Drosophila sıcaklık değişiklikler uzay ve zaman içinde performansını belirlemek için otomatik yöntemi
12 Ekim 2018
Burada zaman ve mekan içinde hızlı ve hassas sıcaklık değişiklikleri üretir programlanabilir bir ısı kontrollü arena kullanarak sıcaklık değiştirme Drosophila lokomotor performansını otomatik olarak belirlemek için bir iletişim kuralı mevcut.
Bu yöntem, sineklerin sıcaklık değişimlerine yanıtı, genotipler arasındaki farklar, diğer duyusal ipuçlarıyla etkileşim veya farklı sıcaklık reseptörlerinin işlevi gibi anahtar soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, zaman ve uzayı kontrol eden ve otomatik bir şekilde birden fazla hızlı ve hassas sıcaklık değişikliğine olanak sağlamasıdır. 20 erkek ve 20 kadın sinekleri 45 mililitre sinek gıda orta içeren bir yetiştirme şişesine yerleştirerek başlayın ve 12 saat ışık altında 25 derece santigrat derece kuluçka içine şişe yerleştirerek, 12 saat karanlık döngüleri.
10 gün sonra, karbondioksit pedleri üzerinde en fazla dört dakika için yeni ekaplanan sinekler anestezi. Ve bakire sinekleri toplamak için bir boya fırçası kullanın 2.5 tarafından 9.5 santimetre taze sinek gıda orta 6.5 mililitre içeren şişeleri sinek, şişe başına 20 sinek gruplara cinsiyet ayrılmış. Sonra şişeleri 5-7 gün boyunca kuvöze geri ver.
Sıcaklık kontrollü bir arena kurmak için arenayı açın ve kontrol bilgisayarındaki sıcaklık aşamaları komut dosyasını açın. Sıcaklık sırasının düzgün ayarlanıp ayarlıldığını doğrulayın ve her deneme aşamasının süresinin 60 saniyeye ayarlanıp ayarldığını kontrol edin. Başlangıç deneysel bloğu bölümünde, bu ayarları onaylayın: istenilen sayıda faz, gösterge kırmızı ışık yayan diyotların yinelemeli açık/kapalı kurulumu, faz başına iki santigrat derece sıcaklık artışı ve başlangıç sıcaklığı olarak 16 santigrat derece.
Ardından, sıcaklık aşamaları komut dosyası çalıştırın. Yazılım beş saniye sonra durdurmak için başlatılması olacaktır. Sıcaklık davranış deneyleri için, arenanın bakır karolarının üstüne beyaz iletken bant iplikçik yerleştirin ve tüm kenarların kapalı olmasını sağlar.
Bakır fayans etrafında ısıtmalı alüminyum halka yerleştirin ve cam kapağı silmek için temiz bir doku kullanın. Alüminyum halkaüstüne kapağı yerleştirin, üzerinden bir sinek üfleme olabilir bir boşluk bırakarak ve şişenin altına sinekzorlamak için iki kez bir acclimated sinek şişe dokunun. Bir ağız aspiratör kullanarak, tuzak bir sinek ve kuvöz içine geri koymadan önce şişe kapatın.
Cam kapak ve alüminyum halka arasındaki boşluk üzerinden arenaya sinek darbe ve hemen boşluğu kapatmak için cam yonca itin. Simetrik aydınlatma sağlamak ve video kayıt programı ile kayıt başlatmak için arena etrafında ışıklar bir çerçeve yerleştirin. Ardından, deneme aşamalarını çalıştırmaya başlamak için kontrol bilgisayarının boşluk çubuğuna basın.
Videoları izlemek için, sinek adımlarını izleme yazılımını açın ve fly tracker klasöründeki yapılandırma dosyasını açın. Video klasöründeki videoların konumunu ve video dosyalarındaki videoların adlarını ayarlayın. Arenanın kenarındaki birden fazla noktanın x/y piksel koordinatlarını temel alan arena ayarlarında sinek arenasının kenarlarını belirtin.
