Name: Apolipoprotein E-eksik farelerde Mineralocorticoid reseptörlerinin etkinleştirmesi üzerinden aterosklerotik plaklar indüksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Öğrenin, ApoE -/- farelerde mineralokortikoid reseptör aktivasyonuyla aterosklerotik plak indüksiyonu yöntemini. Sürekli aldosteron salınımı ile erken ateroskleroz patofizyolojisini hızlıca değerlendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser İtalyan Sağlık Bakanlığı (Ricerca Corrente, GR-2009-1594563 ve PE-2011-02347070 M.C. için) gelen hibe tarafından desteklenmiştir

Çalışma İtalyan Ulusal kurumları sağlık bakım ve kullanım komiteler, yetkilendirme sayı 493/2016-PR tarafından kabul edildi Tüm yordamları yönergeleri deneysel hayvan kullanımı için Avrupa Topluluğu'nun başı yapılmıştır (Avrupa Yönergesi, 2010/63/UE).
Not: Araç (etanol tuzlu çözümde) veya aldosteron içeren ozmotik minipump subkutan implantasyonu (240 µg kg-1 · · d-1) 8-10 hafta içinde-eski erkek fareler için ApoE gen eksik. Genel, 8-10 hafta içinde-eski erkek ApoE−/− fareler yaklaşık 25-26 g ağırlığında.
1. aldosteron eriterek
<ol><li>Aldosteron toz mutlak etanol 1 ml 5 mg geçiyoruz.</li>
	<li>(Etanol içinde çözünmüş) aldosteron 56.7 µL 2,27 µg bir konsantrasyon elde etmek için tuzlu çözüm 68.3 µL için Ekle / µL. doldurun tamamen (her minipump 125 µL yoktur) bu çözümün 125 µL ile tüm ozmotik minipumps.</li>
	<li>Bir minipump debi 0,11 µL/h kullanın; Bu nedenle çözüm 2.64 µL serbest her 24 h vermek her fare çevrede 6 µg · aldosteron 28 gün d-1 .</li>
</ol>2. ozmotik pompa doldurma ve implantasyon
Not: Pompalar iki ayrı bölümde sağlanır: ana gövdesi, pompa ve akım regülatörü.
<ol><li>Doldurun ve cerrahi eldiven kullanarak minipumps kolu. Not: Cilt yağlar ile minipumps performansını etkileyebilir. Aşağıdaki adımları bir steril laminar akış mahallede yapılmalıdır.</li>
	<li>1 mL şırınga (minipumps ile birlikte) Dolum tüpü takmak ve aldosteron çözüm veya araç kadar çizin. Not: Şırınga içindeki hava pompa içine hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için tüp çözümlerinden alıyorum süre izin kaçının önemlidir.</li>
	<li>Daha ileri gidebilirsiniz kadar dolum tüpü delikten minipump ekleyebilir (Şekil 1A-1B). Yavaş yavaş pompa aldosteron veya araç ile doldurun. Sıvı düzey gösteren pompa içinde karanlık gölge dikkat edin. Benzin pompası ile birlikte bu düzey yükselişini seyrediyorum.<ol>
<li>Ne zaman bir boncuk sıvı pompa vücut dışına yükselir pompa doldurma durdurmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde dolum tüpü çıkarması ve akış düzenleyici minipump (Şekil 1 c) vücut içine yerleştirin. Regülatör pompa gövdesi karşı sıkıca oturduğundan emin olun. En fazla 24 saat önce fare (priming yordam) implantasyon için 37 ° C'de steril serum fizyolojik solüsyon içeren bir ölçek dolgulu ozmotik pompalar bırakın.</li>
	<li>Ameliyat asepsis teşvik % 70 etanol ile dezenfekte bir alanda yapmak.</li>
	<li>1-3 damla % 0.25 bupivacaine kesi yerinde uygulamak ve % 3 isoflurane hayvanla anestezi. Tedarik gazı ve akış ölçer 500-1000 mL/dk. yer hayvan indüksiyon odasında ayarla ve üst mühür. Buharlaştırıcı %5 isoflurane için açmak ve fareyi yaslanmış kadar izlemek.<ol>
<li>Nosecone için akış sisteme geçiş. Hayvan odası ve nosecone bulunduğu kaldırın. 2-3 dakika içinde fare uyandırmak başlar. Gaz akışı 100-200 mL/dk akış ölçer ve % 3 isoflurane, buharlaştırıcı yeniden başlatın.</li>
		<li>Yeterli pedal çekilmesi ve palpebral refleksleri test ederek yordamları gerçekleştirmeden önce anestezi derinliği sağlamak. Solunum ve stimülasyon işlemi sırasında yanıt izlemek ve buharlaştırıcı gerektiği gibi ayarlayın.</li>
		<li>Kornealar bir oftalmik merhem uygulayarak kurutma koruyun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hayvan bir ustura (Şekil 1 d) kullanarak cerrahi sitesinden saç kaldırarak hazırlayın. Her zamanki pompalar subkutan implantasyonu için arkasında sitedir.</li>
	<li>% 70 izopropil alkol ile doymuş nonwoven ped malzeme ile cerrahi site hazırlamak.</li>
	<li>(% 70 etanol ile dezenfekte) temiz ve özel bir alanı kullanmak ve steril bir örtüsü ile kaplı. Aletleri ucu bir cam boncuk Sterilizatör yerleştirin. Cerrahi steril aletler ile başlar ve aletleri aseptik kolu.</li>
	<li>Cerrahi makas 0,8-1 yapmak, cm kesi (yaklaşık 2 cm kuyruk yakın), gösterildiği gibi rakamlar 1E-1F. Kısırlık steril eldiven veya ipuçları aletleri ile cerrahi ayrılmış alan dışında herhangi bir şeye dokunmadan tarafından değil korumak.</li>
	<li>Sadece cilt ama değil alttaki dokuları kesmek için kendine iyi bak. Bir yandan forseps kesi açık tutmak için kullanın. Öte yandan cilt pompa için bir cep arkadan yukarı doğru kürek kemiği (üzerinde fareyi sağ veya sol tarafında) için oluşturmak için yaymak için trokar tutmak için kullanın.</li>
	<li>Pompa belgili tanımlık kesme Ekle. Yavaşça pompa tamamen cebine (Şekil 1 H) itin. Yeterince cilt gerginlik yok yarayla kapatmak ücretsiz ya da gerekli cilt germe olmalıdır. Pompa eklendikten sonra ameliyat tel (polyglactin 910 dikiş boyutu 6-0 ile) ile belgili tanımlık kesme dikiş Not: Regülatör Başkanı fare (Şekil 1G) ön doğru odaklı olması gerekir.</li>
	<li>Temiz bir bez (Şekil 1I) ile topikal % 10 povidone/iyot merhem uygulamak ve hayvan ısınma bir sahne üzerinde tutun. Onlar sternal recumbency kurtarmak kadar fareler içinde sahipsiz bırakmayın. Hidrasyon durumu değerlendirmek ve gerekli, subkutan 0,5 mL % 0,9 tuz çözeltisi yönetmek. Hayvan onun rutin konut için dönmek.</li>
	<li>Belgeleri için kurumsal yönergeleri izleyin (örneğin, cerrahi form ile ameliyat ve ameliyat sonrası bilgi, yordam ve tarihi ile güncelleştirme kafes kartı doldurun) ve analjezikler (buprenorfin, 0,05 mg/kg) ameliyat sonrası ağrı azaltmak için sağlar ve antibiyotikler (enrofloksasin 85 mg/kg) ameliyat sonrası enfeksiyonu önlemek için.<ol>
<li>Günlük izleme devam ve ağrı belirtileri için inceleyin. Yara tamamen kapalı ve minipump subkutan cebine korunur dikkat. Yara açılabilir ve fare minipump kaybedebilirsiniz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. kalp diseksiyon
<ol><li>Kurban, anestethize fareler 80-100 mg/kg intramüsküler yönetilen Zoletil anda. Zoletil derin anestezi neden olmaktadır. Not: fareler bir yeterli derinlikte anestezi pedal ve palpebral refleksleri test ederek yordamları gerçekleştirmeden önce olduğundan emin olun; Fareler derin anestezi iken derin. Makas ve forseps, yanal için göğüs kemiği başından doğru retrakte göğüs kemiği ile kaburgalar keserek kullanarak göğüs boşluğuna açın.</li>
