Name: Yalıtım fizyolojik aktif Thylakoids ve onların kullanımı enerji bağımlı Protein taşıma deneyleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Öğrenin bitki biyolojisinde kloroplast membranları arası enerji bağımlı protein taşıma deneyleri için fizyolojik olarak aktif thylakoidlerin izolasyon protokollerini. Bu yöntem, taşıma sırasında sıcaklık ve pH gibi koşulları kontrol altında tutar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu el yazması kimyasal Bilimler Bölümü, yerbilim ve Biosciences, temel enerji Bilimler bize Enerji Bakanlığı aracılığıyla Grant DE-SC0017035, 408 Office tarafından fon ile hazırlanmıştır

1. ilk malzemeleri
<ol><li>400 mL distile su içinde 3 saat yaklaşık 55 g bezelye ıslatın ve plastik bir tepsi içinde ekmek (35 cm x 20 cm x 6 cm) toprak vermikülit ince bir tabaka ile kaplı.</li>
	<li>Tepsiyi bezelye 12/12 h açık/koyu (50 µE/m2s) döngüsü için 9-15 gün altında 20 ° C'de büyümek.</li>
	<li>Protein substrat tercih edilen yöntemi göre hazırlayın. Not: 1 gibi yöntemleri kullanarak protein yüzeylerde hazırladık) vitro transkripsiyon arıtılmış plazmid gelen buğday tohumu özleri veya tavşan retikülosit lysates huzurunda [3H] kullanarak çeviri tarafından takip-lösin veya [35S]-metiyonin, 2) vitro çeviri birleştiğinde transkripsiyon/çeviri takımı TnT gibi kullanarak kitleri Promega yukarıda da belirtildiği gibi radiolabeling ile ve 3) E. colioverexpressed protein saflaştırma. Radyoaktif vitro çeviri ürünler genellikle 50 mM soğuk amino asit taşıma tepkileri kullanmak için önceden ile söndürülür. Bu yöntemlerin her biri, her yeni protein substrat için genellikle bazı optimizasyon gerektirir. Eşleşmiş vitro sistem örneği için bkz: Ling ve Jarvis (2016)9.</li>
</ol>2. kloroplast yalıtım ve miktar
Not: Sağlam kloroplast10yalıtım thylakoids hazırlanmasında ilk adımdır. Tüm malzemeler hazırlık sırasında soğuk tutulmalıdır. Bu adımda kırılma ciddi sonraki thylakoid verim sınırlayabilirsiniz gibi kloroplast, Resuspension hafifçe, ele alınmalıdır.
<ol><li>Çözümleri önceden hazırlayın.<ol>
<li>2 x taşlama arabellek (2xGB): 100 mM K-HEPES pH 7.3, 660 mM sorbitol, 2 mM MgCl2, 2 mM MnCl2, 4 mM EDTA, % 0,2 BSA.</li>
		<li>2 x alma arabellek (2xIB): 100 mM K-Tricine veya K-HEPES pH 8.0, 660 mM sorbitol, 8 mM MgCl2. Not: 3 mM arasında değişen 10 mM den MgCl2 konsantrasyonları gözlemlenebilir farklılıkları kullanılmaktadır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sürekli yoğunluk gradient Percoll 15 mL ve 2xGB 30,900 g sabit açılı Open End 4 ° C'de 30 dk de 15 mL karışımı ile fren kapalı centrifuging tarafından hazırlayın.</li>
	<li>Yaklaşık 25 bin 9-15 gün eski bezelye hasat ve 95 mL 1xGB homojenize. Bir blender ile bilenmiş bıçak ya da bir Polytron kullanıldığını başarıyla. Bu karışımı Miracloth en az 2 kat bir huni ile filtre. Not: kök dokusu miktarını sınırlayarak gerekli değildir ancak homojenizasyon işlemi daha kolay, böylece uzun süreli karıştırma ile oluşabilir kloroplast kırılma azaltmak yapabilirsiniz.</li>
	<li>Sallanan bir kova Open End 4 ° C'de 5 min için 3000 g de cips ve yavaşça 1 mL 1xGB resuspend. Bir fırça en nazik resuspension tekniği olabilir.</li>
	<li>Dikkatle Percoll degrade ve santrifüj 8000 g sallanan bir kova Open End 4 ° C'de 10 dakika için de en üstünde yeşil süspansiyon kapalı tut ile katman.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde taze bir tüpün içine sağlam kloroplast içeren alt yeşil bant hasat. Kurtarılan sağlam kloroplast 1800 g 4 ° C'de 5 min için sallanan bir kova Open End, spin, süpernatant atmak ve yavaşça Pelet 1xIB içinde resuspend. 1 ml 1xIB son resuspension ile her zaman 30 mL 1xIB resuspending bu yıkama bir kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Klorofil (Chl) içeriği ölçmek için 5 mL % 80 aseton ve filtre Whatman 1 filtre kağıdı (nominal kalınlık 180 µm) üzerinden de tam resuspended kloroplast 10 µL karıştırın. 720 absorbans kaydetmek nm, 663 nm ve 645 bir spektrofotometre nm ve aşağıdaki formül11kullanarak Chl konsantrasyonu hesaplayın: [Chl] mg/mL = [40.2* (bir663 -720) + 101.4* (bir645 -720)] * 0,1</li>
	<li>Kloroplast 1 mg/ml 1xIB eşdeğerleriyle Chl ayarlayın.</li>
</ol>3. Thylakoids yalıtım
Not: Thylakoids sağlam kloroplast hipotonik lizis tarafından hazırlanır. Bu kloroplast sorbitol eksik hipotonik arabellek için teşhir ederek elde edilir. İzole thylakoids herhangi bir translocation yolları raporlaması için kullanılabilir, ama ya cpSec1 ya da cpSRP yollarının araştırılması için ise stromal özü (SE) Ayrıca bu hazırlık sırasında izole edilmelidir.
<ol><li>Vaktinden önce aşağıdaki çözümleri hazırlayın.<ol>
