Drosophila sıcaklık değişiklikler uzay ve zaman içinde performansını belirlemek için otomatik yöntemi

Bu yöntem, sineklerin sıcaklık değişimlerine yanıtı, genotipler arasındaki farklar, diğer duyusal ipuçlarıyla etkileşim veya farklı sıcaklık reseptörlerinin işlevi gibi anahtar soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, zaman ve uzayı kontrol eden ve otomatik bir şekilde birden fazla hızlı ve hassas sıcaklık değişikliğine olanak sağlamasıdır. 20 erkek ve 20 kadın sinekleri 45 mililitre sinek gıda orta içeren bir yetiştirme şişesine yerleştirerek başlayın ve 12 saat ışık altında 25 derece santigrat derece kuluçka içine şişe yerleştirerek, 12 saat karanlık döngüleri.

10 gün sonra, karbondioksit pedleri üzerinde en fazla dört dakika için yeni ekaplanan sinekler anestezi. Ve bakire sinekleri toplamak için bir boya fırçası kullanın 2.5 tarafından 9.5 santimetre taze sinek gıda orta 6.5 mililitre içeren şişeleri sinek, şişe başına 20 sinek gruplara cinsiyet ayrılmış. Sonra şişeleri 5-7 gün boyunca kuvöze geri ver.

Sıcaklık kontrollü bir arena kurmak için arenayı açın ve kontrol bilgisayarındaki sıcaklık aşamaları komut dosyasını açın. Sıcaklık sırasının düzgün ayarlanıp ayarlıldığını doğrulayın ve her deneme aşamasının süresinin 60 saniyeye ayarlanıp ayarldığını kontrol edin. Başlangıç deneysel bloğu bölümünde, bu ayarları onaylayın: istenilen sayıda faz, gösterge kırmızı ışık yayan diyotların yinelemeli açık/kapalı kurulumu, faz başına iki santigrat derece sıcaklık artışı ve başlangıç sıcaklığı olarak 16 santigrat derece.

Ardından, sıcaklık aşamaları komut dosyası çalıştırın. Yazılım beş saniye sonra durdurmak için başlatılması olacaktır. Sıcaklık davranış deneyleri için, arenanın bakır karolarının üstüne beyaz iletken bant iplikçik yerleştirin ve tüm kenarların kapalı olmasını sağlar.

Bakır fayans etrafında ısıtmalı alüminyum halka yerleştirin ve cam kapağı silmek için temiz bir doku kullanın. Alüminyum halkaüstüne kapağı yerleştirin, üzerinden bir sinek üfleme olabilir bir boşluk bırakarak ve şişenin altına sinekzorlamak için iki kez bir acclimated sinek şişe dokunun. Bir ağız aspiratör kullanarak, tuzak bir sinek ve kuvöz içine geri koymadan önce şişe kapatın.

Cam kapak ve alüminyum halka arasındaki boşluk üzerinden arenaya sinek darbe ve hemen boşluğu kapatmak için cam yonca itin. Simetrik aydınlatma sağlamak ve video kayıt programı ile kayıt başlatmak için arena etrafında ışıklar bir çerçeve yerleştirin. Ardından, deneme aşamalarını çalıştırmaya başlamak için kontrol bilgisayarının boşluk çubuğuna basın.

Videoları izlemek için, sinek adımlarını izleme yazılımını açın ve fly tracker klasöründeki yapılandırma dosyasını açın. Video klasöründeki videoların konumunu ve video dosyalarındaki videoların adlarını ayarlayın. Arenanın kenarındaki birden fazla noktanın x/y piksel koordinatlarını temel alan arena ayarlarında sinek arenasının kenarlarını belirtin.

LED'lerin merkezinin x/y piksel koordinatlarına göre, pasif kırmızı LED'lerin LED ayarlarındaki konumuna özel. Sinek arenasının kenarlıklarının konumunu kontrol etmek için hata ayıklamayı arena ayarlarında doğru şekilde ayarlayın, kaydet'i tıklatın ve komut dosyasını terminalde çalıştırın. Videonun ekran çekimi, arena ayarlarına giriş yapılan koordinatlardan oluşan mavi bir kareyle görünür.

Ardından arena ayarlarındaki hata ayıklama hatasını false olarak değiştirin. Kaydet'i tıklatın ve izleme işlemini başlatmak için terminaldeki ekranı yeniden çalıştırın. Tipik bir sıcaklık davranış deneyinde, 16, 20 veya 24 santigrat dereceye maruz kalan tek sinekler, deneyin başlangıcında beş dakikadan daha yüksek bir hareket gösterirler.

Sıcaklık kontrollü arena da dinamik sıcaklık değişiklikleri için farklı genetik arka planlardan sinek davranışsal tepkilerkarşılaştırmak için kullanılabilir. Örneğin, bu deneyde, test edilen türlerin hızları, sıcaklık arttıkça, maksimum performans noktasına ulaşıncaya kadar kendi tepki eğrilerine göre artmıştır, sonra hızları çürüyve sinekler yok oldu. Tek tek sinekler orta ve bir yan kiremit 40 derece santigrat maruz kaldığında, rahat bir 22 santigrat derece diğer yan kiremit ile Wild-tipi sinekler hızla arena boyunca hareket durdu ve rahat bir yerde kalır.

Buna karşılık, klasik bellek mutant Dunce sinekler arena keşfetmek tutmak ve rahat bir yerde kontrolleri daha az zaman harcamak. Ayrıca, sıcaklık ve konum kombinasyonları test de dinamik sıcaklık değişiklikleri sırasında farklı sıcaklık reseptörlerinin işlevini anlamak yararlıdır. Bu deneyde de gösterildiği gibi, bireysel d melanogaster mutantların artan sıcaklıklara maruz kalırken, 22 santigrat derecede rahat bir yer de sağlandı.

Bu yordamı gerçekleştirirken, mümkün olduğunca çok sinek davranışı yakalamak böylece sırayla ve hızlı bir şekilde adımları gerçekleştirmek için unutmayın. Bu prosedürün yanında negatif geotaxis veya ısı boğma tahlilleri gibi diğer yöntemler sinekler normal hareket veya normal ısı direnci var gibi ek soruları cevaplamak için kullanılabilir. Bu tekniğin etkileri bize sıcaklık algısı veya ağrı bir rol oynadığı nörolojik bozukluklar veya mutasyonlar anlamak için uzanır.

Genellikle, her adım tek başına basit olduğu için bu yönteme yeni bireyler mücadele edecek ama tekniğin uygulanması gereken bu yüzden mükemmel koordine edilmesi gerekiyor.