	<li>Fare ile sol ventrikül yerçekimi perfüzyon sistemi 10-15 mL buz gibi Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ve daha sonra ile damarlara düzeltmek için tarafsız tampon formalin %10 40-50 mL sıvı. Ne zaman fare güçlü kas kasılmaları sergi ve katı hale fiksasyon belirtilir. Not: Sabitleme işlemi 10-20 dk gerçekleşir. Sabit organ ve dokulara ayirt veya immünhistokimya analizleri gerçekleştirmek için kullanmak mümkündür. Önemlisi, bu tür sabit dokular gen ekspresyonu ve western Blot analizleri için kullanılamaz.</li>
	<li>Kalp aort kalp forseps ile tutup makas ya da bir neşter bıçak ile (Şekil 2A) zarar vermeden kalp mümkün olduğunca yakın olarak aort eksenine dik kesim ayırın. Bir neşter bıçak kemiği sağ ve sol atrium (Şekil 2B) daha düşük puan katıldı düz bir çizgi kesmek için kullanın.</li>
	<li>Kesitli kalbinden (kalp boşluğuna) üst bölümü (OCT) en uygun kesme karışımla doldurun (Şekil 2B-2E). Cryosection plastik kalıp eksenli Dik OCT (Şekil 2F) ile kapak ve dikdörtgen kalıp tabanına yerleştirilmiş aort içinde doku koymak. Tuzak yok hava kabarcığı olmalıdır. Herhangi bir kabarcık varsa, kenarına yerinden deneyin.</li>
	<li>Metal bir plaka kuru buza koyun ve sonra dikkatlice kalıp (Şekil 2 güzerinde) koymak. OKT'yi beyaz olduğunda, kalıp gümüş folyo ile sarın ve –80 ° C'de depolayın</li>
</ol>4. kesme bölümleri aortik kökü
<ol><li>Cryostat makine –20 ° C'ye ayarla Kesme önce katıştırılmış doku yerleştirin ve orada bu sıcaklığa ayarlamak yaklaşık 15 dakika bırakın. Numune tutucu sıcaklık-17 ° C (Şekil 3A) için ayarlayın.</li>
	<li>Cryostat (Şekil 3B)'e blok sıcaklığını equilibrate ve kalıp (Şekil 3 c) dondurulmuş kalp bloğundan çıkar için cryostat makine içinde donmuş kalp bloğu yerleştirin. Donmuş blok blok boyutları numune sahibi (şekil 3D) için daha iyi adapte aşırı OKT kesti.</li>
	<li>Donmuş kalp bloğu ventriküler dışa bakan ile odaklı numune tutucu bağlama (Şekil 3E-3I) ve numune sahibi kafa (Şekil 3J) yönlendirme numune yerleştirin. Kesme blok aortik kökü blade (Şekil 3 K) dikey yapmak için izin vermek için numune tutucu yönünü ayarlayın.</li>
	<li>Blok kesme ve aortik kökü ulaşılana kadar dilimleri atmak (Şekil 3 L-3N). Seri bölümler toplamak ve cam slaytlar (Şekil 3O) koyun. Tüm 3 aort vanalar görününceye kadar aortik kök anatomik profil mikroskop altında izlemek (Şekil 3 P-3Ç).</li>
	<li>Bölüm 10 µm/yağ kırmızı O ve Picro Sirius kırmızı boyama bölümüne ve 6 toplamak için MAC3 µm/bölümüne (Şekil 3R) boyama. Etrafında toplamak üç valfler biri kadar (her kupa için) 6-8 slaytlar kaybolur veya artık sağlam değil.</li>
</ol>5. immünhistokimya
Not: tüm boyama adımlar aşağıdaki protokolleri bildirdi Coplin boyama kavanozların içinde gerçekleştirilir.
<ol><li>
Yağ kırmızı O leke tarafsız yağlar için
	<ol>
<li>70 mL bölümlerde % 37 formaldehit musluk suyundaki de 5 dk. yıkama tamir ve aşırı sudan leke.</li>
		<li>32 mL distile su yağ kırmızı O elde etmek için petrol kırmızı O (isopropanol %0,5) 48 mL seyreltik % 0,3.</li>
		<li>10 dk. yıkama bölümlerde musluk suyu 10 dk için %0,3 70 mL bölümlerde yağ kırmızı o leke.</li>
		<li>İçin Mayer'ın hematoksilen 1 dk 70 ml leke. Musluk suyu 1 dk. için bölümlerde yıkayın.</li>
		<li>70 ml bölümlerini % 0.5 Lityum Karbonat bırakın. Musluk suyu 1 dakika yıkayın.</li>
		<li>Işık mikroskobunun monte bir dijital kamera ile bir sulu montaj orta ve yakalama görüntüleri ile bölümleri bağlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Picro Sirius kırmızı leke kollajen için
	<ol>
<li>10 µm donmuş bölümleri kesme ve slaydın alt monte.</li>
		<li>70 ml bölümlerini aseton 5 dk, hava kuru ve kısa bir süre içinde distile su durulama için düzelt.</li>
		<li>Bölüm 5 dk. durulama distile su içinde kısa bir süre için % 0,2 phosphomolybdic asitin 70 mL yerleştirin.</li>
		<li>Bölümler 70 mL %0,1 Picro Sirius çözeltisi 90 dk. durulama bir kez 70 mL 0,01 N HCl. atmak çözeltisi ile yerleştirin.</li>
		<li>Yerde 0,01 N HCl 2 dk. durulama yılında kısa bir süre için 70 mL distile su. Hava kuru.</li>
		<li>Yerde kısaca %70 etanol 70 mL.</li>
		<li>Tamamen kuru, yer 70 mL Ajan terpen kökenli açıklığın ve mount poli kullanma bölümlerine (butil metakrilat -co-Metil metakrilat) ışık mikroskobunun monte bir dijital kamera ile montaj orta ve yakalama görüntüleri baz alınarak. Not: Bu tür ayırt etmek mümkündür Picro Sirius kırmızı boyama avantajlarından biri olduğunu ben (kalın elyaf, sarı-turuncu birefringence) ve tip III (ince lifler, yeşil birefringence) kollajen lif ağları polarize ışık mikroskobu11 tarafından .</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mac3 leke makrofaj boyama için
	<ol>
<li>6 donmuş µm bölümleri kesme ve slaydın alt monte.</li>
		<li>70 ml bölümlerini 5 dakika süreyle bırakın 70 ml PBS, 2 dk soğuk aseton düzeltmek.</li>
		<li>Bir pipet kullanarak, % 1 ile kapak bölümlerini Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) çözüm ve antijen alımı için (RT) Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. PBS 70 mL 5 min için bırakın.</li>
		<li>Bir pipet kullanarak, dilimleri ile %0,3 hidrojen peroksit 5 min için PBS 3 kez 70 ml 20 dk. Yıkama için kapak.</li>
		<li>Avidin-Biotin kompleksleri (ABC) kullanın-HRP teçhizat için aşağıdaki adımları.</li>
		<li>Bir pipet kullanarak, bölümler, oda sıcaklığında 20 dakika Normal tavşan serumda engelleyin. Durulayın değil.</li>
		<li>Leke MAC3 ile (1:300) 90 dakika süreyle dik yıkama 70 ml PBS ile 5 min için 3 kez.</li>
		<li>Orta-biotinylated (1: 200) ile Anti-sıçan IgG RT. durulama, PBS 3 kez 5 min için 45 dk 70 mL ile leke.</li>
		<li>Tavşan IgG ABC bölümlerle RT. durulama, 5 min için PBS 3 kez 30 dakika 30 mL ile kapak.</li>
		<li>3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) bölümlerle 10 dk. için durulama ile 70 mL distile su için 10 kez kapak.</li>
		<li>İçin Mayer'ın hematoksilen 1 dk 70 ml leke. Musluk suyu 1 dk. için bölümlerde yıkayın.</li>
		<li>70 mL bölümlerde % 0,5 bırakın Lityum Karbonat. Musluk suyu 1 dakika yıkayın.</li>
