Name: Farede Laminektomi ve Omurilik Penceresi İmplantasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Keşfedin farede omurilik penceresi implantasyonu ve intravital mikroskopi ile protein dinamiklerini canlı görüntüleme. Bu yöntem nörobilim ve immünoloji araştırmalarında sinir sistemi süreçlerini incelemek için güvenilir bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S.E. Lutz, Grant KL2TR002002 ve University of Illinois Chicago College of Medicine başlangıç fonları altında Ulusal Çeviri Bilimleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Geliştirme Merkezi tarafından desteklenir. Simon Alford RO1 MH084874 tarafından desteklenir. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve NIH'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Yazarlar Tg eGFP için Columbia Üniversitesi Tıp Merkezi Nöroloji Bölümü'nde Dritan Agalliu teşekkür:Claudin-5 fareler, bilimsel tartışmalar, ve cerrahi protokol ve görüntüleme uygulamalarının geliştirilmesi içine anlayışlar. Yazarlar California Üniversitesi Nörobiyoloji ve Davranış Bölümü Sunil P. Gandhi teşekkür, Irvine stereotaktik cihaz ve hayvan sıcaklık kontrolörü ilk prototip tasarımı için, cerrahi protokol tartışma, ve iki foton lu mikroskopi eğitimi. Yazarlar ayrıca Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc) cerrahi stereomikroskop özelleştirme de yardım için teşekkür ve Ron Lipinski (Balina İmalat) stereotaktik parçaları işleme için.