<li>Hipotonik lizis arabellek: 50 mM K-Tricine veya K-HEPES pH 8.0, 8 mM MgCl2.</li>
		<li>2 x ham Stroma arabellek (için konsantrasyon se): 100 mM K-HEPES pH 8.0, 660 mM sorbitol, 8 mM MgCl2.</li>
		<li>Laemmli örnek arabellek (SDS-EDTA ile desteklenen sayfa için): 125 mM Tris pH 6.8, % 10 SDS, % 20 gliserol, 0,05 mg/mL bromophenol mavi, % 10 β-mercaptoethanol, 10 mM EDTA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>SE kurtarma gerekmiyorsa, sallanan bir kova Open End 4 ° C'de 6 dk 1000 g de sağlam kloroplast santrifüj kapasitesi<ol>
<li>Süpernatant atın ve 1 mg/ml hipotonik lizis tampon resuspend. Ara sıra karıştırma ile 10 dakika, karanlıkta buz üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>Thylakoids 3200 g 8 dk için kova rotor 4 ° C'de sallanan içinde de centrifuging tarafından yeniden elde etmek İki kez, her zaman 1-2 mL ile lizis arabellek resuspending thylakoids yıkayın. 1 mL 1xIB ile resuspend ve yukarıda olarak Chl kloroplast yalıtım protokolünde requantify.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. stromal özü kurtarma ve konsantrasyon
<ol><li>SE kurtarma gerekli ise, 600 µL aliquots 1.5 mL microcentrifuge tüpler sağlam kloroplast bölün ve her tüpün içinde 6 dk için kova rotor 4 ° C'de sallanan 1000 g de santrifüj kapasitesi Not: Bu 1.5 mL microcentrifuge tüpler, kullanırken kalan membranlar için nihai Pelet karışıklık önlemek için yardımcı olur uygun birimdir.<ol>
<li>1 mg/ml Chl hipotonik lizis arabelleği resuspend ve karanlıkta adım 3.2.1 olduğu gibi 10 dk buz üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>Her tüpün içinde 8 dk için kova rotor 4 ° C'de sallanan 3200 x g , santrifüj kapasitesi ve 2 x ham Stroma arabellek eşit bir birimdeki yeni bir microcentrifuge tüp ışık yeşil veya sarı süpernatant aşağıdaki kloroplast lizis aktarmak.</li>
		<li>Thylakoids lizis arabelleği (yaklaşıldığıdır 0,5 mg/mL) 2 cilt ile yıkayın ve 8 dk için kova rotor 4 ° C'de sallanan içinde 3200 g de Santrifüjü tarafından toplamak 1 mg/mL Chl buzda 1xIB için resuspend.</li>
		<li>42.000 g 4 ° C'de kalan membranlar kaldırmak için 30 dk için sabit açılı rotor de ham stroma santrifüj kapasitesi. Immunoblotting iç ve dış zarf proteinler için süpernatant saflığı doğrulamak için kullanılabilir.</li>
		<li>Birimin % 95'i küçük sarı-yeşil Pelet bozmadan her tüp sizden toplamak. Birimin her tüp sizden alınan not.</li>
		<li>Konsantre stromal özü (SE) hazırlamak için toplanan supernatants havuz ve 4 mL 30 kDa MWCO yoğunlaştırıcı filolarının kullanarak konsantre ol. Not: Bu şekilde hazırlanan SE kloroplast, 2.5 mg/mL Chl. türetilen stroma eşdeğerdir Gerekirse, SE on 5 mg/mL Chl eşdeğerleri konsantre olabilir. SE altın renkli ve yapışkan olacaktır. Kova rotor sallanan ile laboratuar efsane RT santrifüje, bunun hakkında 10 min başına mL konsantre gerekir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. cpTat yolu ile ulaşım
Not: CpSec1 veya cpSRP, aksine cpTat yolu çözünür bileşenler gerektirmez veya exogenously enerji kaynakları eklendi; Sadece ışık tahrik proton nedeni gerekli3güçtür. Bu nedenle, sadece izole protein thylakoids ve substrat, tahlil için gereklidir. Tipik yüzeylerde ( Şekil 1' de görüldüğü gibi) 17 kDa ara formları ve 23 kDa alt birimleri oksijen karmaşık gelişen, iOE17 ve iOE23, sırasıyla vardır, ama habercisi formlar, prOE17 ve prOE23, de başarılı bir şekilde taşınan. Öncü formları tüm önerebilirim N-terminal hedefleme sıra, ara formlar yalnızca sıra hedefleme thylakoid vardır.
<ol><li>CpTat ulaşım karışımı 0,33 mg/mL ile Chl thylakoids, 5 mM ATP 1xIB ve 8 mM dithiothreitol (DTT) 1xIB, buz üzerinde hazırlanan bir stoktan hazırlanan bir stoktan hazırlayın. ATP aydınlatma altında yürütülen, kesinlikle bu reaksiyon için gerekli değildir.</li>
	<li>1:30 tanıtımı tarafından başlatmak taşıma birim birim taşıma substrat protein karışımı. Substrat protein 1xIB içinde hazır olmadığı bir 1:1 2xIB ile seyreltme ilk, o zaman kullanmak 1:30 birim birim seyreltilmiş substrat / ulaşım karışımı hazırlamanız. Not: Substrat konsantrasyonu hazırlama yöntemi göre değişir. Overexpression için millimolar tutarları micromolar sağlayacak süre genellikle vitro hazırlıklar micromolar tutarlarına, nanomolar için izin verir. Autoradiography ve fluorography daha immunoblotting daha duyarlı olduğu gibi algılama yöntemleri de düşünülmelidir.</li>
	<li>80-100 µE/m2s omnivor aktif radyasyon (PAR) Oda sıcaklığında 10 dakika için süspansiyon aydınlatmak. Taşıma kinetik gerekiyorsa, oda sıcaklığında thylakoids ve tepki karışıma önceden equilibrate ve 30 dakikaya kadar aydınlatmak.</li>
	<li>Buz gibi 1xIB 8-fold bir seyreltme ile taşıma reaksiyonu durdurmak ve 3200 g microcentrifuge 4 ° C'de 5 min için de Santrifüjü tarafından thylakoids kurtarmak</li>
