types+based+on+genetic+diversity+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence.</a> Infection and immunity. 72 (11), 6306-6312 (2004).</li>
<li>Madigan, M., Martinko, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMadigan%2C+M+%22Brock+Biology+of+Microorganisms%22">Brock Biology of Microorganisms</a>. , (2016).</li>
<li>Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aN%C3%BCsslein-Volhard%2C+C+%22Zebrafish%3Aa+practical+approach%22">Zebrafish:a practical approach</a>. , Oxford University Press. Oxford. (2002).</li>
<li>Anonymous Stanford University Protocols. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://med.stanford.edu/labs/vanderijn-west/Protocols.html">http://med.stanford.edu/labs/vanderijn-west/Protocols.html</a> (2018).</li>
<li>Vanhauwaert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expressed+Repeat+Elements+Improve+RT-qPCR+Normalization+across+a+Wide+Range+of+Zebrafish+Gene+Expression+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Expressed Repeat Elements Improve RT-qPCR Normalization across a Wide Range of Zebrafish Gene Expression Studies.</a> Plos One. 9 (10), e109091(2014).</li>
<li>Hammaren, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adequate+Th2-Type+Response+Associates+with+Restricted+Bacterial+Growth+in+Latent+Mycobacterial+Infection+of+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish.</a> Plos Pathogens. 10 (6), e1004190(2014).</li>
<li>Oksanen, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adult+zebrafish+model+for+preclinical+tuberculosis+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development.</a> Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).</li>
<li>Roth, A., Fischer, M., Hamid, M. E., Michalke, S., Ludwig, W., Mauch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+phylogenetically+related+slowly+growing+mycobacteria+based+on+16S-23S+rRNA+gene+internal+transcribed+spacer+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences.</a> Journal of clinical microbiology. 36 (1), 139-147 (1998).</li>
<li>Rajararna, M. V. S., Ni, B., Dodd, C. E., Schlesinger, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+immunoregulatory+pathways+in+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage immunoregulatory pathways in tuberculosis.</a> Seminars in immunology. 26 (6), 471-485 (2014).</li>
<li>Vynnycky, E., Fine, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natural+history+of+tuberculosis%3A+the+implications+of+age-dependent+risks+of+disease+and+the+role+of+reinfection%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology+and+infection%22%5BJournal%5D)">The natural history of tuberculosis: the implications of age-dependent risks of disease and the role of reinfection.</a> Epidemiology and infection. 119 (2), 183-201 (1997).</li>
<li>Cobat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+loci+control+tuberculin+skin+test+reactivity+in+an+area+hyperendemic+for+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Two loci control tuberculin skin test reactivity in an area hyperendemic for tuberculosis.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2583-2591 (2009).</li>
<li>Delogu, G., Goletti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Spectrum+of+Tuberculosis+Infection%3A+New+Perspectives+in+the+Era+of+Biologics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">The Spectrum of Tuberculosis Infection: New Perspectives in the Era of Biologics.</a> Journal of Rheumatology. 41, 11-16 (2014).</li>
<li>Abel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+human+susceptibility+to+active+and+latent+tuberculosis%3A+present+knowledge+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Genetics of human susceptibility to active and latent tuberculosis: present knowledge and future perspectives.</a> Lancet Infectious Diseases. 18 (3), E75(2018).</li>
<li>Guryev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in the zebrafish.</a> Genome research. 16 (4), 491-497 (2006).</li>
<li>Brown, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+genetic+diversity+and+substructuring+among+zebrafish+strains+revealed+through+copy+number+variant+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extensive genetic diversity and substructuring among zebrafish strains revealed through copy number variant analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 529-534 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada deneysel olarak enfekte yetişkin zebra balığı dokulardan çıkarılan DNA Mikobakteriyel yükler ölçmek için qPCR tabanlı bir uygulama açıklar. Bu uygulama astar 16S-23S rRNA iç kopya etmek spacer sıra40tasarlanmış temel alır. Toplam Mikobakteriyel yükü bir balık örnek olarak kültürlü mikobakteriler bilinen bir dizi arasından çıkarılan ve o bir bakteri genomunu bir kopyasını herhangi bir zamanda sayarsak DNA hazırlanan standart bir eğri kullanarak tahmin edilmektedir. Yaklaşık 100 M. marinu...