Tüm deneyler Illinois Üniversitesi, Chicago Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi protokollerine uyar. Bu ölümcül bir prosedür.
1. Reaktif Hazırlama
<ol><li>DdH 2 O. Steril filtrede 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Glukoz, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2·6H2O, 2 mM CaCl2·2H2O ddH2O. Steril filtre içerecek şekilde suni serebral spinal sıvı (aCSF) hazırlayın ve bireysel kullanımda dondurulun. Kullanmadan önce 39 °C'ye kadar bir su banyosunda aCSF'yi ısıtın.</li>
	<li>Sıcak düşük erime noktası agarose (%2) 65 °C'ye ayarlanmış bir su banyosunda tamamen eriyene kadar aCSF'de Laminektomi sırasında, erimiş agarose aliquot'u bir su banyosunda 39 °C'ye kadar soğutun, böylece 5.2 adım için fizyolojik sıcaklığa yakın bir sıcaklıkta hazırolsun. Not: Agarose çözeltisi -20 °C'de tek kullanımlık aliquotlarda saklanabilir.</li>
	<li>Bakteriyostatik suda steril 50 mg/mL karprofen hazırlayın. 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>% 70 etanol, ddH2O üç yıkıntı ile temiz kapak camları, ve tozsuz bir kapta kuru saklayın.</li>
</ol>2. Backplate 3D Baskı
<ol><li>3DCAD yazılımı kullanarak Şekil 1'de gösterilen boyutlara bir model oluşturmak için kullanılır. İç yazıcı ile ilgili olarak alt yüzeyinde bir elips geniş ve karşı yüzeyde bir lümen oluşturan daha küçük bir elips için loft kesim ile kesilir. Vidaları kabul etmek için delikli iki projektör kolu, arka plaka tutan çatala bağlanmak için yanal olarak uzar. Bu 3B yapıdan üçgenleştirilmiş bir 3B kafes dosyası oluşturun (. STL dosyası). Not: Bkz. Şekil 1B\u2012D ve Ek Dosyalar 1 ve 2.</li>
	<li>Üçgenleştirilmiş 3D örgü dosyasını bir 3B yazıcıya yükleyin.</li>
	<li>0,4 mm hot-end nozul ve 0,2 mm katman yüksekliği kullanarak arka plakaları yazdırın. 205 °C'lik nozul sıcaklığını, 45 °C yatak sıcaklığını ve 45 mm/s yazdırma hızını seçin.</li>
	<li>Ortaya çıkan 3B baskılı arka plakaları yapısal bütünlük için görsel olarak değerlendirin (Şekil 1E); brüt yapısal arıza (lümen yok, çökmüş duvar) baskı kusurlarını gösterir (Şekil 1F).</li>
</ol>3. Cerrahi Hazırlık
<ol><li>Isıtma yastığını önceden ısıtın.</li>
	<li>Kimyasal bir duman kaputunda çalışırken teslimat şırıngasına yüklenir. Teslimat şırıngını isoflurane ünitesine takın.</li>
	<li>8\u201212 haftalık bir fare seçin. Hayvanı tart. İndüksiyon odasında %2 isofluran kullanarak anestezi edin. 5 mg/kg deri altı karprofen enjekte edin.</li>
	<li>Burun konisini yerleştirin ve anestezinin cerrahi düzleminin bakımı için 150 mL/dk akış hızı yla %2 oranında isofluran teslim edin(Şekil 2A\u2012E). Temizleme kolaylığı için ısıtma yastığını tek kullanımlık emici pedile sarın.</li>
	<li>Cerrahi istasyonunda ısıtma yastığı üzerinde bir hayvan yerleştirin ve burun konisi yükleyin. Termometreyi petrol jölesi ile yağlayıp rektuma 5 mm takın. Stabilite için termometre sondasını kuyruğuna bantlayın. Farenin gözlerine oftalmik merhem uygulayın.</li>
	<li>Hidrasyonu korumak için, deney sonlanana kadar her 30 dakikada bir deri altı enjeksiyonla 200 μL laktasyonlu Ringer çözeltisini uygulayın.</li>
	<li>Sprey dorsum ile 70% etanol, makas ile kürk kaldırmak ve povidon-iyot ile site temizleyin.</li>
</ol>4. Laminektomi
<ol><li>Hayvanı kulak çubukları arasına yerleştirin; bunlar, burun konisi ile ilgili olarak farenin baş konumunu korur.</li>
	<li>Bu hayvan derinden interdigital çimdik refleks ve sürekli solunum düzeni eksikliği tarafından değerlendirildiği gibi anestezi olduğunu onaylayın.</li>
	<li>#11 bıçak kullanarak alt torasik/üst lomber bölge üzerinde orta hatta 1,5 cm rostral-kaudal insizyon yapın (Şekil 2). Künt dişli püzeler ve/veya eldivenli parmaklarla tutarak deriyi ayırın. Cildin altında kalan saydam bağ dokusunu ayırmak ve soymak için forceps kullanın. Yüzeysel kas şimdi maruz olmalıdır; bir köpük cerrahi mızrak ile yerinden.</li>
	<li>Hedef vertebranın kalan, daha derin kaslarını temizlemek için köpük cerrahi mızraklar (veya bir curette) kullanın (torasik 12). Arka plaka için bir koltuk oluşturmak için, ayrıca torasik 11 arka yönü kas temizlemek, ve torasik 13 ön yönü. Cerrahi bir mızrakla hafif basınç uygulayarak kanamayı kontrol edin veya bir çeker tabancası ile minimum darbe kullanın. Forceps kullanarak tendondan uzak kalan kas çıkarmaya devam edin</li>
	<li>Kaslar çıkarıldıktan sonra, dikkatle forceps ile keserek tendonları ayırmak. Bu adım tamamlandığında kabloyu görselleştirmek ve işlemek için bol miktarda alan olmalıdır. Inter-vertebral uzayın dura madde kontrol edin, yarı saydam laminar kemik, kemik altında merkezi yüzeysel kan damarı, ve anterior yayılan arter artık açıkça görülebilir.</li>
	<li>Sıcak aCSF ile bölgeyi ısla. Mikromatkap kullanarak omuriliğin uzun eksenine paralel düz vuruşlar kullanarak laminar kemiği tekrar tekrar inceltin(Şekil 2, Şekil 3). İstenirse, gelişmiş ergonomik konfor için cerrahi platformu döndürmek için bir kayma aşaması kullanın (örneğin, sağ elini kullanan bir operatör sondaj adımı için cerrahi platformu saat yönünün tersine döndürebilir). Not: Kullanılan kayma aşaması, sabit taban plakasına göre ±15 mm kaydıran üst alüminyum plakadan yapılmıştır.</li>
	<li>Hafifçe forseps ile yüzeysel spinous süreci kavramak ve vertebra kaldırın; kemik kolayca kaldırılmalıdır. Direnç varsa, matkap la kemik inceltme tekrarlayın ve gerekirse iris makas kullanın, doku zarar önlemek için makas uçları yukarı nişan dikkatli olmak. Not: Durayı sağlam tutmak için kemiğe çekmemek gerekir.</li>
	<li>Herhangi bir kemik kırıkları temizlemek için #4 forceps kullanın. Herhangi bir kanamayı kontrol etmek için hafif çetrene basınç uygulamak için cerrahi bir mızrak kullanın. Sıcak aCSF ile durula. Dokunun kurumasını izin vermeyin.</li>
</ol>5. Kapak-cam İmplantasyonu
<ol><li>3 mm'lik borosilikat kapak camı açıktaki kabloya hafifçe uygulayın.</li>
	<li>Agarose'un 39 °C'ye soğutulmasını sağlayın. Küçük bir spatula kullanarak, kapak cam Kenarına sıcak% 2 agarose / aCSF uygulayın ve kılcal eylem yüzeyin altına çizmek için izin. Not: 39 °C'nin altındaki sıcaklıklarda agarose jel olmaya başlayabilir. Bu durumda, bir su banyosu veya mikrodalga kullanarak yeniden ısınmak. Bazı operatörler ilk agarose bir damla uygulamak ve üstüne kapak cam koymak tercih ederim.</li>
	<li>Torasik düzey 11 vertebra ve torasik düzey 13 vertebra omurga bozulmamış komşu vertebra maruz kemik eklem süreçlerine doku yapıştırıcı uygulayın. Laminaektomi bölgesinin etrafındaki halkaya, bitişik tendon ve enine proses üzerine ek doku yapıştırıcısı uygulayın. Not: Sonraki adımlarda diş çimentosu uygun yapıştırıcı için doku yapıştırıcı gereklidir. Eklem süreçleri, arka plakanın rahat edebileceği doğal bir koltuk oluşturur (Şekil 3). Eklem süreçlerine yapışma eki güçlü noktaları oluşturacaktır.</li>
	<li>Bir porselen karıştırma tepsisinde hızlandırıcı ile karıştırın diş çimentosu. Doku yapışkan tabakası üzerine diş çimentosu aktarmak için küçük bir spatula yararlanın. Arka plakayı pencerenin üzerine ortalanmış cerrahi alana yapıştırmak için diş çimentosu kullanın. Diş çimentosu tedavi için 10 dakika bekleyin. Not: Arka plakanın ön ve posterior eklem proseslerine sıkı yapışması implantın temel yapısal stabilitesini sağlar.</li>
	<li>Arka plakaiç tabanı doldurmak için ek diş çimentosu kullanın, ve arka plakanın alt : doku arayüzü. Not: Diş çimentosu ekstra uygulama yapışmayı artırır ve mikroskop objektif daldırma sıvısı (tuzlu) arka plaka nın alt dışarı sızıntı riskini azaltır.</li>
	<li>Çatallı arka plaka tutucuyu pencere üzerinde uygun konuma getirin. Arka plakayı vidalarla arka plaka tutucuya sabitle. Not: Bu protokolde özel olarak işlenmiş bir arka plaka tutucu kullanılmıştır (Şekil 2G\u2012H).</li>
	<li>Sızıntıyı test etmek için arka plakaya tuzlu su uygulayın. Herhangi bir sıvı sızıntısı durumunda, alanı kuru ve daha fazla diş çimentosu uygulayın.</li>
</ol>6. Görüntüleme Hazırlığı
<ol><li>Cerrahi platformdaki hayvanı optik masaya aktarın. Not: Cerrahi platformumuz, arka plaka tutucumuz ve isofluran etek tutucumuz, sürekli isofluran anestezi uygularken cerrahi ve iki foton görüntüleme istasyonları arasında tek ünite olarak taşınabilir (Şekil 2D,H). Benzer birimler, ticari kaynaklardan elde edilebilen çatal, kiriş ve destekleyici sütun direklerinden(örn. ThorLabs). İntravital mikroskopi için, cerrahi platformun yüksekliğini karşılamak için mikroskop hedefi ile optik tablo arasında en az 11 inç açıklık olmalıdır.</li>
	<li>Cerrahi platformu, paslanmaz çelik montaj direğine ve counterbored sıkma çatalını kullanarak optik masaya yapıştırın.</li>
	<li>Arka plakanın kuyuiçine taze tuzlu uygulayın. Kuyuya bir su daldırma lens indirin.</li>
	<li>İlgi ve odak alanını belirlemek için iletilen veya epifloresan ışığı kullanın. Lazer tarama moduna geçin ve uygun iki foton lazer uyarma dalga boyu, dikroics ve bandpass filtrelerdoku6mevcut floropores için göre vivo görüntüleme gerçekleştirmek .</li>
</ol>