	<li>Değil taşınan kalan substrat kaldırmak, thylakoid Pelet 1xIB 120 µL içinde resuspend ve 2 mg/mL thermolysin ve 10 mM CaCl 1xIB içinde2 6 µL eklenmesi tarafından dış protein sindirimi.</li>
	<li>Proteaz tepki 40 min için buz üzerinde kuluçkaya ve sonra proteaz 25 mM EDTA 1xIB içinde hazırlanan birimle ikiye katlayarak gidermek.</li>
	<li>Thylakoids 3200 g 4 ° C'de 5 min için bir microcentrifuge de centrifuging tarafından yeniden elde etmek Kurtarılan thylakoids 5 mm EDTA 1xIB ve yeni bir tüp transferi 120 μL yıkayın.</li>
	<li>Bir microcentrifuge 4 ° C'de 5 min için 3200 g de santrifüj kapasitesi Laemmli örnek 10 mM EDTA ile desteklenmiş arabellek uygun bir hacmine resuspend. Genellikle yeterince 40 µL hacmi olduğunu substrat SDS-sayfa jel üzerinde tespit etmek ve gerektiğinde tekrar jelleri için örnek tasarruf sağlar.</li>
	<li>Örnekleri 10 dakika kaynar su banyosu yerleştirin ve SDS-PAGE tarafından analiz. Autoradiography, fluorography veya yerel olmayan veya epitope öğesini proteinlerin Western blot taşınan proteinler tespiti için başarılı bir şekilde kullanılmıştır.</li>
</ol>6. cpSec1 yolu ile ulaşım
Not: CpSec1 translocon yoluyla ulaşım overexpression E. coli14,15 üzerinden tedarik veya stroma yoğunlaşarak kurtarılan stromal protein cpSecA112,13, gerektirir. thylakoid yalıtım sırasında. Tipik bir substrat karmaşık gelişen oksijen (prOE33), 33 kDa alt birim Şekil 2' de görüldüğü gibi var.
<ol><li>CpSec1 ulaşım karışımı 0,33 mg/mL ile Chl thylakoids, 0,83 mg/mL Chl eşdeğer SE veya rekombinant cpSecA1 ve 5 mM ATP buz üzerinde 1,5 μg hazırlamak ve kuluçkaya 10 dakikadır. Bir tipik taşıma tepki burada 72 μL, en fazla 60 μL SE eklenmesi nedeniyle gelen karışımdır.<ol>
<li>Rekombinant cpSecA1 SE yerine kullanılacaksa, saf cpSecA1 2xIB eşit bir birimdeki ayarlayın, daha sonra taşıma reaksiyonlar (Örneğin, 0,75 µg/µL) eklemek için uygun bir konsantrasyon oranında seyreltin. Not: uzun süreli depolama için cpSecA1 bir kontrollü, buzdolabında odada buz sonra arıtma depolanır donma onuntemsilcilerini etkinlik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1:10 tanıtımı tarafından başlatmak taşıma birim birim taşıma substrat protein karışımı. Substrat protein 1xIB içinde hazır değil, 2xIB ile 1:1 seyreltme hazırlamak ve 1:10 birim birim seyreltilmiş protein taşıma karışıma ekleyin.</li>
	<li>Tepki altında 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya 80-100 µE/m2s PAR. Yine, daha uzun zaman kinetik veya belirli yüzeyler için gerekli olabilir.</li>
	<li>Işık tedavisi sonra 8-fold seyreltik 3200 g microcentrifuge 4 ° C'de 5 min için de buz gibi 1xIB ve santrifüj tepkiler ile</li>
	<li>Thermolysin ile tedavi ve adımları 5.5 EDTA ile 5,7 gidermek.</li>
	<li>3200 g microcentrifuge 4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi ve uygun bir birimdeki Laemmli örnek arabelleği 10 mM EDTA ile desteklenmiş Pelet resuspend. Su banyosu SDS-sayfa jel yükleme önce 10 dakika kaynar suda koyun.</li>
</ol>7. cpSRP yolu aracılığıyla ekleme
Not: CpSRP54, cpSRP43 ve cpFtsY16cpSRP-aracılı entegrasyonu karmaşık proteinleri (LHCP) Şekil 3 ' te görülen hasat ışık gerektirir. Bu bileşenler için konsantre stromal özü, yoluyla taşıma tepki cpSec1 aktarma protokolü için açıklandığı gibi sağlanır.
<ol><li>CpSRP hazırlamak taşıma 0,33 mg/mL Chl thylakoids, 0,83 mg/mL Chl eşdeğer SE ve 5 mM ATP buz ile karıştırın ve 10 dakikadır kuluçkaya.</li>
	<li>1:10 tanıtımı tarafından başlatmak taşıma birim birim taşıma substrat protein karışımı. Substrat protein 1xIB içinde hazır değil, 2xIB ile 1:1 seyreltme hazırlamak ve 1:10 birim birim seyreltilmiş protein taşıma karışıma ekleyin.</li>
	<li>Reaksiyon, oda sıcaklığında 10 dk 80-100 µE/m2s PAR için kuluçkaya.</li>
	<li>Işık tedavisi sonra 8-fold seyreltik 3200 g microcentrifuge 4 ° C'de 5 min için de buz gibi 1xIB ve santrifüj tepkiler ile Süpernatant atın ve Pelet 1xIB 120 µL içinde resuspend.</li>
	<li>Bölümlerde 5.7 ile 5.5 thermolysin ile tedavi. Thermolysin sindirim burada başarılı membran tümleştirme değerlendirmek için gereklidir. Kurtarılan thylakoids 5 mm EDTA 1xIB ve yeni bir tüp transferi 120 μL yıkayın.</li>
	<li>3200 g microcentrifuge 4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi ve Pelet tekrar 10 mM EDTA ile desteklenmiş 2 x Laemmli arabellek uygun bir hacmine resuspend. Su banyosu SDS-sayfa göre analiz önce 10 dakika kaynar suda koyun. Not: Olgun LHCP (mLHCP) entegrasyonunu proteaz korumalı bozulması ürün (mLHCP-D) görünümünü tarafından değerlendirilir yaklaşık 1,5-2 kDa uncleaved mLHCP17daha küçük.</li>
</ol>