Zebra balığı (Danio rerio) yaygın olarak kullanılan bir hayvan model Biyomedikal araştırma ve ortak omurgalı biyoloji için kabul edilen bir modeldir. Zebra balığı birçok insan hastalıkları modelleme araştırma alanlarına uyarlanmış ve enfeksiyon ve birçok bakteriyel 3 ve viral enfeksiyonlar4 immünolojik araştırmalar kanser1 ve kalp hastalığı2 arasında değişen bozuklukları , 5. Ayrıca, zebra balığı embriyolar rahim gelişimi gelişim biyolojisi6 ve toksikoloji7,8' popüler bir model zebra balığı yaptı.
Araştırma, enfeksiyon biyolojisi, dahil olmak üzere birçok alanda optik şeffaf zebra balığı larva yaygın olarak kullanılır. İlkel makrofajlar algılanan9olduklarında ilk bağışıklık hücreleri 24 saat sonrası döllenme (hpf), içinde görüntülenir. Nötrofil yaklaşık 33 hpf10görünmesini sonraki bağışıklık hücreleri vardır. Zebra balığı larva böylece enfeksiyon erken dönemlerinde ve yokluğunda edinilmiş bağışıklık hücreleri11, doğuştan gelen bağışıklık rolü eğitim için uygulanabilir. Ancak, onun tamamen işlevsel edinilmiş bağışıklık sistemi ile yetişkin zebra balığı ek karmaşıklığı enfeksiyon deneyler için bir katmanı sağlar. T hücreleri çevresinde fertilizasyon123 gün sonrası ve B hücreleri fonksiyonel antikor üretmek mümkün 4 hafta sonrası döllenme13tarafından tespit edilebilir. Yetişkin zebra balığı memeli doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık sisteminin ana karşılıkları vardır. Balık immune systems ve insanlar arasındaki temel farklılıklar olduğu gibi lenfoid doku anatomisi antikor isotypes de bulunur. İnsanlar beş15var ise sadece üç antikor sınıflar14, zebra balığı vardır. Kemik iliği ve lenf düğümleri yokluğunda, Birincil lenfoid organlar olarak balık böbrek ve timus16 ve dalak, böbrek ve bağırsak ikincil lenfoid organlara17olarak hizmet vermektedir. Hücreleri, doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık tam onun cephanelik ile bu farklılıklara rağmen yetişkin zebra balığı bir son derece uygun, kullanımı kolay, memeli konak-patojen etkileşim çalışmaları için modeldir.
Zebra balığı son zamanlarda tüberküloz18,19,20,21,22çalışmaya uygun bir model olarak kurulmuştur. Tüberküloz Mycobacterium tüberküloztarafından neden olduğu hava bir hastalıktır. Dünya Sağlık Örgütü göre tüberküloz1.7 milyon ölümler 2016 yılında neden oldu ve bir tek patojen dünya çapında23tarafından ölüm önde gelen nedenidir. Fareler24,25, tavşan26 ve insan dışı primatlar27 sınırlamaları her yüz ama tüberküloz araştırmasında en iyi bilinen hayvan modelleri vardır. M. tuberculosis enfeksiyonu insan dışı primat modelin insan hastalık en çok benzeyen, ancak bu modeli kullanan ciddi Etik kaygılar nedeniyle sınırlıdır. Diğer hayvan modellerinde M. tüberküloz hastalığı patoloji etkileyen ana bilgisayar-özgüllük tarafından engel. Tüberküloz modelleme içinde en büyük sorunu insan hastalığında enfeksiyon ve hastalık sonuçları geniş yelpazede olmalı: tüberküloz dokunulmazlık gizli, aktif ve yeniden etkinleştirilen enfeksiyona28 sterilize arasında değişen çok heterojen bir hastalık olduğunu , hangi çoğaltmak ve deneysel model zor olabilir.
Mycobacterium marinum M. tuberculosis ile % 85 amino asit kimlik29~ 3.000 orthologous proteinler ile yakın akrabası olduğunu. M. marinum doğal olarak granülom, tüberküloz, kendi iç organları19,30işaretlerinden üreten zebra balığı bozar. Tüberküloz araştırmalarında kullanılan hayvan modellerin aksine zebra balığı birçok yavrular üretir, yalnızca sınırlı bir alan için ve önemlisi, neurophysiologically az gelişmiş omurgalı tüberküloz modelin kullanılabilir olduğunu. Ayrıca, M. marinum enfeksiyon latent enfeksiyon, aktif hastalık veya hatta sterilizasyon Mikobakteriyel Enfeksiyon yakından spektrum hastalığı sonucu insan tüberküloz19, taklit eden yetişkin zebra balığı neden olur 31 , 32. burada, M. marinum karın boşluğuna enjekte ve Mikobakteriyel yükler ve zebra balığı bağışıklık yanıtlarını ölçmek için kantitatif PCR kullanarak yetişkin zebra balığı deneysel tüberküloz modeli için yöntemleri tarif doku örnekleri.

