Name: Fare Lentiviral Gene lazer destekli teslim yumurta döllenmiş (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Öğrenin, fare döllenmiş yumurtalarında lazer destekli zona pellucida delme ve lentiviral gen teslimatı ile transgenik hayvan modelleri oluşturmayı. Bu yöntem %85 gen ekspresyonu sağlar ve genetik hastalık çalışmaları için hızlı uygulama sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma Ulusal Enstitüsü Sağlık (NIH), Ulusal Çevre Sağlık Bilimler Enstitüsü (NIEHS) Intramural araştırma programı tarafından desteklenmiştir. Dr Robert Petrovich ve Dr Jason Williams için kritik okuma el yazması ve faydalı tavsiyeler için minnettarız. Biz de kabul ve Dr. Bernd Gloss, altını gizleme çekirdek, akış sitometresi tesis, floresans mikroskobu ve görüntüleme merkezi ve NIEHS Karşılaştırmalı Tıp şube tesislerin teknik katkılarından dolayı teşekkür ederiz istiyorum. Bay David Goulding Karşılaştırmalı Tıp şubesinden ve Bayan Lois Wyrick görüntüleme Merkezi, bize fotoğraf ve illüstrasyonlar ile sağlamak için NIEHS teşekkür etmek istiyorum.

Tüm hayvan yordamlar ve bu protokol için kullanılan tedaviler NIH/NIEHS hayvan bakımı yönergeleri ile uyumlu olduğunu ve hayvan bakım ve kullanım Komitesi (ACUC), hayvan iletişim kuralı 2010-0004 NIH/NIEHS tarafından kabul edildi.
1. hazırlıkları
<ol><li>Rekombinant yayılıyor lentiviruses ilgi, gen taşıyan hazırlamak/satınalma. Bu çalışmada, copepod yeşil flüoresan protein ifade lentivirus SBI511 (copGFP; GFP için kısaltılır) bir uzama iletim için faktör 1a organizatörü kullanıldı. 2 üretmek için kullanılan standart iletişim kuralları ve titresi lentiviruses titreleri 1e8 transducing birim-mL (TU/mL) daha yüksek. Not: dikkatli olun ve lentiviruses ile temas halinde olan tüm malzeme çamaşır suyu. Enstitü nün yönergeleri güvenli kullanımı ve lentiviruses kullanımı için başvurun.</li>
	<li>İstenen fare zorlanma üreme çift bir gün önce embriyo hasat Kur. Bu deneyde fareler C57BL/6J suşu kullanılmıştır. Yumurtalıklar ve ovidukt koleksiyonu için kullanılan dişi fareler ovumun için herhangi bir hormonları ile tedavi değil.</li>
	<li>2-24 h fare döllenmiş yumurta, hasat öncesinde aşağıdaki gibi birkaç potasyum Simplex en iyi duruma getirilmiş orta24 (KSOM) açılan tabak hazırlamak: 2 mL ile bir 35 mm doku kültürü tedavi çanak ve kapak orta KSOM orta bir 50 μL damla eklemek Dimethylpolysiloxane (DMPS5X) ve 37 oC, % 5 CO2, %5 O2 ve % 90'ı N2 equilibrate için. Not: tek kullanımlık steril tabak kullanın ve ardından lentiviruses maruz atın.</li>
	<li>1 x çözümü hyaluronidase M2 orta hisse senedi çözümden hazırlamak (100 x, 30 mg/mL, mağaza-20 ° C'de). 100 x hisse senedi çözüm suda hazırlanmıştır.</li>
	<li>24 saat sonrası Lazer destekli iletim fare döllenmiş yumurta, çiftleri pseudopregnant dişi fareler hazırlamak için vasectomized erkek ve dişi fareler arasında üreme ayarla.</li>
</ol>2. fare yalıtım yumurta döllenmiş
<ol><li>16-24 h sonrası çiftleşme, vajinal fişler başarılı çiftleşme gösterge ile dişi fareler seçin ve insanca25ötenazi. Bu çalışmada kullanılan fare altında derin CO2 veya isoflurane inhalasyon servikal çıkığı euthanized.</li>
	<li>Yumurtalık ve oviducts göre standart protokolleri25izole etmek.</li>
	<li>Yumurtalık ve oviducts M2 ortamı içeren bir 35 mm çanak aktarın.</li>
	<li>Her yumurtalık için ayrı ampulla döllenmiş yumurta kümülüs hücreleri tarafından çevrili serbest bırakmak için gözyaşı.</li>
	<li>Döllenmiş yumurta transferi ve 35 mm kümülüs hücreleri içeren 1 x hyaluronidase M2 orta çanağı ve 3-5 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>Damlalıklı yukarı ve aşağı kümülüs hücreleri serbest bırakmak için yumurta döllenmiş.</li>
	<li>Döllenmiş yumurta M2 medya ve damlalıklı yukarı ve aşağı hyaluronidase yıkamak için içeren bir 35 mm çanak aktarın.</li>
	<li>Döllenmiş yumurta KSOM ve damlalıklı yukarı ve aşağı yıkama kalan M2 medya ve hyaluronidase içeren bir 35 mm çanak aktarın.</li>