<ol><li>Ellis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+protein+synthesis%3A+principles+and+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Sub-cellular+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chloroplast protein synthesis: principles and problems.</a> Sub-cellular biochemistry. 9, 237(1983).</li>
<li>Li, H. -m, Chiu, C. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+transport+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+plant+biology%22%5BJournal%5D)">Protein transport into chloroplasts.</a> Annual review of plant biology. 61, (2010).</li>
<li>Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-specific+energy+requirements+for+protein+transport+across+or+into+thylakoid+membranes.+Two+lumenal+proteins+are+transported+in+the+absence+of+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).</li>
<li>Skalitzky, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastids+contain+a+second+sec+translocase+system+with+essential+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Plastids contain a second sec translocase system with essential functions.</a> Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).</li>
<li>Dabney-Smith, C., Storm, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDabney-Smith%2C+C+%22Plastid+Biology%22">Plastid Biology</a>. , Springer. 271-289 (2014).</li>
<li>Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+%26%2334%3Bassisted%26%2334%3B+and+%26%2334%3Bspontaneous%26%2334%3B+mechanisms+for+the+insertion+of+polytopic+chlorophyll-binding+proteins+into+the+thylakoid+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct &#34;assisted&#34; and &#34;spontaneous&#34; mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).</li>
<li>Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. hloroP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChloroP%2C+a+neural+network-based+method+for+predicting+chloroplast+transit+peptides+and+their+cleavage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites.</a> Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).</li>
<li>Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locating+proteins+in+the+cell+using+TargetP%2C+SignalP+and+related+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools.</a> Nature protocols. 2 (4), 953(2007).</li>
<li>Ling, Q., Jarvis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+import+into+chloroplasts+isolated+from+stressed+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54717(2016).</li>
<li>Lo, S. M., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLo%2C+SM+%22Photosynthesis+Research+Protocols%22">Photosynthesis Research Protocols</a>. , Springer. 139-157 (2011).</li>
<li>Vernon, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+determination+of+chlorophylls+and+pheophytins+in+plant+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts.</a> Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).</li>
<li>Knott, T. G., Robinson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secA+inhibitor%2C+azide%2C+reversibly+blocks+the+translocation+of+a+subset+of+proteins+across+the+chloroplast+thylakoid+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).</li>
<li>Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SecA+homolog+in+protein+transport+within+chloroplasts%3A+evidence+for+endosymbiont-derived+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting.</a> Science. 266 (5186), 796-798 (1994).</li>
<li>Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+the+cDNA+for+pea+chloroplast+SecA+Evolutionary+conservation+of+the+bacterial-type+SecA-dependent+protein+transport+within+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts.</a> FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).</li>
<li>Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-assisted+post-translational+transport+of+plastidic+type+I+signal+peptidase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).</li>
<li>Luirink, J., Sinning, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRP-mediated+protein+targeting%3A+structure+and+function+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).</li>
<li>Yuan, J., Henry, R., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+factor+plays+an+essential+role+in+protein+integration+into+thylakoids+that+cannot+be+replaced+by+unfolding+or+by+heat+shock+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Hsp70.+Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein.</a> Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).</li>
<li>Tjalsma, H., van Dijl, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics-based+consensus+prediction+of+protein+retention+in+a+bacterial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane.</a> Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).</li>
<li>Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Facile+Reporter+System+for+the+Experimental+Identification+of+Twin-Arginine+Translocation+%28Tat%29+Signal+Peptides+from+All+Kingdoms+of+Life%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life.</a> Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).</li>
<li>Yuan, J., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastocyanin+and+the+33-kDa+subunit+of+the+oxygen-evolving+complex+are+transported+into+thylakoids+with+similar+requirements+as+predicted+from+pathway+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).</li>
<li>Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., Büchel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transversal+and+lateral+exciton+energy+transfer+in+grana+thylakoids+of+spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach.</a> Biochemistry. 43 (45), 14508-14516 (2004).</li>
<li>Frielingsdorf, S., Jakob, M., Klösgen, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stromal+pool+of+TatA+promotes+Tat-dependent+protein+transport+across+the+thylakoid+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).</li>
<li>Tu, C. -J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+FtsY%2C+chloroplast+signal+recognition+particle%2C+and+GTP+are+required+to+reconstitute+the+soluble+phase+of+light-harvesting+chlorophyll+protein+transport+into+thylakoid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Kloroplast ve Thylakoid yalıtım
Aşırı kırılması neden olur zavallı kloroplast ayrılık degradedeki sonra yalıtım ve böylece zavallı thylakoid verim. Hasat doku yavaşça tüm malzeme karıştırma ve tamamen homojenize oluncaya kadar 15 s döngülerle darbe önce batık sağlayarak homojenize en iyisidir. Gerekirse, birden çok daha kısa tur her turda daha az doku ile harmanlama kullanın.
Hasat doku ile temas gelen tüm malzemeler soğutma izole kloroplast etkinlik 2 saat korumak içi...