		<li>Işık mikroskobunun monte bir dijital kamera ile bir sulu montaj orta ve yakalama görüntüleri ile bölümleri bağlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. görüntü analizi aortik kök bölümlerde aterosklerotik lezyonların
Not: Aortik kök bölümler petrol kırmızı O veya MAC3 veya bir antikor ilgi ile lekeli uygun yazılımı ( Malzemeler tabloiçinde gösterilen) kullanılarak analiz edilebilir. Toplam piksel faiz bileşeni için olumlu boyama genel plaket alan için normalleştirilmiş. Görüntüleri toplanmış ve tedavi kör bir araştırmacı tarafından analiz.
<ol><li>
Kalibrasyon
	<ol>
<li>Açık bilgisayar yazılımı ve çözümlenmesi için resimdeki (jpg) seçin.</li>
		<li>Ana sayfa Seç | Oluşturmak | Hızlı kalibrasyon.</li>
		<li>Resim kalibrasyon kadar görüntü ölçek çubuğu boyunca bir çizgi çizerek ayarlayın.</li>
		<li>Kalibrasyon ayarı kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Görüntü Analizi
	<ol>
<li>Kaydedilmiş Kur ayarlama Seçenekler menüsünden seçin | Kayma kalibrasyon seçeneği.</li>
		<li>Kalibrasyon seçin | Uygulamak.</li>
		<li>Çokgen aracını seçin menüsünde seçin ve çevre boyunca tüm aterosklerotik lezyonları çizin.</li>
		<li>Sayısı/boyutu seçin | Türleri. Menüden, alanı ve Yüzde alanıekleyin.</li>
		<li>Sayısı/Size menüsünden, select manuel ve yeni bir pencere açılacaktır.</li>
		<li>Bu pencere üzerinde görüntü üzerinde renk seç aracını tıklatın ve HSI modunu seçin.</li>
		<li>Fare imlecini işaretçiyi bir renk aralığı oluşturmak ilgi olumlu piksel noktası.</li>
		<li>Say ' ı tıklatın ve değeri Ölçüm tablo, gözlenen Sumu, işaretçiyi (µm2' de ifade) alanının yüzdesi aterosklerotik lezyonların toplam alanı ile ilgili olarak gösterir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ross, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9887164">Atherosclerosis--an inflammatory disease.</a> New England Journal of Medicine. 340 (2), 115-126 (1999).</li>
<li>Lafont, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1767898/">Basic aspects of plaque vulnerability.</a> Heart. 89 (10), 1262-1267 (2003).</li>
<li>Getz, G. S., Reardon, C. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3331926/">Animal models of atherosclerosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (5), 1104-1115 (2012).</li>
<li>Bentzon, J. F., Falk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerotic+lesions+in+mouse+and+man%3A+is+it+the+same+disease%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Lipidology%22%5BJournal%5D)">Atherosclerotic lesions in mouse and man: is it the same disease?</a> Current Opinion in Lipidology. 21 (5), 434-440 (2010).</li>
<li>Getz, G. S., Reardon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+the+Apoe-%2F-+and+Ldlr-%2F-+Mice+Yield+the+Same+Insight+on+Atherogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Do the Apoe-/- and Ldlr-/- Mice Yield the Same Insight on Atherogenesis?</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (9), 1734-1741 (2016).</li>
<li>Emini Veseli, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28483459">Animal models of atherosclerosis.</a> European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).</li>
<li>Schwartz, S. M., Galis, Z. S., Rosenfeld, M. E., Falk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque+rupture+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Plaque rupture in humans and mice.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (4), 705-713 (2007).</li>
<li>de Rita, O., Hackam, D. G., Spence, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+aldosterone+on+human+atherosclerosis%3A+plasma+aldosterone+and+progression+of+carotid+plaque%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Effects of aldosterone on human atherosclerosis: plasma aldosterone and progression of carotid plaque.</a> Canadian Journal of Cardiology. 28 (6), 706-711 (2012).</li>
<li>Ivanes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldosterone%2C+mortality%2C+and+acute+ischaemic+events+in+coronary+artery+disease+patients+outside+the+setting+of+acute+myocardial+infarction+or+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Aldosterone, mortality, and acute ischaemic events in coronary artery disease patients outside the setting of acute myocardial infarction or heart failure.</a> European Heart Journal. 33 (2), 191-202 (2012).</li>
<li>McGraw, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldosterone+increases+early+atherosclerosis+and+promotes+plaque+inflammation+through+a+placental+growth+factor-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Aldosterone increases early atherosclerosis and promotes plaque inflammation through a placental growth factor-dependent mechanism.</a> Journal of the American Heart Association. 2 (1), e000018(2013).</li>
<li>Rittie, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+Picrosirius+Red-Polarization+Detection+of+Collagen+Fibers+in+Tissue+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Method for Picrosirius Red-Polarization Detection of Collagen Fibers in Tissue Sections.</a> Methods in Molecular Biology. 1627, 395-407 (2017).</li>
<li>Caprio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+mineralocorticoid+receptors+in+human+vascular+endothelial+cells+regulate+intercellular+adhesion+molecule-1+expression+and+promote+leukocyte+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Functional mineralocorticoid receptors in human vascular endothelial cells regulate intercellular adhesion molecule-1 expression and promote leukocyte adhesion.</a> Circulation Research. 102 (11), 1359-1367 (2008).</li>
<li>Marzolla, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+ICAM-1+in+aldosterone-induced+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Essential role of ICAM-1 in aldosterone-induced atherosclerosis.</a> International Journal of Cardiology. 232, 233-242 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Ateroskleroz, makrofajlar, T-lenfositleri, endotel hücreleri ve düz kas hücreleri1gibi birden çok hücre tipleri arasındaki etkileşimler içeren büyük ve orta damarları ile ilgili kronik bir enflamatuar hastalığıdır. Fare aterojenik modelleri sınırlamaları rağmen aterosklerotik süreç kanıtlara büyük gövdeli mevcuttur. Bu modeller hızla belirli yaş ve cinsiyet deneysel tabur üreten avantajı var. Fareler de tanımlanmış ve homojen bir genetik arka planı göster.
Ateroskleroti...