<ol><li>Weinger, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+cellular+dynamics+in+the+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li>
<li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).</li>
<li>Farrar, M. J., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+implanting+a+spinal+chamber+for+longitudinal+in+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li>
<li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implanting+glass+spinal+cord+windows+in+adult+mice+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50826(2013).</li>
<li>Figley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spinal+cord+window+chamber+model+for+in+vivo+longitudinal+multimodal+optical+and+acoustic+imaging+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model.</a> PLOS ONE. 8 (3), e58081(2013).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).</li>
<li>Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tight+junction+protein+complex+undergoes+rapid+and+continuous+molecular+remodeling+at+steady+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state.</a> Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).</li>
<li>Knowland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+recruitment+of+transcellular+and+paracellular+pathways+underlies+blood-brain+barrier+breakdown+in+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke.</a> Neuron. 82, 1-15 (2014).</li>
<li>Lutz, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolin1+Is+Required+for+Th1+Cell+Infiltration%2C+but+Not+Tight+Junction+Remodeling%2C+at+the+Blood-Brain+Barrier+in+Autoimmune+Neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation.</a> Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).</li>
<li>Harrison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebral+landmarks+for+the+identification+of+spinal+cord+segments+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse.</a> Neuroimage. 68, 22-29 (2013).</li>
<li>Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-4939-0381-8_2">Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue</a>. Bakota, L., Brandt, R. , Springer. New York. 37-50 (2014).</li>
<li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450(2016).</li>
<li>Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser-scanning+microscopy+for+single+and+repetitive+imaging+of+dorsal+and+lateral+spinal+white+matter+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Research%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo.</a> Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).</li>
<li>Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+Low-flow+Digital+Anesthesia+System+for+Mice+and+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).</li>
<li>Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Traditional+and+Integrated+Digital+Anesthetic+Vaporizers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).</li>
<li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+COX-2+inhibitor+celecoxib+prevents+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+through+COX-2-independent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway.</a> Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).</li>
<li>Muthian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COX-2+inhibitors+modulate+IL-12+signaling+through+JAK-STAT+pathway+leading+to+Th1+response+in+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis.</a> Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada açıklanan yöntem, cam pencereden farelerdeki omuriliğin kararlı bir şekilde görüntülenmesine olanak sağlar. Bu yöntem transgenik eGFP BBB remodeling değerlendirmek için uygulanmıştır:Claudin5 +/- bir floresan BBB sıkı kavşak proteinifade fareler, ancak omurilik herhangi bir floresan protein veya hücrelerin çalışmaları için eşit derecede iyi uygulanabilir.
Laminektomi ve omurilik stabilizasyonu için birden fazla yöntem geliştirilmiştir. Tüm protokoller, ilgi çekici yapıya görsel erişim i...