<table><tbody><tr><td>Mycobacterium marinum</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>ATCC 927</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrock 7H10 agar</td><td>BD, Thermo Fisher Scientific</td><td>11799042</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrock OADC zenginleştirme</td><td>BD, Thermo Fisher Scientific</td><td>11718173</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrock 7H9 orta</td><td>BD, Thermo Fisher Scientific</td><td>11753473</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrock ADC zenginleştirme</td><td>BD, Thermo Fisher Scientific</td><td>11718173</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>GENESYS20 Spektrofotometre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su tabletleri (PBS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>Fenol kırmızısı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>27 G iğne</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710004020</td><td></td></tr><tr><td>1 mL şırınga</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>Omnican 100 30 G insülin iğnesi</td><td>Braun</td><td>9151133</td><td></td></tr><tr><td>3-aminobenzoik asit etil ester (pH 7.0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL homojenizasyon tüpü</td><td>Qiagen</td><td>13119-1000</td><td></td></tr><tr><td>2,8 mm seramik boncuklar</td><td>Qiagen</td><td>13114-325</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, ETAX Aa</td><td>Altia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>278475</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>VWR</td><td>22711.290</td><td></td></tr><tr><td>Guanidin tiyosiyanat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9277</td><td>FW 118,2 g/mol</td></tr><tr><td>Sodyum sitrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1613859</td><td>FW 294.1 g/mol</td></tr><tr><td>Tris (serbest baz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRIS-RO</td><td>FW 121.14 g/mol</td></tr><tr><td>TRI reaktifi</td><td>Moleküler Araştırma Merkezi</td><td>TR118</td><td>Guanidin tiyosiyanat-fenol çözeltisi</td></tr><tr><td>PowerLyzer24 homojenizatör</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator m08</td><td>Finnsonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix</td><td>Bioline</td><td>BIO-98005</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 96 kuyucuklu plaka</td><td>BioRad</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>Optik olarak şeffaf film</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>C1000 CFX96 gerçek zamanlı sistemli termal döngüleyici</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase AWAY</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10666421</td><td>dekontaminasyon reaktifi RNazları ortadan kaldırır</td></tr><tr><td>DNaz I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>Ters Transkripsiyon Ana Karışım</td><td>Fluidigm</td><td>100-6298</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast Eva Green ana karışım</td><td>BioRad</td><td>172-5211</td><td></td></tr></tbody></table>