Neredeyse tüm proteinaceous makine uygun kloroplast işlevi için sorumlu sitozol1ile translocated gerekir. Kloroplast zarflar protein yüzeylerde dış membran (TOC) translocon ve iç zar (TIC)2translocon alınır. Daha fazla thylakoid için hedefleme membran ve lümen oluşur ikiz arginin translocation (cpTat)3, salgı (cpSec1)4, sinyal tanıma parçacık (cpSRP)5ve spontan ekleme yolları6 ile . Yüksek verimli yalıtım fizyolojik aktif kloroplast ve thylakoid membran için bir yöntem enerji bilimi ve kinetik bir translocation olay, her yolu farklı taşıma mekanizmaları anlamak ve yerelleştirmek için ölçmek gerekli olan bir kloroplast altı ayrı bölmeleri hiçbirine ilgi belirli protein alt katman.
Kloroplast dan membran izolasyon taşıma enerji ölçümü etkileyen çevresel faktörler (örneğin, tuz ve substrat konsantrasyonu, ATP/GTP ve pH koşulların varlığı) üzerinde daha iyi deneysel kontrol sunar ve kinetik. Bu vitro ortamda aynı sebeplerden dolayı mekanik translocation ayrıntılarını keşif için oldukça rahat. Akıllı yazılım yerelleştirme kloroplast proteinlerin7,8geliştirdi, Ayrıca, vitro taşıma deneyleri onay için daha hızlı bir yöntem mikroskobu tabanlı floresan deneyleri üzerinde bunu sağlarken genetik olarak kodlanmış bir floresan etiketi, bitki dönüşümü ve/veya belirli antikor gerektirir. Burada, iletişim kuralları her enerji bağımlı thylakoid translocation yolları için optimize taşıma deneyleri yanı sıra, kloroplast ve thylakoid izolasyonların bezelye (Pisum sativum) üzerinden için mevcut.