Floresan proteinleri ifade eden transgenik hayvan modelleri, intravital mikroskopi ile birleştirildiğinde, biyoloji ve patofizyolojiye yönelik güçlü bir platform sağlar. Omurilik bu teknikleri uygulamak için, görüntüleme için omurilik hazırlamak için özel protokoller gereklidir. Böyle bir strateji bir laminektomi ve omurilik penceresi implantasyonu yapmaktır. Mikroskopi için ideal bir laminektomi protokolünün temel özellikleri arasında doğal doku yapısı nın ve fonksiyonunun korunması, görüntüleme alanının stabilitesi, hızlı işlem süresi ve sonuçların tekrarlanabilirliği sayılabilir. Belirli bir sorun solunum ve kalp atışı tarafından indüklenen harekete karşı görüntüleme alanı stabilize etmektir. Birden fazla ex vivo ve in vivo stratejileri bu hedeflere ulaşmak için bildirilmiştir1,2,3,4,5. En in vivo yöntemleri spinal kolonun kenarlarına kenetleme içerir2,4 ve genellikle sert bir metalcihazimplante takip 3,4 ameliyat sırasında istikrar için ve downstream görüntüleme uygulamaları. Omurilik kıskaç potansiyel kan akışını tehlikeye ve kan-beyin bariyerini neden olabilir (BBB) protein remodeling.
Bu yöntemin amacı, protokolün invazivliğini en aza indirirken ve sonuçları iyileştirirken, omurganın canlı farede optik görüntüleme için kullanılabilir hale getirilmesidir. Biz hala sağlam mekanik kararlılık elde minimal invaziv oval plastik 3D baskılı arka plaka ile eşleştirilmiş tek bir laminektomi ve kapak cam implantasyon prosedürü açıklar. Arka plaka doğrudan diş çimentosu ile anterior ve posterior vertebral dikenler yapıştırılır. Arka plaka sert bir metal kol ile mikroskop aşamasına eklemek vida delikleri ile yanal uzatma kolları ile donatılmıştır. Bu etkili mikroskop aşamasına bozulmamış anterior ve posterior vertebra demirler, aksi takdirde solunum ve kalp atışı ile tanıtılacak hareket artifakı mekanik direnç sağlayan. Yöntem, torasik düzey 12'de tek bir vertebranın laminektomi için optimize edilmiş ve in vivo görüntüleme sırasında stabilite için alternatif stratejilerde kullanılan kıskaçlar atlanmıştır. İşlem hızlıdır ve fare başına yaklaşık 30 dakika süredilir.
Bu protokol BBB'nin hastalık mekanizmalarını incelemek için kullanılabilir. BBB, merkezi sinir sistemi (CNS) için son derece seçici bir ortam sağlayan endotel hücreleri, vasküler düz kas, perisitler ve astrosit ayak süreçlerinden oluşan dinamik bir mikrovasküler sistemdir. Temsili veriler, gelişmiş yeşil floresan proteini (eGFP): BBB sıkı kavşak proteini Claudin-5'i ifade etmek üzere tasarlanmış transgenik farelerde bu protokolün uygulanmasını betimlemelidir. Sağlanan arka plaka yazdırma dosyaları da alternatif uygulamalar için özelleştirilebilir.