Ateroskleroz mortalite ve morbidite dünya çapında1ana nedenlerinden biridir. Lipidler ve aterosklerotik plak oluşumunu belirleyen lökositler tarafından kan damarları nerede sızmış bir kronik inflamatuar durumu ile karakterizedir. Akut kalp olaylar çoğunluğu plak yırtılması nedeniyle trombotik olaylar ile ilişkilidir. Plak rüptürü eğilimli "hassas" tanımlanır ve pro-inflamatuar lökosit, nekrotik bir çekirdek ve ince lifli kap2artan infiltrasyonu ile karakterizedir. Son yıllarda, klinik ve deneysel çalışmalar hastalığın karmaşık patofizyolojisi açıklık var. Birkaç hayvan modeli moleküler mekanizmaları ateroskleroz3indüksiyon içinde yer alan araştırmak için kullanılır. Şu anda, fare ile karşılaştırıldığında insanlar onun patofizyolojisi mevcut species-specific bazı farklılıklara rağmen ateroskleroz eğitim için en sık kullanılan türdür. İnsanlarda kolesterol dolaşan ağırlıklı düşük yoğunluklu lipoproteinler (LDL), taşınır iken özellikle kolesterol dolaşan esas olarak yüksek yoğunluklu lipoproteinler (ile antiatherogenic özellikleri) tarafından fare modellerinde, muhtemelen oluşur Neden vahşi tipi fareler spontan ateroskleroz4geliştirmek mi ana nedeni temsil eden. Oysa insanlar yaklaşık % 50'sini diyet kolesterol4absorbe Ayrıca, farelerde vahşi tip kolesterol diyet, emici için genellikle dayanıklıdır. Bu sınırlamalarını aşmak için birkaç genetiği değiştirilmiş fare modelleri üretilmedi. Apolipoprotein E-eksik fare (ApoE−/−) ve LDL reseptör-eksik fare (LDLr−/−) yaygın olarak kullanılmaktadır. Yüksek yağ yüksek kolesterol diyet, hızla LDLr−/−farelere göre daha fazla plak ApoE−/− fareler geliştirmek ve bu nedenle, apolipoprotein−/− fareler kullanmaktır LDLr−/−fareler5,6bundan daha yaygın. ApoE−/− fare lezyonlar ateroskleroz herhangi bir aşamada geliştirmek ve her ne kadar fare plaklar bir kararsız fenotip7gösterme bu insanlarda gözlenen karşılaştırılabilir vardır. Genel olarak, apolipoprotein−/− fareler kendiliğinden ateroskleroz geliştirmek ve bu işlem ile Batı diyet3hızlandırılır. Ateroskleroz şiddeti karotis, akciğer, femur ve brachiocephalic arter ve aortik kök6düzeyinde değerlendirilebilir. Özellikle, aortik kökü bir anatomik site farelerde aterosklerotik lezyonları geliştirmek eğilimli temsil eder. Bu nedenle, bu bölgedeki aterosklerotik plak oluşumunu değerlendirmek için yaygın bir uygulama olduğunu.
Çeşitli çalışmalarda bu aldosteron ateroskleroz8,9,10gelişiminde karıştığı göstermiştir. Aldosteron infüzyon aterojenik bir diyet beslenen ApoE−/− farelerde aortik kök aterosklerotik lezyonlar iltihaplı ve lipid-zengin plak oluşumu10inducing gelişimini hızlandırır.
Özetle, aldosteron infüzyon, beslenme, kalp dokuları, miktar ve karakterizasyonu aterosklerotik lezyonların ApoE- / - farelerde katılmasını aterojenik diyet dahil olmak üzere bir protokolü açıklar. Bu yordam iltihaplı, lipid zengini aterosklerotik plaklar verimli bir oluşumu teşvik ve atherogenesis incelenmesi için değerli bir model temsil eder.