<table><tbody><tr><td>Pisum sativum tohumları</td><td>Seedway LLC, Hall, NY</td><td>8686 - Little Marvel</td><td></td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Calbiochem, Gibbstown, NJ</td><td>475855-1</td><td></td></tr><tr><td>%80 Aseton</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>67-64-1</td><td></td></tr><tr><td>Bilenmiş bıçaklı blender</td><td>Waring Ticari</td><td>BB155S</td><td></td></tr><tr><td>Polytron 10-35</td><td>Fischer Sci</td><td>13-874-617</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>GE17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>JA 20 rotorlu Beckman J2-MC</td><td>Beckman-Coulter</td><td>8043-30-1180</td><td></td></tr><tr><td>HB-4 rotorlu Sorvall RC-5B</td><td>Sorvall</td><td>8327-30-1016</td><td></td></tr><tr>1xIB <td>Sigma, Saint Louis, MO'da</td><td>100 mM ditiyotreitol (DTT)</td><td>12/3/83</td><td>İleride kullanım için alikotlarda dondurulabilir</td></tr><tr><td>1xIB'de 200 mM MgATP</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>74804-12-9</td><td>İleride kullanılmak üzere alikotlarda dondurulabilir</td></tr><tr><td>1xIB (2mg / mL)</td> <td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>9073-78-3'te</td> termolizin <td>İleride kullanım için alikotlarda dondurulabilir</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>K-Tricine</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>50-70-4</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Manganez Klorür</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>13446-34-9</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol Mavi</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>115-39-9</td><td></td></tr><tr><td>B-Merkaptoetanol</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>60-24-2</td><td></td></tr></tbody></table>

yalıtım fizyolojik aktif thylakoids ve onların kullanımı enerji bağımlı protein taşıma deneyleri

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Kloroplast vardır organelleri çok sayıda temel metabolik yollar, sorumlu yeşil bitkilerde fotosentez en önemlisi. Kloroplast içinde thylakoid membran sistemi ve fotosentetik pigment, reaksiyon merkezi kompleksleri ve elektron taşıyıcıları çoğu evler ışık bağımlı ATP sentezi için sorumludur. Kloroplast proteinlerin % 90'çekirdeğinde kodlanmış, sitozol tercüme ve daha sonra kloroplast ithal. Daha fazla protein taşıma içine veya thylakoid membran boyunca dört translocation yollar birini kullanır. Buraya, taşıma deneyleri üç enerji bağımlı cpTat, cpSec1 ve cpSRP-aracılı yolu ile birlikte bezelye (Pisum sativum), gelen taşıma-yetkili thylakoids yalıtım için yüksek verimli yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntemler thylakoid protein yerelleştirme, taşıma enerji ve protein translocation mekanizmaları biyolojik membranlar arasında ilgili deneyler etkinleştirin.

Başarılı bir şekilde taşınan substrat miktarını ölçmek için bir veya daha fazla "yüzde giriş" Şerit eklemek kullanışlı olabilir. Aşağıda gösterilen veri için son aktarım tepki thylakoids olmadan yüzde 10'u kullanıldı. Bu "yüzde giriş" da habercisi substrat boyutunu görselleştirmek için yardımcı olur. Yüzde hangi substrat taşınan Karşılaştır substrat karşı için bilinen, tanımlı miktarını temsil eder ve gerekli başlangıçta kullanarak protein hazırlanırken yukarı veya aşağı ölçeklendirilebil...

Biz burada fizyolojik aktif thylakoids yüksek verimli izolasyon için protokoller ve protein taşıma deneyleri kloroplast ikiz arginin translocation (cpTat), salgı (cpSec1) ve sinyal tanıma parçacık (cpSRP) yolu için mevcut.