	<li>Döllenmiş yumurta hazır KSOM damla plakaları için adım 1.3 aktarın. Not: KSOM fare döllenmiş yumurta bir doku kültürü kuluçka 37 ° C, % 5 CO2, %5 O2 ve equilibrate % 90'ı N-2 tutulmalıdır. Kuluçka makinesi 15 dk daha uzun süre plakaları kaldırılıyor embriyolar için zarar görmesine neden.</li>
	<li>Sonraki adıma geçmeden önce 2 h kuluçka için kurtarmak döllenmiş yumurta izin.</li>
</ol>3. fare delikli XYClone lazer ile yumurta döllenmiş
<ol><li>Kurulum ve XYClone lazer üreticinin tavsiye göre kalibre. Genellikle vitro fertilizasyon için kullanılan diğer lazerler, XYClone lazer için döllenmiş yumurta ekleyip yedek olabilir.<ol>
<li>Lazer denetleyicisi kutusu tel üzerinde mikroskop lazer cihazı takın.</li>
		<li>Lazer denetleyicisi kutusu lazer yazılım yolu ile a USB liman çalıştıran bilgisayara takın. 3.1.3. lazer denetleyicisi takın ve açın.</li>
		<li>Mercek ile seyir, bir test örneği (örneğin bir cam slayt üzerinde kuru-erase işaretler) sorgulamaktı.</li>
		<li>X ayarlamak için (lazer kitinde) küçük bir tornavida kullanın ve Y konumunu LED eşleştirmek için lazer ile mikroskop mercek görünür ışık ve lazer kalibre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikroskop sahne alanı'ndaki fare döllenmiş yumurta içeren bir KSOM açılan tabak koyun. Kalenin dışında da kuluçka 15dk daha uzun süre tutmayın.</li>
	<li>Mikroskop mercek ile bakmak ve embriyo'nın zona pelusida odaklanmıştır ve lazer LED ışık görünür olduğundan emin olun.</li>
	<li>LED ışık/lazer ile zona hedeflemek için mikroskop sahne alanı hareket ederler.</li>
	<li>Bilgisayar yazılımı kullanarak XYClone lazer için 250 μs ayarlayın.</li>
	<li>LED ışık boyutu istenen boyutlara (5 Bu deneyde ayarlama) ayarlayın.</li>
	<li>Her döllenmiş yumurta zona üç kez lazer ile sorgulamaktı. Zona ya deldi inceltilerek veya. Yukarıdaki ayarlarla, lazer çapı 10 mikron (Şekil 2) bir delikle üretecek. Not: kutup vücut yakın hedefleyen Lazer embriyonik hücre uzak tutar.</li>
	<li>Sonraki adıma geçmeden önce 2 h doku kültürü kuluçka için kurtarmak döllenmiş yumurta izin.</li>
</ol>4. fare iletim XYClone lazer perforasyon takip yumurta döllenmiş
<ol><li>Damlalıklı 2 μL içine 50 μL KSOM damla konsantre lentivirus (1e8 TU/mL titresi fazla). Değil damlalıklı yukarı ve aşağı yap. Döllenmiş yumurta kolayca damlalıklı ucunu takın. Bizim deneyime dayalı, 1e5-5e5 transducing lentivirus 3 μL'den küçük bir hacim içinde birimdir gen teslim edilmek üzere en uygun.</li>
	<li>Döllenmiş yumurta için kuluçka makinesi 4 günde blastosist geliştirmeye olanak sağlar. Medya değiştirmenize gerek yoktur.</li>
</ol>5. cerrahi olmayan Transduced fare embriyo Transfer sözde hamile farelere
<ol><li>Pseudopregnant fareler, çiftleşme sonra 3,5 gün 1.5 adımda hazırlanan kullanın.</li>
	<li>Fare embriyo pseudopregnant fareler implant için sigara cerrahi embriyo transferi (NTHE) aygıtı kullanın.<ol>
<li>Cerrahi ya da diseksiyon mikroskop kullanarak, serviks görselleştirmek için vajinal spekulum ekleyebilirsiniz.</li>
		<li>Sigara Cerrahi embriyo transferi (NTHE) aygıt yaklaşık 5 mm bir hacmi yaklaşık 2 μL serviks ve mevduat embriyo içine yerleştirin. Not: Bir steril NTHE aygıt her transfer için kullanılan ve işlemden sonra atılır. Tüm reaktifler embriyo manipülasyon kullanılan steril olmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10-15 sağlıklı blastosist 2 μL hacmine KSOM her pseudopregnant fareler için transfer.</li>
	<li>Pseudopregnant farelerde kilo alımı NTHE başarılı olup olmadığını belirlemek için aşağıdaki günlerde ölçmek ve izlemek devam edin.</li>
	<li>Yavruları doğal olarak doğurmak hamile fareler izin veya bir sezeryan 17 gün sonra26embriyo transferi gerçekleştirmek kurtarmak için. Sezeryan genellikle çok az embriyo varsa ve onlar için doğal Doğum çok büyük büyümek gereklidir.</li>
	<li>Doku pups Genotipleme transgenesis27oranını belirlemek için toplamak.</li>
</ol>