LED'lerin merkezinin x/y piksel koordinatlarına göre, pasif kırmızı LED'lerin LED ayarlarındaki konumuna özel. Sinek arenasının kenarlıklarının konumunu kontrol etmek için hata ayıklamayı arena ayarlarında doğru şekilde ayarlayın, kaydet'i tıklatın ve komut dosyasını terminalde çalıştırın. Videonun ekran çekimi, arena ayarlarına giriş yapılan koordinatlardan oluşan mavi bir kareyle görünür.
Ardından arena ayarlarındaki hata ayıklama hatasını false olarak değiştirin. Kaydet'i tıklatın ve izleme işlemini başlatmak için terminaldeki ekranı yeniden çalıştırın. Tipik bir sıcaklık davranış deneyinde, 16, 20 veya 24 santigrat dereceye maruz kalan tek sinekler, deneyin başlangıcında beş dakikadan daha yüksek bir hareket gösterirler.
Sıcaklık kontrollü arena da dinamik sıcaklık değişiklikleri için farklı genetik arka planlardan sinek davranışsal tepkilerkarşılaştırmak için kullanılabilir. Örneğin, bu deneyde, test edilen türlerin hızları, sıcaklık arttıkça, maksimum performans noktasına ulaşıncaya kadar kendi tepki eğrilerine göre artmıştır, sonra hızları çürüyve sinekler yok oldu. Tek tek sinekler orta ve bir yan kiremit 40 derece santigrat maruz kaldığında, rahat bir 22 santigrat derece diğer yan kiremit ile Wild-tipi sinekler hızla arena boyunca hareket durdu ve rahat bir yerde kalır.
Buna karşılık, klasik bellek mutant Dunce sinekler arena keşfetmek tutmak ve rahat bir yerde kontrolleri daha az zaman harcamak. Ayrıca, sıcaklık ve konum kombinasyonları test de dinamik sıcaklık değişiklikleri sırasında farklı sıcaklık reseptörlerinin işlevini anlamak yararlıdır. Bu deneyde de gösterildiği gibi, bireysel d melanogaster mutantların artan sıcaklıklara maruz kalırken, 22 santigrat derecede rahat bir yer de sağlandı.
Bu yordamı gerçekleştirirken, mümkün olduğunca çok sinek davranışı yakalamak böylece sırayla ve hızlı bir şekilde adımları gerçekleştirmek için unutmayın. Bu prosedürün yanında negatif geotaxis veya ısı boğma tahlilleri gibi diğer yöntemler sinekler normal hareket veya normal ısı direnci var gibi ek soruları cevaplamak için kullanılabilir. Bu tekniğin etkileri bize sıcaklık algısı veya ağrı bir rol oynadığı nörolojik bozukluklar veya mutasyonlar anlamak için uzanır.
Genellikle, her adım tek başına basit olduğu için bu yönteme yeni bireyler mücadele edecek ama tekniğin uygulanması gereken bu yüzden mükemmel koordine edilmesi gerekiyor.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, programlanabilir sıcaklık kontrollü bir arena kullanarak Drosophila'nın sıcaklık değişimlerine yanıt olarak lokomotor performansının değerlendirilmesi için bir protokol sunmaktadır. Yöntem, hızlı ve doğru sıcaklık varyasyonlarına olanak tanıyarak sineklerin çevresel değişimlere verdiği yanıtların incelenmesini kolaylaştırır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Davranışsal Biyoloji
- Sıcaklık Duyarlılığı
Arka Plan
- Drosophila, genetik ve çevresel etkileşimlerin incelenmesinde model organizma olarak kullanılır.
- Sıcaklık değişimleri, lokomotor aktivite ve davranışı önemli ölçüde etkileyebilir.
- Bu yanıtların anlaşılması, duyusal işleme ve adaptasyon hakkında bilgiler sağlayabilir.
- Otomatik yöntemler, deneysel koşullardaki hassasiyeti artırır.
Çalışmanın Amacı
- Drosophila'nın farklı sıcaklıklardaki lokomotor performansını incelemek.
- Çeşitli genotipler arasındaki yanıt farklarını araştırmak.