Yalıtım fizyolojik aktif Thylakoids ve onların kullanımı enerji bağımlı Protein taşıma deneyleri

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Bu yöntem, kloroplast membranları arasında protein taşıma mekanizmaları ve enerjik yanı sıra plastids içinde proteinlerin konumu ile ilgili anahtar soruların cevap yardımcı olabilir. Thylakoid protein hedeflemesi için bu tekniğin en büyük avantajı, sıcaklık, pH, iyonik koşullar ve öncül konsantrasyonları da dahil olmak üzere taşıma sırasında thylakoid ortamının tam kontrol sağlar olmasıdır. Üç saat boyunca 400 mililitre distile su yaklaşık 55 gram bezelye ıslatarak başlayın.Toprağa plastik bir tepsi içinde batırılmış bezelye ekin, vermikülit ince bir tabaka ile kaplı, ve metin protokolü açıklandığı gibi dokuz ila 15 gün boyunca büyümek. Kloroplast izolasyon gününde, 15 mililitre Percoll mililitre ve 15 mililitre lik 2xGB tamponu 30 mililitrelik polikarbonat yüksek hızlı santrifüj tüpünde 30, sabit açıda rotorda 900 gs'lik bir karışımı nı frenkapalı yken 30 dakika boyunca 30 dakika boyunca santrifüj ederek sürekli bir yoğunluk gradyanı hazırlayın. Sonra hasat yaklaşık 25 gram dokuz ila 15 günlük bezelye sürgünler.Soğutulmuş bir blender soğuk 1xGB tampon 95 mililitre ekleyin, keskinleştirilmiş bıçakları ile. Ve homojenize. Soğutulmuş bir kabın üzerine bir huni yerleştirilen peynir bezi en az iki kat ile bu karışımı filtreleyin.Santrifüj filtrasyon bir 15 mililitre polikarbonat santrifüj tüp kullanarak bir sallanan kova rotor 3, 000 gs dört derece santigrat beş dakika için. Supernatant atın ve hafifçe 1xGB bir mililitre pelet resuspend için bir paintbrush kullanın. Bundan sonra dikkatle Percoll gradyan üstüne ekran süspansiyon katman için bir cam duruş pipet kullanın.8,000 gs'de sallanan bir kova rotorunda 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca freni kapalı santrifüj edin. Bir duruş pipet kullanarak tekrar dikkatle bozulmamış kloroplastlar içeren alt yeşil bant taze bir 50 mililitre polikarbonat tüp içine aktarın ve 1xIB tampon 30 mililitre ekleyin. Dört santigrat derece beş dakika için 1, 800 gs bir sallanan kova rotor tüp santrifüj.Supernatant attıktan sonra, yavaşça bir boya fırçası ile 1xIB bir mililitre pelet resuspend. 30 mililitre 1xIB ve santrifüj de aynı koşullarda tekrar yıkayın. 1xIB bir mililitre son santrifüj sonra pelet resuspend.Klorofil konsantrasyonu belirlemek için, % 80 aseton beş mililitre ile tamamen resuspended kloroplast10 mikrolitre karıştırın. 11 mikrometre gözenek boyutuna sahip 180 mikrometre kalınlığındaki filtre kağıdından süzün ve klorofil konsantrasyonunu spektrofotometre ile belirleyin. Soğuk 1xIB kullanarak mililitre başına bir miligram kloroplast karışımı seyreltin.Stromal ekstresin gerekli olmadığı nda thylakoidleri izole etmeye başlamak için cpTat taşıma, santrifüj bozulmamış kloroplastlar 1,5 mililitrelik tüplerde sallanan kova rotorunda 1,000 gs'de dört derece santigrat derece altı dakika süreyle. Bundan sonra, supernatant atın ve bir mikropipet ile mililitre başına bir miligram elde etmek için hipotonik lysis tampon pelet resuspend. 10 dakika ara sıra karıştırarak karanlıkta buz üzerinde kuluçka.Timokoidleri kurtarmak için, sallanan kova rotorunda santrifüj 3, 200 gs'de dört derece santigrat derecede sekiz dakika. Bir ila iki mililitre likiz tamponu ile peleti yeniden suyararak ve aynı koşullarda santrifüj ederek timokoidleri iki kez yıkayın. Son santrifüjden sonra, peleti 1xIB tamponunun bir mililitresinde yeniden askıya alın ve daha önce gösterildiği gibi bir spektrofotometre kullanarak izole timokoidlerde klorofil konsantrasyonunu belirleyin.CPSec1 ve CPSRP eliquate gibi stromal ekstresi kurtarma gerektiren yollar için bir sallanan kova rotor ve santrifüj izole kloroplast600 mikrolitre 1,000 gs dört derece santigrat altı dakika için. Kloroplast lysis için, 600 mikrolitre hipotonik lysis tamponu ile pelet askıya alıyoruz. Ara sıra karıştırma ile 10 dakika boyunca karanlıkta buz üzerinde kuluçka.Sonra tüpleri sallanan kova rotorunda 3, 200 gs'de dört santigrat derecede sekiz dakika santrifüj edin. Stroma kaydetmek için, yeni bir mikro santrifüj tüp sarı supernatant açık yeşil transfer ve 2x ham stromal tampon eşit hacim ekleyin. Thylokoids yıkamak için, dört santigrat derece sekiz dakika boyunca 3, 200 gs iki cilt lysis tampon ve santrifüj ekleyin.Mililitre başına bir miligram klorofil konsantrasyonu elde etmek için 1xIB pelet resuspend ve taşıma tahlillerde daha sonra kullanılmak üzere buz üzerinde bir kenara koyun. Seyreltilmiş ham stroma'yı 42, 000 gs'de sabit açı rotoruyla santrifüj ederek ham stromadan arta kalan membranları 42 derece santigrat derecede 30 dakika çıkarın. Daha sonra her tüpten alınan hacmi not ederken, küçük sarı yeşil pelet rahatsız değil emin olmak için her tüp hacminin% 95 toplamak.Konsantre stromal ekstresi hazırlamak için, toplanan supernatants havuz. Sonra dört mililitre kullanın 30 kilodalton moleküler ağırlık kesme konsantratörü ekstre beş kat konsantre. Buz üzerinde 1,5 mililitrelik bir tüpteki cpTat taşımasını tahlil etmek için izole timokoidleri mililitrede 0,33 miligram lık son klorofil konsantrasyonuna, 1xIB'de hazırlanan beş milimolar ATP'ye ve 1xIB'de hazırlanan sekiz milimolar DTT'ye karıştırın.Taşımayı başlatmak için, substrat proteinini taşıma karışımına tanıtın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca fotosentetik olarak aktif radyasyonun saniyede 80 ila 100 mikroeinstein'ı ile süspansiyonu aydınlatarak reaksiyonuyguluyor. Taşıma reaksiyonu durdurmak için, süspansiyonu buz gibi 1xIB ile sekiz kat seyreltin.Centrifuge 3, 200 gs bir mikro santrifüj beş dakika dört derece santigrat thys de thylokoids kurtarmak için. Supernatant attıktan sonra, buz soğuk 1xIB 120 mikrolitre pelet resuspend. CPSec1 veya PSRP yollarını teşpetmek için aşağıdakileri 1,5 mililitrelik bir tüpte buz üzerinde karıştırın.Mililitrebaşına 0.33 miligram son klorofil konsantrasyonuna thylakoidler, stromal ekstresin mililitre klorofil eşdeğerleri başına 0.83 miligram ve 1xIB'de hazırlanan beş milimolar ATP. Buz gibi soğuk 1xIB ile reaksiyonu istenilen hacime getirin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın. Taşımayı başlatmak için bu taşıma karışımına substrat proteinhacmine göre %10 hacim sağlar.Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca fotosentetik olarak aktif radyasyonsaniyede metrekare başına 80 ila 100 mikroeinstein ile aydınlatın. Reaksiyonu durdurmak için süspansiyonu buz gibi 1xIB ile sekiz kat seyreltin. Santrifüj 3, 200gs bir mikro santrifüj beş dakika dört santigrat derece.Supernatant attıktan sonra, buz soğuk 1xIB 120 mikrolitre pelet resuspend. Taşınmış değil artık substrat kaldırmak için, mililitre termilsin başına iki miligram altı mikrolitre ve 1xIB 10 milimolar kalsiyum klorür ekleyerek dış protein sindirmek. Bu proteaz reaksiyonu 40 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın.1xIB'de 25 milimolar EDTA ile hacmi ikikatına çıkararak proteazı söndürün. Centrifuge 3, 200 gs bir mikro santrifüj beş dakika dört derece santigrat thys de thylokoids kurtarmak için. Supernatant çıkarıldıktan sonra, 1xIB beş milimolar EDTA 120 mikrolitre de kurtarılan timokoidler resuspend, ve yeni bir 1.5 mililitre tüp transfer.Tekrar santrifüj sonra 3, bir mikro santrifüj beş dakika boyunca bir mikro santrifüj içinde gs dört santigrat, supernatant atın ve laemmli örnek tampon uygun bir hacim içinde pelet resuspend, 10 milimolar EDTA ile takviye. Örnekleri 10 dakika kaynar su banyosuna koyun. Örnekleri SDS sayfasına göre analiz etmeye devam edin.iOE17 proteininin cpTat yolu ile taşınması, tanıtılan substrat ile olgun işlenmiş form arasında 2-3 kilodalton büyüklüğünde bir boyut kaymasıile sonuçlandı. Bunun nedeni, başarılı bir cpTat taşımasını gösteren n terminal sinyal peptidinde dekoltedir. Termolizin tedavisi sadece başarılı bir şekilde taşınan ve bu nedenle proteus dirençli olgun bant bırakır.OE33 öncütünün CPSec1 yolu üzerinden taşınması, olgun substratta bir boyut kayması ve taşınan substratproteus koruması ile sonuçlandı. LHCP öncülünün cpSRP yolu ile timokoid membrana yerleştirilmesi, termolysin sindirimi ile değerlendirilerek 1,5 ila iki kilodalton boyut kaymasına yol açmıştır. Bu başarılı membran ekleme, membran tam proteolysis olgun LHCP bozulma ürün amcaaved korur gibi.Bu videoyu izledikten sonra enerjiye bağımlı cpTat, cpSec 1 ve cpSRP yolları ile thylokoids ve asa tranportivity izole etmek için nasıl iyi bir anlayışa sahip olmalıdır. Bir kez bu teknik ustalaştıktan sonra düzgün yapıldığında 3-4 saat içinde yapılabilir. Bu videoda resimli olmasa da biz genellikle izole ve fotosentetik aktif kloroplastlar ve thylakoids ile çalışırken laboratuarda havai ışıkları kapalı tutmak.Bu prosedürü denerken izole kloroplast ve thylakoidleri dört santigrat derecede tutmak önemlidir. Başlangıçta kloroplastları nazikçe askıya almamayı unutmayın. İlk santrifüj adımından sonra Procoll degradesini rahatsız etmekten kaçının.Ayrıca, yüzde giriş örneği taşıma reaksiyonlarına paralel olarak hazırlanabilir ve substrat taşımasını tahmin etmek için aynı jel üzerinde çalıştırılabilir. Unutmayın, radyoaktif yüzeyler ile çalışan vicdani işleme ve uygun PPE gerektirir. Bu teknik, geliştirildikten sonra, protein hedeflemesi alanında araştırmacıların thylakoid membranlar arasında protein taşımasını yöneten enerjik, kinetik ve benzersiz mekanizmaları keşfetmelerinin önünü açmıştır.