<table><tbody><tr><td>Ayarlanmış kalori diyeti (yağdan %42)</td><td>Envigo</td><td>TD.88137</td><td>aterojenik diyet</td></tr><tr>Sürekli <td>realaz</td><td>Aldosteron</td><td>SIGMA A9477</td> hormonu için doldurma tüplü Alzet model 1004 ile<td>ozmotik mini pompa</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>SIGMA</td><td>34852-M</td><td>çözücü</td></tr><tr><td>%70 İzopropil Alkol ile doyurulmuş Alchol Hazırlıkları</td><td>Kendal Webcol</td><td>6818</td><td>Dezenfektan</td></tr><tr><td>Cerrahi tel (Vicryl 6.0)</td><td>Demas</td><td>500004</td><td>cerrahisi</td></tr><tr><td>%10 Povidon/iyot merhem</td><td>Aplicare-Meriden</td><td>52380-0026-1</td><td>Antiseptik</td></tr><tr><td>Formalin %10</td> <td>SIGMA</td><td>HT5012</td><td>vaskolatürü sabitlemek için</td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>Bio-Optica</td><td>07-MP1515</td><td></td></tr><tr><td>OCT Bileşik</td><td>Sakura Finetek</td> gömmek için<td>Kriyostat</td><td>Leica</td></tr><tr><td></td><td></td><td>CM1900</td><td></td></tr> gömmek için 4583 <tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Kulak</td><td>Kepçesi</td><td>AU-L0615-500</td><td>tampon çözeltisi</td></tr><tr><td>Yapışma Slaytları Polisin</td><td>VWR</td><td>631-0107</td><td>mikroskop gözlükleri</td></tr><tr><td>Kapak Camları</td><td>Bio-Optica</td><td>72015</td><td>kapak camları</td></tr><tr><td>Formaldehit %37</td><td>SIGMA</td><td>252549</td><td>çözücü</td></tr><tr><td>Yağ Kırmızı O çözeltisi (izopropanol içinde% 0,5)</td><td>SIGMA</td><td>O1391</td><td>boyama çözeltisi</td></tr><tr><td>Mayer' s Hematoksilen</td><td>SIGMA</td><td>MHS32</td><td>boyama çözeltisi</td></tr><tr><td>Lityum Karbonat</td><td>SIGMA</td><td>62470</td><td>yıkama tamponu</td></tr><tr><td>Sulu Montaj Ortamı</td><td>Thermo Scientific</td><td>TA-125-</td><td>montaj çözeltisi</td></tr><tr><td>Aseton</td><td>SIGMA</td><td>179124</td><td>çözücü</td></tr><tr><td>Histoloji için</td><td>fosfomolibdik asit çözeltisi</td><td>SIGMA</td><td>HT153</td></tr><tr><td>Direct Red 80 (Picrosirius Kırmızısı)</td><td>SIGMA</td><td>365548</td><td>boyama solüsyonu</td></tr><tr><td>Bio Clear (terpen kökenli temizleme maddesi)</td> <td>Bio-Optica</td><td>06-1782D</td><td>histolojik örneklerin hazırlanması için ürün</td></tr><tr><td>Eukitt Hızlı Sertleştirme montaj ortamı (Poli (bütil metakrilat-ko-metil metakrilat)</td> <td>SIGMA</td><td>3989</td><td>montaj çözeltisi</td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat</td><td>Fluka</td><td>71725</td><td>tozu</td></tr><tr><td>Hidrojen Peroksit çözeltisi (% 30)</td> <td>SIGMA</td><td>H1009</td><td>çözeltisi</td></tr><tr><td>Vectorstain ABC KITI şunları içerir: anti-tavşan IgG ABC, normal tavşan serumu, İkincil biyotinile Anti-Sıçan IgG,</td> <td>Vektör Laboratuvarları</td><td>PK-6100</td><td>boyama çözeltisi</td></tr><tr><td>3-amino-9-etilkarbazol</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>SK-4200</td><td>boyama çözeltisi</td></tr><tr><td>Mac3 antikoru</td><td>BD Biosciences</td><td>553322</td><td>Görüntüleri</td></tr><tr><td>analiz etmek için</td> antikor<td>ImagePro Premier 9</td><td>Media Cybernetics</td><td>050910000-2534</td> yazılımı</tr></tbody></table>

