Hippo Luciferase tabanlı büyük tümör baskılayıcı (Latı) biyoalgılayıcı kullanarak yolu etkinliğini sinyal izleme

Laboratuvarım meme ve akciğer kanserinde Hippo yolunun rolünü inceliyor ve son zamanlarda Hippo sinyal aktivitesini izlemek için yeni bir biyosensör geliştirdik. Bu yöntem, Hippo yolunun faktörlere nasıl tepki verdiği ve diğer sinyal yollarıyla nasıl etkileşime girdiği gibi hücresel sinyal ağları hakkındaki temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, büyük hassasiyeti ve ayrıca çok sayıda numunenin hızlı ve aynı anda işlenebilmesidir.

Bu teknik, Hippo sinyal yolunun düzenleyicilerini hem in vitro hem de in vivo olarak araştırmak için temel ve translasyonel araştırmalarda çeşitli uygulamalara sahiptir. Başlamak için, DH5-Alfa bakteri sıvı kültüründen taze LATS-BS plazmitlerini mini hazırlayın. Transfeksiyondan bir saat önce, ortamı plakadan aspire edin ve her oyuğa 500 mikrolitre büyüme ortamı ekleyin.

Önemli bir nokta, maksimum ekspresyon ve aktivite elde etmek için LATS biyosensörünün taze olarak hazırlanması gerektiğidir. Ayrıca, lusiferaz testi yapılırken pozitif bir kontrol olarak her zaman MSD gibi Hippo yolunun bir yukarı akış düzenleyicisinin kullanılması önerilir. Bundan sonra, hücreleri inkübatöre geri koyun.

Daha sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi, bir DNA çözeltisi olan çözelti A'yı ve seyreltilmiş polimer bazlı bir transfeksiyon reaktifi olan çözelti B'yi hazırlayın. Bundan sonra, hemen çözelti B'yi çözelti A'ya ekleyin ve karıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Transfeksiyon komplekslerinin oluşmasına izin vermek için numuneyi oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

Daha sonra, transfeksiyon komplekslerinin toplam hacmini, hafif bir girdap ile plakanın her bir oyuğuna damla damla ekleyin. Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, transfeksiyon kompleksi içeren ortamı çıkarın ve yeni tam ortamla değiştirin.

Daha sonra hücreleri bir gün daha 37 santigrat derecede kültürleyin. Uygun miktarda 5x Pasif lizis tamponunu damıtılmış su ile seyreltin. Ardından, ortamı plakadan tamamen aspire edin.

Her oyuğa bir mililitre PBS ekleyin ve ayrılmış hücreleri ve artık büyüme ortamını çıkarmak için plakayı hafifçe döndürün. Ardından PBS'yi tamamen aspire edin. Ardından, her kuyucuğa 250 mikrolitre 1xPLB ekleyin.

Hücre tek tabakasının PLB ile eşit şekilde kaplanmasını sağlamak için kültür plakasını 15 dakika boyunca sallanan bir platforma yerleştirin. Bundan sonra, lizatı 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. LAR-2'yi 80 santigrat derece depodan çıkarın ve oda sıcaklığına dengeleyin.

Ardından, uygun miktarda tahlil için Renilla tespit reaktifini hazırlayın. Renilla algılama reaktifini 50x substrata ve tamponuna ekleyin. Daha sonra, her hücre lizatının 10 mikrolitresini 1.5 mililitrelik tüplere dağıtın.

Ardından, iki saniyelik bir ön ölçüm gecikmesi ve ardından 10 saniyelik bir ölçüm periyodu gerçekleştirmek için bir luminometre programlayın. Dikkatlice, 20 mikrolitre LAR-2 reaktifini bir tüpe aktarın ve karıştırmak için hızlıca yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, tüpü hemen luminometreye yerleştirin ve okumayı başlatın.

Okumadan sonra, numune tüpünü luminometreden çıkarın, 20 mikrolitre Renilla reaktifi ekleyin ve karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, numuneyi luminometreye yerleştirin ve bir sonraki okumayı başlatın. İlk olarak, metin protokolünde açıklandığı gibi HEK293 Ad hücrelerini kültürleyin, ayırın, sayın ve plakalayın.

Daha sonra, transfeksiyondan bir saat önce, ortamı plakadan aspire edin ve beş mililitre taze tam büyüme ortamı ile değiştirin. Son olarak, seyreltilmiş çözelti B'yi çözelti A'ya ekleyin ve karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, transfeksiyon komplekslerinin toplam hacmini plakaya eklemeden önce numuneyi oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin ve hafifçe döndürün.

Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri deneyin ve sayın. Plaka 10.000 ila 20.000 hücre, 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna, kuyucuk başına toplam 100 mikrolitre ortam hacminde.

Bundan sonra, hücreleri bir gün daha inkübe edin. Lusiferaz testini gerçekleştirmeden bir ila dört saat önce, kuyu başına 10 mikromolar nihai konsantrasyonda Hippo yolunu potansiyel olarak düzenleyen ajanlar ekleyin. Daha sonra, ortamı hücrelerden tamamen aspire edin ve hücreleri her bir kuyucukta 100 mikrolitre PBS ile yıkayın.

Ardından, her bir kuyucuğa 20 mikrolitre PLB ekleyin. Kültür plakasını 15 dakika boyunca sallanan bir platforma yerleştirin. Ardından, plakanın her bir oyuğuna 20 mikrolitre LAR-2 reaktifi aktarın ve karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.

Bundan hemen sonra, plakayı bir plaka okuma luminometresine yerleştirin ve okumayı başlatın. Bu protokolün ilk bölümünde, LATS-BS, LATS kinaz aktivitesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için farklı genlerle birlikte transfekte edildi. İkinci protokolde LATS-BS, HEK293-Ad'ye transfekte edildi ve hücreler 96 oyuklu plakalara geçirildi.

Transfeksiyondan 40 saat sonra, hücreler Hippo sinyalinin bilinen farklı küçük molekül düzenleyicileri ile muamele edildi ve ardından bir lusiferaz testi yapıldı. Bu tahlillerin sonuçlarını yorumlarken, proteinlerin ve ilaç tedavilerinin biyosensör aktivitesini etkileyen geri bildirim yollarını aktive edebileceğine dikkat edilmelidir. Aday ile Hippo sinyal yolu arasındaki ilişkiyi doğrulamak için daha fazla deney gerekli olacaktır.

Bu prosedürü takiben, kantitatif Real-Time PCR veya Western Blot gibi diğer yöntemler, LATS kinaz aktivitesi ile ilgili ek soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, kanser biyolojisi alanındaki araştırmacıların birçok biyolojik ve biyokimyasal süreçte LATS kinaz ve Hippo sinyal yolağının dinamiklerini ve aktivitesini keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Tarama amaçlı ilaçların son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü uygularken her zaman uygun önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.