<ol><li>Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors%3A+basic+to+translational%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors: basic to translational.</a> Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).</li>
<li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titration+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protocols in Human Genetics. , Chapter 12 Unit 12 10 (2007).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li>
<li>Filipiak, W. E., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+transgenic+rat+production%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Advances in transgenic rat production.</a> Transgenic Research. 15 (6), 673-686 (2006).</li>
<li>McGrew, M. J., Sherman, A., Lillico, S. G., Taylor, L., Sang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+conservation+between+rodents+and+chicken+of+regulatory+sequences+driving+skeletal+muscle+gene+expression+in+transgenic+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional conservation between rodents and chicken of regulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens.</a> BMC Developmental Biology. 10, 26(2010).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+transgenic+pigs+mediated+by+pseudotyped+lentivirus+and+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Production of transgenic pigs mediated by pseudotyped lentivirus and sperm.</a> PLoS One. 7 (4), e35335(2012).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+quail+production+by+microinjection+of+lentiviral+vector+into+the+early+embryo+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Transgenic quail production by microinjection of lentiviral vector into the early embryo blood vessels.</a> PLoS One. 7 (12), e50817(2012).</li>
<li>Wassarman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zona+pellucida+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annul+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Zona pellucida glycoproteins.</a> Annul Review of Biochemistry. 57, 415-442 (1988).</li>
<li>Clift, D., Schuh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restarting+life%3A+fertilization+and+the+transition+from+meiosis+to+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (9), 549-562 (2013).</li>
<li>Fong, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastocyst+transfer+after+enzymatic+treatment+of+the+zona+pellucida%3A+improving+in-vitro+fertilization+and+understanding+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation.</a> Human Reproduction. 13 (10), 2926-2932 (1998).</li>
<li>Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+different+isolation+procedures+for+blastomeres+from+two-cell+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos.</a> Human Reproduction. 2 (5), 421-424 (1987).</li>
<li>Ribas, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+zona+pellucida+removal+on+DNA+methylation+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos.</a> Biology of Reproduction. 74 (2), 307-313 (2006).</li>
<li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li>
<li>Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+knockout+by+electroporation+of+engineered+endonucleases+into+intact+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos.</a> Scientific Reports. 4, 6382(2014).</li>
<li>Hosokawa, Y., Ochi, H., Iino, T., Hiraoka, A., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoporation+of+biomolecules+into+single+cells+in+living+vertebrate+embryos+induced+by+a+femtosecond+laser+amplifier%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Photoporation of biomolecules into single cells in living vertebrate embryos induced by a femtosecond laser amplifier.</a> PLoS One. 6 (11), e27677(2011).</li>
<li>Horii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+microinjection+methods+for+generating+knockout+mice+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Scientific Reports. 4, 4513(2014).</li>
<li>Hamra, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+transgenic+rats+by+lentiviral+transduction+of+male+germ-line+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).</li>
<li>Kanatsu-Shinohara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+transgenic+rats+via+lentiviral+transduction+and+xenogeneic+transplantation+of+spermatogonial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells.</a> Biology of Reproduction. 79 (6), 1121-1128 (2008).</li>
<li>Dann, C. T., Garbers, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+knockdown+rats+by+lentiviral+transduction+of+embryos+with+short+hairpin+RNA+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes.</a> Methods in Molecular Biology. 450, 193-209 (2008).</li>
<li>Chandrashekran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgenic+mice+by+lentivirus-mediated+modification+of+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa.</a> FASEB Journal. 28 (2), 569-576 (2014).</li>
<li>Woods, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+in+vitro+fertilization+facilitates+fertilization+of+vitrified-warmed+C57BL%2F6+mouse+oocytes+with+fresh+and+frozen-thawed+spermatozoa%2C+producing+live+pups%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups.</a> PLoS One. 9 (3), e91892(2014).</li>
<li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+blastocyst+dissection+and+subsequent+cultivation+of+embryonic+stem+cells+in+a+serum%2Fcell+free+culture+system%3A+applications+and+preliminary+results+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model.</a> Journal of Translational Medicine. 4, 20(2006).</li>
<li>Martin, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((En+masse+lentiviral+gene+delivery+to+mouse+fertilized+eggs+via+laser+perforation+of+zona+pellucida%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">En masse lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs via laser perforation of zona pellucida.</a> Transgenic Research. 27 (1), 39-49 (2018).</li>
<li>Lawitts, J. A., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Culture of preimplantation embryos.</a> Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).</li>
<li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+oocyte+microinjection%2C+maturation+and+ploidy+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caesarean+section+and+fostering%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Caesarean section and fostering.</a> CSH Protocols. 2006 (2), (2006).</li>
<li>Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+of+plant+and+animal+samples+without+prior+DNA+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li>
<li>Bin Ali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+pregnancy+and+birth+rates+with+routine+application+of+nonsurgical+embryo+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer.</a> Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).</li>
<li>Liu, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrase-deficient+lentivirus%3A+opportunities+and+challenges+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 14 (5), 352-364 (2014).</li>
<li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Lentiviruses onların ana bilgisayar genom entegre yeteneği onları istikrarlı gen teslim için ideal bir vektör yapar. Lentiviral vektörel çizimler ilâ 8.5 kilobaz çifti (kbp) hücre özgü veya indüklenebilir rehberleri, seçim işaretleri veya floresan moieties ağırlayacak genetik malzemesinin taşıyabilir. Anonim genomik malzeme onların ana bilgisayar genom parçası olarak çoğaltabilir ve hızlı veya istediğiniz zaman noktalarda devre dışı bırakmak için düzenlenir. Bu vektörler gen ifadesi çeşitli aşamalarında geliştirme ve mar...