apolipoprotein e-eksik farelerde mineralocorticoid reseptörlerinin etkinleştirmesi üzerinden aterosklerotik plaklar indüksiyon

Induction of Atherosclerotic Plaques Through Activation of Mineralocorticoid Receptors in Apolipoprotein E-deficient Mice

Ateroskleroz nedeniyle kronik inflamatuar yanıt vasküler endotel etkileyen ve hipertansiyon, dislipidemi ve diyabet gibi çeşitli faktörler tarafından yükseltilir. Bugüne kadar kardiyovasküler hastalık gelişimi için bir risk faktörü olarak aldosteron dolaşan bir rol destekleyecek kanıt vardır. Transgenik fare modelleri ateroskleroz için önde gelen hücresel ve moleküler süreçleri çalışmaya üretilmedi. Bu el yazması ApoE- / - farelerde aldosteron sürekli infüzyon yararlanır ve aterosklerotik plaklar aortik kökü tedavisi 4 hafta sonra oluşturur bir iletişim kuralını tanımlar. Biz, bu nedenle, miktar ve aortik kök düzeyinde aterosklerotik lezyonların karakterizasyonu için bir yöntem gösterilmektedir. Aldosteron infüzyon katma değeri aterosklerotik lezyonları lipid ve inflamatuar hücre zengin nesil tedavi 4 hafta sonra gösterilir. Plak lipid ve makrofaj içeriğinde ölçmek için boyama yordamlarda ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Özellikle, bu protokol için kalp kalp doku antigenicity korumak ve algılama antijenleri ilgi kolaylaştırmak amacıyla Ekim doku gömme gerçekleştiriyoruz. Plak fenotip analizini ateroskleroz gelişiminin patofizyolojisi çalışma ve anti-aterojenik uyuşturucu gelişimi için roman farmakolojik hedefleri belirlemek için geçerli bir yaklaşım temsil eder.

8-10 hafta içinde Apo- / - fareler, minipumps araç veya aldosteron ile demlemek için implante edildi (Şekil 1E-1I) ve (ayarlanan kalori diyet yağ % 42) aterojenik bir diyet için 4 hafta beslenir. Tedavi sonunda fare euthanized ve PBS ve yukarıda açıklandığı gibi % 10 formalin ile derin. Aortik kök kalp apikal kısmından ayrıldı ve Ekim (Şekil 2) bulunuyordu. Kesit aort köklerin bir cryostat makinesi (<s...

ApoE- / - fareler aldosteron sürekli bir sürüm boyunca aterojenik bir diyet ile beslenen aort kökünde ateroskleroz ikna etmek için bir protokol açıklar. Plak kompozisyon karakterize yöntemleri de açıklanmaktadır.

Apolipoprotein E-eksik farelerde Mineralocorticoid reseptörlerinin etkinleştirmesi üzerinden aterosklerotik plaklar indüksiyon

Atherosclerosis is due to a chronic inflammatory response affecting vascular endothelium and is promoted by several factors such as hypertension, ...