- Diğer duyusal ipuçlarıyla olan etkileşimleri analiz etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Programlanabilir sıcaklık kontrollü bir arenanın kullanımı.
- Erkek ve dişi sineklerin kontrollü ortamlara yerleştirilmesi.
- Farklı sıcaklık koşulları altında lokomotor aktivitenin izlenmesi.
- Doğru analiz için otomatik veri toplama.
Temel Sonuçlar
- Sıcaklıkların hızla değiştirilebilme ve sinek davranışlarının değerlendirilebilme yeteneği kanıtlanmıştır.
- Genotipler arasında lokomotor performans açısından anlamlı farklılıklar belirlenmiştir.
- Sıcaklık yanıtları ile duyusal ipuçları arasındaki etkileşimler gösterilmiştir.
Sonuçlar
- Bu yöntem, Drosophila'da sıcaklık duyarlılığını incelemek için sağlam bir çerçeve sunar.
- Bulgular, davranış üzerindeki genetik ve çevresel etkilerin anlaşılmasına katkı sağlamaktadır.
- Gelecekteki çalışmalar, bu tekniği nörobilimdeki daha geniş uygulamalar için kullanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Alanları
Bu yöntem, Drosophila'da sıcaklığa bağlı lokomotor performansın yüksek kapasiteli ve otomatik bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanıyarak nörogenetik çalışmalarda hedef doğrulaması için kantitatif fenotipik veriler sağlar. Mekansal ve zamansal olarak kontrollü termal uyarılara verilen dinamik davranışsal yanıtları yakalayarak, ağrı ve duyusal bozukluk modelleriyle ilgili sıcaklık algılama yolaklarının mekanistik risk analizini destekler. Otomatik takip ve tekrarlanabilir çevresel kontrol, gen fonksiyonu ve çevresel etkileşim çalışmalarını içeren erken keşif iş akışlarında öngörücü güveni artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Sıcaklık tepkisi fenotiplerine olan genetik katkıların sorgulanmasına olanak tanıyarak, sıcaklık algılayıcı genlerin ve nöronal yolakların fonksiyonel doğrulamasını destekler.
- Operasyonel Değer: Genotipe özgü etkileri ayrıştırmak için, mutant ve yaban tipi suşların özdeş ve programlanabilir çevresel koşullar altında yan yana karşılaştırılmasını kolaylaştırır.
- Öngörücü Değer: Sıcaklık gradyanları boyunca doz-tepkime benzeri performans eğrileri oluşturarak, hedef önceliklendirmesi için fonksiyonel eşiklerin ve fenotipik şiddet gradyanlarının belirlenmesine yardımcı olur.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Genetik kütüphanelerin veya termal hassasiyetin farmakolojik modülatörlerinin taranması için güçlü, yüksek içerikli fenotipik okumalar olarak hizmet eden, nicelendirilebilir lokomotor çıktılar (hız, konum tercihi) üretir.
- Operasyonel Değer: Otomatik video takibi ve arena standardizasyonu, deneyler arası değişkenliği azaltarak orta ve yüksek kapasiteli tarama kampanyaları için uygun, ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir analizlere olanak tanır.
- Analiz Hazırlığı: Genotipler ve deneysel gruplar arasında kıyaslanabilen normalize edilmiş davranışsal metrikler oluşturarak analiz validasyonunu ve laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliği destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel İlişki: Ektoterm termal adaptasyon mekanizmalarını modeller ve memeli ağrı ve termoregülasyon hedefleriyle potansiyel ilgisi olan korunmuş nöronal termosensasyon yolaklarına dair içgörüler sunar.
- Preklinik Süreklilik: Genotip-fenotip-çevre ilişkilerini kurarak, hedef doğrulama süreçlerinde risk ayarlı ilerleme kararlarını destekleyen termal performans eğrilerinin boylamsal değerlendirmesine olanak tanır.