isolation-physiologically-active-thylakoids-their-use-energy

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Tarif edilen karşılaştırmalı nicel proteomik yaklaşım, farklı koşullar altında multiprotein komplekslerinin bileşimi içine bir bakış açısı elde etmeyi amaçlamaktadır ve genetik olarak farklı suşların karşılaştırılması ile gösterilmiştir. Kantitatif analiz için bir sükroz yoğunluk gradyanı farklı fraksiyonların eşit hacimleri kütle spektrometresi ile analiz edilir ve karıştırılır.

Multiprotein kompleksleri Karşılaştırmalı Analizi için Yeni Bir Yaklaşım dayanarak<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolik Etiketleme ve Kantitatif Kütle Spektrometre

Örnekler arasındaki mitokondriyal membran potansiyelinin karşılaştırılması, hücresel durum hakkında değerli bilgiler verir. Mitokondriyi izole etmek ve floresan kullanarak inhibitörlere ve ayrıştırıcılara yanıtı değerlendirmek için ayrıntılı adımlar açıklanmaktadır. Bu protokolün yöntemi ve faydası, bir hücre kültürü ve hücresel stresin hayvan modeli kullanılarak gösterilmiştir.

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Proteolipozomlar, iyi tanımlanmış bir biyokimyasal ortamda yeniden oluşturulan saflaştırılmış kanalları ve taşıyıcıları incelemek için kullanılır. Bu proteinlerin aracılık ettiği akışı ölçmek için deneysel bir prosedür gösterilmiştir. Sulandırılmış proteinin fonksiyonel özelliklerini kantitatif olarak belirlemek için proteolipozomları hazırlama, kayıtları gerçekleştirme ve verileri analiz etme adımları açıklanmaktadır.

Bir Proteoliposome Tabanlı effluks Deney Cl Tek-molekül Properties belirleme<sup&gt; -</sup&gt; Kanallar ve Nakliyeciler

Mitokondri bitki hücre sadece küçük bir yüzdesi olarak, onlar çalışmalar bir dizi için saf gerekir. Mitokondri bitki organları çeşitli Homojenizasyon, son derece saf mitokondriyal kesir elde etmek için Diferansiyel ve yoğunluk gradient Santrifüjü tarafından takip tarafından ayrılmış olabilir.

Yalıtım ve solunum ölçümleri mitokondri Arabidopsis thaliana üzerinden

Burada, bir protokol fucoxanthin klorofil a/c proteinler (FCP) Diyatomlarla dan ayırmak ve onları uyarma enerji transferi iyon kompozisyon değişiklikleri üzerine çalışmaya doğal lipit kompozisyonları ile lipozomlar içine dahil mevcut.

İzole ve ışık-hasat antenler Diatom Cyclotella Meneghiniana lipozomlar Thylakoid lipidler ile gelen ekleme

Bir iletişim kuralı bitki aydınlatma için thylakoid protein kompleksi organizasyon ve mavi yerel polyacrylamide ile kompozisyon jel elektroforez (BN-sayfa) ve 2D-SDS-sayfa açıklanmıştır. Protokol Arabidopsis thalianaiçin optimize edilmiş ama küçük değişiklikler ile diğer bitki türleri için kullanılabilir.

Thylakoid membran Protein kompleksleri tarafından mavi yerli jel elektroforez Analizi

Burada çözündürüldükten thylakoid kompleksleri tarafından yerel Yeşil Jel Elektroforez ayırmak için bir iletişim kuralı mevcut. Yeşil Jel bantları daha sonra zaman korelasyon tek foton sayma (TCSPC tarafından) karakterizedir ve veri analizi için temel adımlar sağlanır.

Ispanak Thylakoid Protein kompleksleri yerli yeşil Jel Elektroforez ve grup Time-Correlated tek foton sayma kullanarak karakterizasyonu tarafından ayrılması

Burada, Arabidopsis yaprakları ve onların üç ana alt bölmeler (zarf, stroma ve thylakoids) sağlam kloroplast arındırmak için bir yöntem tarif fark centrifugations, sürekli Percoll degradeler, bir arada kullanarak ve iş öğelerinin sürekli olmayan sükroz degradeler. Subplastidial ve immunoblotting ve proteomik proteinlerin hücre altı yerelleştirme için önemli bir yöntemdir.

Kloroplast alt bölmeler Arabidopsis üzerinden hazırlanması Protein yerelleştirme Immunoblotting veya proteomik analizi için

Proteom ölçeğinde protein keşfi ve nicelleştirmesi ile uyumlu yüksek kaliteli mitokondri izolasyonu için iki aşamalı bir protokol sunuyoruz. Protokolümüz genetik mühendisliği gerektirmez ve bu nedenle herhangi bir birincil hücre ve dokudan mitokondri incelemek için uygundur.

Gelişmiş protein keşfi ve nicelleştirme için mitokondrinin iki aşamalı etiketsiz izolasyonu

AviTag-spesifik Konum Kısıtlı Aydınlatma Takviyeli Biyotinilasyon (ALIBi), ribozom popülasyonlarının etiketlenmesi ve afinite-affinite-arındırıcı olarak arındırılması amacıyla geliştirilen, sonraki dizileme ve proteomik analiz için geliştirilen yeni bir optogenetik olarak aktive edilmiş yöntemdir.

Rekombinant Peptit Etiketine Özgü Konum Kısıtlı Aydınlatma Güçlendirilmiş Biyotinilasyona Dayalı Subhücresel Ribozom Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Öğrenin bitki biyolojisinde kloroplast membranları arası enerji bağımlı protein taşıma deneyleri için fizyolojik olarak aktif thylakoidlerin izolasyon protokollerini. Bu yöntem, taşıma sırasında sıcaklık ve pH gibi koşulları kontrol altında tutar.

Yalıtım fizyolojik aktif Thylakoids ve onların kullanımı enerji bağımlı Protein taşıma deneyleri

Daha fazla video keşfet