Bu yöntem farelerde erken ateroskleroz patofizyolojisi anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, aldosteron yetişkin büyüme ateroskleroz plakları gelişimini neden olan verimlilik, hızlılık. Bazı teknik adımların yalnızca metin yönergesi yoluyla öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi çok önemlidir.Prosedürü gösteren Caterina Mammi, benim laboratuvar bir personel bilim adamı olacaktır. Cerrahi eldiven ler giyerek, mini pompa dolum tüpünü bir mililitreşile takın ve tüpü 125 mikrolitre aldosteron veya araç çözeltisi ile yükleyin. Daha fazla ilerleyene ve pompayı aldosteron çözeltisi ile yavaşça doldurana kadar dolgu tüpünü mini pompanın üst kısmındaki delikten takın.Pompa gövdesinden sıvı bir boncuk yükseldiğinde pompayı doldurmayı bırakın ve dolum tüpünü dikkatlice çıkarın. Akış regülatörü mini pompanın gövdesine takın, regülatörün pompa gövdesine sıkıca bakılmasına dikkat edin ve dolgulu pompayı implantasyondan 24 saat öncesine kadar 37 santigrat derecede steril tuzlu çözelti içeren bir kabın içine asal olarak yerleştirin. Pompaları yerleştirmek için, kılları cerrahi bölgeden çıkarmak için bir jilet kullanın ve maruz kalan cildi %70'i iopropil alkolle dezenfekte edin, dokuma sızma ped malzemesi.Daha sonra, deri yoluyla 0.8-bir santimetre lik bir kesi yapın, ancak altta yatan dokuları değil ve kesiyi açmak için çerseps kullanın. Diğer taraftan bir trokar kullanarak, skapula doğru kesi pompa için bir cep oluşturmak için deri yayıldı ve kesi içine pompa eklemek, regülatör başı farenin önüne doğru yönelik, yavaşça pompa tamamen cebine iterek böylece gerginlik veya germe olmadan yara kapatmak için yeterli deri var. Pompa takıldıktan sonra, ameliyat teli ile kesi dikiş ve topikal uygulamak için temiz bir bez kullanın, 10%povidone iyot merhem.Sonra fare tam recumbency kadar izleme ile bir ısınma aşamasında kurtarmak için izin verin. Uygun deneysel bitiş noktasında, 10 ila 15 mililitre buz gibi soğuk DPBS ile yerçekimi perfüzyonu kullanarak sol ventrikül üzerinden fare perfuse, nötr tamponlu formüllerin% 10 40 ila 50 mililitre izledi. 10 ila 20 dakika sonra fareyi stereo-mikroskop altına yerleştirin ve aşırı periaortik ve perikardiyal yağ dokusunu çıkarmak için perçeler ve makaslar kullanın.Keçelerle sabit kalbi tutun ve aort kemerinin erişimine dik bir şekilde kesin, hasara yol açmadan kalbe mümkün olduğunca yakın. Kalp aort tan ayrıldıktan sonra, sağ ve sol atriyumun alt noktalarını birleştirerek düz bir çizgi boyunca enine kesmek için neşter kullanın ve açık kalbin üst kısmını optimum kesme sıcaklığı bileşiğiyle doldurun. Dikdörtgen kalıbın tabanına dik olarak yerleştirilen aort ekseni ile kriyo-kesitli plastik bir kalıp ile rezeke doku yerleştirin ve taze OCT ile doku kapağı.Doku düzgün odaklı olduğundan emin olmak için kalıp Backlight, daha sonra dikkatle kuru buz üzerinde bir metal plaka üzerinde kalıp yerleştirin, eksi 80 derece Santigrat depolama için gümüş folyo ile tüm kalıbı sarma EKIM beyaz döndüğünde. Kriyo-stat eksi 20 santigrat dereceye ulaştığında, dondurulmuş kalp bloğunu dışa bakacak şekilde numune tutucuya monte edin ve numune tutucuyu numune nin yönlendirme kafasına takın. Numune tutucunun yönünü, aort kökü ile bıçağa dik olarak blok bölümüne ayarlayın ve aort köküne ulaşılıncaya kadar bloğu kesin.Üç aort kapağı da ortaya çıkana kadar anatomik aort kök profilini izleyerek seri bölümleri cam slaytlar üzerine toplayın. Sonra altı ila sekiz, 10 mikrometre kalınlığında bölümleri toplamak ya da üç vana biri kaybolur veya artık bozulmamış kadar. Yağ kırmızı O nötr yağ boyama için, beş dakika için% 37 formaldehit 70 mililitre bölümleri düzeltmek, musluk suyunda iyice yıkama izledi.2-3 dakika sonra, erişim suyu kapalı leke ve 10 dakika boyunca% 0.3 yağ kırmızı O 70 mililitre bölümleri leke. Kuluçka sonunda, 10 dakika musluk suyunda slaytlar yıkayın ve Meyer's hematoksilin 70 mililitre içinde bir dakika hücreleri leke, bir dakika su yıkama ve bir dakika emersion 0.5% lityum karbonat 70 mililitre. Daha sonra hücreleri son bir dakika suda yıkayın ve ışık mikroskobu ile görüntüleme için sulu bir montaj ortamı ile bölümleri monte.Tedavi dört hafta sonra, apolipoprotein-E nakavt fareler lipid içeriğinde önemli bir artış gösterdi, kontrol-vahşi tip hayvanlara göre. Ayrıca, aldosteron tedavisi mack-3 boyama ile kanıtlanan ve araç tedavi farelere göre bu hayvanlarda daha iltihaplı aterosklerotik plak gösteren olarak nakavt hayvanlarda makrofaj içeriğini artırır. Ancak, aldosteron tedavisi aterosklerotik plakların kollajen içeriğini değiştirmez.Bu prosedürü denerken, bu yöntemin sadece aterojenik boya ile beslendiğinde ateroskleroz geliştirmeye doğal yatkın olan apolipoprotein fareler için doğrulandığı unutulmaması önemlidir. Bu nedenle farklı hayvan modellerine uygulanamaz. Bu prosedürü takiben, diğer aort bölgesindeki aterosklerozun karakterize edilmesi ve aterosklerotik yükün toplamının ölçülmesi için infra-boyama gibi diğer yöntemler de uygulanabilmektedir.Bu teknik, geliştirilmesinden sonra ateroskleroz alanında araştırmacıların inflamasyon ve endotel disfonksiyonu gibi aterogenezin erken mekanizmasını keşfetmelerinin önünü açmıştır. Isophane ve formalin gibi uçucu bileşiklerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken güvenlik laboratuvarı yüz maskesi takmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