- Mekanistik Risk Azaltma: Uzaysal ve zamansal termal profilleme yoluyla sıcaklık reseptörü fonksiyonunun analizine izin vererek, genetik lezyonların duyusal işlemleme eksiklikleriyle ilişkilendirilmesindeki belirsizliği azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, genetik pertürbasyonu kontrollü bir çevresel bağlamda ölçülebilir davranışsal çıktılara bağlayarak erken keşif sürecine uyum sağlar; böylece nörodavranışsal araştırmalarda hipotez odaklı hedef doğrulama ve öncü bileşik belirleme çalışmalarını destekler.
- Keşif Biyolojisi: Kontrollü termal uyaranlara karşı dinamik lokomotor yanıtları genetik arka planla ilişkilendirerek, sıcaklık algılayan gen fonksiyonlarının sistematik olarak sorgulanmasını destekler.
- Tarama: Sıcaklığa duyarlı yollarda güvenilir bileşik veya genotip taramasına olanak tanıyan standartlaştırılmış, kantitatif davranışsal veriler (örn. hız, mekansal tercih) sağlar.
- Analitik: Deneysel gruplar arasında performans eğrilerinin, EC50 benzeri termal eşiklerin ve eğri altındaki alan metriklerinin istatistiksel karşılaştırmasına uygun, zaman ve sıcaklık çözünürlüklü davranışsal veri setleri üretir.
- Translasyonel Araştırma: Drosophila termal yanıt fenotiplerini korunmuş duyusal iletim mekanizmalarıyla ilişkilendirerek, termosensasyon ve ağrı araştırmalarında türler arası hedef doğrulamasına bilgi sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Otomatik arena ve takip hattı, termosensasyonun ötesindeki çoklu duyusal modalitelerde gen-çevre etkileşimlerini incelemek için yeniden kullanılabilir bir platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hassas spatiotemporal termal uyaran ve otomatik davranışsal miktar belirleme imkanı sağlayarak, sıcaklık algılayan nöral devrelerin mekanizmasına açıklık getirir.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış çevresel kontrol, otomatik veri toplama ve azaltılmış manuel işlem sayesinde yeniden üretilebilirliği sağlar ve operatöre bağlı değişkenliği minimize eder.
- Stratejik Değer: Nörogenetik taramalarda subjektif davranışsal skorlamaya olan bağımlılığı azaltan objektif, kantitatif fenotipik veriler sunarak, devam/tamamla (go/no-go) karar güvenini artırır.
- Portföy Etkisi: Genetik lezyonları termal performansla ölçülebilir eksikliklerle ilişkilendirerek risk katmanlı hedef önceliklendirmesine olanak tanır ve yüksek güvenilirlikli terapötik hedeflerin erken teşhisini destekler.
Uygulama Hususları
- Drosophila yönetimi, davranışsal analiz tasarımı ve video tabanlı takip yazılımı konfigürasyonu konusunda uzmanlık gerektirir.
- Doğru çevresel ve davranışsal veri yakalama için sıcaklık kontrollü arena donanımına, senkronize aydınlatmaya ve video kayıt sistemlerine bağımlıdır.
- Siteler veya kullanıcılar arasında tekrarlanabilirliği sağlamak için arena kalibrasyonunun, takip parametrelerinin ve termal protokol tanımlarının ekipler arası standartlaştırılmasını gerektirir.
- Diğer böcek modellerine veya duyusal uyarılara uyarlama; türe özgü boyut ve yanıt kinetiğine bağlı olarak arena boyutlarının, takip eşiklerinin ve termal artış hızlarının yeniden kalibre edilmesini gerektirebilir.
- Pratik sınırlamalar arasında arena kapasite kısıtlamaları (deney başına bir sinek) ve termal değişimler ile davranışsal kayıt arasındaki zamansal uyumu korumak için titiz bir prosedürel koordinasyon ihtiyacı yer almaktadır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Title
0:29
Fly and Temperature-Controlled Arena Preparation
2:02
Temperature Behavioral Experiments
3:13
Video Tracking and Data Analysis
4:31
Results: Representative Drosophila Performance Analyses in Response to Temperature Changes in Space and Time
6:08
Conclusion