Bu yöntem embriyonik hücreleri tarafından lentiviruses gen teslim için erişilebilir hale getirmek için fare döllenmiş yumurta zona pelusida permeabilizing için ayrıntılı yönergeler sağlar. Lentiviruses doğa verimli gen teslim edilmek üzere memeli hücreleri tarafından tasarlanmıştır. Hücrelerin bölünmesi ve bölme bulaştırmak ve lentiviral genom onların ana bilgisayar kromozom1entegre. Lentiviral konak hücre aralığını kolayca VSV-G protein2geniş tropism nedeniyle vesicular Stomatit virüs glikoprotein (VSV-G), ile rekombinant lentivirus pseudotyping tarafından genişletilir. İletim lentiviral genler stabil entegre ve ana bilgisayar kromozomlarını transjenik hayvanlar oluşturmak için ideal bir araç oluşturma bir parçası olarak dile getirdi. Eğer erken sahne embriyonik hücreler için teslim lentiviral genom çoğaltılır ve tüm organizmada dile getirdi. Lentiviral iletim fare, sıçan, tavuk, bıldırcın üretimi için yol açmıştır ve3,4,5,6,7 transgenics diğer türler arasında domuz. Lentiviral gen teslim, tipik yöntemi ancak, yetenekli teknisyenler ve özel ekipman erken sahne embriyo Kapsüller zona pelusida engeli aşmak için gerektirir. Bu yöntem genel amacı lentiviral gen teslim kolaylaştırmak için bir lazer kullanarak zona permeabilize nasıl tarif etmektir.
Memeli yumurta döllenme ve çevresel etkileşimleri8,9döllenmiş yumurta polyspermy karşı korumak için takip sertleşir zona pelusida tarafından çevrili. Zona embriyoların blastosist yumurtadan kadar uzak embriyonik hücreleri lentiviruses tutan bir bariyer oluşturur. Kültürlü fare yumurta kapağı 4 gün sonra döllenmiş ve damızlık pups içine normal gelişim için önce pseudopregnant fareler içine implante olması gerekir. Bu nedenle, iletim için perivitelline boşluğu, zona ve embriyonik hücreleri arasında boşluk içine zona üzerinden tarama önce lentiviruses microinjected.
Zona pelusida kez vitro fertilizasyon insan yumurta döllenme oranı10artırmak için kaldırılır. Ancak, fare zona pelusida kimyasal kaldırılması olumsuz fare embriyo gelişimi etkiler ve embriyonik hücreleri11,12' ye zararlıdır. Diğer yöntemler gen teslim edilmek üzere fare döllenmiş yumurta DNA doğrudan mikroenjeksiyon içine hücre çekirdeği13tarafından zona pelusida engeli aşmak. Pronuclear mikroenjeksiyon genler embriyolar için teslim etkili bir yoludur. Ancak, bu yana her embriyo mikroenjeksiyon için tek tek bir yerde tutulur, uygulama zahmetli ve zaman alıcı bir acemi kullanıcı için olabilir.
Elektroporasyon ve fotoporasyon gibi diğer yöntemleri geçici için yararlı ve kısa vadeli gen teslim fare için döllenmiş yumurta14,15,16. Bu yöntemler, CRISPR-Cas9 bileşenleri ve adlandırılan teslim etmek için yaygın olarak kullanılır. Ancak, genlerin Elektroporasyon ve fotoporasyon teslim transgenics oluşturmak için verimli bir şekilde kullanılamaz. Delinmiş fare epididim toplanan sperm hücreleri de lentiviruses tarafından transduced ve vitro fertilizasyon için transjenik hayvanlar17,18,19, üretmek için kullanılan 20.
Bu protokol için fare embriyo lentiviral gen teslim bir lazer kullanarak zona permeabilizing tarafından yönetilir. XYClone lazer vitro fertilizasyon21 ve embriyonik kök hücre22tarımı için yardımcı olarak geliştirilmiştir. Bu kurulumu basit ve kullanımı kolay küçük bir aparat var. Bir kez bir mikroskobunun yüklü, o bir objektif lens yer kaplar ve eşlik eden yazılımın mikroskop göz mercekleri ile bakarken Lazer hedefleyen için izin verir ( iletişim kuralıbkz: Bölüm 3). Bir kez zona XYClone lazer tarafından delikli, lentiviruses gen teslim23Kültür Medya içine tanıttı olabilir. Birden fazla lentiviruses aynı anda birkaç genlerin kromozom birleşme için teslim etmek için kullanılabilir.
Bu iletişim kuralı yalıtmak nasıl anlatacağım ve kültür fare yumurta döllenmiş, zona pelusida perforasyon için lazer kullanılışını ve fare embriyonik hücreleri iletim tarafından lentiviruses gösterir.