induction-atherosclerotic-plaques-through-activation

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu yazıda daraltıcı manşet fare karotis arter ateroskleroz ikna etmek için tasarlanmıştır. Implante manşet farklı inflamatuvar fenotip aterosklerotik lezyon gelişimi tetikleyen yüksek, düşük ve salınımlı shear stresin iyi tanımlanmış bölgeler oluşturur, kendi iç lümen konik şekli nedeniyle.

Fare Shear stres İndüklenmiş Ateroskleroz Tetikleme Karotis Kol İmplantasyonu

Histokimyasal ve immünohistokimyasal analizle birlikte aort sinüsünün ve çıkan aortun hassas kesitini kullanarak fare modellerinde aterosklerotik lezyonları ölçmek ve karakterize etmek için prosedürleri açıklıyoruz.

Murin Aort Sinüsünde Aterosklerotik Lezyonların Kantitatif Analizi ve Karakterizasyonu

Bu video kemirgen arterlerde intimal plak iki kalkınma modelleri gösterir ve miyointimal hiperplazi ve ateroskleroz farklılıkları vurgulamaktadır.

Farelerde Ateroskleroz Karşı miyointimal hiperplazide uyaran: İki Geçerli Modellerinin An Introduction

Vasküler kalsifikasyon, insan kardiyovasküler hastalığının önemli bir belirleyicisi ve katkıda bulunan bir faktördür. Bu protokol, kültürlenmiş primer vasküler düz kas hücrelerinin kalsifikasyonunu indüklemek ve yakın kızılötesi floresan görüntüleme kullanarak hayvan aortlarında kalsifikasyon ve makrofaj yükünü ölçmek için yöntemleri açıklar.

Aort Kalsifikasyon ve Enflamasyon Vasküler düz kas hücrelerinin ve Görüntüleme Kalsifikasyon

Bu çalışmada farelerde hızlandırılmış ateroskleroz indüksiyonu için invaziv bir prosedür açıklanmaktadır. Elektrik veya kriyo kaynaklı yaralanma yöntemi ile karşılaştırıldığında, mekanik kaynaklı yaralanma revaskülarizasyon tedavileri sonrası restenoz insan durumunu taklit eder ve ilgili moleküler mekanizmaların çalışması için idealdir.

Farelerde Hızlandırılmış Ateroskleroz Indüksiyonu: "Tel-Yaralanma" Modeli

Biz hayvan diseksiyon, doku gömme, kesit, Boyama, ve brachiocephalic arterler analizini sistematik yöntemleri de dahil olmak üzere son aşama fare aterosklerotik lezyonları hücresel bileşimi karakterize etmek için standart bir protokol öneriyoruz atheroprone düz kas hücre soy izleme fare.

Kantitatif analiz düz kas hücre soy izleme farelerin gelişmiş aterosklerotik lezyonları içinde hücresel kompozisyon

Ateroskleroz murine modelleri, moleküler düzeyde patojenik yolları araştırmak için yararlı araçlardır, ancak lezyon gelişimi için standartlaştırılmış bir ölçmek gerektirir. Bu protokol, aort kökü, Aort kemer ve brachioksefalik arter dahil olmak üzere ana arter damarlarında lezyon boyutunu belirlemek için optimize edilmiş bir yöntem açıklanmaktadır.

Fareler içinde ateroskleroz ölçümü

Bu protokol, aterosklerozun mekanizmaları ve ilerlemesi hakkında daha derinlemesine araştırmaları kolaylaştırmak için aterosklerotik plakların kantitatif analizi için kapsamlı bir metodoloji sağlar.

Atrosklerotik Fare Modelinde Aort Ark ve Kök Lezyonlarının İzolasyonu ve Analizi

Merkezi sinir sistemi içine yenidoğan farelerin beyin (intraserebroventriküler) ve (intravenöz) 2) sistemik tedavi ajanları tanıtmak içine 1): Bu makale, enjeksiyon iki çok farklı yöntemler göstermektedir.

Fare intraserebroventriküler sayesinde Terapötik Ajanlar teslimi (ICV) ve intravenöz (IV) Enjeksiyon

Gen hedefleme araçları son gelişme nakavtla üretimi (KO) tavşan mümkün kılar. Bu çalışmada, biz Çinko Parmak nükleazlardır (ZFN) kullanarak beş Apolipoprotein (Apo) C-III KO tavşan oluşturulur. Bu çalışma ZFN KO tavşan üretmek için son derece verimli bir yöntem olduğunu göstermiştir.

Çinko Finger nükleazlar kullanılması Apolipoprotein C-III Knockout Tavşanlar Üretimi

Öğrenin, ApoE -/- farelerde mineralokortikoid reseptör aktivasyonuyla aterosklerotik plak indüksiyonu yöntemini. Sürekli aldosteron salınımı ile erken ateroskleroz patofizyolojisini hızlıca değerlendirin.

Apolipoprotein E-eksik farelerde Mineralocorticoid reseptörlerinin etkinleştirmesi üzerinden aterosklerotik plaklar indüksiyon

Daha fazla video keşfet