tüberküloz mycobacterium marinum enfekte yetişkin zebra balığı içinde modelleme

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tüberküloz Şu anda en ölümcül insan patojen 1.7 milyon ölüm ve 10.4 milyon enfeksiyonları her yıl neden olduğunu. Maruz kalma bu bakteri steril bir enfeksiyondan aktif olarak devam eden bir ölümcül hastalık arasında değişen insanlarda geniş hastalığı spektrum neden olur. Asemptomatik, ama bir fulminan hastalık yeniden etkinleştirmek için potansiyele sahip latent tüberküloz, en yaygın biçimidir. Yetişkin zebra balığı ve onun doğal patojen Mycobacterium marinum son zamanlarda Tüberküloz hastalığı geniş spektrumu çalışmaya uygun bir model olduğu kanıtlanmıştır. Önemlisi, spontan gecikme süresi ve yeniden etkinleştirme gibi edinilmiş bağışıklık yanıtı Mikobakteriyel Enfeksiyon bağlamında bu modelde okudu. Bu makalede, biz yetişkin zebra balığı, nükleik asitler Mikobakteriyel yükler ve ana bilgisayar bağışıklık yanıtı kantitatif PCR ile ölçüm için çıkarım için iç organları koleksiyonu deneysel enfeksiyon için yöntemleri açıklanmaktadır. All-in-house-geliştirilmiş, M. marinum -belirli qPCR tahlil DNA olmayan bölme, Uyuyan veya son zamanlarda ölü mikobakteriler Ayrıca algılarken geleneksel kaplama yöntemleri daha duyarlıdır. DNA ve RNA aynı birey ayıklanır, hastalıklı devlet ve ev sahibi ve patojen gen ekspresyonu arasındaki ilişkileri incelemek mümkündür. Tüberküloz için yetişkin zebra balığı modeli böylece konak-patojen etkileşimleri çalışmaya son derece uygun, memeli vivo içinde sistemi olarak kendini göstermektedir.

Doğal balık patojen Mycobacterium marinum zebra balığı iç organların bozar ve histolojik olarak görünür granülomlar19ile sistemik enfeksiyon oluşturur. Yetişkin zebra balığı mayi bir iğne ile M. marinum ile enfekte. DNA ve RNA ayıklanır ve Mikobakteriyel yük nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) DNA'yı kullanarak şablon olarak ölçülür. Yöntemin Şekil 1' de gösterilen.
<p class="jove_content" fo:keep-together.wi...

Burada, içinde bir yetişkin zebra balığı kendi doğal patojen Mycobacterium marinumkullanarak bir iletişim kuralı modeli insan tüberküloz için mevcut. Ayıklanan DNA ve RNA gelen virüslü zebra balığı iç organlarının balıklar ve ana bilgisayarın bağışıklık yanıtı qPCR ile toplam Mikobakteriyel yükler ortaya çıkarmak için kullanılabilir.