<table><tbody><tr><td>CD510B-1 plazmid</td><td>Sistemi Biosciences</td><td>CD510B-1</td>, EF1a-copGFP Dimetilpolisiloksan Sigma DMPS5X kültür embriyoları hyaluronidaz Sigma H3506 <td>eksprese eden lentivirüsü paketlemek için kullanılır</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td></td><td></td><td></td><td>kümülüs hücrelerini çıkarmak için kullanılır</td></tr><tr><td>XYClone Lazer</td><td>Hamilton Thorne Biosciences,</td><td>fare döllenmiş yumurtaları</td><td></td></tr> <tr><td>delmekAmeliyatsız Embriyo Transferi (NSET) Cihazı</td><td>ParaTechs</td><td>60010</td><td>NSET</td></tr> embriyo <tr><td>< güçlü > KSOM orta< / güçlü ></td><td>Millipore</td><td>MR-020P-5F</td><td>kültür embriyoları</td></tr> <tr><td>< güçlü > KSOM'un bileşimi: < / güçlü ></td> <td>><</td><td></td><td></td> mg / 100mL < / güçlü ></tr> <tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>555</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>18.5</td></tr><tr><td>KH<alt>2</alt>PO<alt>4</alt></td><td></td><td></td><td>4.75</td></tr><tr><td>MgSO<alt>4</alt> 7H<alt>2</alt>O</td><td></td><td></td><td>4.95</td></tr><tr><td>CaCl<alt>2</alt> 2H<alt>2</alt>O</td><td></td><td></td><td>25</td></tr><tr><td>NaHCO<alt>3</alt></td><td></td><td></td><td>210</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td></td><td></td><td>3.6</td></tr><tr><td>Na-Piruvat</td><td></td><td></td><td>2.2</td></tr><tr><td>DL-Laktik Asit, sodyum tuzu</td><td></td><td></td><td>0.174mL</td></tr><tr><td>10 mM EDTA</td><td></td><td></td><td>100 & mikro; L</td></tr><tr><td>Streptomisin</td><td></td><td></td><td>5</td></tr><tr><td>Penisilin</td><td></td><td></td><td>6.3</td></tr><tr><td>%0.5 fenol kırmızısı</td><td></td><td></td><td>0.1 mL</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td></td><td></td><td>14.6</td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Amino Asitler</td><td></td><td></td><td>1mL</td></tr><tr><td>MEM Esansiyel olmayan AA</td><td></td><td></td><td>0.5 mL</td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td>100</td></tr><tr><td><güçlü >M2 orta< / güçlü ></td> <td>Millipore</td><td>MR-015-D</td><td>kültür embriyoları</td></tr> <tr><td>< güçlü > M2 Bileşimi: < / güçlü ></td><td></td><td></td> <td>< güçlü >mg / 100mL < / güçlü ></td></tr> <tr><td>Kalsiyum Klorür</td><td></td><td></td><td>25.1</td></tr><tr><td>Magnezyum Sülfat (susuz)</td><td></td><td></td> <td>16.5</td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td></td><td></td><td>35.6</td></tr><tr><td>Potasyum Fosfat, Monobazik</td><td></td><td></td><td>16.2</td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat</td><td></td><td></td><td>35</td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td></td><td></td><td>553.2</td></tr><tr><td>Albümin, Sığır Fraksiyonu</td><td></td><td></td><td>400</td></tr><tr><td>D-Glikoz</td><td></td><td></td><td>100</td></tr><tr><td>Na-HEPES</td><td></td><td></td><td>54.3</td></tr><tr><td>Fenol Kırmızısı</td><td></td><td></td><td>1.1</td></tr><tr><td>Pirüvik Asit</td><td></td><td></td><td>3.6</td></tr><tr><td>DL-Laktik Asit</td><td></td><td></td><td>295</td></tr></tbody></table>