<table><tbody><tr><td>3D yazıcı</td><td>Raise3D</td><td>Pro2</td><td>Arka plakaları yazdırmak için</td></tr><tr><td>PLA 3D baskı filamenti</td><td>Inland</td><td>PLA+-175-B</td><td>Siyah plastik 3D baskı malzemesi</td></tr><tr><td>3D CAD yazılımı</td><td>Dassault Systemes</td><td>Solidworks yazılımı</td><td>3D şekiller tasarlamak için kullanılır</td></tr><tr><td>3D yazıcı yazılımı</td><td>Raise3D</td><td>Ideamaker yazılımı</td><td>3D yazıcı ile arayüz oluşturmak için kullanılan yazılım</td></tr><tr><td>3D baskılı oval arka plaka</td><td>özel</td><td></td><td>Stabilize edici görüntüleme alanı</td></tr><tr><td>Cerrahi diseksiyon mikroskobu</td><td>Leica</td><td>M205 C</td><td>Leica FusionOptics ile donatılmış, Planapo 0.63x M serisi objektif ve kayma aşaması</td></tr><tr><td>Mikroskop kamerası</td><td>Leica</td><td>MC170</td><td>Cerrahi alanı görselleştirmek için HD renkli kamera</td></tr><tr><td>Kayma aşaması</td><td>Leica</td><td>10446301</td><td>Kayma aşaması iki metal plakadan yapılmıştır. Taban plakası sabittir. Üst plaka, dönme ve doğrusal harekete izin vermek için yağlanmış arayüz üzerinde kayar.</td></tr><tr><td>Cerrahi istasyon ve stabilizasyon çatalı</td><td>Balina İmalatı</td><td>özel</td><td>Laminektomi</td></tr><tr><td>SomnoSuite düşük akışlı izofluran dağıtım ünitesi</td><td>Kent Scientific</td><td>SS-01</td><td>Entegre dijital buharlaştırıcı ile cerrahi anestezi uygulaması</td></tr><tr><td>Paslanmaz çelik 1,5 inç montaj direği</td><td>ThorLabs</td><td>P50/M</td><td>İki fotonlu görüntüleme</td></tr> <tr><td>için cerrahi istasyonu optik masaya monte etmek için1.5" montaj için Havşa Delme Çatalı Post</td><td>ThorLabs</td><td>PF175</td><td>İki fotonlu görüntüleme için optik masaya cerrahi istasyon montajını stabilize etmek için</td></tr><tr><td>İdeal kemik mikromatkabı</td><td>Harvard cihazı</td><td>72-6065</td><td>Laminektomi için inceltme kemiği</td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-10</td><td>Isınma tuzlu</td></tr><tr><td>su Koter tabancası</td><td>FST</td><td>18010-00</td><td>Koterize edici minör kanama</td></tr><tr><td>Isıtma yastığı</td><td>Benchmark</td><td>BF11222</td><td>1.9 "x 4.5" 20 "silikon ısıtıcı Teflon uçlar, 10W, 5V</td></tr><tr><td>K tipi termokupllu rektal prob</td><td>Physitemp</td><td>RET3</td><td>Fare vücut sıcaklığının ölçülmesi</td></tr><tr><td>vazelin</td><td>Sigma</td><td>8009-03-8</td><td>Yağlama rektal prob</td></tr><tr><td>Geri besleme ayarlı termal kontrolör</td><td>özel</td><td>NA</td><td>Ticari olarak temin edilebilen alternatifler arasında Physitemp TCAT serisi</td></tr><tr><td>PVA Cerrahi göz mızrakları</td><td>Beaver-visitec bulunur uluslararası</td><td>40400-8</td><td>Emici kan</td></tr><tr><td>Elektrikli düzeltici</td><td>Wahl</td><td>41590-0438</td><td>Kırpma fare kürkü</td></tr><tr><td>Bıçak, # 11</td><td>FST</td><td>14002-14</td><td>Cerrahi alet</td></tr><tr><td>Forseps, # 5</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td>Cerrahi alet</td></tr><tr><td>Forseps, # 4</td><td>FST</td><td>14002-14</td><td>Cerrahi alet</td></tr><tr><td>Titatnium dişli forseps</td><td>WPI</td><td>555047FT</td><td>Cerrahi alet</td></tr><tr><td>Titanyum İris makası</td><td>WPI</td><td>555562S</td><td>Cerrahi alet</td></tr><tr><td>Vetbond doku yapıştırıcısı</td><td>3M</td><td>084-1469SB</td><td>Dental akrilik için doku yüzeyinin hazırlanması</td></tr><tr><td>Seramik karıştırma tepsisi</td><td>Jack Richeson</td><td>420716</td><td>Dental akrilik ajanın hızlandırıcı ile karıştırılması</td></tr><tr><td>Orthojet dental akrilik</td><td>Lang Dental</td><td>1520BLK, 1503BLK</td><td>Arka plakayı dokuya kalıcı olarak yapıştırma</td></tr><tr><td>Küçük yuvarlak kapak camı, # 1 kalınlık, 3 mm</td><td>Harvard aparatı</td><td>64-0720</td><td>optik pencere</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td>aCSF için</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7447-40-7</td><td>aCSF için</td></tr><tr><td></td><td>Glikoz Fisher Scientific</td><td>50-99-7</td><td>aCSF için</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>MgCl2 & için orta nokta; 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>7791-18-6</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>CaCl2&middot için; 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>10035-04-8</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Rimadyl</td><td>QM01AE91</td><td>Analjezi</td></tr> için <tr><td>Bakteriyostatik su</td><td>Henry Schein</td><td>2587428</td><td>Carprofen</td></tr><tr><td>Isofluran</td> için seyreltici <td>Henry Schein</td><td>11695-6776-2</td><td>Anestezi</td></tr><tr><td>Emzirilmiş zil çözeltisi</td><td>Baxter</td><td>0338-0117-04</td><td>Hidrasyon fare için</td></tr><tr><td>Agarose Yüksek EEO</td><td>Sigma</td><td>A9793</td><td>jel noktası 34-37 derece C</td></tr><tr><td>Oftalmik kayganlaştırıcı merhem</td><td>Akwa Gözyaşları</td><td>68788-0697</td><td>Kornea kurumasını önleyin</td></tr><tr><td>MOM İki Fotonlu Mikroskop</td><td>Sutter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