Tüberküloz Mycobacterium marinum enfekte yetişkin zebra balığı içinde modelleme

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Bu yöntem, adaptif immün yanıtların rolü ve bu multifaktöriyel hastalığın patogenezi gibi tüberküloz alanındaki temel soruların yanıtlaştırılabildiği gibi yardımcı olabilir. Bu nükleik asit baz yönteminin en büyük avantajı hem bakteriyüklerinin hem de gen ekspresyonu seviyelerinin aynı bireyden ölçülebiliyor olmasıdır. Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi 7H10 plaka üzerinde kültür M.marinum.ADC zenginleştirme içeren 7H9 orta 10 mililitre transfer, polisorbat 80, ve gliserol bir hücre kültürü şişesi. Daha sonra, aseptik şişe içine M.marinum bakteriyel kitle bir döngü aktarmak için steril bir mikrolitre aşılama döngü kullanın. Kapağı gevşek bırakın veya OD600 yaklaşık 0,7 ulaşana kadar üç ila dört gün boyunca sallayarak olmadan karanlıkta 29 santigrat derece yeterli gaz değişimi ve kültür için izin vermek için bir filtre kapağı kullanın.Seyreltin ve metinde belirtildiği gibi bakteri kültüre devam. Enfeksiyon için bakteriyel çözüm hazırlamaya başlamak için, taze bir tüp içine kültürün bir mililitre aktarın. Santrifüj 10, 000 g üç dakika.Supernatant çıkarın ve steril PBS bir mililitre pelet resuspend. Bir izleyici olarak fenol kırmızı mililitre başına 0.3 miligram ile steril PBS kullanarak, istenilen bakteri konsantrasyonuna ulaşmak için süspansiyon seyreltin. Bundan sonra, bir mililitreşşüş yavaş yavaş bir 27 gauge iğne ile süspansiyon çekmek için kullanın üç kez.Her aliquot için kullanmadan hemen önce bu adımı gerçekleştirin. İlk olarak, pipet parafin film bir parça üzerine seyreltilmiş bakteriyel çözelti beş mikrolitre damlacık. Sonra, damlacık bir 30 gauge insülin iğne içine çekin.Biri vahşi balık, diğeri bez mutant balık olan bu deney için beş ila sekiz aylık bir balık kullanın. Nemli köpüklü plastik bir parça nın yarımktıları bu balık ventral tarafı konumlandırın. 45 derecelik bir açıyla pelvik yüzgeçleri arasında insülin iğnesi enjekte edin.Tüm açıklığın karın boşluğunun içinde olduğundan emin olmak için iğneyi yukarı doğru aç. Sonra, yavaş yavaş bakteriyel çözelti enjekte edin. Bundan sonra, dikkatlice iğne çıkarın ve hemen taze tank suyu ile dolu bir kurtarma tankı balık aktarın.7H10 plakaları üzerinde her 15 dakikada bir kullanılan bakteriyel aliquot örnekleri alın. Enfeksiyon dozunu doğrulamak için bu örnekleri beş gün boyunca 29 derecede kuluçkaya yatırın. Düzenli olarak balık ların refahını kontrol edin, 3-aminobenzoik asit etil ester fazla% 0.02 ile suda kuluçka tarafından enfeksiyon belirtileri ile herhangi bir balık ötenazi emin olun.Balık ötenazi sonra, branchiostegal ışınları için bir pin posterior takın. Balığı platforma sokmak için kuyruktan ikinci bir iğne yerleştirin. Neşter kullanarak tüm karın boşluğunu açın.Sonra, kalpten başlayıp bir bloktaki tüm iç organları ayırmak için omurga boyunca kuyruk boyunca çalışan iç organları toplamak için küçük bir kaşık ve keskin uçlu cımbız kullanın. Cloaca bağırsak ağı ayırmak ve yarım düzine 2,8 milimetre seramik boncuk içeren 1,5 mililitrelik homojenizasyon tüpü içine organları aktarmak için cımbız kullanın. Numuneyi dondurmak için tüpü hemen kuru buzüzerine yerleştirin.Numuneyi homojenize olana kadar negatif 80 santigrat derecede saklayın. DNA ve RNA ayıkladıktan sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi kantitatif PCR ile mikobakteriyel yükleri ölçün. Bu çalışmada, yetişkin zebra balıkları intraperitoneal enjeksiyon ile M.marinum ile enfekte olur.Yüksek enfeksiyon dozu hangi mikobakteriyel yük ortalama yük sonuçta balık öldürerek yaklaşık beş milyon bakteri ulaşana kadar artmaya devam eden ilerleyici bir hastalığa yol olduğu görülmektedir. Öte yandan düşük doz, ilerleyici, gizli, yeniden aktive edilmiş ve sterilize edilmiş enfeksiyonlarla insan tüberkülozunda görülene benzer bir hastalık spektrumunun gelişmesine yol açar. Bu durumda, yük dört hafta boyunca artmaya devam ediyor ve bu hastalık balığın çoğunda sabit bir duruma ulaşıyor.Bu veriler, balık enfekte etmek için kullanılan mikobakterilerin ilk sayısı enfeksiyonun sonucu için kritik bir belirleyici olduğunu ortaya koymaktadır. Rag mutant zebra balıkları yeterince yüksek bakteri yükleri ve artan morbidite yol mikobakterilerin büyümesini sınırlamak mümkün olduğu görülmektedir. Bu açıkça mikobakteriyel enfeksiyonu kontrol adaptif bağışıklık önemini göstermektedir.Interlökin-4 düzeyleri, interlökin-4'ün etkin bir şekilde piyasaya sürülmesi için adaptif yanıtın gerekli olduğunu, ancak mikobakteriyel enfeksiyon sonrası interferon gamanın getirilmesi için vazgeçilmez olduğunu ortaya koyan yabani tip grupta anlamlı olarak daha yüksektir. Bu protokol, hem DNA hem de RNA'nın aynı örnekten toplanmasını sağlar ve bu da numunenin mikobakteriyel yükünü hem konak hem de bakterilerin gen ekspresyonu verileriyle birleştirmeyi mümkün kılar. Bu teknik, mikobakteriyel yükler ve immün yanıtlar üzerindeki etkilerini değerlendirmek için ilaç veya aşı adaylarının yönetimi ile kombine edilebilir.Bu prosedürü denerken, bir biyogüvenlik düzeyi iki patojen ile çalışırken kişisel güvenlik ve atık bertaraf için yerel kurallara uymayı unutmayın önemlidir. Bu teknik, in vivo modelinde etik olmayan bir memeli olmayan zebra balığında hareketsiz mikobakterilerle hem aktif hem de gizli tüberkülozun incelenmesini mümkün kıldığıdır.