fare lentiviral gene lazer destekli teslim yumurta döllenmiş

Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Lentiviruses gen teslim memeli hücreleri için verimli vektörleridir. İletim, lentiviral genom stabil ana bilgisayar kromozom kurulmuştur ve döl için geçirilir. Böylece, onlar istikrarlı hücre hatları oluşturulması, vivo içinde teslim edilmesi göstergeleri ve iletim transjenik hayvanlar oluşturmak için tek hücre döllenmiş yumurta için ideal vektörleridir. Ancak, fare yumurta döllenmiş ve erken sahne embriyolar zona pelusida, lentiviral gen teslim karşı bir bariyer oluşturur bir glikoprotein matris tarafından korunmaktadır. Lentiviruses zona nüfuz için fazla büyüktür ve genellikle viral parçacıkların mikroenjeksiyon perivitelline boşluğu, zona ve embriyonik hücreleri arasında boşluk içine tarafından teslim edilir. Çok yetenekli teknoloji ve özel ekipman gereksinimini fare embriyo gen teslim için lentiviruses kullanımını en aza. Bu makalede bir lazer ile zona perfore tarafından fare döllenmiş yumurta permeabilizing için bir iletişim kuralı. Lazer-delikli embriyolar için herhangi bir hasara yol açmaz ve lentiviruses embriyonik hücreler gen teslim için erişim sağlar. Transduced embriyoların blastosist in vitro geliştirmek ve pseudopregnant farelerde implante transgenik pups geliştirmek. Bu protokol için kullanılan etkili ve kullanımı kolay lazerdir. Stabil lentiviruses tarafından teslim genler fare embriyonik hücreleri birleştirmek ve germline nakle engel vardır. Hiçbir embriyolardan gerektirir transgenik fareler oluşturulması ve mikroenjeksiyon döllenmiş yumurta için alternatif bir yöntem bu.