farede laminektomi ve omurilik penceresi İmplantasyonu

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Bu protokol, fare omuriliğinin in vivo görüntülemesi için spinal kord laminektomi ve cam pencere implantasyonu için bir yöntem tanımlanmaktadır. Entegre bir dijital buharlaştırıcı isoflurane düşük akış hızında anestezi istikrarlı bir düzlem elde etmek için kullanılır. Tek bir vertebral omurga kaldırılır, ve ticari olarak kullanılabilir bir kapak-cam ince bir agarose yatak üzerine kaplanmış. 3D baskılı plastik bir arka plaka daha sonra doku yapıştırıcı ve diş çimentosu kullanılarak komşu vertebral dikenlere yapıştırılır. Bir sabitleme platformu solunum ve kalp atışı hareket artifakı azaltmak için kullanılır. Bu hızlı ve kelepçesiz yöntem akut multi-foton floresan mikroskopi için uygundur. Bu tekniğin transgenik farelerde spinal kord vaskülatürünün iki foton mikroskobuna uygulanması için temsili veriler eklenmiştir: Claudin-5 — sıkı bir kavşak proteini.

İmplante cam pencereler ve intravital iki foton mikroskopi CNS proteinlerinde dinamik değişiklikleri değerlendirmek için yararlı bir araç sağlar. BBB'nin fonksiyonel bütünlüğü, sıkı bağlantı proteinlerinin ekspresyonu, hücre altı lokalizasyonu ve ciro oranlarından etkilenir7. Önceki çalışmalar, sıkı kavşak proteinlerinin sabit durumda hızlı ve dinamik remodeling geçmesi olduğunu göstermiştir8. Şu anda açıklanan laminektomi ve cam pencere haz...

Bu protokol, intravital mikroskopi ile görselleştirmeyi kolaylaştırmak için bir farenin omuriliğine cam pencere nin yerleştirilmesini açıklar.