modeling-tuberculosis-mycobacterium-marinum-infected-adult

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Şeffaf zebrabalıkları embriyolar gibi görselleştirmek için faydalı model bilgisayarlar ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ve hücre içi bakteriyel patojenler arasında işlevsel çalışma etkileşimleri,...

Hücre içi bakteriyel patojenler ile Zebra balığı Embryolarının Enfeksiyon

Kaynak: Niu, L. ve diğerleri. Zebrafish embriyolarında mikobakteriyel enfeksiyon sırasında makrofaj litik hücre ölümünün intravital mikroskopi ile görselleştirilmesi. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, Mycobacterium marinum enfeksiyonu sonrası zebrafish embriyolarında makrofaj litik hücre ölümünü görselleştirmek için intravital konfokal mikroskopi kullanımını göstermektedir.

Zebrafish embriyolarında mikobakteriyel enfeksiyon sırasında makrofaj hücre ölümünün canlı görüntülemesi

Kaynak: Bernut, A. ve diğerleri. Zebrafish embriyolarında Mycobacterium abscessus'un patogenezi ve kordonunun çözülmesi ve görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2015)Bu video, floresan makrofajları ifade eden ve floresan Mycobacterium absessus kaba suşuyla enfekte olan transgenik zebrafish embriyolarını kullanarak konak-patojen etkileşimlerini görselleştiren bir protokolü göstermektedir. Ekstrahücre kordonunun bağışıklık kaçışını nasıl mümkün kıldığını, bakterilerin hayatta kalmasını ve konak hücre...

Mycobacterium abscessus ile enfekte olan zebrafish embriyolarında konak-patojen etkileşimlerinin canlı görüntülemesi

Kaynak: Luukinen, H. ve diğerleri. Mycobacterium marinum enfekte yetişkin zebrabalıklarda tüberkülozun modellemesi.  J. Vis. Exp. (2018).

Zebrafish modeli kullanarak mikobakteriyel enfeksiyonda konak bağışıklığının rolünün değerlendirilmesi

Kaynak: Flores, E. ve diğerleri. Zebrafish larvalarında gıda kaynaklı enfeksiyonlar için protozoan paramecium caudatum aracı olarak kullanılması. J. Vis. Exp. (2019).Bu video, zebrafish larvalarında floresan E. coli enfekte paramecia ile beslenerek gıda kaynaklı bakteriyel bağırsak enfeksiyonu modeli oluşturma yöntemini göstermektedir.