İzole/transduced fare döllenmiş yumurta gelişimi mikroskop altında günlük (Şekil 1) kontrol edilebilir. Sağlıklı embriyoların blastosist 3-4 gün içinde geliştirmek. Bu protokol için 60-p tedavi edilmezse embriyo geliştirmek blastosist23. 114 lazer delikli transduced embriyo dışarı, 54 geliştirilen blastosist (oranı % 47) ve 46 blastokistlerin ifade GFP (F/54 85 =)23.
<p class="jove_content" fo:keep-together....

Döllenmiş yumurta fare ve erken sahne embriyolar zona pelusida, gen teslim karşı bir bariyer oluşturur bir glikoprotein matris tarafından korunmaktadır. Bu makalede, zona lentiviral vektörler ile embriyonik hücreler transduce ve transgenik fareler oluşturmak için bir lazer ile perfore için bir iletişim kuralı.

Fare Lentiviral Gene lazer destekli teslim yumurta döllenmiş

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...

Bu zona pellucida ve lentiviral gen teslim lazer perforasyon yoluyla döllenmiş fare yumurtaları ilgi genleri sunmak için kullanılan alternatif ve kullanımı kolay bir yöntemdir. Fare donör prosedürünün lazer destekli delinme işlemi, diğer virüs türlerinin veya transfeksiyon reaktiflerinin girişini kolaylaştırmak için diğer türlerin döllenmiş yumurtaları için de uygulanabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, döllenmiş fare yumurtalarının mikromanipülasyonu ve mikro enjeksiyonu için özel bir beceri gerektirmesidir.Döllenmiş fare yumurta izolasyon prosedürü gösteren Page Myers, NIEHS Karşılaştırmalı Tıp dalından bir araştırma bilim adamı olacaktır. Çiftlemeden 16 ila 24 saat sonra, standart protokollere göre yumurtalıkları ve ovaductları vajinal fişli dişi farelerden izole edin. Tüm dokular toplandığında, her yumurtanın ampulla ayrı gözyaşı, ve kümülatif hücrelerle çevrili döllenmiş yumurta serbest, ve kümülatif hücrelerde yumurta transferi 35 milimetrelik bir çanak taze M2 ortamda bir x hyaluronidaz içeren, oda sıcaklığında üç ila beş dakika kuluçka için.Pipet yumurta birkaç kez kümülatif hücreleri serbest bırakmak için, ve yeni bir 35 milimetrelik çanak M2 orta içeren yumurta aktarın,

laser-assisted-lentiviral-gene-delivery-to-mouse-fertilized-eggs

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu cerrahi teknik fare gözün subretinal boşluk içine gen terapisi vektörleri ve kök hücrelerinin enjeksiyonu göstermektedir.

Fare Göz içine Gen Terapisi Vektörler ve Kök Hücre Subretinal Enjeksiyon

Kaynak: Lutz, D., et al. Gelişmekte Olan Fare Beyin ve Omuriliğinin İn Utero Transdüksiyonu Sonrası Ultrastrüktürel Nöroplastisite Parametrelerinin Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2019).Bu video, fare embriyolarında rahim içi enjeksiyon yoluyla viral transdüksiyonu göstermektedir. Ameliyat için hamile bir fare hazırlanır ve rahim boynuzlarını ortaya çıkarmak için orta hat kesisi yapılır. İstenilen geni içeren bir virüs ve takip boyası karışımı, hedeflenen yerlerde rahim keseleri içindeki...

Bir farede utero viral transdüksiyon

Kaynak: Koza, P., et al. Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach. J. Vis. Exp. (2020)Bu video, transgenik sıçanların üretimi için stabil transgen entegrasyonu sağlamak amacıyla, döllenmiş sıçan embriyolarına lentiviral vektörlerin mikroenjeksiyon yardımıyla iletilmesini göstermektedir.

Sıçan Fertilize Embriyolarının Lentiviral Vektör Tabanlı Transdüksiyonu

Kaynak: Chiarella, A. M. et. al., Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers. J. Vis. Exp. (2018)Bu video, lentiviral transdüksiyon kullanılarak genetik olarak modifiye edilmiş fare embriyonik kök hücrelerinin oluşturulmasını göstermektedir. Lentiviral partiküller, stabil genomik entegrasyona ve transdükte hücrelerin seçilmesine olanak tanıyan bir antibiyotik direnç markörü iletir.