Farede Laminektomi ve Omurilik Penceresi İmplantasyonu

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Bu yöntem, bozulmamış merkezi sinir sistemi içinde in vivo protein dinamiğinin incelenmesini sağlayarak nörobilim ve immünoloji alanındaki soruları ele alır. Bu prosedürün başlıca avantajları görüntü edinimi için mükemmel bir hareket stabilitesi, kısa cerrahi süre, gaz anestezi azaltılmış operatör maruz kalma ve ucuz özelleştirilebilir backplates vardır. Bu yöntemin görsel gösterimi, prosedürün laminektomi adımları sırasında altta yatan sinir sistemi dokusuna zarar vermeden kemiğin çıkarılması zor olduğu için önemlidir.Yordamı başlamadan önce, belirtilen boyutlara bir model oluşturmak için 3B bilgisayar destekli tasarım yazılımı kullanın. Yani elimizde üç boyutlu bir nesne var, bununla başlayabiliriz. Daha sonra yapabileceğim şey, baskı sürümü için ayarları koyabiliyoruz.Bu yüzden bunu edit'i açarsam, Advanced'e gidin ve tüm bu ayarlara bakmamı sağlayan bir pencere açın. Meme sıcaklığını 205 dereceye, yatak sıcaklığını 45 dereceye, yazdırma hızını ise 3D yazıcıda saniyede 45 milimetreye ayarlayın. Arka plakaları yazdırmak için 0,4 milimetresıcak ent nozul ve 0,2 milimetrelik katman yüksekliği kullanın.Daha sonra yazdırılan arka plakaları yapısal bütünlükleri için görsel olarak değerlendirin. Brüt yapısal hatalar yazdırma hatalarını gösterir. Arka plakalar hazır olduğunda, sekiz ila 12 haftalık anestezili farenin başını cerrahi bir engelleyicinin kulak çubukları arasında bir ısı yastığına yerleştirin ve hayvanın gözlerine merhem uygulayın.Parmak ucurmasına yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, alt torasik üst lomber bölge üzerinde kaudal orta hat kesisine 1,5 santimetrelik rostral yapmak ve cildi peritondan ayırmak için 11 numaralı bıçağı kullanın. Yüzeysel kas ortaya çıkarmak için deri altında kalan şeffaf bağ dokusu geri soymak için forceps kullanın. Hedef vertebra kalan derin kas ile birlikte bir köpük cerrahi mızrak ile kasları yerinden.Arka plaka için bir koltuk oluşturmak için, torasik 11 ve torasik 13 ön yönü arka kısmından kas temizleyin. Gerekli tendondan kalan kas kaldırmak için forceps kullanarak. Tüm kas çıkarıldığında, dikkatle görselleştirme ve omurilik manipüle için yeterli alan elde edilene kadar forseps ile tendonu kesti.İntervertebral uzayın dura mater, yarı saydam laminar kemik, kemik altında merkezi yüzeysel kan damarı, ve anterior yayılan arter açıkça görülebilir. Bölgeyi sıcak yapay serebral spinal sıvı ile ısıtın ve omuriliğin uzun eksenine paralel düz vuruşlar kullanarak laminar kemiği inceltmek için mikro matkap kullanın. Hafifçe forseps ile yüzeysel spinous süreci kavrayarak, vertebra kaldırın.Kemik kolayca kaldırılmalıdır. Herhangi bir kemik kırıkları temizlemek için sayısı dört forceps kullanın, bir cerrahi mızrak ve gerektiği gibi nazik sabit basınç ile herhangi bir kanama kontrol. Sonra sıcak yapay beyin omurilik sıvısı ile doku durulayın.Kapak camı implantasyonu için, açıktaki kabloya üç milimetrelik borosilikat kapakca hafifçe uygulayın. 39 derece Santigrat uygulamak için küçük bir spatula kullanın cam kenarına% 2 agarose ısıtılır ve kapak cam yüzeyinin altında agarose çizmek için kılcal eylem sağlar. Torasik düzey 11 ve 13 vertebra iktisadi sinde bozulmamış komşu vertebranın maruz kalan kemikli eklem süreçlerine doku yapıştırıcısı uygulayın.Komşu tendon ve enine işlem üzerinde laminektomi siteetrafında bir halka ek doku yapıştırıcı uygulayın. Daha sonra, doku yapışkan tabakası üzerine hızlandırıcı ile karışık diş çimentosu uygulamak için yeni bir spatula kullanın ve kapak cam pencere üzerinde merkezli cerrahi alana bir arka plaka yerleştirin. Diş çimentosu birden fazla ince tabaka uygulanması daha güçlü bir arka plaka yapışmasonuçları, ancak diş çimentosu kurumaya başlamadan önce hızlı bir şekilde arka plaka yerleştirmek için emin olun.Diş çimentosu 10 dakika tedavi için izin verdikten sonra, ek yapıştırıcı ile arka yerin iç tabanı ve alt doldurun. Diş çimentosu ince tabakalar halinde uygulanması, tüm protokolü tehlikeye sokabilir kapak cam ve agarose, çimento yayılması riskini azaltmaya yardımcı olabilir. Diş çimentosu kuruduğunda, çatallı arka plaka tutucuyu pencerenin üzerinde uygun konuma uygulayın ve arka plakayı arka plaka tutucuya vidalayın.Daha sonra sızıntı yı test etmek için arka plakaya tuzlu uygulayın. Hayvan ve cerrahi platform daha sonra kapak cam pencereden görüntüleme için iki foton mikroskobun optik tabloya transfer edilebilir. Bu temsili deneyde, EGFP pozitif claudin-5 bir vasküler pleksus boyunca floresan etiketli sıkı kavşaklar içinde görselleştirilmiştir.Z projeksiyonundaki sıkı kavşak yapılarının net bir şekilde tanımlaması, başarılı bir laminektomi, pencere yerleşimi ve arka plaka implantasyonundan sonra minimal XY görüntü deplasmanının üretildiğini gösterir. Bu prosedürü denerken bu mikrocerrahinin zor olduğunu ve ustalaşmanın zaman alabileceğini unutmamak önemlidir. Ancak bir kez hakim, bu ameliyat yaklaşık 30 dakika içinde yapılabilir.Bu prosedürü takiben, diğer yöntemler, iki foton mikroskopi ve in vivo görüntüleme gibi, nörovasküler remodeling ve omurilik içeren diğer hastalık süreçleri hakkında ek sorulara cevap için yapılabilir.

laminectomy-and-spinal-cord-window-implantation-in-the-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Fare spinal kolon stabilize ve tekrarlayan gerçekleştirmek için minimal invaziv bir...

Fare Omurilik İki foton Mikroskop kullanarak in vivo Görüntüleme

Kurulan demiyelinizasyon ile farelerin omurilik içine fare sinir kök hücrelerinin (NSC'lerde) nakli ayrıntılı. NSC'lerde hazırlanması, torasik vertebra 9 (T9) ve NSC'lerde nakli laminektomi farelerde pre-ve post-operatif bakım birlikte özetlenmiştir.