Zebrafish larvalarında Bağırsak Enfeksiyonunun Gıda Kaynaklı Bakterilerle Modellenmesi

Bu video makalede, başarılı bir bütün omurgalı hayvan organizmayı kullanarak bileşik test ve ilaç keşfi için yeni bir güçlü bir araç sağlayan Zebra balığı embriyolarının büyük sayıda bulaştırmak ve analiz etmek için kurulmuştur yüksek kapasiteli boru hattı açıklanır.

Kuruluş ve Eğitim için bir Yüksek Verimli Kur Optimizasyonu<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Ve<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Enfeksiyon İlaç Keşif için bir model olarak

İn vivo patojen ve immün savunmanın mukozal düzeydeki uzaysal-zamansal etkileşimleri, mevcut omurgalı konakçılarında kolayca görüntülenemez. Burada sunulan yöntem, genç zebra balığının yüzme kesesini bir enfeksiyon bölgesi olarak kullanarak canlı omurgalılarda mukozal kandidiyazisi incelemek için çok yönlü bir platformu tanımlamaktadır.

Swimbladder Enjeksiyon ile Larva Zebra balığı Mukozal Candidiazis Modelleme

Optik olarak şeffaf zebra balığı embriyoları, patojenik mikroorganizmalar ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri gerçek zamanlı olarak incelemek ve görselleştirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Mycobacterium abscessus'un mikro enjeksiyonu, floresan görüntüleme ile birlikte, zebra balığı embriyolarında kordon oluşumu gibi temel patojenik özellikleri incelemek için kullanılır.

Görüntüleme Patogenez ve Cording Deşifre ve<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Zebra balığı Embriyolar

Burada biz yetişkin zebra balığı (Danio rerio) DNA tabanlı aşı ile Bağışıklama için bir iletişim kuralı tanımlamak ve doğrulama başarılı olay göstermektedir. Bu yöntem çeşitli enfeksiyon modellerinde aşısı adayların preklinik tarama için uygundur.

Yetişkin zebra balığı bağışıklama DNA tabanlı aşıların preklinik tarama için

Bu protokol, Mycobacterium marinum enfeksiyonu sırasında embriyonik zebra balığında makrofaj davranışını ve ölümü görselleştirmek için bir tekniği açıklamaktadır. Bakterilerin hazırlanması, embriyoların enfeksiyonu ve intravital mikroskopi için adımlar dahildir. Bu teknik, enfeksiyon veya steril inflamasyon içeren benzer senaryolarda hücresel davranış ve ölüm gözlem uygulanabilir.

İntravital Mikroskopi ile Zebrabalığı Embriyolarında Mikobakteriyel Enfeksiyon Sırasında Makrofaj Litik Hücre Ölümünün Görüntülenmesi

Şu anda kronik bakteriyel enfeksiyonlara karşı ilaç taramasına uygun in vivo modellerin eksikliği vardır. Burada, zebra balığı larvalarında kalıcı bir enfeksiyon oluşturmak için bir Pseudomonas aeruginosa klinik izolatı ile yara enfeksiyonu için bir protokol açıklıyoruz.

Yaralı Zebra Balığı Larvalarında Kalıcı Pseudomonas aeruginosa Enfeksiyonunun Modellenmesi

Keşfedin, Mycobacterium marinum ile yetişkin zebra balığında tüberküloz modellemesi yapmayı. Bu yöntem, bakteri yükü ve bağışıklık yanıtını aynı bireyden ölçerek hastalık patogenezini incelemenizi sağlar.

Tüberküloz Mycobacterium marinum enfekte yetişkin zebra balığı içinde modelleme

Daha fazla video keşfet