Lentivirüs ile Enfekte Edilmiş Fare Embriyonik Kök Hücrelerinin Üretilmesi

Bu video, lentiviral vektörlerin döllenmiş bir fare embriyosunun perivitellin boşluğuna pronükleer enjeksiyonunu açıklar. Lentivirüs, döllenmiş embriyonun genomuna dahil edilen ve sonunda transgenik farelere yol açan transgeni içerir.

Lentiviral Vektör Bazlı Perivitellin Enjeksiyonu: İlgilenilen Geni Döllenmiş Tek Hücreli Fare Oositlerine Dönüştürmek İçin Bir Yöntem

Bu videoda, lentiviral gen iletimini kolaylaştırmak için fare döllenmiş yumurtalarında zona pellucida'nın koruyucu tabakasının lazer destekli nüfuzunu gösteriyoruz. Lentivirus, genomlarına istikrarlı bir şekilde entegre edilmiş bir ilgi genine sahip transgenik hayvanların üretilmesini sağlar.

Lazer Destekli Lentiviral Gen Dağıtımı: Lentiviral Gen Dağıtımını Kolaylaştırmak için Fare Döllenmiş Yumurtalarını Geçirgen Hale Getirme Tekniği

Bu protokol, çiftlik hayvanı zigotlarında sitoplazmik mikroenjeksiyonun nasıl yapılacağını gösterir. Bu teknik, nakavt hayvanlar oluşturmak için genom düzenleme araçları gibi tek hücreli embriyoya herhangi bir çözelti vermek için kullanılabilir.

Lazer destekli Hayvancılık Zigotlann Sitoplazmik Mikroenjeksiyon

Geleneksel işlev kaybı çalışmalar nakavt hayvanlar kullanarak genlerin kez pahalı ve zaman alıcı olmuştur. Somatik mutagenesis CRISPR-aracılı Elektroporasyon tabanlı gen içinde vivoişlevleri anlamak için güçlü bir araçtır. Burada, nakavt fenotipleri beyincik Proliferasyona hücrelerdeki analiz etmek için bir yöntem raporu.

CRISPR-aracılı kaybı serebellar granül işlev analizinin gen transferi Elektroporasyon tabanlı rahim içinde kullanarak hücreleri

Burada, lentiviral bir vektör perivitelline alanda bir döllenmiş yumurta, basit bir iğne ile transgene entegrasyon ve kurucusu transgenik fareler ile yüksek etkinlik üretimini teşvik için bir protokol mevcut.

Lentiviral aracılı transgenik fareler üretimi: doğrudan eğitim kurucuları basit ve son derece etkili bir yöntem

Bu makalede, zigot perivitellin uzaya bir virüs süspansiyon birden fazla enjeksiyon kullanarak sıçan embriyolarında lentiviral transgenez için metodoloji sağlamayı amaçlamaktadır. Farklı bir baskın kürk rengi ile doğurgan bir erkek zorlanma ile çiftleştirilmiş dişi sıçanlar sözde hamile koruyucu anneler oluşturmak için kullanılır.

Lentiviral Vektör Yaklaşımı Kullanarak Transgenik Sıçanların Üretimi

Burada, embriyonik kök hücreler kullanarak, özellikle büyük DNA knock-in (KI) için genetiği değiştirilmiş fare modelleri geliştirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, CRISPR / Cas9 genom düzenlemesi kullanılarak ayarlanır ve geleneksel homolog rekombinasyon aracılı doğrusallaştırılmış DNA hedefleme yöntemine kıyasla önemli ölçüde iyileştirilmiş KI verimliliği ile sonuçlanır.

Genle Manipüle Edilmiş Fare Modelleri Geliştirmek için Embriyonik Kök Hücrelerde CRISPR / Cas9 Aracılı Yüksek Verimli Gen Hedefleme

Öğrenin, fare döllenmiş yumurtalarında lazer destekli zona pellucida delme ve lentiviral gen teslimatı ile transgenik hayvan modelleri oluşturmayı. Bu yöntem %85 gen ekspresyonu sağlar ve genetik hastalık çalışmaları için hızlı uygulama sunar.

Fare Lentiviral Gene lazer destekli teslim yumurta döllenmiş

Daha fazla video keşfet