Spinal Kordonlar nörotropik Mouse Hepatit Virüs ile Etkilenmiş Fare Fare Nöral Kök Hücre Transplantasyon Cerrahi

Bu video, beynin farklı bölgelerine stabil optik erişim için bir fare modeline kraniyal pencere implante etmek için cerrahi bir prosedür sunmaktadır.

Fare Modelinde Kranial Görüntüleme Penceresinin İmplantasyonu: Murin Beyninin Bölgelerine Stabil Optik Erişim için Cam Tabanlı Lamel İmplante Etmek İçin Cerrahi Bir Prosedür

Bu video, transgenik farelerde optik bir pencereden beynin nöral aktivite kaydını göstermektedir. Fareler, sinirsel aktivitelerin tespit edilmesini sağlayan bir floresan proteini eksprese eder. Kafatasının küçük bir kısmı, optik bir pencere takmak için dikkatlice çıkarılır ve daha sonra görüntülemeden önce ışığı engellemek için kafatası siyah çimento ile kaplanır.

Görüntü Sinirsel Aktivitelerine Transgenik Farelerin Beynine Optik Pencerelerin Yerleştirilmesi

Kaynak: Pietruczyk, E. A., et al. Farede laminektomi ve omurilik penceresi implantasyonu. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, in vivo görüntüleme için anestezi uygulanmış bir fareye bir omurilik penceresinin implantasyonunu göstermektedir. Protokol, bir borosilikat kapak camı ve 3D baskılı bir arka plaka kullanarak açıkta kalan omuriliği stabilize eder. Bu yöntem, kan-beyin bariyeri dinamiklerini ve nörovasküler etkileşimleri incelemek için yüksek çözünürlüklü iki foton mikroskobunu mümkün kılar.

In Vivo Görüntüleme için Bir Farede Omurilik Penceresi İmplantasyonu

Viral vektörler hedefli gen manipülasyonu için izin verir. Bu arka boynuzu içine, bir viral vektör stereotaksik enjeksiyon, birincil somatosensoriyel afferentleri ve merkezi sinir sistemi nöronları arasındaki sinaptik bir temas önemli yer kullanılarak, koşullu gen ekspresyonu ya da fare omurilik ablasyonu için bir yöntem göstermektedir.

Fare Omurilik Koşullu Gen Manipülasyon için bir Viral Vector Stereotaksik Enjeksiyon

Deneysel otoimmün ensefalomiyeliti incelemek için yetişkin farelerin açıkta kalan omurilikleri üzerine cam pencerelerin implante edilmesi ve bakımı için bir yöntem açıklıyoruz. Bu pencereler, iki foton mikroskobu kullanarak canlı hayvanlarda hücre altı düzeyde hücre dinamiklerini izlemek için omuriliğe kronik optik erişim sağlar.

Deneysel Otoimmün Encephalomyelitis Erişkin Farelerde Cam Omurilik Windows&#39;u implante

Omurilik yaralanması ciddi morbidite ve mortalitesi yüksek bir neden travmatik bir durumdur. Bu çalışmada detaylı olarak nöral kök hücrelerin bir nakli ardından farelerde omurilik yaralanması bir kontüzyon modelini tarif.

Omurilik Yaralanması Deneysel Kontuzif Modelinde Sinir Kök Hücre Nakli

Bu videoda, bir canlı fare dorsal spinal kord üzerinde kronik optik görüntüleme odasını yerleştirmeye yönelik bir prosedür açıklanmaktadır. odası, cerrahi işlem ve kronik görüntüleme gözden ve gösterilmiştir.

Boyuna için bir Spinal Odası implantasyon için bir Prosedürü İn Vivo Fare Omurilik Görüntüleme

Bu protokol, fare modelinde stabil traneksiyon tipi omurilik yaralanmasıinin indüksiyonu için hassas bir laminektominin nasıl oluşturulacak larını, omurilik yaralanması araştırmaları için en az ikincil hasarın nasıl yaratılabildiğini açıklamaktadır.

Farelerde Tam Traneksiyon Tipi Spinal Kord Yaralanması İndüksiyonu

Mevcut protokol, tümör hücrelerinin intervertebral boşluğa enjekte edilmesiyle tekrarlanabilir bir murin spinal kord gliomu modelinin geliştirilmesini tanımlamakta ve araştırma ve terapötik geliştirme için daha etkili ve daha az invaziv bir yaklaşım sunmaktadır.

Tümör Hücrelerinin Farelerin Omuriliğine Cerrahi Nakli

Keşfedin farede omurilik penceresi implantasyonu ve intravital mikroskopi ile protein dinamiklerini canlı görüntüleme. Bu yöntem nörobilim ve immünoloji araştırmalarında sinir sistemi süreçlerini incelemek için güvenilir bir platform sunar.

Farede Laminektomi ve Omurilik Penceresi İmplantasyonu

Daha fazla video keşfet